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Bioengineering

3 डी सेल संस्कृति मॉडल का मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग के लिए तैयारी रणनीतियाँ नमूना

Published: December 5, 2014 doi: 10.3791/52313
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Notre Dame, 2Harper Cancer Research Institute, University of Notre Dame

Summary

अमर कैंसर कोशिका लाइनों 3 डी सेल संस्कृतियों, जैविक अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान मॉडल के रूप में विकसित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल नमूना तैयार मंच में सुधार सहित 3 डी सेल संस्कृतियों का मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग विश्लेषण के लिए 3 डी सेल संस्कृतियों को तैयार करने के लिए उपयोगकर्ताओं को हिदायत है।

Protocol

इमेजिंग के लिए 1. 3 डी सेल संस्कृति और तैयारी

  1. संस्कृति एक उपयुक्त सेल लाइन, यानी, HCT116 बृहदान्त्र कार्सिनोमा सेल लाइन, दो आयामी, monolayer की संस्कृति में।
  2. आम तौर पर कुछ दिन लगते हैं, जो 50-70 confluency%, जब तक एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम मैककॉय की 5A मीडिया के साथ एक टी-25 फ्लास्क में HCT 116 कोशिकाओं को विकसित।
  3. 0.25% trypsin-EDTA समाधान के साथ रिलीज कोशिकाओं और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं के एक हिस्से की गिनती और सेल घनत्व और व्यवहार्यता के लिए जाँच करने के लिए नीले रंग धुंधला trypan।
  4. गिनती के बाद, अच्छी तरह / 6000 कोशिकाओं का एक उपयुक्त बोने घनत्व हासिल करने के लिए पूरा मध्यम के साथ कोशिकाओं को कमजोर, या 30,000 कोशिकाओं / एमएल।

2. Agarose 96 अच्छी तरह प्लेटें लेपित तैयार

  1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में मानक मीडिया के 10 एमएल (मीडिया में 1.5% agarose समाधान) 10 agarose के 0.19 छ जोड़ें। कोमल मिश्रण द्वारा समावेश सुनिश्चित करें। एक पानी के स्नान में agarose आटोक्लेव20 मिनट के लिए।
  2. फ्लैट तली 96 अच्छी तरह से थाली संस्कृति प्लेट के 60 केंद्रीय कुओं में, agarose + मीडिया के मिश्रण के महाप्राण 50 μl एक multichannel विंदुक का उपयोग करना। थाली के परिधीय किनारों पर कुओं से थोड़ा अधिक वाष्पीकरण की दर है के रूप में, 200 μl 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के बजाय इन किनारों को agarose जोड़ें।
  3. Agarose मिश्रण भीतरी वेल्स को जोड़े जाने के बाद, को शांत करने के लिए एक तरफ थाली सेट ~ 37 कोशिकाओं के अलावा पहले सी °।

3. बीज और तीन आयामी संस्कृति करते हैं

नोट: अधिक या कम कोशिकाओं शामिल संस्कृति की आवश्यकताओं के आधार पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन यह इन शर्तों संस्कृति के 10-14 दिनों के बाद व्यास में लगभग एक मिलीमीटर के 3 डी सेल संस्कृति संरचनाओं में परिणाम है कि निर्धारित किया गया है (नहीं दिखाया डेटा) ।

  1. उचित सेल के समाधान के 200 μl जोड़ने के लिए (~ 6000 कोशिकाओं को रोकने के लिए पतला) agarose-लेपित96 अच्छी तरह से थाली। प्लेट कवर और सेल के विकास के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के साथ humidified इनक्यूबेटर में निर्धारित किया है।
  2. सेल मीडिया हर 48 घंटे की एक न्यूनतम बदलें, या मीडिया प्रकट होता है जब रंग बदल जाए।
    1. ध्यान से agarose के तल पर (दिन 2 से नग्न आंखों को दिखाई) छोटे 3 डी सेल संस्कृति के आसपास से पुराने मीडिया aspirating द्वारा मीडिया को बदलें। धीरे 3 डी सेल संस्कृति पर ताजा मीडिया के 200 μl जोड़ें।
    2. इन मीडिया परिवर्तन के दौरान (वैकल्पिक कदम), परीक्षण के लिए केमोथेरापी या अन्य दवाओं जोड़ें। पूरा मीडिया के साथ अंतिम एकाग्रता के लिए पसंद की दवा पतला और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए अपेक्षित 200 μl जोड़ें।
    3. 3 डी सेल संस्कृतियों व्यास में लगभग एक मिलीमीटर होते हैं, जब तक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप से 3 डी सेल संस्कृति के विकास की निगरानी।

