Summary
Ex-Vivo Lung Perfusjons (EVLP) har tillatt lungetransplantasjon hos mennesker til å bli lettere tilgjengelig ved at evnen til å vurdere organer og utvide donor pool. Her beskriver vi utviklingen av en rotte EVLP program og finesser som gir mulighet for en reproduserbar modell for fremtidig ekspansjon.
Abstract
Antallet akseptable donor lungene tilgjengelig for lungetransplantasjon er sterkt begrenset på grunn av dårlig kvalitet. Ex vivo Lung perfusjon (EVLP) har tillatt lungetransplantasjon hos mennesker til å bli lettere tilgjengelig ved å muliggjøre evnen til å vurdere organer og utvide donor bassenget. Ettersom denne teknologien utvider og forbedrer, evnen til å evaluere og potensielt forbedre kvaliteten av substandard lungene før transplantasjon er et kritisk behov. For mer grundig evaluere disse metodene, trenger en reproduserbar dyremodell for å bli etablert som ville tillate testing av forbedrede teknikker og styring av de donerte lungene så vel som til lunge-transplantasjonsmottaker. I tillegg er en EVLP dyremodell av patologier forbundet, f.eks ventilasjon indusert lungeskade (VILI), vil tilveiebringe en ny metode for å evaluere behandlinger for disse sykdommer. Her beskriver vi utviklingen av en rotte EVLP lunge program og avgrensninger for dette megthod som gir mulighet for en reproduserbar modell for fremtidig ekspansjon. Vi beskriver også anvendelsen av denne EVLP system for å modellere VILI i rotte lungene. Målet er å gi forskersamfunnet med nøkkelinformasjon og "perler av visdom" / teknikker som oppsto fra prøving og feiling, og er avgjørende for å etablere et EVLP system som er robust og reproduserbar.
Introduction
Klinisk Relevans
Det er for tiden en mangelen på egnede lungene tilgjengelig for transplantasjon med bare 19% av lungene være i stand til å bli utnyttet nasjonalt fører til langvarig vente-liste tid eller pasienter som dør som venter på transplantasjon en. Mangel kan være grunn til eldre givere, traumer, infeksjon, multi-system organsvikt og noen ganger skadde giver lungene ved innhøsting to. I tillegg er den tette en skrøpelig organ utenfor brysthulen og standard transport og konserveringsteknikker kan føre til nedbrytning og ikke-levedyktige i lungene. Derfor opprettholde og forbedre lunge levedyktighet ex-vivo har nylig blitt et stort fokus i lungetransplantasjon medisin.
Ex-vivo Lung Perfusjons (EVLP)
Ex-vivo lunge perfusjon (EVLP) har utviklet seg til kontinuerlig perfuse organer blir evaluert for transplantasjon og muliggjør en periode med vurdering av at allestrømmer for potensialet i lungeredning eller rekondisjonering. EVLP kan forlenge totalt ut av kroppen organ iskemisk tid og la de donerte organer til å reise videre avstander tre. Vanligvis blir lungene ventilert med 50% av total lungekapasitet eller 20 CMH 2 O av toppluftveistrykk med en brøkdel av inspirert oksygen (FiO 2) 30% 50% 4. Preserveringsoppløsning er perfusert ved 40 til 60 ml / kg (ca. 40% av den forutsagte minuttvolum på 100 ml / kg) hos mennesker og større dyr 5,6, men blir perfusert på rundt 20% av hjertets minuttvolum for rotter 7. Inkludering av STEEN løsning har tillatt menneskelige lungene å reise i RT miljøer uten utvikling av lungeødem 9. Denne banebrytende arbeid har blitt videreutviklet av University of Toronto Lung Transplant Program 10-13 og er til vurdering for bedre vurdering av marginale donor lungene for transplantasjon 14,15. Imidlertid vil den optimale ventilation og perfusjon betingelser som er nødvendig for å regenerere marginale og / eller sub-standard lungene for transplantasjon er ikke kjent og er for tiden et aktivt forskningsområde.
Isolerte lunge perfusjon systemer har vært brukt i små dyr for å forårsake lungeskade, gjenoppretter luftveissykdommer, og perfuse lungene med forskjellige løsninger for å forebygge ischemisk skade. Forskere har skapt et lite dyremodell av lungetransplantasjon ved å bruke den isolerte lunge-perfusjon system for å etterligne EVLP protokoller som kan benyttes i mennesker og større dyr 16-18. Imidlertid har denne eksperimentelle modellen mange utfordringer med hensyn til de ulike teknikkene og parametrene som brukes for å etterligne menneskelig fysiologi. Spesielt er det mange nyanser i å opprettholde lunge levedyktighet under EVLP. Disse særegen kan oppstå på grunn av forskjeller i høsting teknikk, positive ventilasjonsinnstillinger trykk, perfusatkonsentrasjonene sammensetning og strømningsforhold og kanylering av lungen. Therefore, målet er her for å gi forskersamfunnet med en rekke feilsøkings og implementerings tips som vi har funnet føre til en robust metode for å implementere EVLP i en gnager modell.
