Summary
Linhas celulares de cancro imortalizadas pode ser cultivada como culturas de células em 3D, um modelo valioso para a pesquisa biológica. Este protocolo descreve imaging espectrometria de massa de culturas de células em 3D, incluindo melhorias na plataforma de preparação de amostras. O objetivo deste protocolo é para instruir os usuários a preparar culturas de células em 3D para análise de imagem espectrometria de massa.
Protocol
Cultura de Células 1. 3D e Preparação for Imaging
- Cultura uma linha celular apropriada, isto é, HCT116 linha celular de carcinoma do cólon, em duas dimensões, cultura em monocamada.
- Crescer células HCT 116 num frasco T-25 com meios 5A de McCoy + 10% de soro fetal de bovino a 5% numa incubadora de CO 2 até 50-70% de confluência, o que geralmente leva alguns dias.
- Células liberam com solução de tripsina-EDTA 0,25% e contar uma parte das células usando um hemocitômetro e tripan coloração azul para verificar a densidade e viabilidade celular.
- Após a contagem, diluir as células com meio completo para obter uma densidade de sementeira adequado de 6.000 células / poço, ou 30.000 células / ml.
2. Prepare Agarose revestido placas de 96 poços
- Adicionar 0,19 g de agarose com 10 ml de meio padrão em um tubo de 50 ml de solução de agarose (1,5%) em meio 10. Assegurar a incorporação pela mistura suave. Autoclave a agarose, num banho de águadurante 20 min.
- Usando uma pipeta de canais múltiplos, aspirado de 50 ul da mistura de agarose + de memória nos 60 poços centrais da placa de 96 poços de fundo placa de cultura plana. Como os poços nas bordas periféricas da placa têm taxas de evaporação ligeiramente superior, adicionar 200 ul de 1x fosfato salino tamponado (PBS) em vez da de agarose a estes bordos.
- Uma vez que a mistura de agarose foi adicionado aos poços interiores, definir o prato de lado para esfriar para ~ 37 ° C antes da adição das células.
3. As sementes e tendem a cultura tridimensional
NOTA: Mais ou menos células podem ser semeadas em função das exigências da cultura envolvida, mas determinou-se que estas condições resultam em estruturas 3D de cultura de célula de aproximadamente 1 mm de diâmetro após 10-14 dias de cultura (dados não mostrados) .
- Adicionar 200 ul da solução de células apropriado (diluído para conter ~ 6.000 células) para que a agarose-revestidoPlaca de 96 poços. Cobrir a placa e fixado na incubadora humidificada com 5% de CO2 a 37 ° C durante o crescimento celular.
- Mudança de mídia celulares no mínimo a cada 48 horas, ou quando a mídia parece estar mudando de cor.
- Mudar media cuidadosamente por aspiração com os meios de cultura de células em torno da pequena 3D (visível a olho nu por dia 2) na parte inferior da agarose. Adicionar 200 mL de meio fresco suavemente sobre a cultura de células em 3D.
- (Etapa opcional) Durante estas alterações na mídia, adicione quimioterápicos ou outros medicamentos para o teste. Dilui-se a droga de escolha para a concentração final com meio completo e adicione os necessários 200 ul a cada poço.
- Monitorar 3D crescimento de cultura de células ao microscópio óptico, até que as culturas de células em 3D são aproximadamente 1 mm de diâmetro.
4. Colheita das culturas de células em 3D
- Use a 2 ml pipeta sorológica para remover suavemente a cultura de células em 3D a partir do leito de agarose. <li> Lavam-se as culturas de células em 3D com PBS por suavemente pipetando-as em cerca de 1 ml de PBS numa placa de 24 poços de espera.
- Transferência colhidas culturas de células em 3D via pipeta sorológica para tubos de centrífuga para extração de proteínas ou metabolito, ou incorporá-las em um meio de corte para ajudar a cortar para aplicações de imagem.
5. Incorporar culturas de células em 3D no Gelatin
- Prepara-se uma solução de ~ 175 mg / ml de gelatina em água de elevada pureza (18 mohms preferida). 22,23 Misturar vigorosamente a gelatina. Observe a solução se tornar viscoso e difícil de manipular. Coloque o tubo cônico contendo gelatina em banho-maria a ~ 60 ° C e quente até que a solução se torne clara e fácil de aspirar.
NOTA: A solução de gelatina quente endurece rapidamente enquanto esfria, então executar todas as etapas a seguir rapidamente antes do congelamento. - Depois ele é aquecido, pegue a gelatina imediatamente para a capa de cultura de células. Manter o tubo com gelatina em um beaker com água pré-aquecido a cerca de 60 ° C para evitar o endurecimento da solução de gelatina.