4. हार्वेस्ट 3 डी सेल संस्कृतियों

  1. धीरे agarose बिस्तर से 3 डी सेल संस्कृति को दूर करने के लिए एक 2 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग करें।
    2. <ली> धीरे एक इंतज़ार कर 24 अच्छी तरह से थाली में लगभग 1 मिलीलीटर पीबीएस में उन्हें pipetting द्वारा पीबीएस के साथ 3 डी सेल संस्कृतियों धो लें।
  2. स्थानांतरण प्रोटीन या मेटाबोलाइट निकासी के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए सीरम वैज्ञानिक pipet के माध्यम से 3 डी सेल संस्कृतियों काटा, या उन्हें इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए टुकड़ा करने की क्रिया में सहायता करने के लिए एक काटने माध्यम में एम्बेड।

जिलेटिन में 5. एम्बेड 3 डी सेल संस्कृतियों

  1. उच्च शुद्धता पानी में ~ 175 मिलीग्राम / एमएल जिलेटिन की एक समाधान तैयार (18 MΩ पसंदीदा)। 22,23 सख्ती जिलेटिन मिलाएं। चिपचिपा और हेरफेर करने के लिए मुश्किल होता जा रहा समाधान का निरीक्षण करें। समाधान महाप्राण करने के लिए स्पष्ट और आसान हो जाता है जब तक ~ 60 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में जिलेटिन युक्त शंक्वाकार ट्यूब प्लेस और गर्म।
    नोट: गर्म जिलेटिन समाधान यह ठंडा के रूप में तेजी से और मज़बूत बनाता है, इतनी तेजी से ठंड से पहले निम्न चरणों के सभी प्रदर्शन करते हैं।
  2. यह गरम किया जाता है के बाद, सेल संस्कृति हुड के लिए तुरंत जिलेटिन ले। एक BEA में जिलेटिन के साथ ट्यूब रखेंके बारे में 60 में preheated के पानी के साथ KER जिलेटिन समाधान का सख्त से बचने के लिए सी °।
  3. एक 2 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करना, एक 24 फ्लैट तली थाली के कुएं में गर्म जिलेटिन समाधान के 0.6 मिलीलीटर जमा। यह मात्रा एक पतली परत में नीचे कवर करने के लिए पर्याप्त है। धीरे तुरंत 3 डी संरचना rupturing से बचने के लिए एक अलग 2 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग जिलेटिन की परत के शीर्ष पर 3 डी सेल संस्कृतियों जमा।
    नोट: केयर जिलेटिन में पीबीएस के लिए जगह नहीं इस स्तर पर लिया जाना चाहिए। यदि ऐसा होता है, हालांकि, एक 200 μl पिपेट का उपयोग जिलेटिन के ऊपर से पीबीएस को हटा दें।
  4. 3 डी सेल संस्कृतियों जिलेटिन परत की सतह पर रखा जाता है के बाद संस्कृतियों की स्थिति को परेशान नहीं करने के लिए इतनी के रूप में, ध्यान, 3 डी सेल संस्कृतियों पर गर्म जिलेटिन मिश्रण का एक और 0.6 एमएल पिपेट। दूसरी परत रखा गया है, -80 डिग्री सेल्सियस पर जिलेटिन एम्बेडेड 3 डी सेल संस्कृतियों फ्रीज।

6. स्लाइस और पिघलना माउंट वेंई मास Spectrometric इमेजिंग के लिए 3 डी सेल संस्कृतियों जिलेटिन एम्बेडेड