Protocol
MERK: Alle prosedyrer ble utført i henhold til de til retningslinjene Institutional Animal Care og National Research Council Veiledning for Humane Stell og bruk av forsøksdyr (IACUC) og har gjennomgått godkjenning av The Ohio State University IACUC komiteen.
1. Første oppsett
- Sett opp EVLP krets og har varm (37 ° C) perfusatet sirkulerer gjennom systemet før innlemme ex-plantet lunge (figur 1).
- Still varmt vannbad, som brukes til jakken perfusatet reservoaret, varmeveksleren, og kunstig thorax, til 37 ° C og sirkulerer (figur 1).
- Kjøre en de-oksygene oppløsning (f.eks, 6% O 2, 8% CO2, 84% N2) i motstrøms gjennom perfusatet i gassfilter for å sikre perfusatet har ~ 6% oppløst oksygen for forsøket.
MERK: Dette deoksygenert perfusatet gjør vurderingen of lungefunksjonen ved måling av oksygen som innføres i perfusatet, post-organ. - Åpne datainnsamlingsprogram og koble pulmonalt arterietrykk transduser, trakeal differensialtrykkomformer, respiratorisk strømningsdifferensialtrykkomformer, lungene vekt transduser, og pumpehastigheten svinger til EVLP kretsen og datainnsamling / analog-til-digital omformer boks ( Figur 2).
- Sett opp operasjonsbordet og driftsverktøy på EVLP krets (figur 3).
- Sett opp en liten beholder med flytende nitrogen nær EVLP kretsen hvis prøvene vil bli oppnådd.
MERK: Forfatteren er systemet blitt endret for å samle pre-orgel og post-orgel perfusatet uten å avbryte trykkstrømningsdynamikk som potensielt kan skade lungene.
2. Utarbeidelse av anestesi og Heparin, anesthetization av Rat
- Sett på følgende personlig verneutstyr(PPE) før du håndterer rotter og rotte vev: kirurgiske maske, kirurgiske hansker, og disponibel kappe.
- Vei rotte og noter vekten.
- Forbered 1200 U / kg heparin.
- Forberede både 60 mg / kg ketamin og 5 mg / kg Xylazin i samme sprøyte, forbereder ketamin først.
- Intraperitonealt injisere blanding av ketamin og Xylazin inn i rotte og la 5 min for rotte å bli bevisstløs.
- Bekreft riktig anesthetization ved å sjekke tå klype refleks. Hvis rotta ikke trekke tilbake sin tå, er det ikke føler smerte.
- Flytt rotte til operasjonsbordet, sikre i liggende stilling, og spray med alkohol for sterilisering.
3. Utvinning og Initial Ventilasjon av Rat Lunger
- Forberede 4-20 cm lang silkesuturer (3-0 eller 4-0 burde holde).
- Begynne innspillingen data ved hjelp av datainnsamlingsprogram.
- Se etter passende dybde av anestesi, ved hjelp av kirurgisk saks inn peritoneal cateten av en midtlinjen laparotomi og injisere heparin i vena cava inferior.
- Bære snittet kranialt forbi manubrium inn i halsen til luftrøret er utsatt. Ikke brudd brysthulen (Figur 4A).
- Dissekere posterior til luftrøret i midtlinjen, og skyver en silkesutur posterior til luftrøret (figur 4B).
- Heve fremre delen av luftrøret og gjøre en tverrgående snitt mellom bruskringer, høye på luftrøret. Ikke kutt gjennom bakre membranøs delen av luftrøret på dette punktet (Figur 4C).
- Cannulate luftrør med luftrøret kanyle og sikker med silke sutur (Figur 4D). Kontroller at sutur ligatur er sikret i innskjæring å redusere migrasjon av kanylen.
- Koble luftrøret kanyle til ventilasjonskretsen.
- Slå på mekanisk ventilator å starte mekanisk ventilering av luNGS.
MERK: Innledende innstillinger ble valgt til å være en tidevolum på 4 ml / kg og positive enden-ekspiratorisk trykk (PEEP) av 2 CMH 2 O. Disse innstillingene er de opprinnelige innstillingene og avhengig av eksperimentelle forhold kan bli justert når orgelet er i ex-vivo perfusjon system. - Skriv inn brysthulen gjennom sternum / xyphoid og fortsette kranialt mot suprasternal hakk. Pass på å unngå å berøre lungene.
MERK: Som rottelunger er skjør, kan utilsiktet manipulasjon føre til traumer og lungeødem (figur 5A). - Ved hjelp av to haker, trekke brysthula til riktig utsett anatomi (figur 5A). Igjen, ta vare for å unngå å berøre lungene.
- Fjern thymus med svak økning og stump disseksjon.
- Shift mageinnholdet til en side for å avsløre enten inferior vena cava (IVC) eller mesenteriske blodåre (MV).
- Incise enten IVC eller MV til exsanguinate rotte, og gir aktiv dødshjelp.
- Plasser en silke sutur posterior til lungearterien og aorta i forberedelse for å sikre lungearterien kanyle (Figur 5B).
- Lage et 2-3 mm snitt på fremre overflate av høyre ventrikkel utløpskanal og plassere kanylen i snittet og inn i hovedlungearterien og sikre med silke sutur (figur 5C).
