Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Вскрытие и Монтаж Published: November 9, 2014 doi: 10.3791/52315

Introduction

Поля развития и клеточной биологии были значительно повлияло на модель организма: дрозофилы. В рамках этой модели, исследования диска глазного способствовали большое знаний относительно сигнализации, клеточной биологии и других областях. Покойный третий личиночной диск возрастной стадии глаз хорошо изучена и является мощным модель для использования, так как она дает снимок серии периодов развития, каждый со своими молекулами и процессов уникальный сигнальных, как морфогенетические борозды прогрессирует по диску глаз 8. Тем не менее, существует необходимость дальнейшего расширения нашего понимания процессов развития в куколки фазе развития. В то время как были проведены исследования по куколки глаз диска 3-7, наши знания не подходит широту работы, которая была выполнена на третьем диске возрастной стадии глаз. Это связано, в частности, к большей сложности в рассекает куколки диск глаз. Таким образом, презентациясобственно метод рассечения может значительно расширить научные исследования в этой области.

В то время как есть этапы в рамках развития куколки глаз дисков, которые легко рассеченные, особенно вокруг периода середины куколки, другие временные периоды гораздо более сложной задачей, чтобы рассекать. Этот протокол представляет собой один способ рассечения куколки глаз диски, которые можно повсеместно используемые для всех куколок развития временных рамок. Этот протокол может быть использован в качестве альтернативы другим протоколом 9, который показывает более простой и быстрый метод рассекать глазные диски из midpupal моменты времени. Этот протокол изначально снимается и разработана для подготовки студентов старших курсов бакалавриата в UCLA Бакалавриат исследовательского консорциума в функциональной геномики (URCFG) 10,11 в технике куколки глаз вскрытия. Многие студенты бакалавриата смогли использовать это видео и метод, чтобы узнать эту сложную технику.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эта процедура представляет собой процедуру, 2 день.

День 1 (2 ч + рассекает время)

1. куколки глаз Диск Рассечение

  1. Выберите куколку для вскрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: возраст куколки быть расчлененным будет определяться экспериментальным потребностей. Тем не менее, если изучение морфологии клеток, это часто делается на 42 ч после образования пупария (APF) при 25 ° С, что возраст куколок показано на видео. Собирают белый куколки (считается 0 ч APF) с увлажненной кистью и расположить их в хронологическом порядке (в зависимости от времени сбора) в новой муха пищевой флакон, поддерживаемой при 25 ° С. Рассеките возрасте куколки в этом же хронологическом порядке, чтобы сохранить разницу во времени между куколок как можно ближе.
  2. Передача куколки в каплю фосфатно-солевом буфере (PBS, рН 7,4, см материалы для рецепте) на силиконовой пластины вскрытии.
  3. Держите верхнюю часть куколки случае с пинцетом и проколоть и открыть лАуэр часть куколки случае с парой острых щипцов. Снимите куколку из дела во вновь образовавшуюся дыру.
  4. Сделайте диагональный срез ножницами, середине грудной клетки, в куколки. Снимите мусора или передавать куколка голову к новому падению PBS. Чистый помощью пипетки с грушей трубку (см материалы и рисунок 1 для деталей) и добавить дополнительную PBS по мере необходимости. Убедитесь, чтобы избежать обезвоживания.
  5. Надежно возьмитесь за верхнюю часть куколки головы кутикулы с парой щипцов. С помощью кончика трубы воздуходувки, осторожно нажмите на куколки случае выдавливать мозг и другие ткани, в том числе глазных дисков, из куколки случае. Будьте уверены, чтобы избежать захвата любой ткани в кутикулу.
  6. Использование вентилятора трубку, наполненную PBS, мягко удар жира ткани тела и другой мусор из головы случае четко отделить и идентифицировать мозговые и глазные диски.
    Примечание: Ведение мозг, прикрепленный к головной куколки случае позволит использовать исследователь онОбъявление случай как "ручки" для дальнейшего манипулирования ткани, не повреждая глаз диски или мозг. Тем не менее, оно является общим для сместить мозга и глаз диски из головного случае, и это не наносит ущерб общей процедуры и результаты. Это часто занимает несколько попыток дуть и толкает успешно извлекать глазные диски и мозг изнутри куколки случае головки и так, чтобы они четко отделены от окружающих тканей. Чище и отдельный можно получить глазные диски из окружающих тканей поможет предотвратить постороннее ткани от фиксации в глаза дисков.
  7. После вскрытия, немедленно передать ткани на стеклянную посуду 3 скважины на льду с 0,5 мл раствора Фикс (см материалы). Поплавок ткани на поверхности Fix решения в течение нескольких минут (обычно на время, необходимое для рассекать следующий набор глазных дисков).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если это не первый глаз диск, чтобы разрезать в этом раунде рассечение, completelу погрузить предыдущий глаз диск в Fix решения. При выполнении специальных процедур окрашивания (например, активные формы кислорода, лизосом и т.д.) это должно быть сделано до фиксации. Для того чтобы сделать это, хранить расчлененный глазные диски в ледяной PBS до продолжения соответствующего протокола окрашивания.
  8. После вскрытия и погружение всех глазных дисков, которые расчленены, переместите стекло блюдо 3 а к рокера и рок при комнатной температуре в течение 30 мин.