  1. फ्रीजर से 3 डी सेल संस्कृतियों युक्त 24 अच्छी तरह से थाली निकालें। एक चिमटी से नोचना या स्केलपेल अच्छी तरह से नीचे की ओर धीरे स्लाइड होगा जब तक अपने हाथ से गर्मी के साथ प्लेट के नीचे गर्म।
  2. सुचारू रूप से केंद्र विगलन बिना जिलेटिन मुक्त कराने, चिमटी से नोचना या स्केलपेल स्लाइड। Cryostat का समर्थन करने के लिए पानी की एक बूंद लो और समर्थन करने के लिए जिलेटिन डिस्क पालन करने के लिए इस का उपयोग करें।
    1. जिलेटिन में एम्बेडेड 3 डी सेल संस्कृतियों -30 डिग्री सेल्सियस पर टुकड़ा करने की क्रिया के लिए सबसे अधिक उत्तरदायी हैं। उपयोग करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ cryostat ब्लेड और कांच साफ। ब्लेड या ब्लेड का dulling को रोकने के लिए प्रत्येक 3 डी सेल संस्कृति-जिलेटिन डिस्क के लिए एक नया ब्लेड के एक अलग हिस्से का प्रयोग करें।
  3. 3 डी सेल संस्कृतियों दिखाई देने लगते हैं, जब तक cryostat का उपयोग कर, धीरे अतिरिक्त जिलेटिन बंद का सामना।
  4. इस बिंदु पर धीरे-धीरे 12-16 माइक्रोन वर्गों में एक निर्बाध गति के साथ 3 डी सेल संस्कृतियों टुकड़ा।
    नोट: टुकड़ा करने की क्रिया के लिए महत्वपूर्ण कारक है इसलिए इन सब के अनुरूप परिणाम सुनिश्चित करने के लिए जाँच की जानी चाहिए ब्लेड के लिए कांच की दूरी, ब्लेड कोण, cryostat का तापमान, और समर्थन पर डिस्क के कोण, शामिल हैं।
  5. ध्यान से स्लाइस पिघलना और उचित लेबल ईण्डीयुम टाइटेनियम ऑक्साइड (आईटीओ) लिपटे गिलास स्लाइड पर उन्हें माउंट और एक desiccator में यह दुकान। अधिकतम गुणवत्ता के लिए जितनी जल्दी संभव हो स्लाइस का उपयोग करें।

MALDI इमेजिंग के लिए 7. मैट्रिक्स आवेदन और नमूना तैयार

  1. MALDI इमेजिंग से पहले, उचित मैट्रिक्स के साथ स्लाइस तैयार करते हैं।
    1. छोटे अणु विश्लेषण के लिए, कोई धोने कदम आम तौर पर आवश्यक हैं। बरकरार प्रोटीन का पता लगाने के लिए, ठंड 100% एसीटोन में स्लाइस धोने, Carnoy के तरल पदार्थ, या 70% / 95% isopropanol ऐसे संकेत मुखौटा सकता है कि लिपिड के रूप में छोटे अणुओं को निकालने के लिए 24 -। 26
    2. धीरे एक समय में कोई 30 से अधिक सेकंड के लिए धो लो। ऐसा न करेंकिसी भी स्लाइस को परेशान करने के लिए।
  2. 0.1% TFA के साथ, कार्बनिक विलायक और पानी की एक समाधान में मैट्रिक्स तैयार करें। ऐसे α-Cyano-4-hydroxycinnamic एसिड (CHCA) के रूप में छोटे अणु के लिए, 60% ACN का उपयोग करें: 40% एच 2 ओ: 0.1% TFA (10 मिलीग्राम / एमएल)। प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस तरह के sinapic एसिड (30 मिलीग्राम / एमएल) के रूप में, एक ही विलायक समाधान का उपयोग करें। Sinapic एसिड का इष्टतम घुलनशीलता के लिए, TFA के अलावा पहले acetonitrile में पहली भंग: एच 2 ओ समाधान। अन्य matrices के उचित रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    नोट: मैट्रिक्स कई अलग अलग तरीकों के साथ लागू किया जा सकता है, लेकिन यह कुछ matrixes व्यर्थ नमूना प्रतिपादन, ऐसे ferulic एसिड के रूप में जिलेटिन, के साथ सह-crystalize पाया गया है ध्यान दिया जाना चाहिए। छोटे क्रिस्टल का पता चला और जैविक मतभेद के बजाय मैट्रिक्स प्रभाव के लिए जिम्मेदार ठहराया जा करने के लिए और अधिक आणविक प्रजातियों के लिए अनुमति देता है, और अधिक सुसंगत जन स्पेक्ट्रा का उत्पादन।
  3. विधि handspotting द्वारा मैट्रिक्स लागू करें।
    1. Matr के 0.5 μl लागू करने के लिए एक ठीक इत्तला दे दी सिरिंज का प्रयोग करेंनौवीं 3 डी सेल संस्कृति टुकड़ा पर समाधान और मैट्रिक्स crystalize करने के लिए अनुमति देते हैं।
  4. वैकल्पिक रूप से, Airbrush विधि का उपयोग करें। मैट्रिक्स समाधान के साथ एक वाणिज्यिक ग्रेड एयरब्रश भरें।
    1. , 8-12 इंच दूर स्लाइड से स्प्रेयर पकड़ो टुकड़ा पर एक ठीक स्प्रे करना है। गुजरता के बीच में, एक मिनट के लिए सबसे अच्छा क्रिस्टल के गठन के लिए अनुमति देने के लिए के लिए मैट्रिक्स शुष्क करने की अनुमति देते हैं। एयरब्रश के ऊपर से 10-20 गुजरता मैट्रिक्स 22 के एक इष्टतम परत का निर्माण करने के लिए आवश्यक है।
  5. वैकल्पिक रूप से, उच्च बनाने की क्रिया विधि कहीं और विस्तृत का उपयोग करें। 25,27
  6. की परवाह किए बिना मैट्रिक्स आवेदन करने की विधि की पूर्व MALDI-एमएसआई के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए एक desiccator में सूखी स्लाइड। 25