- Transekt apex av hjertet for å gi tilgang til venstre ventrikkel og skylle eventuelle klumper innenfor lunge blodkar ved strømmer ~ 15 ml av en lav K + elektrolytt løsning gjennom lungearterien og ut gjennom toppen av hjertet inn i brysthulen ( Figur 5D).
- Koble lungearterien (PA) kanyle til EVLP krets. Sikre tilsiget linje som kommer fra kretsen til PA kanylen er primet med perfusatet å unngå luft inn i hjertet og lungene.
- Slå påHoved peristaltiske pumpen og sette den til en lav (~ 2 ml / min) raskere å tillate perfusatet å kjøre gjennom lungearterien og ut venstre hjertekammer inn i brysthulen. ** KRITISK STEP ** Sørg for at PA trykket ikke pigg som dette er et tegn på enten en blokkering eller dårlig kanylering (figur 6).
- Slå av peristaltiske pumpen.
- Plasser en silke sutur bak hjertet, rundt ventriklene (figur 7).
- Starte prosessen med kanylerør i venstre atrium ved å sette inn en liten par kirurgiske tenger inn i toppen, gjennom mitral ventil, og inn i venstre atrium.
MERK: Dette vil strekke mitralklaffen og lette kanylering. Aggressiv utvidelse, eller for dypt utvidelse, kan utilsiktet rift i venstre atrium rende anskaffelse ineffektiv. - Fjerne tang fra hjertet.
- Sett venstre atrium kanyle inn i toppen gjennom mitralklaffen og inn i venstre vedrium.
- Fest venstre atrium kanyle med silke sutur bak hjertet (Figur 8).
MERK: Dette sutur kan være "pre-tied" for å lette kanylering. - Koble lungearterien kanyle til ex-vivo lunge perfusjon krets (9A). Ikke koble venstre atrium kanyle til EVLP kretsen før hjerte-lunge-blokk har blitt fullstendig fjernet fra kroppen.
- Klemmes fast i spiserøret med en hemostat og kuttet under klemmen (mellom klemmen og diafragma), slik at spiserøret kan brukes til å heve kardiopulmonal strukturer cephalic.
- Omsvøp dissekere det omkringliggende vev og kutte synkende aorta og hjelpefartøy for å frigjøre hjerte-lunge-blokk som det blir reist via spiserøret (figur 9B).
- Transekt luftrøret cephalic til trakealkanyle til helt gratis hjerte-lunge-blokk.
- Ta av hjerte-lunge-blokken og plasser i designated sted på EVLP kretsen (figur 9C).
- Koble venstre atrium kanyle til utløpet linje og starte hovedslangepumpe (figur 9D).
4. Ex Vivo Perfusjons av lungene
- Raskt fjerne ventilasjons linje fra toppen av EVLP apparater og feste bolig med trykksensorene, og sett ventilasjons linje på toppen av huset på toppen av EVLP apparatet.
MERK: Dette vil tillate ventilasjons data som skal registreres og press overvåket. - Sikre boblen fellen er fylt med en tilstrekkelig mengde perfusatet slik at ingen luftbobler (dvs. luft emboli) blir introdusert til lungene.
- Sakte endre ventilasjon og perfusjon innstillingene til ønskede eksperimentelle nivåer under den første 15 min. I tillegg, i løpet av denne første opptrappingsfase, øke perfusjon strømningshastigheten til ønsket hastighet og / eller trykk.
MERK: Proging ventilatoren å produsere intermitterende sukk pust, som letter bevegelsen av væske ut av lungene plass og dermed forsinke utbruddet av ødem, anbefales. Disse kan fremstilles ved vifter utstyrt med sukk funksjon. - Definer "Time 0" som den tid da ventilasjonsparametre er på et tidevolum på 4 ml / kg, PEEP ved 2 cm H 2 O, og perfusjon parametere er på sin forventede nivåer og holdt konstant.
- Om nødvendig, ta Perfusatprøver fra prøven port, flash fryse i flytende nitrogen, og merk tiden av prøvene.
- Når forsøket er ferdig, isolere eventuelle nødvendige anatomiske stykker for innsamling og enten flash fryse i flytende nitrogen eller sted i å fikse løsning for videre studier.
