Abstract
이 비디오 상세히 마우스 대장 직장 - 신경 제제를 사용하여 시험 관내 전기 생리 단일 섬유 기록 프로토콜을 설명한다. 접근 방식은 편견 식별 및 개별 대장 구 심성의 기능을 특성화 할 수 있습니다. 하나 또는 몇 심성에서 발생하는 전파 활동 전위 (APS)의 세포 외 녹음 (즉, 단일 섬유) 대장 직장에서 수용 필드 (RI의)을 조롱 신경 섬유 다발로 만들어진다. 대장 직장은 골반 (PN) 또는 요추 내장의 (LSN) 신경 부착 길이 방향으로 열 중 하나를 제거한다. 조직 플랫 피닝 및 산소화 크렙스 용액으로 관류, 기록 챔버에 배치된다. 초점 전기 자극은 기능적으로 다섯 mechanosensi에 구 심성을 분류 (프로빙 점막 쓰다듬어 원주 스트레칭을 무디게) 더 세 가지 기계적인 자극에 의해 테스트 대장 구 심성 엔딩을 찾는 데 사용됩니다적인 클래스를 제공합니다. 이러한 기계적 자극 없음에 응답 엔딩 기계적으로 문자를 구분 구 심성 (실종자)으로 분류됩니다. 화학 물질에 대한 RI의 지역화 된 노출에 의해 mechanosensitive 및 실종자가 과민 반응 (즉, 향상된 응답 감소 임계 값 및 / 또는 mechanosensitivity의 취득)에 대한 평가 될 수는 모두 (예를 들어, 염증 수프 (IS), 캡사이신, 아데노신 삼인산 (ATP)). 우리는 장비와 대장 직장 - 신경 기록 준비, 부착 PN 또는 LSN, 신경 다발에서 대장 직장, 단일 섬유 녹음에 RI의 식별과 대장 직장의 수확 및 RF에 화학 물질의 지역화 된 응용 프로그램을 설명합니다. 또한, 표준화 된 제조 기계적 자극의 적용 과제도 논의된다.
Introduction
통증 과민 명백 병인 학적 원인이나 조직 손상의 유무에 존재 과민성 대장 증후군 (IBS)을 포함하여 위장 기능 장애로부터 고통받는 환자의 주된 불만이다. 예를 들어, IBS 환자 (복부의 촉진에 즉, 부드러움) 정상적인 장 기능 동안 직장 풍선 팽창 증가 감도 높게 응답을 포함하는 과민 반응,뿐만 아니라 체세포 추천의 과민 반응을 나타내는 일. 의 개선 이해, 대장 구 심성을 대상으로하는 IBS 환자에서 (구 아닐 레이트 사이 클라-C의 효능 linaclotide 4-6 경구 섭취 예를 들어, 국소 마취제 2,3의 내 직장 점안을) 통증과 과민을 완화에 효과적 일 수 있기 때문에 대장 직장의 구 심성 신경 분포가 중요합니다.
대장의 구 심성을 포함하여 내장 구 심성,/ nutrient- 화학적 및 열적 양상 (예를 들면, 7-9)에 응답 할 수있다. 그러나, 기계적 자극 (즉, mechanosensitive 구 심성)에 응답 내장 구 심성이되었습니다 기계적 자극 (예를 들어, 내강 팽만, 스트레칭) 일반적으로 불편과 고통 10-16을 포함하여 의식이 감각에 야기 할 것들이기 때문에 가장 철저하게 연구했다. 또한, 내장은 일반적으로, 기계적으로 문자를 구분 구 심성 (실종자)에 의해 신경 지배를 자동 또는 자고 통각 수용기 (17)이라고합니다. 정상적인 생리 조건에서, 실종자는 기계적인 자극에 응답하거나 매우 높은 응답이 18 임계 값이 있지만 활성화 및 병태 생리 학적 조건에서 mechanosensitivity를 획득 과민 반응에 공헌 할 수 없습니다.
여기에 설명 된 시험 관내 제조 방법 및 프로토콜을 이용하여, 우리는 개발 바다 전기 자극 전략을 채용 대장 직장 (19) 모두 mechanosensitive 및 MIA 엔딩의 편견 식별을 가능하게 수용 엔딩에 대한 RCH. 대장 신경 분포는 요추 내장의 (LSN)과 골반 신경 (PN) 경로에서 파생 다섯 mechanosensitive 클래스 (장막, 점막, 근육, 근육 점막, 장간막) 한 MIA 클래스 (20)으로 분류 할 수있다 대장 구 심성을 포함한다. 이 체외 준비를 사용하여, 우리는 대장 실종자 인수 mechanosensitivity는 LSN 경로에 PN 경로에서 실종자의 71 %와 실종자의 23 %를 증감 염증 수프 (IS), 그들의 수용 필드의 짧은 노출 다음 (민감) 발견 19. 우리는 또한 오래 지속되는 행동 내장 과민 반응의 맥락에서 실종자의 장기 감작 (최대 28 일) 문서화 (모산 (21) 또는 2,4,6- 트리니트로 산으로 결장 내 치료를받은 쥐에서, 즉 (TNBS) 22) .