एक MALDI-TOF प्रणाली का प्रयोग 8. MALDI-एमएसआई विश्लेषण (यानी, AutoFlex तृतीय)

नोट: इस खंड में एक MALDI-TOF इमेजिंग प्रयोग के लिए मानकों की स्थापना के लिए निर्देश और सलाह शामिल हैं। भारतीय नौसेना पोत पर निर्भर करता हैtrument निर्माता और सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया, प्रक्रिया भिन्न हो सकते हैं।

  1. सुरक्षित रूप से छवि के लिए आईटीओ लेपित स्लाइड से जुड़ी 3 डी सेल संस्कृति स्लाइस 75 मिमी x 25 मिमी स्लाइड पकड़ बना एक एडाप्टर में स्लाइड्स फिट बैठते हैं। साधन में स्लाइड एडाप्टर लोड करें।
  2. सवाल में बड़े पैमाने पर सीमा के लिए एक उपयुक्त अंशांकन मानक चुनकर MALDI-MSI के लिए साधन तैयार करें। छोटे अणुओं की पूछताछ के लिए, प्रयोग मैट्रिक्स, α-CHCA के अनुरूप पाया है कि संकेत है, calibrants की एक आम समूह हैं। प्रोटीन का विश्लेषण के लिए, ब्याज की बड़े पैमाने पर रेंज में जाना जाता प्रोटीन मानकों (यानी, Ubiquitin, trypsinogen) का चयन और calibrants रूप में 3 डी सेल संस्कृतियों के निकट देखा जाता है। विधि विकास के साथ आगे बढ़ने से पहले साधन जांचना।
  3. इमेजिंग के लिए पहले, उपकरण निर्माता द्वारा प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग कर चुनाव की बड़े पैमाने पर सीमा के लिए डाटा अधिग्रहण के तरीकों का विकास। देखें आंकड़े 1 और 2 के लिएछोटे अणु और प्रोटीन इमेजिंग। छोटे अणु इमेजिंग के लिए, उच्चतम सामूहिक संकल्प के लिए मोड reflectron का उपयोग करें।
    1. 100-1,000 एम / Z के बीच और 8,000- 25,000 मी / z के बीच प्रोटीन के लिए छोटे अणु डाटा अधिग्रहण के लिए बड़े पैमाने पर सीमा को समायोजित करें। उपकरण के साथ संभव उच्चतम सामूहिक संकल्प प्रदान करते हुए चुनाव के क्षेत्र धरना लिए बड़े पैमाने पर सीमा को समायोजित करें।
    2. लेजर शक्ति, आवृत्ति, अंशांकन समाधान और पास के एक 'बलि' 3 डी सेल संस्कृति टुकड़ा का उपयोग कर लेजर दृश्यों और स्थान आकार की संख्या को समायोजित करें। मुख्य साधन नियंत्रण सॉफ्टवेयर में इन सेटिंग्स को ध्यान से देखें। 60% बिजली, 400 लेजर दृश्यों, अल्ट्रा छोटी सी जगह का आकार: एक सिफारिश की प्रारंभिक बिंदु के रूप में निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें। ये सेटिंग्स उपकरणों और तरीकों भर में भिन्नता है, इसलिए प्रत्येक विशिष्ट साधन के लिए उच्चतम गुणवत्ता स्पेक्ट्रा देने के लिए साधन मापदंडों का अनुकूलन होगा। समायोजित किया जा सकता है कि अन्य मापदंडों डिटेक्टर लाभ, नमूना दर, और इलेक्ट्रॉनिक लाभ शामिल हैं। एसइमेजिंग सॉफ्टवेयर में उपयोग के लिए इस विधि एवेन्यू (यानी।, AutoExecute विधि FlexImaging पर आकर्षित करेगा कि)।
      नोट: पता लगाने के साथ हस्तक्षेप नहीं करने के लिए इतनी के रूप में ब्याज की बड़े पैमाने पर सीमा के नीचे दबाने आयनों (फिर साधन नियंत्रण में पाया)।
    3. चुनाव की बड़े पैमाने पर सीमा के लिए प्रोटीन डाटा अधिग्रहण विधियों का विकास करना। ऊपर उल्लिखित ही चरणों का पालन करें, लेकिन मध्य से उच्च द्रव्यमान पर्वतमाला के लिए, के बारे में 3 केडीए से ऊपर, रैखिक मोड का उपयोग करें।
      नोट: सेटिंग छोटे अणु तरीकों के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों से अलग होगा।
