Introduction
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर: विकास और कोशिका जीव विज्ञान के क्षेत्र में काफी मॉडल जीव से प्रभावित किया गया है. इस मॉडल के भीतर, आंख डिस्क की पढ़ाई ज्ञान के विषय में संकेतन, कोशिका जीव विज्ञान और अन्य क्षेत्रों का एक बड़ा सौदा योगदान दिया है. देर तीसरे लार्वा instar आंख डिस्क बड़े पैमाने पर अध्ययन किया और यह विकास की अवधि की एक श्रृंखला की एक स्नैपशॉट देता है, के रूप में उपयोग करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है किया गया है, अपनी अनूठी संकेतन अणुओं और प्रक्रियाओं के साथ प्रत्येक, morphogenetic कुंड आंख डिस्क भर में प्रगति के रूप में 8. हालांकि, आगे विकास की पोटा संबंधी चरण में विकास की प्रक्रिया के बारे में हमारी समझ का विस्तार करने की जरूरत है. पोटा संबंधी आंख डिस्क 3-7 पर अध्ययन किया गया है, हमारे ज्ञान तीसरे instar आंख डिस्क पर प्रदर्शन किया गया है कि काम के विस्तार के दृष्टिकोण नहीं है. यह पोटा संबंधी आंख डिस्क विदारक में अधिक कठिनाई, भाग में, कारण है. इसलिए, की एक प्रस्तुतिविच्छेदन की उचित विधि बहुत इस क्षेत्र में अनुसंधान का विस्तार कर सकता है.
आसानी से विशेष रूप से मध्य-पोटा संबंधी अवधि के आसपास, विच्छेदित कर रहे हैं कि पोटा संबंधी आंख डिस्क विकास के भीतर चरणों रहे हैं, अन्य समय अवधि बहुत अधिक चुनौतीपूर्ण काटना हैं. इस प्रोटोकॉल सार्वभौमिक सभी पोटा संबंधी विकास समय फ्रेम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि पोटा संबंधी आंख डिस्क विदारक के लिए एक विधि का प्रतिनिधित्व करता है. इस प्रोटोकॉल midpupal समय बिंदुओं से आंख डिस्क टुकड़े के लिए एक आसान और तेजी से विधि से पता चलता है कि एक और प्रोटोकॉल 9 के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल मूल रूप से फिल्माया और कार्यात्मक जीनोमिक्स (URCFG) पोटा संबंधी आंख विच्छेदन की तकनीक में 10,11 में यूसीएलए अंडर ग्रेजुएट रिसर्च कंसोर्टियम में उन्नत स्नातक छात्रों के प्रशिक्षण के लिए विकसित किया गया था. कई स्नातक छात्रों को इस चुनौतीपूर्ण तकनीक जानने के लिए इस वीडियो और विधि का उपयोग करने में सक्षम थे.
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Protocol
यह प्रक्रिया एक 2 दिन की प्रक्रिया है.
दिन 1 (2 घंटा + समय विदारक)
1. पोटा संबंधी आँख डिस्क विच्छेदन
- विच्छेदन के लिए एक प्यूपा का चयन करें.
नोट: विच्छेदित किए जाने की प्यूपा की उम्र प्रयोगात्मक आवश्यकताओं द्वारा निर्धारित किया जाएगा. सेल आकारिकी की जांच हालांकि, अगर इस बार वीडियो में दिखाया गया pupae की उम्र है, जो 25 डिग्री सेल्सियस, पर puparium गठन (APF) के बाद 42 घंटे में किया जाता है. एक गीला तूलिका के साथ सफेद pupae (माना 0 घंटा APF) लीजिए और 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा एक नया मक्खी भोजन शीशी में (संग्रह समय के आधार पर) कालानुक्रमिक क्रम में उन्हें व्यवस्था. संभव के रूप में बंद pupae के बीच समय के अंतर रखने के लिए यह एक ही कालानुक्रमिक क्रम में वृद्ध pupae काटना. - फॉस्फेट बफर खारा की एक बूंद में प्यूपा स्थानांतरण एक सिलिकॉन विदारक थाली पर (पीबीएस, पीएच 7.4, नुस्खा के लिए सामग्री देखें).