mechanosensitive 구 심성 신경, 근육과 근육 점막 구 심성 중 jove_content은 "> (즉, 스트레칭 구분) 및 유해 대장 팽만 (23, 24)의 인코딩을 보조하다 카나비노이드 대장 직장의 원주 스트레치를 인코딩 할 수있는 유일한 클래스입니다. 컴퓨터 제어를 사용하여 동력 액츄에이터, 우리는 평면화 대장 암 조직의 원주 방향의 표준, 균질하고 재현성 램핑 신축성을인가하고 상기 스트레치 성 구 심성을 낮은 임계치와 높은 임계치 (23)를 분류. 또, 신축성 감작를 시간 경과에 따라 결장 내 모산 21 TNBS (22) 치료 후 과민 구 심성은 내장 통증 및 과민 반응의 스트레칭에 민감한 대장 구 심성의 역할을 제안, 행동 내장 과민 반응의 시작, 지속, 및 / 또는 복구에 해당합니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고 :이 프로토콜을 검토하고 피츠버그 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었다.
수정 크렙스 솔루션 및 시험 약물 분취 1. 준비
- 117.9의 NaCl, 4.7 KCl을 25의 NaHCO3, 1.3의 NaH 2 PO 4, 황산 1.2, 2.5 CaCl2를 11.1 D 글루코오스, 2 소듐 뷰티 레이트, (20), 아세트산 나트륨 (mm 단위)가 포함 개질 크렙스 용액 6 L 만들기 0.004 니페디핀 (자발적인 근육의 수축을 차단하기 위해), 0.003 인도 메타 신 (indomethacin)은 (내인성 프로스타글란딘의 합성을 차단하기 위해). 각각 조직의 절개 및 단일 섬유 녹음, 얼음처럼 차가운 따뜻한 크렙스 솔루션을 사용합니다.
- 모든 화학 용액을 준비 (예를 들어, IS, 캅사이신, ATP) 원하는 농도로 분액.
대장 직장 - 신경 조직의 2 해부
- 마취 및 수컷 마우스 안락사 (6-8주 이전, 20~30g)에서를10 변위 유량 CO 2 실 - 생쥐까지 분당 챔버 체적의 30 %는 가슴 움직임의 부재로 나타내는 바와 같이 호흡 완전히 멈춘다.
- 즉시, 흉부 챔버를 개방 절단 우심방을 천공하고, 얼음처럼 차가운 크렙스의 충분한 볼륨 (~ 500 ml)에 마우스 시체를 침지 안락사,에게서 피를 뽑다 다음 (4 ° C) 솔루션은 carbogen (95 % O 2 버블 5 % CO 2).
- 조심스럽게 모든 내장 그러나 콜론과 골반 장기를 제거합니다. 약간 횡격막 위 T12 척추 분절에 걸쳐 반 마우스 횡단면과 빙냉 함유 해부 챔버에 꼬리 절반을 전송하고, 크렙스 용액을 버블.
- 실체 현미경 아래에서 요도에 자신의 접합에에 병행하여 방광 및 생식 기관을 제거하고 총장 골 동맥으로 분기합니다 때까지 하강 / 복부 대동맥을 제거합니다. PN 또는 surroundin에서 LSN 무료g의 무딘 절개하여 조직과 L6 및 S1 척추 (PN)에 열 또는 T13과 (LSN)에 L1 척추에 자사의 복부 진입 점까지 장골 외부에서 신경을 따릅니다.
- 치골 치골 좌우 비구 관절을 잘라 및 장골 뼈를 제거합니다. 신경이 척추를 입력 어디까지 대장 직장 가까이에서 첨부 된 근육과 결합 조직에서 하나 PN 또는 LSN 조심스럽게 무료.
- 조심스럽게 원위부 대장 직장을 노출 장골 뼈를 절제. 연속체에 부착 된 PN 또는 LSN과 원위부 대장 직장을 해부하다.
- 티슈 챔버의 욕조에 부착 함과 함께 신경 대장 직장 전송. 더 해부 과도한 결합 조직을 제거하고 방지 장간막 국경을 따라 길이 방향으로 대장 직장을 엽니 다.
- 이 위를 향하도록 점막면, chambe의 실리콘베이스에 기록 구획에 인접한 대장 직장의 장간막 가장자리를 고정R 및 힘은 액추에이터에만 연결 후크 긁어 대장 직장의 길이 antimesenteric 부착 (도 1에 도시되고도 2a에 촬영).
- 마우스 홀 및 게이트에 의해 목욕 구획에 연결되는 기록 구획에 PN이나 LSN 연장. 부드럽게에 신경을 준수 할 수있는 친수성 표면을 제공 녹화 실에서 작은 유리 거울에 신경 트렁크를하다. 따뜻한와 목욕 구획 Superfuse (30-32 ° C가), 크렙스 솔루션을 산소와 미네랄 오일과 기록 구획을 입력합니다.
3. 단일 섬유 녹음하고 받아들이는 필드의 현지화
- 조심스럽게 높은 배율 (- 60X 50)에 입체 현미경 PN 또는 LSN에서 epineurium (신경초)를 벗겨. ~ 100 ㎛ 두께의 8 신경 다발 - 미세 집게를 사용하여, 5에 신경 트렁크를 애타게.