Representative Results
Sanntid mekaniske data innsamlet gjennom datainnsamlingsprogram kan lett bli analysert for å teste en rekke hypoteser. For eksempel viser Figur 10A gjennomsnittlig lungevekt gjennom 60 min fra 10 rotteeksperimenter hvor dyrene ble ventilert med en lav tidevolum / lav PEEP på 4 ml / kg, og to CMH 2 O. Selv om det er en meget liten økning i lungevekt i løpet av eksperimentet, er denne økning ikke er statistisk signifikant (ANOVA, p = 0,92). Figur 10B viser gjennomsnittlig pulmonalt arterietrykk (PAP) gjennom 60 min fra 12 rotteeksperimenter. Den nedre PAP ved 0 min tidspunkt er et resultat av lavere strømnings og ventilasjonsinnstillinger brukt ved begynnelsen av alle forsøkene og PAP forblir konstant etter dette tidspunkt med ingen statistisk signifikante forandringer etter t = 10 min (ANOVA på rekkene, p = 0.89). Figur 10C viser pulmonal vaskulær resistens (PVR) gjennom 60 min fra 12 rotteeksperimenter og selv om det er en liten nedgang i PVR etter t = 20 min, var det ingen statistisk signifikant forskjell i PVR under dette eksperimentet (ANOVA på rekkene, p = 0,65). I forhold til PVR-data vises her, Noda et al. har vist PVR å øke noe over tid i 4 timer. Imidlertid, disse forfattere angir data i PVR starter på 1 time i stedet for begynnelsen av forsøket og ingen standardavviksverdier er gitt 7. Noda et al. også viser ikke lungeødem data for de fire hr eksperimenter så ingen sammenligning kan gjøres med dataene som presenteres her i figur 10A. Store forskjeller i Noda et al. Fremgangsmåten i forhold til hva som er vist i dette dokumentet omfatter: en 1 time kaldt bevaring i LPS-løsning før EVLP ble rotter innledningsvis ventilert med en gassblanding med isofluran å gjengi dem bevisstløs, ble perfusatet løsning supplert med 50 mg metylprednisolon og 50 mg av cefalosporin, total flow ble definert som 20% av det beregnede blodsirkulasjon, ble Perfusatprøver tatt bare etter lungen var blitt ventilert med 100% O2 i 5 minutter før, og forsøket ble kjørt i 4 timer.
Prøver tatt i løpet av eksperimentet fra perfusatet kan også bli analysert for mange formål. Som et eksempel, i figur 11 demonstrerer vi hvor høyt tidevolum / høy PEEP ventilasjon kan indusere en pro-inflammatorisk respons i 60 min. For disse eksperimentene, perfusatet fra 4 rotter ventilert henhold skadelige betingelser, dvs. høy tidevolum på 10 ml / kg og høy PEEP på 8 CMH 2 O, ble analysert for pro- og anti-inflammatoriske cytokiner IL1β, TNFa og IL4 ved bruk av standard ELISA-teknikker. Som vist i figur 11, sammenlignet med cytokin-nivåer før ventilering (0 min), 60 min på skadelig ventilasjon førte til en statistisk signifikant økning i IL-1β og TNFa (pro-inflammatoriske cytokiner) a nd ingen endring i IL-4 (anti-inflammatorisk cytokin) konsentrasjon. Derfor er dette EVLP systemet i stand til å generere lungeskade profiler ofte observert i løpet mekanisk ventilasjon.
Figur 1. Diagram og fotografi av små dyr ex-vivo lunge perfusjon (EVLP) krets. Bokstaver i diagrammet matche opp med bokstaver i fotografiet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Alle svingere er godt festet i kontrollbokser."> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. rotte operasjonsbordet er sikkert satt opp ved siden av ex vivo lunge perfusjon (EVLP) krets. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. (A) Et snitt er gjort kranialt for å eksponere trakea. Brysthulen er ikke utsatt. (B) En silke sutur er plassert bak luftrøret. (C) Luftrøret er delvis skåret for å forberede kanylering. (D) Luftrøret kanyle plasseres i posisjonering n og sikret med en silke sutur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. (A) Den brysthulen er trukket tilbake for å gi tilgang til hjertet og lungene. (B) Forberedelse til å plassere sutur bak lungearterien. (C) Den lungearterien kanylert og bundet med den tidligere plassert silke sutur. (D) En lav K + elektrolytt løsning skylles gjennom lungearterien og ut i venstre atrium for å fjerne eventuelle blodpropper. Klikk her for å se et større versjon av denne figur.
Figur 6. Økning av pulmonal arteriell flyt når du skyller lungen kan føre til at lungearterietrykket å øke dramatisk. Hvis kanylering ble utført riktig, og det er ingen store blokkering, trykket bør reduseres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .
Figur 7. Silk sutur er plassert rundt hele hjertet i forberedelse til venstre atrium kanylering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
n-side = "always"> 
Figur 8. Den venstre atrium kanylen er på plass med en silke sutur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9. (A) Lungearterien kanyle er forbundet med den ex-vivo lunge perfusjon krets. (B) Den esophagus blir klemt fast og bindevevet er rett ut dissekert for å fjerne hjerte-lunge-bloc. (C) Et hjerte-lunge-blokken er fjernet fra brysthulen, og plassert i ex-vivo lunge perfusjon krets. (D) Den venstre atrium er koblet til ex vivo lunge perfusjon krets. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig9large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10. (A) Lung vekten av Sprague Dawley hannrotter ved 60 min for ex vivo lunge perfusjon (n = 10). (B) lungearterietrykket av Sprague Dawley hannrotter ved 60 min for ex vivo lunge perfusjon (n = 12). (C) Lunge vaskulær motstand av Sprague Dawley rotter gjennom 60 min av ex vivo lunge perfusjon (n = 12), indikerer NS ingen statistisk signifikant forskjell. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
"Figur 11" src = "/ files / ftp_upload / 52309 / 52309fig11highres.jpg" />
Figur 11. Effekt av 1 time ventilasjon ved høye tidevolum (10 ml / kg) og høy PEEP (8 CMH 2 O) på pro- og anti-inflammatoriske cytokin-konsentrasjoner i perfusatet. N = 4, * angir statistisk signifikant forskjell respekt til 0 hr prøve (p <0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 12. (A) En riktig ventilasjon og perfusert lunge koblet til EVLP krets. (B) Høy positiv end-ekspiratorisk trykk (PEEP) forårsaker en rift på luftrøret delinger forårsaker bobler å danne på skaden og fylle den kunstige thorax. es / ftp_upload / 52309 / 52309fig12large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 13. (A) lungearterien kanyle. Denne kanyle er mindre enn den venstre atrium kanyle. (B) Venstre atrium kanyle. Denne kanyle er mye større enn lungearterien kanyle. (C) Trachea kanyle. Dette kanyle har ribbe til hjelp i å sikre luftrøret med silke sutur. Den enden som er satt inn i luftrøret er også litt spiss for å hjelpe til å sette kanylen inn i luftrøret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
09fig14highres.jpg "/>
Figur 14. (A) Hjertet apex er holdt av en pinsett som høyre hjertekammer er i ferd med å bli radert for å cannulate lungearterien. (B) Utvidelse av mitralklaffen ringrommet med et par små buttendede pick-ups gjør det enklere å visualisere veiene inn i venstre atrium. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Systemovervåking
Hvilke ting ser ut når eksperimentet kjører godt:
Når kanyler har blitt plassert i kretsen og lungene er ventilerende, det er flere måter å sikre at systemet fungerer som det skal. Det bør ikke være noen lekkasjer av perfusatet hele linjen. Pulmonal vaskulær motstand (PVR) bør holde seg relativt konstant (forutsatt en konstant flyt). Oksygen utveksling bør øke når respiratoren fungerer og utvide lungene å rekruttere flere alveolene for gassutveksling. Figur 12A viser godt ventilert og perfundert lungene koblet til EVLP krets inne i kunstig thorax.
Hvilke ting ser ut når eksperimentet ikke kjører godt:
Det er noen vanlige problemer som har hatt den høyeste frekvensen av forekomsten i løpet av begynnelsen stadier av en EVLP eksperiment. Den første og enkleste to rette er en lekkasje i linjen spennende fra lungene. Dette er merkbar ved et basseng av perfusat pooling henhold del av kretsen og nivået i reservoaret stadig minkende. Kontroller og trekk til eventuelle rørforbindelser rundt utslippsområdet og inspisere selve røret for en lekkasje. Hvis denne lekkasjen skjer før lungen, kan det også innføre bobler inn i lungen. Dette bør rettes opp så raskt som mulig som luftbobler i perfusatet vil resultere i skade på vev og forårsake en betydelig økning av PVR. Det kan også være en lekkasje som kommer fra lunge, eller en av kanyler. Dette kan være forårsaket av enten glidning av en kanyle eller en hindring i spennende linje forårsaker en trykkoppbygging. Inspisere posisjonen for begge kanyler for å sikre verken har glidd eller vridd. PA press bør også overvåkes i løpet av denne prosessen, fordi en umiddelbar økning i PA press er et åpenbart tegn på at en hindring av noe slag nylig har skjedd. Figur 12Bviser en sprukket lunge som sprukket på grunn av høyt trykk. En lekkasje fra lungen i seg selv kan også være forårsaket av en rift i vevet. Dette problemet kan eller ikke kan være repareres men reposisjonering og den trekkes til kanyler er det beste alternativet i dette scenariet.
Key Learning poeng / Muligheter:
Prøving og feiling utviklingen av ex-vivo lunge perfusjon systemet har tillatt oss å identifisere flere sentrale problemstillinger som vi skisserer her for å legge til rette for effektiv implementering av EVLP system. Først når det gjelder innkjøp, er det viktig at standard anestesiteknikker blir fulgt til riktig bedøve dyrene (nok anestesi, injeksjon i peritoneum) og feste til alle IACUC politikk er nødvendig. Kanylene (vist i figur 13 A, B og C) skal tømmes gjentatte ganger for å fjerne eventuelle koagulere og / eller avfall i lunge vasculature. Med hensyn til dyr utvalg, foreslår vi at du bruker Sprague Dawley eller Lewis rotter som veier 250-350 g. Spesiell forsiktighet bør utvises når kanylerør rotter som veier nær 250 g siden fartøyene vil bli mindre og derfor mye vanskeligere å cannulate uten å skade blodkar. Hvis mindre rotter, eller en musemodell, skal anvendes, kan mindre kanylen trenger å bli brukt.