- Usando uma pipeta de 2 ml serológico, depositar 0,6 ml da solução de gelatina quente para dentro do poço de uma placa de fundo plano de 24. Este volume é suficiente para cobrir a parte inferior de uma camada fina. Depositar suavemente as culturas de células 3D imediatamente em cima da camada de gelatina utilizando uma pipeta de 2 ml diferente para evitar a ruptura da estrutura 3D.
NOTA: É preciso ter cuidado nesta fase para não colocar PBS na gelatina. Se isso acontecer, no entanto, remover o PBS a partir do topo da gelatina utilizando uma pipeta de 200 uL. - Depois de as culturas de células em 3D são colocados sobre a superfície da camada de gelatina, cuidadosamente pipetar outros 0,6 ml da mistura de gelatina quente sobre as culturas celulares em 3D, de modo a não perturbar a posição das culturas. Depois de a segunda camada é colocado, congelar as culturas de células embebidas em 3D de gelatina à temperatura de -80 ° C.
6. Slice e Thaw Mount thGelatina e-incorporado culturas de células em 3D para Mass Spectrometric Imagem
- Remova a placa de 24 cavidades contendo as culturas de células em 3D a partir do congelador. Aqueça o fundo da placa com o calor de sua mão até uma pinça ou bisturi vai deslizar suavemente para o lado do bem.
- Suavemente deslize a pinça ou bisturi, liberando a gelatina sem descongelar o centro. Tomar uma gota de água para o suporte de criostato e utilizar isto para aderir o disco de gelatina para o suporte.
- Culturas de células 3D incorporados em gelatina são mais passíveis de cortar a -30 ° C. Limpar a lâmina de vidro com criostato e etanol a 70% antes da utilização. Use uma parte diferente da lâmina ou uma lâmina nova para cada célula disco cultura gelatina 3D para evitar embotamento da lâmina.
- Usando o criostato, rosto suavemente o excesso de gelatina até que as culturas de células em 3D se tornam visíveis.
- Neste ponto, cortar lentamente as culturas de células em 3D com um movimento suave em 12-16 mm seções.
NOTA: Os factores críticos para corte incluem a distância do vidro para a lâmina, o ângulo da pá, a temperatura do criostato, e o ângulo do disco sobre o suporte, de modo que todas estas têm de ser verificados para assegurar resultados consistentes. - Descongelar cuidadosamente as fatias e montá-los em índio óxido de titânio (ITO) lâminas de vidro -Revestido adequadamente rotulados e armazená-lo em um dessecador. Use as fatias tão rapidamente quanto possível para a máxima qualidade.
Aplicação 7. Matrix e Preparação de Amostras para MALDI Imagem
- Antes de imaging MALDI, preparar fatias com a matriz apropriado.
- Para as pequenas análise molécula, não há passos de lavagem são geralmente necessários. Para a detecção de proteína intacta, lavar as fatias em 100% de acetona fria, fluido de Carnoy, ou 70% / 95% de isopropanol para remover pequenas moléculas, tais como lípidos, que poderiam mascarar o sinal de 24 - 26.
- Lave cuidadosamente para não mais do que 30 segundos de cada vez. Nãoperturbar quaisquer fatias.
- Prepare a matriz numa solução de solvente orgânico e água, com 0,1% de TFA. Para molécula pequena tal como α-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA), utilizar 60% de ACN: H2O 40%: 0,1% de TFA (10 mg / ml). Para a detecção de proteína tal como ácido sinápico (30 mg / ml), utilizar a mesma solução de solvente. Para solubilidade óptima do ácido sinãpico, dissolver primeiro em acetonitrilo antes da adição do TFA: H2O solução. Outras matrizes podem ser usadas conforme apropriado.
NOTA: Matriz pode ser aplicada com vários métodos diferentes, mas deve notar-se algumas matrizes foram encontrados para co-cristalizar com a gelatina, tais como o ácido ferúlico, tornando a amostra inutilizável. Cristais menores produzem espectros de massa mais consistente, permitindo a espécie mais moleculares para ser detectada e atribuída a diferenças biológicas, em vez de os efeitos da matriz. - Aplicar matriz pelo método handspotting.
- Use uma seringa de ponta fina para aplicar 0,5 ul da matrix solução na fatia de cultura de células e 3D permitem que a matriz para cristalizar.
- Como alternativa, use o método airbrush. Encha um airbrush classe comercial com a solução matriz.
- Segure o pulverizador 8-12 centímetros de distância do slide, apontar um spray fino na fatia. Em entre as passagens, permitir que a matriz secar durante 1 min, para permitir o melhor para a formação de cristais. Até 10-20 passagens do spray é necessária para produzir uma camada de matriz 22 óptima.