- 백금 - 이리듐 참조를 배치티슈 챔버 크렙스 용액과 접촉하는 전극. 순차적으로 동일한 재료로 이루어진 기록 전극 상 개별 신경 다발을 배치.
- 부드럽게 쓰다듬어에 의해 대장 표면 아래로 대장 구 심성에서 AP를 보여주고 부드러운 페인트 브러시를 사용합니다. 검출 AP (활동 전위) 녹음을 통해 콜론에 분포 신경 다발 (들)를 찾습니다.
참고 : PN과 LSN은 또한 방광과 골반 장기에 분포. - 추가로 10 μm의 두께 ~ 미세 필라멘트 다발로 신경 다발을 분할하고, 기록 전극 상 개별 필라멘트를 배치 30 G 바늘 팁의 쌍을 사용한다.
- 전기적 현재 확산의 ~ 2mm 반경을 생산 초과 임계 자극 강도 (10mA 크기, 0.3 Hz에서 @ 0.5 밀리 초 시간)에서 구 심성 엔딩을 자극하는 점막 표면에 수직 라운드 팁 동심 전극을 배치합니다. 체계적 (~ 1.5 mm 단계를 전극 이동) 평평 대장 직장의 길이와 폭을 따라 수용 엔딩 현지화.
- 구 심성 결말이 흥분 할 때, 최소한의 자극 강도 (자극 임계 값)이 필요 활성화 (수용 필드, RF)의 위치를 정확히 파악할 수있는 전극의 위치를 조정합니다. > 3mA (19) 자극 임계 값 엔딩을 폐기하십시오.
- 자극 인공물과 활동 전위의 발병 사이의 전도 속도 1 ~ (CV)) 수용 필드 (RF)에서, 자극 전극 및 상기 기록 위치, 2) 전도 지연 (예를 들어,도 2B의 간격)를 계산 .
CV (m / 초) = 거리 (mm) / 전도 지연 (밀리 초).
Mechanosensitive 대장 구 심성의 4 기능 분류
- 전기 자극에 의한 RF를 찾은 후, RF에 다음과 같은 세 가지 기계적인 자극을 적용
- CALIBRA의 끝을 눌러 프로빙 자극을 실시테드 프레이 같은 나일론 모노 필라멘트 (0.4 1g의 힘) 수직으로 평탄화 된 대장 직장에서 RF쪽으로.
- 부드럽게 RF에 작은 표면 전단 응력을 생성하는 좋은 나일론 필라멘트 가닥 (10 mg의 힘)으로 대장 점막을 쓰다듬어하여 쓰다듬어 자극을 실시한다.
- 경 스트레칭 력을 얻어 컴퓨터 제어 동력 액츄에이터를 이용하여 원주 연신을 실시 - 단계 2.8에 기재된 후크 퀴 통하여 대장 직장의 항 장간막 가장자리를 따라 원주 방향 (0~5 mN의 / 초에서 170 MN) .
- 장막으로, 점막을 (프로빙 둔 만 응답) 구 심성을 분류 근육 (원주 스트레칭에 대응하고 프로빙 둔) 근육 / 점막을 (원주 스트레칭, 점막 쓰다듬어에 대응하고 프로빙 둔), 또는 (쓰다듬어 점막 및 프로빙 둔 응답) MIA (세 기계적 자극의에 반응하지 않음).
- 만에 (장간막 구 심성의 경우어려운 LSN의 신경 분포)은 전기 자극에 의해 선택적으로 활성화 장간막의 프로빙 / 기계 쓰다듬어하여 수용 엔딩을 찾습니다.
- 스트레칭에 민감한 구 심성 (근육과 근육 점막)의 경우, 경 스트레칭 중 첫 번째 AP를 불러 일으키는 힘으로 정의 된 응답 임계 값을 결정합니다.
- 장막 심성 들면, 컴퓨터 제어 동력 구동되는 액추에이터에 의해 수용 필드의 프로빙 점상의 수준을 상승 그들의 응답을 기록.
받아들이는 엔딩 5. 화학 응용 프로그램 / 변조
- 기계적인 자극에 대한 기본 응답을 기록 (즉, 경 스트레칭, 프로빙 반점, 또는 점막 쓰다듬어에 응답).
- 코트 바닥 튜브 (10mm 높고 4 × 4mm 2 정사각형 또는 4 황동 또는 스테인레스 스틸, - 5 mm 직경)의 조각의 가장자리에 바셀린과 대장 직장의 수용 필드 위에 놓습니다.
- 제거화학 물질 (들)을 검사 할 함유하는 용액을 5 분에 170 μL - 크렙스 내부 튜브 용액 및 3에 대해 수용 결말을 노출.
- 화학 응용 프로그램 중 심성의 반응을 모니터 (일부 구 심성은 chemosensitive 있습니다).
- 화학 물질의 작용을 정지하고, 약액 튜브를 제거한다. 내 4 - 6 분, 기준선 응답과 동일한 기계적 자극에 대한 구 심성 응답을 테스트한다.
- 워시 아웃의 충분한 기간 (> 15 분) 후 다시 기계적인 자극을 다시 적용합니다.
6. 녹음 및 차별 AP 스파이크
- 20 kHz에서 축삭에서 기록 된 전기 신호를 디지털화하여 컴퓨터에 데이터를 저장한다. 오디오 모니터에 의해 온라인 신호를 모니터링합니다.