Trakeal kanylering er ikke vanligvis utfordrende så lenge suturen er festet på riktig måte ved først å føre en silkesutur posterior til luftrøret etter at dissekere de omkringliggende fascia og før kanylering. Følg dette med en anterior snitt 1-2 luftrørsringer over sutur å passere kanylen. Knytte kvadrat knop i mellom luftrørsringer for å sikre den innen en groove for bedre sikkerhet (Figur 4C). Kanylering av lungearterien (PA) er mer krevende sammenlignet med trakeal kanyle. Følgende trinn ble brukt i denne studienfor denne prosedyren. Først, ta tak i hjertet apex med en pinsett. Passere en annen pinsett i tver sinus og tråden en sutur for å feste kanylen i den proksimale PA. Incise høyre ventrikkel umiddelbart før den høyre ventrikkel utløpskanalen (RVOT) (figur 14A). Etter snitt i RVOT, vil kanylen føres inn i lungearterien utløpskanalen. Å ha sutur i posisjon bak lungearterien / aorta før retten ventriculotomy øker effektiviteten (figur 5C). Kanylen skal festes på plass med sutur for å forhindre løsner. En stor komplikasjon kan oppstå hvis PA kanylen ikke er i korrekt anatomisk orientering. Kanylen kan settes inn for langt og bare perfuse en gren eller bli mal-plassert med vridning av hjerte-lunge-prøven ved fjerning fra brysthulen. Dette kan lett rettes tilbake til den opprinnelige stilling for å bevare den riktige vinkel på anatomical posisjon. Endelig er Venstre atrial (LA) kanylering den mest utfordrende delen av prosedyren. LA kanyle må plasseres innenfor venstre atrium. Med vev være ekstremt sprøtt, være oppmerksom på å ikke bruke betydelig kraft eller vridning for å unngå en tåre i lungevenen og venstre atrium som da ville gjøre eksperimentet unsalvageable. PA kanyle er best plassert før LA kanyle. En venstre ventriculotomy med fjerning av spissen har vist seg å forstyrre cordae tendinae og tillater lettere adgang gjennom mitral brosjyrer. Dessuten gjør den ventriculotomy det lettere å strekke og visual mitralklaffen og å mate kanylen gjennom mitralklaffen. Utvidelse av mitralklaffen ringrommet med et par små buttendede pick-ups kan gjøres for å visualisere veiene inn i LA (Figur 14B). Sutur bør plasseres bak hjertet før kanylering. Dette kan gjøres ganske enkelt ved å løfte hjertet opp ved hjelp av et par av small buttendet pick-ups og plassere sutur under og over hjertet. LA er nå klar til å bli kanulert. Mate LA kanyle gjennom pick-ups for å visualisere plasseringen av kanylen inn i venstre atrium. Vis forsiktighet for ikke å løsne kanylen tilbake inn i venstre hjertekammer. Suturen skal da være tett festet langs myokard av venstre ventrikkel. Sikring av suturen til venstre atrium kunne tilstoppe hele eller en del av kanylen.
I løpet av fremgangsmåten, er det viktig at ingen luft forbli i innstrømningsseksjonen i anordningen. Enhver betydelig luft kan produsere en luft emboli øke PVR (effektivt en "air-lock") som vil resultere i et mye lavere perfusat strømning for et gitt trykk. Forskjellige punkter kan benyttes for å fjerne luft i systemet. Luft inne i utløpsseksjonen er forventet, og bør ikke ha noen skadelig effekt på lungene. En grisemodell for pulmonal hypertensjon har værtvist seg å gjenskape patologi fra kontinuerlige små mengder luft over en 8-ukers periode. Den økte luft reduserer mengden av perfusjon stede mens forårsaker betennelse i omliggende vev 19.
Initiering av perfusjon kan oppstå når kanylering er fullført, men før røret kommer fra LA er forbundet med EVLP linje. Perfusatet bør kjøres gjennom å tømme ut eventuelle blodpropper og dette perfusatet kan tømmes i brystveggen uten noen problemer. Bytte perfusatet pumpe til manuell modus og langsomt øke strømningshastigheten til ~ 2 ml / min gir mulighet for tett oppfølging av PA press. Presset mer enn 20-30 CMH 2 O kan indikere en obstruksjon og ser for perfusatet avslutter LA er også en indikator, men dette kan være svært vanskelig å se. Hvis trykket øker til over 20-30 CMH 2 O, stoppe pumpen og kontroller både cannulations. Så snart trykket er konstant rundt 10-20 CMH 2 O tillate the perfusatet for å løpe gjennom og inn i brysthulen i 2 min. På dette tidspunkt linjen fra LA kan være koblet til EVLP krets. Perfusatet pumpehastigheten kan økes til 5-10 ml / min. Ettersom fluidet hodet går gjennom kretsen, vil det være en økning i trykket PA grunn av økningen i høyden av væsken hodet og derfor det statiske trykk. Hvis fluidet ikke kan strømme over det høyeste punkt i linjen, kan det være nødvendig å enten anvende en sugekraft på den motsatte enden av linjen eller forsøke å senke det høyeste parti av ledningen. Når dette problemet er overvunnet, bør perfusatet sirkulere uten noen problemer.