- संदंश और पियर्स के साथ पोटा संबंधी मामले के शीर्ष पकड़ो और एल खुलातेज संदंश की एक जोड़ी के साथ पोटा संबंधी मामले की ower भाग. नवगठित छेद में मामले से प्यूपा निकालें.
- प्यूपा में कैंची, मध्य छाती, के साथ एक विकर्ण कटौती करें. मलबे को हटाने या पीबीएस की एक नई ड्रॉप करने के प्यूपा सिर हस्तांतरण. स्वच्छ पिपेट धौंकनी ट्यूब (सामग्री और जानकारी के लिए चित्रा 1 देखें) का उपयोग करते हुए और आवश्यकतानुसार अतिरिक्त पीबीएस जोड़ें. निर्जलीकरण से बचने के लिए सुनिश्चित करें.
- सुरक्षित पकड़ संदंश की एक जोड़ी के साथ पोटा संबंधी सिर छल्ली के ऊपर. धौंकनी ट्यूब की नोक का प्रयोग, धीरे मस्तिष्क और पोटा संबंधी मामले से बाहर आंख डिस्क, सहित अन्य ऊतकों, बाहर निकालना पोटा संबंधी मामले पर धक्का. छल्ली के भीतर किसी भी ऊतक हथियाने से बचने के लिए सुनिश्चित करें.
- पीबीएस के साथ भरा बनाने वाला ट्यूब का प्रयोग, धीरे स्पष्ट रूप से अलग करने के लिए सिर मामले से बाहर वसा शरीर के ऊतकों और अन्य मलबे झटका और दिमाग और आंख डिस्क की पहचान.
नोट: पोटा संबंधी सिर मामले से जुड़ी दिमाग में रखते हुए शोधकर्ता वह उपयोग करने की अनुमति देगाआँख डिस्क या मस्तिष्क को नुकसान पहुँचाए बिना ऊतक के भविष्य के हेरफेर के लिए एक "हैंडल" के रूप में विज्ञापन के मामले में. हालांकि, यह सिर मामले से दिमाग और आंख डिस्क बेदखल करने के लिए आम है और इस समग्र प्रक्रिया और परिणाम के लिए हानिकारक नहीं है. यह अक्सर उड़ाने और सफलतापूर्वक वे स्पष्ट रूप से कर रहे हैं आसपास के ऊतकों से अलग है कि पोटा संबंधी सिर का मामला है और इसलिए भीतर से आंख डिस्क और मस्तिष्क निकालने के लिए आगे बढ़ाने के कई प्रयास करने पड़ते हैं. क्लीनर और अधिक अलग एक आंख डिस्क को फिक्सिंग से बाहरी ऊतक को रोकने में मदद मिलेगी आसपास के ऊतकों से आंख डिस्क प्राप्त कर सकते हैं. - विच्छेदन के बाद तुरंत ठीक समाधान के 0.5 मिलीलीटर (सामग्री देखें) के साथ बर्फ पर एक 3 अच्छी तरह से कांच डिश के लिए ऊतक हस्तांतरण. कुछ मिनट (यह आँख डिस्क के अगले सेट काटना लेता है आम तौर पर समय) के लिए ठीक समाधान की सतह पर ऊतक फ्लोट.
नोट: इस विच्छेदन, completel के इस दौर में विच्छेदित होने वाली पहली आंख डिस्क नहीं हैY फिक्स समाधान में पिछले आंख डिस्क डूब. (आदि जैसे, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, लाइसोसोम,) विशेष धुंधला प्रक्रियाओं के प्रदर्शन तो यह निर्धारण करने से पहले किया जाना चाहिए. ऐसा करने के लिए आदेश में, पहले उचित धुंधला प्रोटोकॉल को जारी करने से ठंडा पीबीएस में विच्छेदित आंख डिस्क की दुकान. - सभी आंख डिस्क का विच्छेदन और डुबकी के बाद विच्छेदित किया जा रहा है, 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक घुमाव और रॉक करने के लिए 3 अच्छी तरह से कांच पकवान चाल है.
2. Immunostaining
- ध्यान से फिक्स समाधान निकालने और 0.3% ट्राइटन X-100 के साथ पीबीएस के 0.5 मिलीलीटर जोड़ने (0.3% पीबीटी, सामग्री देखें) और 10 मिनट के लिए एक घुमाव पर ऊतक धो लो. 4 washes के (10 मिनट प्रत्येक) की कुल के लिए यह कदम तीन बार दोहराएँ.