- 오프라인 AP 스파이크를 분석하고 개별 스파이크 파형 (25)의 주성분 분석을 기반으로 하나의 단위를 구별.
참고 : 하나의 기록이 일 더 이상 포함되어야합니다두 쉽게 식별 가능한 활성 단위.
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Representative Results
설치는 그림 1에 예시되어있다. 그것은 실리콘 늘어선 목욕 구획 및 연속 미네랄 오일 충전 실에 첨부 된 신경의 대장 직장을 수용하는 맞춤형 조직 챔버를 포함한다. 두 챔버는 구획 CNC 기계에 의해 아크릴 수지의 고체 블록으로부터 기계 가공 하였다 두 구획의 바닥이어서 결장 조직 다운 핀을 쉽게 허용하도록 기업 실리콘 늘어서 하였다. 조롱 신경 다발에서 세포 외 AP는 공통 모드 제거비 (CMRR ~ 60dB)와 저잡음, 배터리로 구동되는 차동 증폭기를 사용하여 기록됩니다. 증폭기의 이득은 0.3~10 kHz에서 10,000 배와 대역 필터의 범위로 설정된다. 대장 직장의 전기 자극은 대장 점막과 접촉 동심 전극을 통해 정전류 모드에서 광학적으로 결합 된 자극에 의해 제공됩니다. 기계 자극 (대장 스트레칭 및 프로빙 반점)는 교류에 의해 제공됩니다힘 액추에이터를 같습 제어. AD 변환기와 소프트웨어는 적절한 기계적, 전기적 자극뿐만 아니라, 기록을 개시하기 위해 전압 지령 출력을 전송하고 차동 증폭기에서 세포 외 AP 신호를 디지털화하여 양쪽 자극과 기록 과정을 감독한다. 기계적 및 전기적 노이즈 소스로부터 분리하기 위해, 티슈 챔버, 현미경 및 차동 증폭기는 공압식 대에 탑재 패러데이 케이지 안에 배치된다.
도 2a에 도시 된 바와 같이, 부착 신경 대장 직장으로는 마우스로부터 해부 항 장간막 에지를 따라 절개하여, 실리콘과 안감 조직 실 내의 평평한 고정되고; 신경 인접한 기록 챔버 내에서 유리 미러 상에 배치된다. 임계 값에서 RF의 전기 자극에 응답하여 활동 전위 (AP)의 대표적인 기록은 그림 2B에 표시됩니다. 이 레코드의 AP는 자극 아트 뒤쳐ifact (•) 수초 탈락 된 C 웰 섬유의 범위에서, 0.43 m / sec의 전도 속도 계산 결과 기록 전극에 RF부터 전도 지연으로 인해 밀리 초 (49)에 의해. (본 프레이 모노 필라멘트 형, 1g 및 RF 미세 점막 쓰다듬어 10 ㎎와 RF 프로빙)를 손으로 전달되는 자극에 대한 구 심성 전형적인 반응은도 2C에 표시. 이 기록은 두 쉽게 식별 가능한 구 심성를 포함, 만 큰 진폭 심성은 스트로 킹에 응답합니다. 도 2D에 도시 된 바와 같이, 프로빙 심성 응답도 대장 직장에 동일한 위치에 정확하게 초과되어 재생 가능한 기계적 힘 (5, 10, 20, 40 및 80의 Mn 계열을 얻어 컴퓨터 제어 동력 액추에이터에 의해 평가 하였다, 5 초 시간). 마찬가지로, 대장 직장의 원주 스트레치가 (0 - 5 mN의 / 초에서 170 mN의)는 그림 2E에 표시되는 대표적인 반응과 같은 액추에이터에 의해 제공됩니다
도 3에 도시 된 바와 같이, 기능적 대장 심성 세 가지 기계적 자극 (위의 단계 4.2 참조)에 응답하여 자신의 프로파일에 기초하여 여섯 가지로 분류 될 수있다. 장간막 구 심성을 제외한 모든 구 심성 엔딩이 전기 자극에 있었다 (전자 STIM, 가장 왼쪽 열, 화살표는 자극 이슈를 나타냅니다). 기계적으로 문자를 구분 구 심성 (실종자)의 세 가지 기계적인 자극 중 하나에 응답하지 않습니다. (- 1.4 g 0.4) 반면에, 모든 mechanosensitive 엔딩 프로빙에 응답합니다. 그 중, 근육과 근육 점막 엔딩은 원주 스트레치에 의해 활성화된다 (0-170 MN), 따라서 스트레칭에 민감한 구 심성을 불린다; 근육 점막 엔딩도 (10 mg)을 쓰다듬어에 의해 활성화된다. 점막 엔딩도 (10 mg)을 쓰다듬어에 의해 활성화하지만 스트레칭되지 않고 장막 엔딩 중 하나를 스트레칭 또는 쓰다듬어에 의해 활성화되지 않습니다 있습니다. 장간막 엔딩 기계적 B에 의해 식별됩니다장간막을 돌진.