  4. ऐसे Bruker MALDI-TOF प्रणालियों के लिए FlexImaging के रूप में उपकरण निर्माता, द्वारा प्रदान की इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सेटअप विशिष्ट एमएस साधन मापदंडों।
    1. विधियों से पहले विकसित किया है और बचाया उपयोग करते हुए, एक नई इमेजिंग फाइल और फोल्डर बनाये। ऐसे रेखापुंज स्थान (कदम 8.3.2 या 8.3.3 में सेटअप) साधन नियंत्रण पद्धति की स्थापना आकार (लगभग 200 माइक्रोन 50 माइक्रोन के लिए डिफ़ॉल्ट से परिवर्तन), और स्थिति के रूप में साधन मापदंडों का चयन करें3 डी सेल संस्कृति पर स्कैन करने के लिए जहां tion।
    2. बदले में प्रत्येक के लिए लेजर चलती है, नमूना पर तीन उपयुक्त सिखाने अंक का चयन करें। 'प्रिंट स्क्रीन' का उपयोग MALDI-TOF लेजर नियंत्रण सॉफ्टवेयर से ऑप्टिकल तस्वीर प्राप्त करते हैं।
      नोट: कई इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम 'सिखाने' एक स्कैनर या अक्सर साधन कैमरा के साथ प्राप्त किया जा सकता है, जो लेजर स्थित है जहां सॉफ्टवेयर, के लिए नमूने के एक ऑप्टिकल तस्वीर की आवश्यकता होती है।
  5. फिर इमेजिंग सॉफ्टवेयर नहीं है (नियंत्रण यंत्र) से इमेजिंग प्रक्रिया शुरू करने और प्रत्येक टुकड़ा से जन स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण। विशेष क्षेत्रों के लिए स्थानीय सबसे 3 डी सेल संस्कृति भर में बड़ी संख्या में लोगों को और दूसरों को ध्यान से देखें।

9. वैकल्पिक डेटा विश्लेषण तरीके

  1. लक्षित विश्लेषण के लिए, मतलब स्पेक्ट्रम में एक बड़े पैमाने पर क्लिक करके स्पेक्ट्रा के मार्गदर्शन विश्लेषण करते हैं, या (इमेजिंग सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से एक विशेष सीमा से ऊपर जनता लेने की अनुमति उदा।, अटल बिहारी चोटियों) शीर्ष 20% सीमा ove। गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, मैट्रिक्स चोटियों का वितरण या मतलब स्पेक्ट्रम की जांच।
  2. ऐसे आर या Matlab के रूप में गणितीय सॉफ्टवेयर में निकाले डेटासेट के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन।
    1. पसंद के सॉफ्टवेयर में लोड करने के लिए ASCII स्वरूप, एक पठनीय पाठ फ़ाइल में निर्यात एकल स्पेक्ट्रा।
    2. कई विभिन्न सॉफ्टवेयर प्रोग्राम द्वारा 28 को पढ़ने के लिए mzML प्रारूप के ASCII, mzXML, करने के लिए अलग-अलग स्पेक्ट्रा कन्वर्ट -। 31 या एक विश्लेषण (.img) प्रारूप फ़ाइल, ऐसे एमआरआई के रूप में अन्य इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल एक आम प्रारूप के रूप में डेटा निर्यात 32 विश्लेषण के लिए दो खुले स्रोत विकल्पों MSiReader और BioMap 32,33 हैं।
    3. फ़ाइलों सॉफ्टवेयर के द्वारा पठनीय प्रारूप में निर्यात कर रहे हैं एक बार, संबंधित सॉफ्टवेयर निर्देश के माध्यम से डाटासेट लोड। लोड हो रहा है के बाद, ऐसी आधार रेखा को हटाने और सामान्य रूप में, बाद के अधिग्रहण प्रोसेसिंग प्रदर्शन करते हैं।
    4. इस डाटासेट के साथ, stati प्रदर्शनऐसे में इस तरह के मैटलैब 18 के रूप में सॉफ्टवेयर में एल्गोरिदम में बनाया कस्टम स्क्रिप्ट या तो उपयोग पदानुक्रमित क्लस्टरिंग के प्रमुख घटक विश्लेषण के रूप में stical उपचार।