- Como alternativa, use o método de sublimação detalhado em outros lugares 25,27.
- Lâminas secas num exsicador durante pelo menos 30 min antes de MALDI-MSI, independentemente do método de aplicação da matriz 25.
8. MALDI-MSI Análise usando um sistema de MALDI-TOF (ie, AUTOFLEX III)
NOTA: Esta seção contém instruções e conselhos para a definição de parâmetros para uma experiência de imagem MALDI-TOF. Dependendo das insfabricante e software utilizado trument, o processo pode variar.
- Coloque os slides em um adaptador feito para armazenar com segurança 75 milímetros x 25 milímetros slides para imagem 3D fatias de cultura de células associadas a slides ITO revestidos. Coloque o adaptador de slides no instrumento.
- Prepare o instrumento para MALDI-MSI selecionando um padrão de calibração adequada para a faixa de massa em questão. Para interrogação de moléculas pequenas, os sinais detectados que correspondem à matriz utilizada, α-CHCA, são um grupo comum de calibradores. Para a análise de proteínas, proteínas padrão conhecidas (ou seja, ubiquitina, tripsinogênio) na gama de massa de interesse são seleccionados e manchado adjacente às culturas de células em 3D como calibradores. Calibrar o aparelho antes de prosseguir com o desenvolvimento do método.
- Antes de imagem, desenvolver métodos de aquisição de dados para a faixa de massa de escolha utilizando o software fornecido pelo fabricante do instrumento. Ver figuras 1 e 2 parapequena molécula de proteína e de imagem. Para molécula pequena imagem, use reflectrão modo para a mais alta resolução de massa.
- Ajuste o intervalo de massas para a aquisição de dados pequena molécula entre 100-1.000 m / z e de proteínas entre 8.000- 25.000 m / z. Ajustar a gama de massa para abranger a região de escolha, proporcionando a máxima resolução possível de massa com o instrumento.
- Ajuste a potência do laser, freqüência, número de disparos de laser e tamanho do ponto, utilizando a solução de calibração e uma fatia de cultura de células em 3D perto do 'sacrifício'. Observe essas configurações no software de controle de instrumento principal. Use as seguintes configurações como ponto de partida recomendado: poder de 60%, a 400 disparos de laser, ultra tamanho pequeno ponto. Essas configurações variam conforme os instrumentos e métodos, assim otimizar parâmetros do instrumento para dar os espectros mais alta qualidade para cada instrumento específico. Outros parâmetros que podem ser ajustadas incluem o ganho do detector, taxa de amostragem, e o ganho electrónico. Save este método para utilização no software de imagem (isto é., Método AutoExecute FlexImaging que irá basear-se).
NOTA: iões Suprimir abaixo da gama de massa de interesse (novamente encontrada no instrumento de controlo) de modo a não interferir com a detecção. - Desenvolver proteína métodos de aquisição de dados para a faixa de massa de escolha. Siga os mesmos passos descritos acima, mas para as faixas de massa médio a alto, acima de cerca de 3 kDa, usar o modo linear.
NOTA: As definições serão diferentes daqueles usados para pequenos métodos molécula.
- Parâmetros do instrumento de configuração específicas MS usando o software de imagem fornecida pelo fabricante do instrumento, como FlexImaging para sistemas Bruker MALDI-TOF.
- Criar um novo arquivo de imagem e pasta, usando os métodos desenvolvidos antes e salvos. Selecione os parâmetros do instrumento, tais como tamanho do ponto raster (mudança do padrão de cerca de 200 mm a 50 mm), defina o método de controle de instrumento (configuração na etapa 8.3.2 ou 8.3.3), e posição local a ser verificado através da cultura de células em 3D.
- Escolha três pontos ensine adequadas na amostra, movendo-se o laser de um de cada vez. Obter a fotografia óptica do software de controle do laser MALDI-TOF usando 'print screen'.
NOTA: Muitos programas de software de imagem exigem uma fotografia óptica da amostra de "ensinar" o software onde o laser é localizado, o qual pode ser obtido com um scanner ou muitas vezes a câmara instrumento.
- Em seguida, iniciar o processo de imagem a partir do software de imagem (não o controle de instrumentos) e adquirir espectros de massa de cada fatia. Observe a maioria massas em toda a cultura de células em 3D e outros localizados em áreas específicas.
9. Opcional Métodos de Análise de Dados
- Para a análise orientada, executar análise manual dos espectros clicando uma massa no espectro médio, ou permitir que o software de imagem para escolher automaticamente massas acima de um limite específico (por exemplo., Picos above topo limiar de 20%). Para o controlo de qualidade, analisar a distribuição de picos de matriz ou o espectro médio.