도 4a에 표시 5 분으로 구분 된 세 개의 연속 원주 뻗기에 의해 유발 스트레칭에 민감한 심성 대표 응답입니다. 스파이크 번호는 균등 세 쓰레기통에 비닝 모두 응답 크기 (스파이크 번호) 및 응답 임계 값에서 높은 재현성을 공개,도 4b에 자극 - 반응 함수로 표시됩니다.
이 체외 대장 직장 - 신경 준비도 수용 엔딩을 구 심성하는 화학 물질의 로컬 응용 프로그램을 허용합니다. 화학 물질에 대한 노출은 물리적 대장 직장의 나머지 부분을 분리하기 위해 RF 대장 점막 꼭대기에 놋쇠 또는 스테인레스 스틸 튜브를 배치함으로써 심성 RF 주변 영역에 한정된다. 화학 응용 프로그램에 다음과 같은 일반적인 결과는 다음과 같습니다 : 산 고장 성 용액의 응용 프로그램에 따라 구 심성 (AHS (26); 그림 5A)를 직접 활성화를, 아니 염증 수프 신청 후 MIA에 의해 활성화,하지만 mechanosensitivity의 인수 (19;도 5b), IS의 응용 프로그램 (그림 5C) 후 기계적 스트레칭에 대한 응답이 증가 (즉, 과민성) 및 응용 프로그램 후 기계적 스트레칭으로 감소 응답 cGMP의의 (그림 5D).
실험 구성도 1의 개략도. 대장 직장 - 신경 조직 구획 두 챔버에 넣고 패러데이 케이지에 의해 다른 전자 기기로부터 차동 증폭기 헤드 스테이지와 함께 격리된다. 각 구 심성 RF 세 가지 기계적인 자극에 의해 대장 직장의 전기 자극 (전자 STIM)로 식별 및 테스트 : 나일론 모노 필라멘트 프로빙, 점막 쓰다듬어, 원주 스트레칭. ttps : //www.jove.com/files/ftp_upload/52310/52310fig1highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 첨부 골반 신경 (A)와 해부 대장 직장의 실체 현미경을 통해 이미지 B -. E는 대표적인 기록을 보여줍니다. (B) 활동 전위 (AP) 전기 자극에 의해 유발 (자극 유물, •). (C) 일반적인 반응은 모노 필라멘트 프로빙 및 점막 쓰다듬어를 개최 손. (D, E) 프로브 및 컴퓨터 제어 힘 액츄에이터에 의해 전달 원주 스트레칭에 대한 응답을 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
대장 구 심성 클래스의 그림 3. 기능적 특성. 구 심성은 전기 자극에 의해 (전자 STIM, ↑) 대장 직장의에 위치한 다섯 mechanosensitive 클래스로 분류 한 기계적으로 문자를 구분 구 심성 (MIA) 3 등급에 해당 응답 프로필을 기반으로 기계적인 자극 :. 프로빙, 쓰다듬어, 스트레칭 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
재현성, 컴퓨터 제어 기계적 자극에 대한 구 심성도 4 반응. (A) - 점막 근육의 응답(- 5 분 간 자극 간격 5 mN의 / 초에서 170 mN의 0) 연속 3 fferent가 뻗어 램핑. (B) 응답 (활동 전위 스파이크) 균등 세 빈 (- 57, 57-113, 113 - 0 (170) MN)에 비닝하고 자극 - 반응 함수로 표시; 응답 임계 값을 삽입에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
엔딩을 수용하는 지역화 된 화학 응용 프로그램에 그림 5. 수입 성의 응답. (A) 산성 고장 성 용액 (AHS)의 응용 프로그램에 장막 심성의 감수성의 예. 종료 MIA로 (B) mechanosensitivity (과민성)의 인수의 예. 이 MIA 직접 응답하지 않았습니다염증 수프 (IS)에,하지만 이후 프로빙 1.4 g 모노 필라멘트에 반응했다. (C) 과민성는 (응답의 크기와 응답 임계 값의 감소에서 증가)는 자사의 IS 결말의 노출 후 근육 심성의 스트레칭. 응답의 (D) 감쇠가 클릭 구아노 신 모노 포스페이트 (cGMP)에 그 결말의 노출 후에는 근육 점막 구 심성으로 스트레칭. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 체외 대장 직장 - 신경 준비는 잘 내장 감각 신경에 다른 비 기능적 접근 방법 (예를 들면, 세포 분자, 조직 학적 연구)를 보완 개별 대장 구 심성 신경의 신경 인코딩 기능 (연구 할 수있는 강력한 방법이 될 입증되었습니다 ) 자세한 내용은 리뷰 27을 참조하십시오. 통각 및 장기 대장의 과민 반응에 기여하는 신경 메커니즘은 밝혀지지하고 약리 조작은 내장 통증을 완화 할 수 공개 대상을 가지고 수행되었다. 이러한 준비의 성공적인 구현과 관련된 다음과 같은 주요 포인트는 아래에 설명되어 있습니다 : 전기 노이즈의 1) 감소, 신호 검출 2) 증가하고, 구 심성 인코딩의 변화를 평가하는 표준화 된 자극의 3)를 선택합니다. 또한,이 기술의 몇 가지 제한 사항이 논의된다.
