באפיון פונקציונלי מבחנה של עכבר המעי הגס מביא Endings
Summary
This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.
Abstract
וידאו זה מדגים בפירוט פרוטוקול במבחנה חד-סיבי אלקטרו הקלטה באמצעות הכנת colorectum עצבים עכבר. הגישה מאפשרת זיהוי משוחד ואפיון פונקציונלי של afferents מעי גס בודדת. הקלטות תאית של פוטנציאלים מופצים פעולה (APS) שמקורם אחד או כמה מביא (כלומר, חד-סיבים) שדות פתוחים (RFS) בcolorectum עשויים מסיבי עצב fascicles הקניט. Colorectum מוסר גם עם האגן (PN) או עצב splanchnic המותני (LSN) מצורף ופתח longitudinally. הרקמה ממוקמת בחדר הקלטה, הצמיד את שטוח וperfused עם פתרון קרבס מחומצן. גירוי חשמלי מוקד משמש כדי לאתר את קצוות מביא המעי הגס, אשר נבדקו על ידי שלושה נוספות גירויים מכאניים שונים (להקהות חיטוט, ליטוף הרירי ומתיחה היקפית) לסווג תפקודי afferents לחמש mechanosensiשיעורים מופרזים. סופים מגיבים לאף אחד מגירויים מכאניים אלה מסווגים כafferents מכאנית שאינו רגישה ל( נעדרים). שני mechanosensitive והנעדרים ניתן להעריך ולרגישות (כלומר תגובה משופרת סף,, מופחת, ו / או רכישה של mechanosensitivity) על ידי חשיפה מקומית של RFS לכימיקלים (למשל, מרק דלקתי (IS), קפסאיצין, אדנוזין טריפוספט (ATP)). אנו מתארים את הציוד והכנת הקלטת colorectum עצבים, קציר של colorectum עם PN המצורף או LSN, זיהוי של RFS בcolorectum, ההקלטה חד-סיבים מfascicles העצב, ויישום מקומי של כימיקלים לRF. בנוסף, אתגרים של ההכנה והיישום של גירוי מכאני סטנדרטי גם דנו.
Introduction
כאב ורגישות יתר הם התלונות העיקריות של חולים הסובלות מהפרעות תפקודיות במערכת העיכול, כוללים תסמונת מעי רגיז (IBS), אשר קיימים בהעדר הסיבה הנראית לעין pathobiological או נזק לרקמות. לדוגמא, חולי IBS להפגין רגישות יתר, כולל תגובות מוגברות להתנפחות בלון רקטלית ורגישות מוגברת במהלך פעולת מעיים רגילה, כמו גם רגישות יתר של הפניה גופנית (כלומר, רגישות למישוש באזור הבטן) 1. בגלל מיקוד afferents מעי גס הוכיח להיות יעיל בהקלת כאב ורגישות יתר בחולי IBS (למשל, החדרה תוך-רקטלי בהרדמה מקומית 2,3; בליעה דרך הפה של linaclotide guanylate cyclase-C אגוניסט 4-6) הבנה, שיפור של עצבוב מביא של colorectum חשוב.
afferents הקרביים, כולל afferents מעי גס, הם מסוגלים להגיב לשיטות כימיות / nutrient- ותרמית (למשל, 7-9). עם זאת, afferents הקרביים להגיב לגירויים מכאניים (כלומר, afferents mechanosensitive) הייתה נחקר ביותר ביסודיות כי גירויים מכאניים (למשל, התנפחות luminal, מתיחה) הם אלה שבדרך כלל להצמיח תחושות מודעים, כוללים אי נוחות וכאב 10-16. בנוסף, את הקרביים גם innervated ידי afferents מכאנית רגישה (נעדרים), בדרך כלל מכונים nociceptors שקט או שינה 17. בתנאים פיסיולוגיים נורמלים, נעדרים אינם מגיבים לגירוי מכאני או שיש לי גבוהה מאוד תגובת ספי 18, אבל יכולים להיות פעיל ולרכוש mechanosensitivity בתנאי pathophysiological ולתרום לרגישות יתר.