Representative Results

एमएसआई इमेजिंग 3 डी सेल संस्कृतियों में कई अलग अलग आणविक वितरण प्रकट करने की क्षमता है। ऊपर उल्लिखित विधि का प्रयोग, छोटे अणुओं बड़े प्रोटीन (चित्रा 1) (चित्रा 2) से प्रजातियों संस्कृति भर में लगाया जा सकता है। इन परिणामों के MSiReader। 32 परिणाम ब्याज की एक क्षेत्र या पूरे स्कैन किया क्षेत्र में या तो दृश्य सॉफ्टवेयर के साथ 3 डी सेल संस्कृति भर में ब्याज की एकल आयनों के लिए विश्लेषण किया जा सकता है नि: शुल्क उपकरण के साथ एक एकल आयन के दृश्य दिखा। इसके अलावा सबसे अधिक सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से खोज के प्रयासों सहायता कर सकते हैं जो उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित एक निश्चित सीमा से ऊपर आयनों कल्पना जाएगा। एकल आयन नक्शे प्राप्त कर रहे हैं एक बार, ज्यादातर सॉफ्टवेयर आयनों की colocalization देखने के लिए ओवरले छवियों करने की क्षमता भी शामिल है। दोनों में दृष्टिकोण की खोज के आधार पर या एक लक्षित फैशन में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग 3 डी सेल संस्कृतियों का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।


चित्रा 3 डी सेल संस्कृति के विकास और सेक्शनिंग। वाम) पूर्व कटाई करने के लिए 14 दिन पर देखा के रूप में एक अक्षुण्ण कोलोरेक्टल HCT-116 3 डी सेल संस्कृति संरचना के ऑप्टिकल छवि के 1. प्रतिनिधि परिणाम है। सही) एक कोलोरेक्टल 3 डी सेल संस्कृति पिघलना के एक लगभग इक्वेटोरियल टुकड़ा के ऑप्टिकल छवि इमेजिंग के लिए एक इतो में लिपटे स्लाइड पर मुहिम शुरू की। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा एक 3 डी सेल संस्कृति। ऊपर) कम द्रव्यमान (छोटे अणु) रेंज में α-CHCA के साथ हासिल की औसत जन स्पेक्ट्रा के एक भूमध्यरेखीय खंड के छोटे अणु MALDI-एमएसआई के 2. प्रतिनिधि परिणाम है। के नीचे) प्रतिनिधि छवियाँएक भी बड़े पैमाने पर: 327.8 मी / z मुख्य रूप से 3 डी सेल संस्कृति और के इंटीरियर के लिए स्थानीय 429.7 एम / मुख्य रूप से 3 डी सेल संस्कृति के किनारे के लिए स्थानीय Z। धराशायी लाइन अंडाकार आकृति की अनुमानित बढ़त इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा एक 3 डी सेल संस्कृति। ऊपर) उच्च (प्रोटीन) मास रेंज में sinapic एसिड के साथ हासिल की औसत जन स्पेक्ट्रा के एक भूमध्यरेखीय खंड के MALDI-एमएसआई द्वारा प्रोटीन इमेजिंग के 3. प्रतिनिधि परिणाम है। नीचे) एक भी बड़े पैमाने पर की छवियों प्रतिनिधि: मुख्य रूप से अंडाकार आकृति के किनारे के लिए स्थानीय 10,871 मी / z, और अधिक अंडाकार आकृति के इंटीरियर की ओर स्थानीयकृत 12,184 मी / z। धराशायी लाइन अंडाकार आकृति की अनुमानित बढ़त इंगित करता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