활동 전위 (APS) propagati(130) MV - NG는 세포 내 신경을 따라 축삭은 일반적으로 100의 횡단 잠재력을 가지고있다. 그러나, 축삭 막의 작은 특정 커패시턴스이 비교적 큰 탈분극 만 용이하게 임피던스 상당히 낮은를 갖는 (주변 세포 외 조직 / 간질 액으로 소산시킬 세포막 작은 전하 변위 초래 지질막 이하). 신경 필라멘트 / 축색 돌기에서 세포 외 기록하기위한, 전기 신호가 레코딩을 위해 노이즈 감소를 우선 렌더링 대표적인 생체 전기 녹화 설정과 관련된 열적 / 백색 잡음의 크기에 가까운 마이크로 볼트의 범위이다. 가장 효과적으로 주변 잡음으로부터 전기 절연하기 위해, 티슈 챔버, 기록 및 접지 전극을, 차동 증폭기 (DC 배터리 구동)과 패러데이 케이지의 실체를 배치하는 것이 도움이 될 수있다. 만약 운동 이슈의 기계적 진동이 도움이됩니다 저해하는 공기 공기 테이블에 패러데이 케이지를 배치 발생합니다. 이상적으로는, "+"를 입력하고, 기록 전극과 기준 전극 "-"는 차동 증폭기의 입력 포트는 각각 공통 접지에 대하여 비교 임피던스를 가져야하고 서로 가까이 위치 될. 따라서, 외부 노이즈에 의해 양 전극에 대한 기록과 동일 차동 증폭기에 의해 엄격한 공통 모드 제거를 실시한다.
기록 전극의 임피던스가 상당히 미세 신경 필라멘트와 접촉하는 반면, 우리의 설정 (도 2A)에서, 기준 전극은 챔버 내에서 조직 관류 크렙스 용액에 침지된다. 사소 임피던스 부정합이 하나의 전극 구성은 소음 감소를 위해 일반적으로 적합하지 않습니다. 그러나,이 구성은 단지 하나 상 ELECTR 신경 미세 섬유를 배치의 편의를 제공(10-15mm) 제한된 길이의 마우스 대장의 신경 섬유에서 녹음 할 때 특히 매력적이다 송시. 피크 간 배경 잡음은 레코드 20 μV 이하일 때 우리의 경험에 기초하여, 단일 - 전극 구성이 수용 가능하다. 그렇지 않으면, 상기 노이즈 감소 신경 미세 섬유가 서로 평행하게 배치 된 두 기록 전극과 기준 전극에 접촉되어야하는 두개의 전극 구성의 기록을 요구한다. 패러데이 케이지 안에 모든 큰 금속 부품은 하나의 공통 접지, 우리의 설정에서 구리 블록에 스타 같은 방식으로 접지해야합니다. 케어 접지 루프의 형성을 피하기 위해주의가 필요하다.
세포 외 AP들의 검출을 위해, 첫번째 단계는 대장 직장 - 신경 조직의 절개 성공적이다. 핀치 또는 비가 역적 신경을 손상 AP 전도에 영향을 미칠 수있는, 해부 동안 신경은 피해야한다 당기. 해부 신경 줄기는 t을 필요로오 손상 탈분극에 의해 신경 전도를 차단할 수 있습니다 때 칼륨 누수 연결된 근육 조직의 자유. 이 해부 기술은 일반적으로 개월 주 동안 열심히 연습을 통해 획득 및 취급 및 수술 도구를 사용하여의 눈과 손의 협응력과 손재주의 높은 수준을 요구한다. 또한, 대장 암 조직의 손상을 방지하기 위해, 전기 검색 전략이 무딘 둥근 팁과 비교적 큰 직경 (외부 Φ0.55 mm, 내부 Φ0.125 mm)을 가지고 있으며, 미세 조작기에 의해 접속되어 동심 전극을 이용한다 겸손한 기계적인 힘의 결과로 호환 다리, 점막 표면 (~ 100 mg)을 적용. 기록 추적에서 큰 신호를 얻기 위해, AP 유도 막 관통 전류가 표출되어야하며 신경 축색 돌기 (들)와 전극 표면 사이에 작은 임피던스 브리지를 생성하여 전극 상에 "포획". 절연 따라서, epineurium 및 신경 외피신경은 10 μm의 두께 ~ 미세 섬유에 신경을 분할하는 과정에서 무료 해부 할 필요가있다. AP 유도 트랜스 전류 축삭 막으로부터 짧은 거리 내에 상당히 소산 때문에, 박형화 신경 필라멘트는 일반적으로 인해 전극 표면에 축삭 '근접하여 더 나은 신호 대 소음 비율을 초래한다. 미네랄 오일 실에서, 신경에 종종 배치 미러 크렙스 용액 (유리 표면이 친수성 인)의 얇은 층을 끈다. 그것은 기록 전극 및 신경 필라멘트 기록시 미러면과 접촉하지 않는 것을 필요가있다. 전극 및 미러 표면 사이의 낮은 임피던스를 제공하는 브리지 크렙스 용액의 잔여 액 (즉, 분로는) 상당히 레코드의 신호 진폭을 감소시킬 것이다.