- Realizar análises estatísticas com conjuntos de dados extraídos em software matemático, como R ou Matlab.
- Exportação espectros único em formato ASCII, um arquivo de texto legível, para carregar no software de escolha.
- Converter os espectros individuais para ASCII, mzXML, de formato mzML para a leitura por vários programas de software diferentes, 28 -. 31 ou exportar os dados como um arquivo de formato Analisar (.img), um formato comum usado para outras aplicações de imagem, como ressonância magnética 32 Duas opções de código aberto para a análise são MSiReader e Biomap 32,33.
- Uma vez que os arquivos são exportados em um formato legível pelo software, carregar o conjunto de dados via as instruções do respectivo software. Após o carregamento, realizar o processamento pós-aquisição, tais como remoção da linha de base e normalização.
- Com este conjunto de dados, executar statistical tratamentos, tais como análise de componentes principais de agrupamento hierárquico utilizando ou scripts personalizados ou construídos em algoritmos de software, tais como Matlab 18.
Representative Results
MSI de imagem tem o potencial de revelar muitos distribuição molecular diferente em culturas de células em 3D. Usando o método descrito acima, a partir de espécies de pequenas moléculas (Figura 1) para proteínas grandes (Figura 2) pode ser rastreado através da cultura. Estes resultados mostram a visualização de um único ião com a ferramenta livre MSiReader. 32 Os resultados podem ser analisados para os iões individuais de interesse através da cultura de células com o software de visualização 3D ou numa região de interesse, ou a totalidade da região digitalizada. Além disso a maioria dos softwares irá visualizar automaticamente íons acima de um certo limite definido pelo usuário, o que pode ajudar os esforços de descoberta. Assim que os mapas individuais de íon são obtidos, a maioria software inclui uma capacidade de sobrepor as imagens para ver a co-localização de íons. Ou em abordagens descoberta ou baseado no de forma orientada, a imagiologia espectrometria de massa é uma ferramenta poderosa para a análise de culturas de células em 3D.
Figura 1. Os resultados representativos de 3D crescimento cultura de células e de corte. Esquerda) de imagem óptica de uma estrutura de cultura de células colorectal intacta HCT-116 3D como visto no dia 14 antes da colheita. Direita) óptico de imagem de uma fatia de aproximadamente equatorial de um colorectal 3D degelo cultura de células montado numa corrediça ITO-revestido para geração de imagens. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Os resultados representativos de molécula pequena MALDI-MSI de uma secção equatorial de uma cultura de células em 3D. Top) espectro de massa médio alcançado com α-CHCA na faixa de baixa massa (pequena molécula). Inferior) Imagens representativas deuma única massa: 327,8 m / z localizada principalmente para o interior da cultura de células e 3D 429,7 m / z localizada principalmente para a borda da cultura de células em 3D. A linha tracejada indica a borda aproximada do esferóide. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Os resultados representativos de imagem de proteína por MALDI-MSI de um plano equatorial, de uma cultura de células em 3D. Top) os espectros de massa médio conseguido com ácido sinápico em maior (intervalo de proteína) em massa. Inferior) Imagens representativas de uma única massa: 10.871 m / z localizada principalmente para a borda do esferóide, e 12,184 m / z localizada mais para o interior do esferóide. A linha a tracejado indica a borda aproximada do esferóide. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Utilizando os métodos descritos acima, as culturas celulares podem ser cultivadas em 3D e analisados com MALDI-MSI. Muitas linhas de células imortalizadas irá formar estruturas 3D quando cultivadas de forma adequada. 9,10 Cuidados devem ser tomados para cultivar células que não foram passadas muitas vezes, isto é, possuem baixos números de passagem. Em geral, as células com números de passagens de dez e inferior são óptimas para o crescimento de culturas de células em 3D. Crescer as culturas de células em 3D em um apoio tradicional agarose prevê um custo eficaz para grupos de pesquisa interessados em cultura de células em 3D para experimentar este sistema. Este método utiliza alguns componentes não já, na maioria dos laboratórios de cultura de células de mamíferos. Atenção especial deve ser dada para a preparação das placas de agarose para o crescimento, de modo que as culturas de células em 3D são consistentes em tamanho e forma; alguns aspectos que requerem atenção cuidadosa incluem a verificação de que não há bolhas de ar aprisionadas são à mistura e que um menisco adequada é formada na parte inferior de cada well. Se o menisco não forma adequada, as células podem crescer em formas não-esferóides ou em pequenos aglomerados. Além disso, deve-se tomar cuidado para não colocar em PBS a gelatina com os esferóides. Se isso acontecer, remover o PBS a partir do topo da gelatina utilizando uma pipeta de 200 uL. Se o custo não é um factor, placas de fundo redondo de ligação de ultra-baixa estão comercialmente disponíveis e oferecem simplificação destes passos. Embora outros métodos de incorporação de tecido também pode ser dispendioso e de espectrometria de massa não-compatível, gelatina-incorporação tem sido mostrado para ser barata e versátil. Preparação estratégias descritas acima foram optimizados para culturas de células 3D para obter os dados de mais alta qualidade. Embora a incorporação de gelatina e foi mostrada para ser compatível com a análise de espectrometria de massa, este processo faz estreitar as matrizes disponíveis devido à co-cristalização. Uma vez congeladas, as culturas de células em 3D são estáveis durante meses, enquanto eles não são congelar-descongelar. A gelatina torna-se opaco quando congelado, e a célula 3Dculturas são de uma cor semelhante, por isso é aconselhável antes de congelar para documentar a colocação de cultura de células em 3D para auxiliar no corte.