Noen problemer skal overvåkes med hensyn til respiratoren. For det første kan vridning av bronkiene / luftrør og hjerte-lungeposisjon oppstå som lungene blir mer ødematøse og vekten øker. Det er viktig for kanyler til å forbli i en relativt tett anatomisk posisjon, og derfor endre den ene eller begge kanylee kan være nødvendig. Trykk eller volum kontrollert vifter samt positiv eller negativ ventilasjon kan brukes med denne EVLP system. For rottemodellen, har vi funnet ved hjelp av positivt trykk, volum kontrollert ventilasjon fungerer godt på tidevolum mellom 4-10 ml / kg og på positive end-ekspiratorisk trykk (PEEP) mellom 2-8 CMH 2 O. Imidlertid kan en PEEP av 8 CMH 2 O forårsake et mulig brudd på delinger av luftrøret. Etter hvert forsøk (eller sett av eksperimenter hvis det utføres back-to-back), ventilasjonslinje som fører til luftrøret bør rengjøres av noen bronchoalveolar lavage (BAL) væske som kan ha reist opp luftrøret. Denne væsken vil stivne hvis urørt og kan helt blokkere ventilasjons linje.
Perfusatet sammensetningen er kritisk for en vellykket EVLP eksperiment. En 5% dekstran blandingen muliggjør lunge perfusjon som er nær fysiologiske betingelser, opprettholder en stabil kolloidosmotiske trykk for å drive fluidet back inn i vaskulaturen til å hindre ødem og forhindrer trombose i de pulmonale fartøy. Det er viktig å merke seg at noen arter av rotter kan være allergisk mot dekstran som kan forårsake lungeødem 20. Innholdet i perfusatet var uendret i alle forsøksgrupper i denne studien, derfor dekstran innholdet bør ikke være en confounder. Det kolloidosmotiske trykk er en kritisk variabel som har potensiale til å forbedre eller frem vev ødem. Kommersielt tilgjengelige perfusjon oppløsninger som er optimalisert for kaldt statisk lagring eller normotermisk perfusjoner er blitt brukt i dette systemet for å øke lunge levedyktighet ganger. Vi merker oss at noen av disse løsningene inneholde albumin og en bekymring er muligheten for bovint serumalbumin utløser en inflammatorisk respons i gnagere lungen. Selv om optimal perfusat sammensetning er en kontinuerlig gjenstand for undersøkelse, må perfusatet for å ta hensyn til den kolloidosmotiske trykk, det osmotiske trykk og bufferkapasitet. We anbefalt at løsningen være basert på en modifisert Krebs-Henseleit-løsning eller cellekulturmedier. Den Kolloidosmotisk Trykket skal vedlikeholdes av dekstran eller albumin, avhengig av programmet. Perfusjon trykk og strømningshastighet påvirker organ og supra fysiologisk perfusjon parametere kan gjøre det organ utsatt for mekanisk traume.
Visuelle indikatorer under Experiment:
Det er mange visuelle signaler samt indikasjoner fra sanntidsdata som kan brukes til å avgjøre om en EVLP eksperiment kjører godt. Lungen vil forbli den samme størrelse, og vil deflate til samme volum etter hvert åndedrag. Det vil heller ikke være noe som lekker fra lungen i seg selv. PVR, lunge vekt, og etterlevelse vil holde seg relativt konstant. Oksygenproduksjonen vil være konstant eller øke litt.
Det finnes mange visuelle indikatorer når lungen blir kompromittert i løpet av et eksperiment. Lunge blir ødematøst ennd raskt vokser i størrelse og vekt. Fargen på lungeforandringer (fra en tan-rosa til hvitt) og lommer av væske kan identifiseres i vevet. Hvis luftrøret eller lunge brudd fra barotraume eller eldre oppblåsthet, vil det bli bobler fra det punktet av skade (Figur 12B). Oksygenproduksjonen vil reduseres og PVR og etterlevelse vil dramatisk øke også.
Potensialet i å bruke en EVLP modell på små dyr som gnagere åpner døren for fremtidige studier bedre behandling av lungetransplantasjoner. Imidlertid liten dyremodellen krever en bedre forståelse for å etterligne en virkelig lungetransplantasjon. Denne modellen kan benyttes i fremtiden for å forbedre medisinske behandlinger og definere utgangsverdier for fremtidige lungetransplantasjonsstudier.