ऊपर उल्लिखित विधियों का प्रयोग, 3 डी सेल संस्कृतियों हो गई है और MALDI-एमएसआई के साथ विश्लेषण किया जा सकता है। जब उचित। 9,10 केयर, वह यह है भी कई बार पारित कर कम बीतने संख्या है नहीं किया गया है कि कोशिकाओं को खेती करने के लिए लिया जाना चाहिए सुसंस्कृत कई अमर सेल लाइनों 3 डी संरचनाओं बनेगी। सामान्य में, दस और कम बीतने के नंबर के साथ कोशिकाओं 3 डी सेल संस्कृतियों से बढ़ के लिए उपयोगी हैं। एक पारंपरिक agarose के समर्थन में 3 डी सेल संस्कृतियों बढ़ रहा है इस प्रणाली की कोशिश करने के लिए 3 डी सेल संस्कृति में रुचि अनुसंधान समूहों के लिए एक लागत प्रभावी तरीका प्रदान करता है। इस विधि नहीं पहले से ही सबसे स्तनधारी सेल संस्कृति प्रयोगशालाओं में कुछ घटकों का इस्तेमाल करता। सावधान ध्यान के विकास के लिए agarose प्लेटों की तैयारी करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए 3 डी सेल संस्कृतियों आकार और आकार में लगातार कर रहे हैं इतना है कि; सावधान ध्यान देने की जरूरत है कि कुछ पहलुओं कोई हवाई बुलबुले मिश्रण करने के लिए और एक उचित meniscus के प्रत्येक के नीचे डब्ल्यू पर बनता है कि फँस कर रहे हैं कि जाँच के शामिल हैंपक्ष। Meniscus के ठीक से फार्म नहीं करता है, कोशिकाओं गैर अंडाकार आकृति आकार में या छोटे गुच्छों में विकसित हो सकता है। इसके अलावा, देखभाल spheroids साथ जिलेटिन में पीबीएस जगह करने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए। यदि ऐसा होता है, एक 200 μl पिपेट का उपयोग जिलेटिन के ऊपर से पीबीएस को हटा दें। लागत एक कारक नहीं है, अल्ट्रा कम बाध्यकारी दौर नीचे प्लेटों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और इन कदमों का सरलीकरण प्रदान करते हैं। अन्य ऊतक एम्बेडिंग तरीकों में भी महंगी और गैर-मास स्पेक्ट्रोमेट्री संगत हो सकता है, जिलेटिन एम्बेड सस्ती और बहुमुखी दोनों होना दिखाया गया है। 3 डी सेल संस्कृतियों उच्चतम गुणवत्ता डेटा प्राप्त करने के लिए ऊपर उल्लिखित तैयारी रणनीतियों अनुकूलित किया गया है। जिलेटिन एम्बेड मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ संगत होना दिखाया गया है, इस प्रक्रिया की वजह से सह क्रिस्टलीकरण के लिए उपलब्ध matrices के संकीर्ण करता है। जमे हुए एक बार, 3 डी सेल संस्कृतियों के रूप में लंबे समय तक वे फ्रीज thawed नहीं कर रहे हैं के रूप में महीने के लिए स्थिर रहे हैं। जिलेटिन जमे हुए जब अपारदर्शी हो जाता है, और 3 डी सेलसंस्कृतियों में एक समान रंग के होते हैं, तो यह टुकड़ा करने की क्रिया में सहायता करने के लिए 3 डी सेल संस्कृति नियुक्ति करने के लिए दस्तावेज़ ठंड से पहले सलाह दी जाती है।

स्लाइड्स की तैयारी, मैट्रिक्स कई अलग अलग तरीकों के साथ लागू किया जा सकता है, लेकिन यह कुछ matrixes व्यर्थ नमूना प्रतिपादन, ऐसे ferulic एसिड के रूप में जिलेटिन, के साथ सह-crystalize पाया गया है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। छोटे मैट्रिक्स क्रिस्टल अधिक सुसंगत जन स्पेक्ट्रा का उत्पादन। Handspotting मैट्रिक्स आवेदन का सरलतम विधि है, वहीं बड़े विलायक मात्रा बड़ा क्रिस्टल आकार और महत्वपूर्ण विश्लेष्य प्रवास में परिणाम कर सकते हैं।