Quando se preparam lâminas, a matriz pode ser aplicada com vários métodos diferentes, mas deve notar-se que algumas matrizes foram encontrados para co-cristalizar com a gelatina, tais como o ácido ferúlico, tornando a amostra inutilizável. Pequenos cristais de matriz produzir espectros de massa mais consistente. Enquanto handspotting é o método mais simples de aplicação da matriz, o maior volume de solvente pode resultar em tamanhos de cristais de maiores dimensões e a migração do analito significativo.
No espectrômetro de massa, os avanços nas tecnologias de MALDI-MSI ter reduzido a expertise necessária para análises começo. Aquisição e análise de dados é simples na maioria dos sistemas, permitindo que até mesmo um novato para obter informações de alta qualidade a partir de lâminas de ITO-revestidos. A seleção cuidadosa dos parâmetros do instrumento, otimizada sobre a não-imagem cultur celular 3D digno nas proximidadeses, é crítico para a obtenção de dados de elevada qualidade. Por exemplo, o aumento do poder do laser pode aumentar a intensidade do pico, mas diminuindo a potência do laser pode melhorar a resolução e dar formas dos picos mais simétricas. Culturas de células em 3D deve ser utilizado rapidamente após o corte para garantir a qualidade da amostra ideal. A degradação de sinal de proteínas pode ser visto em menos de uma semana sem o armazenamento adequado (exsicador / -80 ° C congelador), particularmente na região de massa alta (acima de 20 kDa). Devido à crescente demanda, muitos programas de software de visualização diferentes foram desenvolvidos e são gratuitos para o público de investigação. A maioria dos espectrômetros de massa de imagem tenha instalado o software necessário para visualizar massas individuais com os formatos proprietários utilizados em cada instrumento. Estes programas de software pode ser usado para obter imagens em série única e exportar os dados. A maioria dos softwares também irá permitir que a sobreposição de duas ou mais massas de interesse. Além disso, muitos espectadores diferentes para dados MSI são gratuitos para download, como um MSiReaderd Biomap. 32,33 Os dados de espectrometria de massa obtidos também podem ser processados após a aquisição, com facilidade, trazendo informações mais úteis para a frente.
Da farmacêutica à lipídios às proteínas, o sistema descrito acima permite a aquisição rápida de dados para avaliar a distribuição das moléculas de interesse através de uma estrutura de cultura de células em 3D. As secções em série podem ser tomadas para a imagem de toda a estrutura 3D através da construção de cada imagem 2D de uma fatia da cultura de células em 3D. As técnicas e notas no protocolo vai ser útil para pesquisadores que desejam começar cultura celular tridimensional como uma ponte entre a cultura monocamada e modelos animais. Uma vez dominado, essas técnicas podem ser aplicadas a vários tipos de culturas de células em 3D, tecidos e culturas de células, permitindo que os pesquisadores imagem consoante amostras que escolhem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HCT116 Cell line | ATCC | ATCC CCL-247 | Potential hazard, handle with care |
| McCoy's 5A media | Gibco | 16600-108 | |
| Fetal Bovine serum | HyClone | SH30071.03 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA solution | Gibco | 25200-056 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010049 | |
| Gelatin, unflavored | Knox | Available at most grocery stores in single-packets | |
| ITO-coated glass slides | Delta Technologies, Limited | CG-90IN-S115 | |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Sinapic Acid | Sigma-Aldrich | 85429 | |
| 0.3 mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set | RoyalMax Airbrush | Many options available on sites such as Amazon.com |
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