नोट: अच्छी तरह से समाधान की सावधानी से हटाने के ऊतकों को नुकसान या हानि को रोकने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत किया जा सकता है. समाधान एक pipet के साथ सावधानी से aspirated जा सकता है; हम एक ठीक-Tippe पसंद करते हैंविकास, ऊतक aspirating की संभावना को कम करने के लिए चपटा उद्घाटन किया गया है कि डिस्पोजेबल हस्तांतरण pipet. - 4 धोने के अंत में, धोने को हटा दें और अच्छी तरह से करने के लिए (सामग्री देखें) 0.5 मिलीलीटर ब्लॉक समाधान जोड़ने और 30 मिनट के लिए सेते हैं.
नोट: अपनी जरूरतों के हिसाब से इस समय सीमा को बढ़ाया जा सकता है. - 30 मिनट के ब्लॉक समय के अंत में, एक microwell थाली में कुओं की उपयुक्त संख्या में (ब्लॉक समाधान में पतला) प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के pipet 10 μl.
नोट: एक microwell थाली में से एक अच्छी तरह से पोटा संबंधी मामले से जुड़ी आंख डिस्क के बारे में 4 जोड़े या संलग्न दिमाग के साथ आंख डिस्क के 8 अलग जोड़े को समायोजित करेगा. (: 500 कमजोर पड़ने 1) और विरोधी कट (1: 200 कमजोर पड़ने) प्रतिनिधि डेटा के लिए इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल प्राथमिक एंटीबॉडी विरोधी phosphotyrosine हैं. - 3 अच्छी तरह से कांच पकवान से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान से भरा microwell थाली कुओं में विच्छेदित ऊतक स्थानांतरण.
- जगहएक गीला कागज तौलिया पर microwell प्लेट रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर एक खाली pipet टिप बॉक्स (या इसी तरह की अन्य कंटेनर) और दुकान में (निर्जलीकरण को रोकने के लिए).
2 दिन (4 घंटा + समय बढ़ते)
- 0.3% पीबीटी (≈0.5 मिलीग्राम) के साथ एक नया 3 अच्छी तरह से कांच पकवान microwell थाली से ऊतक स्थानांतरण और घुमाव पर 10 मिनट के लिए ऊतक धो लो. 4 washes के एक कुल के लिए इस कदम (10 मिनट प्रत्येक) तीन से अधिक बार दोहराएँ
- पिछले धोने निकालें और अच्छी तरह से करने के लिए ब्लॉक समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें. 30 मिनट के लिए ब्लॉक.
नोट: अपनी जरूरतों के हिसाब से इस समय सीमा को बढ़ाया जा सकता है. - एक कवर या एल्यूमीनियम के साथ प्रकाश से 3 अच्छी तरह से कांच पकवान ब्लॉक समाधान निकालें और अच्छी तरह से करने के लिए (ब्लॉक समाधान में पतला अपनी प्राथमिक एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट तरंगदैर्ध्य, के लिए उपयुक्त fluorescently लेबल एंटीबॉडी से बना) माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ने और रक्षा पन्नी और कमरे में कम से कम 2 घंटे के लिए सेतेतापमान.
नोट: सभी बाद के चरणों इसी प्रकार प्रकाश जोखिम से संरक्षित किया जाना चाहिए. इस ऊष्मायन प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन के समान एक सेटअप में, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ाया जा सकता है, लेकिन यह भी प्रयोगशाला फिल्म, या एंटीबॉडी संरक्षण वांछित है अगर एक microwell थाली के साथ कवर 3 अच्छी तरह से कांच डिश में किया जा सकता है. - एंटीबॉडी ऊष्मायन के अंत में, माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और अच्छी तरह से करने के लिए 0.3% पीबीटी के 0.5 मिलीलीटर जोड़ने और 10 मिनट के लिए घुमाव पर धो लें. 4 washes के एक कुल के लिए इस कदम (10 मिनट प्रत्येक) दोहराएँ.
नोट: (: 1,000 कमजोर पड़ने 1) DAPI धुंधला वांछित है, पहले धो शुरू करने से पहले, पहली धोने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि पीबीटी के 500 μl को DAPI के शेयर समाधान के 0.5 μl (सामग्री देखें) जोड़ें.