שימוש בהכנה במבחנה והפרוטוקול המתוארת כאן, שפיתחנו ומועסקים אסטרטגית גירוי חשמלית לים rch לסופים פתוחים, המאפשרים זיהוי משוחד של שני קצות mechanosensitive וMIA בcolorectum 19. עצבוב המעי הגס נובע מsplanchnic המותני (LSN) ומסלולי עצבים אגן (PN), וכולל afferents מעי גס שיכול להיות מסווגת לחמש כיתות mechanosensitive (serosal, ריריים, שרירים, שרירי-רירית, mesenteric) ואחד בכיתה MIA 20. שימוש בתכשיר זה במבחנה, מצאנו כי mechanosensitivity רכש נעדרי מעי גס (רגישות) בעקבות חשיפה קצרה של השדות פתוחים שלהם למרק דלקתי (IS), אשר רגיש 71% מנעדרים במסלול PN ו -23% מנעדרים במסלול LSN 19. אנחנו גם תיעדנו רגישות לטווח ארוך (עד 28 יום) של נעדרים בהקשר של רגישות יתר לטווח ארוך התנהגות קרביים (כלומר, בעכברים שקבלו טיפולי intracolonic עם zymosan 21 או חומצת 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic (TNBS) 22) .
jove_content "> בין afferents mechanosensitive, afferents שרירים ושרירים-הרירית הם השיעורים היחידים שtonically לקודד מתיחה היקפית של colorectum (כלומר, הם מתיחה רגישה) וsubserve הקידוד של התנפחות מעי גס רעיל 23,24. שימוש במחשב שבשליטה כוח מפעיל, אנחנו מוחלים סטנדרטיים ואחידים, ולמתוח ramped לשחזור בכיוון ההיקפי של רקמת המעי הגס השטוחה ומסווגים נוסף afferents למתוח רגיש כנמוך סף וגבוה סף 23. בנוסף, במהלך הרגישות של הזמן למתוח afferents -sensitive לאחר zymosan intracolonic 21 או 22 TNBS טיפול מתאים לתחילה, ההתמדה, ו / או ההתאוששות של רגישות יתר קרביים התנהגות, המצביעה על תפקידו של מעי גס afferents למתוח רגיש בכאב ורגישות יתר קרביים.Protocol
Representative Results
Discussion
בהכנת colorectum העצבים מבחנה המתוארת כאן הוכיחה להיות גישה רבת עוצמה כדי לחקור פונקציות קידוד עצביות של מעי גס afferents בודדת, אשר יפה משלימה גישות אחרות שאינם פונקציונליות (למשל מחקרים, סלולריים, מולקולריים, והיסטולוגית) על עצב סנסורי קרביים ( ראה סקירה 27</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH award R01 DK093525 (GFG). We greatly appreciate the scientific review and grammatical editing of the manuscript by Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) and thank Michael Burcham for assistance in preparation of figures.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Leica MZ16 stereo microscope | Leica Microsystems Inc. | ||
| Leica IC D camera | Leica Microsystems Inc. | ||
| Amplifier | World Precision instruments, Inc. | SYS-DAM80 | Low-noise differential amplifier |
| Two-compartment tissue chamber | Custom made | ||
| Power1401 | Cambridge Electronic Design Limited | Power1401 | Data acquisition, analog signal input/out |
| Spike2 v5.02 | Cambridge Electronic Design Limited | Software package that works with the Power1401 | |
| Audio monitor | Natus | Am 8 | |
| Square pulse stimulator | Natus | S48 | To deliver electrical stimuli |
| Photoelectric isolation unit | Natus | PSIU6 | Stimulus isolation to reduce noise |
| Concentric bipolar microelectrode | FHC Inc. | CBFFG75 | To deliver electrical stimuli |
| Dual-mode lever system | Aurora Scientific Inc. | Series 300C | To deliver mechanical stimuli |
| forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | forceps with fine tips |
References
- Naliboff, B. D., et al. Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome. Gut. 41, 505-512 (1997).
- Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia by local rectal anesthesia in irritable bowel syndrome (IBS) patients. Pain. 105, 223-230 (2003).
- Verne, G. N., Sen, A., Price, D. D. Intrarectal lidocaine is an effective treatment for abdominal pain associated with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. Journal of Pain. 6, 493-496 (2005).