노출 후이 대장 직장 - 신경 준비는 구 심성 신경의 기능 변화에 대한 연구를 허용화학 매개 물질과 시험 관내에서 욕설 다양뿐만 아니라 장기간의 병태 생리 학적 조건에서 RI의 컨텍스트 (예를 들면, 이전에 처리 된 마우스에서 찍은 colorectums). 높은 정밀도와 재현성 및 2) 강력하고 재현성 구 심성 응답 1) 표준화 자극 : 구 심성의 기능 변화에 대한 객관적인 측정은 다음에 따라 달라집니다. RF의 자극을 프로빙하고 쓰다듬어 대장 직장에 적용되는 세 가지 기계적 자극, 종종 휴대용 프레이 같은 모노 필라멘트에 의해 제공됩니다. 프로빙, 모노 필라멘트는 일반적으로 벤딩 때 재현 수직 힘을 제공하도록 조정된다. 결장 표면 (124.8 kPa의 0.4 g 및 수직 적용될 때, 본 프레이 형 모노 필라멘트 (0.4 내지 1g)을 높은 공칭 응력 발생 작고 다른 단면 직경 (0.2 및 0.3 mm, 각각)을 가지고 1g에 대한 138.7 kPa의), 강렬한, 반점 기계적 자극 beyon생리 학적으로 정상 범위를 거라고. 또한, 필라멘트의 날카로운 에지 가능성 공칭 응력 (스트레스 농도)보다 상당히 높은 초점 피크 응력과 응력의 불균일 분포를 야기한다. 전형적인 RF 사이즈 (1mm 2) 모노 필라멘트의 단면, 재현성 휴대용 모노 필라멘트와 동일한 사이트를 자극하는 무능력보다 상당히 큰 것을 감안할 때, 그것은 다를 반복 자극 반응을 관찰하는 것이 일반적이다 AP 크게 주파수 및 지속 시간. 예로서, 가능성에 기여하지 못하여 상당히 변화되어 같은 휴대용 모노 필라멘트 (1g)에 의해도 2c에 도시 된 프로빙 응답 재현성 연속 자극 사이의 가변 부위와 동일한 지속 기간 및 간격을 프로빙. 점막은 휴대용 필라멘트에 의해 전달 쓰다듬어 것은 마찬가지로 도전이며 또한 동일한 심성에서 변수 응답을 연상시키는 경향이있다. 자극 재현성이 될 수 있습니다정확한 프로빙 (스트레치) 힘을 전달하기 위해 컴퓨터 제어 동력 액츄에이터를 이용하여 향상시켰다. 프로브를 들어, 우리는 더 큰 직경 모노 필라멘트를 사용 (예를 들어, # 6.45, 1mm) 더 완벽하게 전형적인 구 심성 RF (24,28)를 포함한다. 컴퓨터 제어 둘레 신축성 RF에 관한 다른 조직 연신 방법과 반대로, 가능하게, 대장 직장의 길이에 걸쳐 균일하게 변형이 가능 필적 원주 기계적 응력 (즉, 0에 기초하여 원래의 원통형 구성에서 결장 팽만와 상관 - 45 mmHg로 관내 압력 23) - 170 백만 스트레칭은 0에 해당합니다. 연신 력 안티 장간막 가장자리에 균일하게인가되기 때문에, 직접적으로 RF, RF 심성에서 유발 된 로컬 기계적 응력은 신축성 연속 애플리케이션 간의 재현성이다. 또한, L 형 칼슘 채널 차단제 니페디핀 I로 욕조에 첨가nhibit 자연 평활근 수축, 경 스트레치 테스트 (23) 사이에 대장 준수의 유지에 기여한다. 마지막으로, 신축성 경 프로토콜 심성 응답 - 응답 기능 및 응답 임계치 모두에서 작은 가변성 재생 가능한 입증되었다 (예를 들면,도 4). 따라서, 경 스트레칭에 구 심성 응답은 널리 내장 통증 및 과민 반응 (예, 19-22,24,26,28-31)의 신경 메커니즘을 연구하는 구 심성 기능의 변경 사항에 대한 객관적인 평가로 사용되어왔다.
대장 직장 - 신경 준비는 대장 내장 구 심성의 연구를위한 강력한 도구입니다. 그러나, 그것은 또한 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 우선, 후근 신경절의 감각 뉴런 세포체 축삭 분자 그 균체 아이덴티티 (예를 들면, 단일 셀 RT-PCR 또는 TR에 대한 연구를 배제, 가로로 준비되고대장 심성의 다른 클래스)의 anscriptome 분석. 둘째, 단일 섬유 기록 낮은 신호 대 잡음비가 상당히 다른 실험실에서이 프로토콜의 광범위한 적용을 제한 최적 절개 수술 / 신경 분할 기술 및 저잡음 기록을 요구한다. 셋째,이 시험관 준비는 자율 신경계, 호르몬과 사이토 카인, 장내 미생물 순환 및 중추 신경계에서 변조를 내림차순으로 내장 감각을 조절 전신 요인의 조사에 적용 할 수없는 경우가 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica MZ16 stereo microscope | Leica Microsystems Inc. | ||
| Leica IC D camera | Leica Microsystems Inc. | ||
| Amplifier | World Precision instruments, Inc. | SYS-DAM80 | Low-noise differential amplifier |
| Two-compartment tissue chamber | Custom made | ||
| Power1401 | Cambridge Electronic Design Limited | Power1401 | Data acquisition, analog signal input/out |
| Spike2 v5.02 | Cambridge Electronic Design Limited | Software package that works with the Power1401 | |
| Audio monitor | Natus | Am 8 | |
| Square pulse stimulator | Natus | S48 | To deliver electrical stimuli |
| Photoelectric isolation unit | Natus | PSIU6 | Stimulus isolation to reduce noise |
| Concentric bipolar microelectrode | FHC Inc. | CBFFG75 | To deliver electrical stimuli |
| Dual-mode lever system | Aurora Scientific Inc. | Series 300C | To deliver mechanical stimuli |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Forceps with fine tips |
References
- Naliboff, B. D., et al. Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome. Gut. 41, 505-512 (1997).
- Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia by local rectal anesthesia in irritable bowel syndrome (IBS) patients. Pain. 105, 223-230 (2003).
- Verne, G. N., Sen, A., Price, D. D. Intrarectal lidocaine is an effective treatment for abdominal pain associated with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. Journal of Pain. 6, 493-496 (2005).
- Chey, W. D., et al. Linaclotide for irritable bowel syndrome with constipation: a 26-week, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate efficacy and safety. Am J Gastroenterol. 107, 1702-1712 (2012).
- Rao, S., et al. A 12-week, randomized, controlled trial with a 4-week randomized withdrawal period to evaluate the efficacy and safety of linaclotide in irritable bowel syndrome with constipation. Am J Gastroenterol. 107, 1714-1724 (2012).
- Busby, R. W., et al. Pharmacologic properties, metabolism, and disposition of linaclotide, a novel therapeutic peptide approved for the treatment of irritable bowel syndrome with constipation and chronic idiopathic constipation. J Pharmacol Exp Ther. 344, 196-206 (2013).
- Mei, N. Intestinal chemosensitivity. Physiol Rev. 65, 211-237 (1985).
- Mei, N., Lucchini, S. Current data and ideas on digestive sensitivity. J Auton Nerv Syst. 41, 15-18 (1992).
- Su, X., Gebhart, G. F. Mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat are polymodal in character. J Neurophysiol. 80, 2632-2644 (1998).
- McMahon, S. B., Morrison, J. F. Spinal neurones with long projections activated from the abdominal viscera of the cat. J Physiol. 322, 1-20 (1982).
- Cervero, F., Sann, H. Mechanically evoked responses of afferent fibres innervating the guinea-pig's ureter: an in vitro study. J Physiol. 412, 245-266 (1989).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Mechanosensitive properties of pelvic nerve afferent fibers innervating the urinary bladder of the rat. J Neurophysiol. 72, 2420-2430 (1994).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71, 2046-2060 (1994).
- Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. Activation of unmyelinated afferent fibres by mechanical stimuli and inflammation of the urinary bladder in the cat. J Physiol. 425, 545-562 (1990).
- Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. A novel type of unmyelinated chemosensitive nociceptor in the acutely inflamed urinary bladder. Agents Actions. 25, 219-221 (1988).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127, 166-178 (2004).
- Meyer, R. A., Davis, K. D., Cohen, R. H., Treede, R. D., Campbell, J. N. Mechanically insensitive afferents (MIAs) in cutaneous nerves of monkey. Brain Res. 561, 252-261 (1991).
- Handwerker, H. O., Kilo, S., Reeh, P. W. Unresponsive afferent nerve fibres in the sural nerve of the rat. J Physiol. 435, 229-242 (1991).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G170-G180 (2011).
- Feng, B., La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G1085-G1098 (2012).
- Feng, B., et al. Long-term sensitization of mechanosensitive and -insensitive afferents in mice with persistent colorectal hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G676-G683 (2012).
- Feng, B., et al. Altered colorectal afferent function associated with TNBS-induced visceral hypersensitivity in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G817-G824 (2012).
- Feng, B., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Differential roles of stretch-sensitive pelvic nerve afferents innervating mouse distal colon and rectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298, G402-G409 (2010).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33, 9831-9839 (2013).
- Jolliffe, I. T. Principal component analysis. , 2nd, Springer. New York, NY. (2002).
- La, J. H., Feng, B., Schwartz, E. S., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Luminal hypertonicity and acidity modulate colorectal afferents and induce persistent visceral hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G802-G809 (2012).
- Christianson, J. A., et al. plasticity and modulation of visceral afferents. Brain Research Reviews. 60, 171-186 (2009).
- Kiyatkin, M. E., Feng, B., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Combined genetic and pharmacological inhibition of TRPV1 and P2X3 attenuates colorectal hypersensitivity and afferent sensitization. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G638-G648 (2013).
- Brumovsky, P. R., Feng, B., Xu, L., McCarthy, C. J., Gebhart, G. F. Cystitis increases colorectal afferent sensitivity in the mouse. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297, G1250-G1258 (2009).
- Shinoda, M., Feng, B., Gebhart, G. F. Peripheral and central P2X receptor contributions to colon mechanosensitivity and hypersensitivity in the mouse. Gastroenterology. 137, 2096-2104 (2009).
- Tanaka, T., Shinoda, M., Feng, B., Albers, K. M., Gebhart, G. F. Modulation of visceral hypersensitivity by glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α-3 in colorectal afferents. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G418-G424 (2011).