Disclosures
None
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne assistanse fra Harvard Apparatus, spesielt Stephanie Pazniokas, MS (Physiology Systems & Regenerative Medicine) for deres hjelp i kretsstevne, modifikasjon og feilsøking av perfusjon krets og XVIVO Perfusjons (Daniel Martinelli, CCP, CTP) for gi ikke-klinisk bruk lunge plegia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPL-2 Basic Lung Perfusion System | Harvard Apparatus | ||
| Tweezer #5 stainless steel, curved 11 cm | Kent Scientific Corporation | IND500232 | |
| Tweezer #5 Dumostar, 11 cm | Kent Scientific Corporation | INS500085-A | |
| Tweezer #7 Titanium, 12 cm tips curved | Kent Scientific Corporation | INS600187 | |
| McPherson-Vannas Scissors 8 cm, Str 5 mm | Kent Scientific Corporation | INS14124 | |
| Vannas Scissors 8 cm Str 5 mm | Kent Scientific Corporation | INS14003 | |
| Instrument Sterilization Tray 5" x 7" | Kent Scientific Corporation | INS800101 | |
| Heparin 30,000 units per 30 ml | APP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
| Ketamine 500 mg per 5 ml | JHP Pharmaceuticals | Supplied from OSU Pharmacy | |
| Xylazine 100 mg per 1 ml | Akorn | Supplied from OSU Pharmacy | |
| 10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle | B-D | 309301 | |
| Hyflex NBR | Ansell | S-17310M | Bite proof gloves |
| BL1500 | Sartarius | Practum 1102-1S | Scale |
| Large Flat Bottom Restrainer | Braintree Scientific Inc | FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat | Rat tunnel for injection |
| Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large | Kiberly-Clark | 50708 | |
| Rapidpoint 405 | Siemens | blood gas analyzer | |
| Fiberoxygenator D150 | Hugo Sachs Elektronik | PY2 73-3762 | |
| LabChart v7.3.7 | ADInstruments | ||
| Tracheal cannula | Harvard Apparatus | 733557 | |
| Pulmonary Artery cannula | Harvard Apparatus | 730710 | |
| Left Atrium cannula | Harvard Apparatus | 730712 | |
| Peristaltic Pump | Ismatec | ISM 827B | |
| Small Animal Ventilator model 683 | Harvard Apparatus | 55-000 | |
| Ecoline Star Edition 003, E100 | Lauda | LCK 1879 | Water Heater |
| Tubing Cassette | Cole-Parmer | IS 0649 | |
| Connect kit D150 | Cole-Parmer | VK 73-3763 | |
| PowerLab 8/35 | ADInstruments | 730045 | |
| TAM-A transducer amplifier module type 705/1 | Hugo Sachs - Harvard Apparatus | 73-0065 | |
| TAM-D transducer amplifier type 705/2 | Hugo Sachs - Harvard Apparatus | 73-1793 | |
| SCP Servo controller for perfusion type 704 | Hugo Sachs - Harvard Apparatus | 732806 | |
| CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 | Hugo Sachs - Harvard Apparatus | 731747 | |
| VCM ventilator control module type 681 | Hugo Sachs - Harvard Apparatus | 731741 | |
| TCM time control module type 686 | Hugo Sachs - Harvard Apparatus | 731750 | |
| IL2 Tube set for perfusate | Harvard Apparatus | 733842 | |
| Tube set for moist chamber | Harvard Apparatus | 73V83157 | |
| Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID | Harvard Apparatus | 721017 | perfusate line entering lung |
| Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID | Harvard Apparatus | 721019 | perfusate line leaving lung |
| low potassium dextran glucose solution | flushing the lung |
References
- United States Organ Transplantation, Organ Procurement and Transplantation Network & Scientific Registry for Transplant Recipients Annual Report 2011. , Available from: http://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2011 (2011).
- Maathuis, M. H., Leuvenink, H. G., Ploeg, R. J. Perspectives in organ preservation. Transplantation. 83, 1289-1298 (2007).
- Cardoso, P. F. New perspectives in lung transplantation: from conventional preservation to ex vivo lung perfusion and lung reconditioning. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 35, 1057-1059 (2009).
- DeCampos, K. N., Keshavjee, S., Liu, M., Slutsky, A. S. Optimal inflation volume for hypothermic preservation of rat lungs. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 17, 599-607 (1998).
- Perrot, M., et al. Report of the ISHLT Working Group on Primary Lung Graft Dysfunction part III: donor-related risk factors and markers. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 24, 1460-1467 (2005).
- Mulloy, D. P., et al. Ex vivo rehabilitation of non-heart-beating donor lungs in preclinical porcine model: delayed perfusion results in superior lung function. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 144, 1208-1215 (2012).
- Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 45, e54-e60 (2014).
- Perrot, M., Liu, M., Waddell, T. K., Keshavjee, S. Ischemia-reperfusion-induced lung injury. American journal of respiratory and critical care medicine. 167, 490-511 (2003).
- Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. The Lancet. 357, 825-829 (2001).
- Perrot, M., et al. Strategies to optimize the use of currently available lung donors. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 23, 1127-1134 (2004).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 27, 1319-1325 (2008).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 9, 2262-2269 (2009).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. The New England journal of medicine. 364, 1431-1440 (2011).
- Cypel, M., et al. Normothermic Human Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) for Improved Assessment of Extended Criteria Donor Lungs for Transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28, S126-S126 (2009).
- Sanchez, P. G., et al. Normothermic Ex Vivo Lung Perfusion as an Assessment of. Marginal Donor Lungs - The NOVEL Lung Trial. J Heart Lung Transpl. 32, S16-S17 (2013).
- Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation proceedings. 42, 444-447 (2010).
- Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: technique and application in lung preservation studies. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 36, 490-493 (2010).
- Niemeier, R. W. The isolated perfused lung. Environmental health perspectives. 56, 35-41 (1984).
- Zhou, X., et al. A pulmonary hypertension model induced by continuous pulmonary air embolization. The Journal of surgical research. 170, e11-e16 (2011).
- Harris, J. M. Differences in responses between rat strains and colonies. Food and cosmetics toxicology. 3, 199-202 (1965).