मास स्पेक्ट्रोमीटर में, शुरुआत विश्लेषण के लिए आवश्यक विशेषज्ञता को कम कर दिया MALDI-एमएसआई प्रौद्योगिकियों में अग्रिम। डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण इतो में लिपटे स्लाइड से उच्च गुणवत्ता की जानकारी प्राप्त करने के लिए भी एक नौसिखिए की अनुमति के सबसे प्रणालियों, पर सीधा है। आस-पास के गैर छवि योग्य 3 डी सेल संस्कृतियों पर अनुकूलित साधन मापदंडों का चयन सावधानी से,तों, उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, लेजर शक्ति बढ़ती शिखर तीव्रता में वृद्धि हो सकती है, लेकिन लेजर शक्ति घटते संकल्प को बेहतर बनाने और अधिक सममित शिखर आकार दे सकते हैं। 3 डी सेल संस्कृतियों इष्टतम नमूना गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए टुकड़ा करने की क्रिया के बाद जल्दी से इस्तेमाल किया जाना चाहिए। प्रोटीन संकेत की गिरावट (20 केडीए ऊपर) विशेष रूप से उच्च द्रव्यमान क्षेत्र में, उचित भंडारण (dessicator / -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर) के बिना कम से कम एक सप्ताह में देखा जा सकता है। कारण बढ़ती मांग के कई अलग अलग दृश्य सॉफ्टवेयर प्रोग्राम विकसित और अनुसंधान जनता के लिए स्वतंत्र हैं किया गया है। अधिकांश इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमीटर प्रत्येक साधन का इस्तेमाल किया पर मालिकाना स्वरूपों के साथ ही आम जनता कल्पना करने के लिए आवश्यक सॉफ्टवेयर स्थापित किया है। ये सॉफ्टवेयर प्रोग्राम डेटा एकल बड़े पैमाने पर छवियों को प्राप्त करने और निर्यात करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सबसे सॉफ्टवेयर भी ब्याज की दो या दो से अधिक जनता की ओवरले की अनुमति देगा। इसके अतिरिक्त, एमएसआई डेटा के लिए कई अलग अलग दर्शकों को ऐसे MSiReader एक के रूप में, डाउनलोड करने के लिए स्वतंत्र हैंडी BioMap। भी आगे के लिए और अधिक उपयोगी जानकारी लाने में आसानी के साथ पोस्ट-अधिग्रहण संसाधित किया जा सकता प्राप्त 32,33 मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा।

प्रोटीन के लिए लिपिड को दवाइयों से, ऊपर उल्लिखित प्रणाली एक 3 डी सेल संस्कृति संरचना भर में ब्याज के अणुओं के वितरण का मूल्यांकन करने के लिए डेटा का तेजी से अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है। धारावाहिक वर्गों 3 डी सेल संस्कृति का एक टुकड़ा में से प्रत्येक के लिए 2 डी छवि से निर्माण करके छवि के लिए पूरे 3 डी संरचना लिया जा सकता है। प्रोटोकॉल में तकनीक और नोट्स monolayer की संस्कृति और पशु मॉडलों के बीच एक सेतु के रूप में तीन आयामी सेल संस्कृति शुरू करने के लिए बधाई देने के शोधकर्ताओं के काम का हो जाएगा। में महारत हासिल करने के बाद, इन तकनीकों वे चुन जो भी नमूने छवि के लिए शोधकर्ताओं की इजाजत दी, 3 डी सेल संस्कृतियों, ऊतकों, और सेल संस्कृतियों के कई प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HCT116 Cell line ATCC ATCC CCL-247 Potential hazard, handle with care
McCoy's 5A media Gibco 16600-108
Fetal Bovine serum HyClone SH30071.03
0.25% Trypsin-EDTA solution Gibco 25200-056
Agarose Sigma-Aldrich A9539
Phosphate Buffered Saline Gibco 10010049
Gelatin, unflavored Knox Available at most grocery stores in single-packets
ITO-coated glass slides Delta Technologies, Limited CG-90IN-S115
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)  Sigma-Aldrich C8982
Sinapic Acid Sigma-Aldrich 85429
0.3 mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set RoyalMax Airbrush Many options available on sites such as Amazon.com

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Ahlf Wheatcraft, D. R., Liu, X., Hummon, A. B. Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models. J. Vis. Exp. (94), e52313, doi:10.3791/52313 (2014).

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