- Chey, W. D., et al. Linaclotide for irritable bowel syndrome with constipation: a 26-week, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate efficacy and safety. Am J Gastroenterol. 107, 1702-1712 (2012).
- Rao, S., et al. A 12-week, randomized, controlled trial with a 4-week randomized withdrawal period to evaluate the efficacy and safety of linaclotide in irritable bowel syndrome with constipation. Am J Gastroenterol. 107, 1714-1724 (2012).
- Busby, R. W., et al. Pharmacologic properties, metabolism, and disposition of linaclotide, a novel therapeutic peptide approved for the treatment of irritable bowel syndrome with constipation and chronic idiopathic constipation. J Pharmacol Exp Ther. 344, 196-206 (2013).
- Mei, N. Intestinal chemosensitivity. Physiol Rev. 65, 211-237 (1985).
- Mei, N., Lucchini, S. Current data and ideas on digestive sensitivity. J Auton Nerv Syst. 41, 15-18 (1992).
- Su, X., Gebhart, G. F. Mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat are polymodal in character. J Neurophysiol. 80, 2632-2644 (1998).
- McMahon, S. B., Morrison, J. F. Spinal neurones with long projections activated from the abdominal viscera of the cat. J Physiol. 322, 1-20 (1982).
- Cervero, F., Sann, H. Mechanically evoked responses of afferent fibres innervating the guinea-pig’s ureter: an in vitro study. J Physiol. 412, 245-266 (1989).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Mechanosensitive properties of pelvic nerve afferent fibers innervating the urinary bladder of the rat. J Neurophysiol. 72, 2420-2430 (1994).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71, 2046-2060 (1994).
- Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. Activation of unmyelinated afferent fibres by mechanical stimuli and inflammation of the urinary bladder in the cat. J Physiol. 425, 545-562 (1990).
- Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. A novel type of unmyelinated chemosensitive nociceptor in the acutely inflamed urinary bladder. Agents Actions. 25, 219-221 (1988).
- Brierley, S. M., Jones, R. C., Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127, 166-178 (2004).
- Meyer, R. A., Davis, K. D., Cohen, R. H., Treede, R. D., Campbell, J. N. Mechanically insensitive afferents (MIAs) in cutaneous nerves of monkey. Brain Res. 561, 252-261 (1991).
- Handwerker, H. O., Kilo, S., Reeh, P. W. Unresponsive afferent nerve fibres in the sural nerve of the rat. J Physiol. 435, 229-242 (1991).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G170-G180 (2011).
- Feng, B., La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G1085-G1098 (2012).
- Feng, B., et al. Long-term sensitization of mechanosensitive and -insensitive afferents in mice with persistent colorectal hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G676-G683 (2012).
- Feng, B., et al. Altered colorectal afferent function associated with TNBS-induced visceral hypersensitivity in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G817-G824 (2012).
- Feng, B., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Differential roles of stretch-sensitive pelvic nerve afferents innervating mouse distal colon and rectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298, G402-G409 (2010).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33, 9831-9839 (2013).
- Jolliffe, I. T. . Principal component analysis. , (2002).
- La, J. H., Feng, B., Schwartz, E. S., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Luminal hypertonicity and acidity modulate colorectal afferents and induce persistent visceral hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G802-G809 (2012).
- Christianson, J. A., et al. plasticity and modulation of visceral afferents. Brain Research Reviews. 60, 171-186 (2009).
- Kiyatkin, M. E., Feng, B., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Combined genetic and pharmacological inhibition of TRPV1 and P2X3 attenuates colorectal hypersensitivity and afferent sensitization. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G638-G648 (2013).
- Brumovsky, P. R., Feng, B., Xu, L., McCarthy, C. J., Gebhart, G. F. Cystitis increases colorectal afferent sensitivity in the mouse. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297, G1250-G1258 (2009).
- Shinoda, M., Feng, B., Gebhart, G. F. Peripheral and central P2X receptor contributions to colon mechanosensitivity and hypersensitivity in the mouse. Gastroenterology. 137, 2096-2104 (2009).
- Tanaka, T., Shinoda, M., Feng, B., Albers, K. M., Gebhart, G. F. Modulation of visceral hypersensitivity by glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α-3 in colorectal afferents. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G418-G424 (2011).