3. बढ़ते
- पिछले धोने के अंत में, बीआर दूर करने के लिए एक माध्यम के रूप में 70% ग्लिसरॉल या पीबीएस का उपयोग कर एक स्लाइड पर स्पर्शतंतु / आंख डिस्क माउंटऐन और स्लाइड के एक तरफ एक पूल में अन्य अवांछित ऊतकों.
- ध्यान संदंश के बीच हीड्रास्टाटिक दबाव का उपयोग ऊतक ले जाते हैं, या बहुत धीरे एक संदंश टिप के साथ, और स्लाइड के केंद्र की ओर एक स्तंभ में आंख डिस्क अप लाइन.
- ऊतक चारों ओर से सभी बाहरी ग्लिसरॉल या पीबीएस निकालें (एक प्रयोगशाला की wicking कार्रवाई पोंछे का उपयोग या संदंश इस के लिए काम करते हैं).
- आँख डिस्क स्तंभ के एक पक्ष के साथ बढ़ते मध्यम की एक छोटी राशि (≈10 μl) प्लेस और आंख डिस्क पर बढ़ते मध्यम प्रसार करने के लिए इतनी के रूप में ऊतक पर एक coverslip जगह.
- 1 से 2 मिनट ऊतक / बढ़ते मध्यम पूरी तरह से बाहर का प्रसार करने की अनुमति देने के लिए स्लाइड बैठते हैं.
- Coverslip के किनारों के आसपास से किसी भी अतिरिक्त बढ़ते मध्यम से साफ कर लें और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ इसे सील.
- Confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग आंख डिस्क की फ्लोरोसेंट छवियों पर कब्जा.
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल के उपयोग का एक उदाहरण के रूप में, परिणाम midpupal (42 बजे 25 डिग्री सेल्सियस पर APF) अलग एंटीबॉडी के साथ immunostained आंख डिस्क illustrating phosphotyrosine अवशेषों के खिलाफ निर्देशित एक एंटीबॉडी का उपयोग करके चित्रा 2 में प्रस्तुत कर रहे हैं, कोशिकाओं की झिल्ली हो सकता है मनाया (2A चित्रा). इस midpupal चरण से पहले होने वाले अंतिम patterning प्रक्रियाओं निम्नलिखित पोटा संबंधी आंख में ommatidial कोशिकाओं की नियमित व्यवस्था की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक अन्य प्रतिनिधि छवि शंकु कोशिकाओं के नाभिक कट प्रतिलेखन कारक (चित्रा 2 बी) के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग कर से पहचाना जा सकता है दर्शाया गया है.
चित्रा 1:. विच्छेदन प्रक्रिया में इस्तेमाल किया धौंकनी ट्यूब के विधानसभा आरेख वें पर जानकारी के लिए सामग्री अनुभाग देखेंधौंकनी ट्यूब का ई अलग घटकों.
चित्रा 2:. Midpupal आंख डिस्क के immunostaining 42 बजे APF पर) ommatidia (phosphotyrosine) और पोटा संबंधी आंख डिस्क से बी) कोन सेल नाभिक (कट) के शिखर आकृति विज्ञान एक कल्पना करने के लिए इस प्रोटोकॉल के उपयोग का प्रदर्शन प्रतिनिधि immunostaining. स्केल सलाखों 50 माइक्रोन =.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) | 80 g NaCl, 2g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Caution: Irritant! Wear gloves. |
| 0.3% PBT | 1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. |
| Fix Solution | (≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use | ||
| Normal goat serum | Rockland antibodies & assays | B304 | Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C |
| Block Solution | 10% NGS in PBT. This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use. | ||
| DAPI stock solution | Life Technologies | D3571 | For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O. |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Labs | H-1000 | Mounting medium |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O. |
| Equipment | |||
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | Used to rock tissue in 3 well glass dish |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Krayden | NC9897184 | Used to make silicone dissection dish |
| Silicone dissecting dish | Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator. | ||
| 3 well glass dish | Corning | 7220-85 | The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product. |
| 72 well microwell minitray | Nunc | 438733 | |
| Sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade | Ted Pella | 1346 | |
| 100 mm Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow. |
| Disposable Transfer Pipets, Fine Tip | Samco Scientific | 231 | |
| Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches | |||
| PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2. |
| Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00001 |
References
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