2. Иммуноокрашивание

  1. Осторожно снимите Fix решение и добавить 0,5 мл PBS с 0,3% Triton X-100 (0,3% PBT, ознакомиться с материалами) и мыть ткань на кресле-качалке в течение 10 мин. Повторите этот шаг еще три раза в общей сложности 4 стирок (10 мин каждый).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательное удаление раствора из скважины может быть выполнена под микроскопом рассекает чтобы предотвратить повреждение тканей или потери. Решение может быть атмосферный тщательно пипеткой; мы предпочитаем тонкую tippeд, одноразовые передачи пипетки, что была на открытии сплющенный уменьшить шанс аспирационных ткани.
  2. В конце 4-й стирки, мыть удалить и добавить 0,5 мл раствора блок (см материалы) в лунку и инкубировать в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: этот период времени может быть продлен в соответствии с вашими потребностями.
  3. В конце времени блока 30 мин, пипетки 10 мкл первичного антитела раствора (разбавленного раствора в блок) в соответствующее числу скважин в планшете.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Один лунку планшете будет разместить около 4 пары глаз дисков, подключенных к куколки случае или 8 изолированных пар глаз дисков с мозгами прилагается. В качестве первичных антител в этом протоколе для репрезентативных данных являются анти-фосфотирозина (1: 500 разведение) и анти-Cut (1: 200 разведение).
  4. Перенести расчлененный ткани в планшете скважин, заполненных промывочной первичного антитела Решение от стеклянной посуде 3 а.
  5. Местопланшета дл смачиваемой на бумажное полотенце (чтобы предотвратить обезвоживание) в качестве наконечника пипетки поле пустым (или другого подобного контейнера) и хранят при температуре 4 ° С в течение ночи.

День 2 (4 ч + монтаж время)

  1. Передача ткани из планшете к новому стеклянную посуду 3 скважины с 0,3% PBT (≈0.5 мл) и промывают ткань в течение 10 мин на качалке. Повторите этот шаг еще три раза в общей сложности 4 стирок (10 мин каждый)
  2. Удалить последнюю стирку и добавить 0,5 мл раствора Блок к колодцу. Блок в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: этот период времени может быть продлен в соответствии с вашими потребностями.
  3. Удаление раствора Block и добавить 0,5 мл раствора вторичного антитела (из флуоресцентно меченых антител, соответствующих вашей первичного антитела и длина волны флуоресценции, разведенного в растворе блок) на лунку и защитить стеклянную посуду 3 также от света с крышкой или алюминия фольга и инкубировать в течение по крайней мере 2 ч при комнатнойТемпература.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги должны быть так же защищены от воздействия света. Это инкубирование может быть продолжено в течение ночи при 4 ° С, в установке, подобной первичной инкубации антитела, но она также может быть выполнена в стеклянной чашке 3 хорошо покрыты лабораторной пленкой, или планшете, если сохранение желаемого антитела.
  4. В конце инкубации антител, удалить вторичным антителом решение и добавить 0,5 мл 0,3% PBT к колодцу и мыть на качалке в течение 10 мин. Повторите этот шаг для в общей сложности 4 стирок (10 мин каждый).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если окрашивание DAPI желательно, перед началом первой стирки, добавить 0,5 мкл DAPI раствора (см материалы) к 500 мкл PBT, которые будут использоваться для первой стирки (1: 1000 разбавления).

3. Монтаж

  1. В конце последней стирки, монтировать усиков / глаз диски на слайде, используя 70% глицерина или PBS в качестве среды для удаления брAin и других нежелательных тканей в бассейне на одной стороне слайда.
  2. Осторожно переместить ткань с использованием гидростатического давления между щипцов, или очень аккуратно с наконечником щипцов, и выстраиваются глазные диски в колонну по направлению к центру слайда.
  3. Удалите все посторонние глицерин или PBS со всего ткани (используя влагу действие лаборатории салфеткой или щипцы работать для этого).
  4. Поместите небольшое количество (≈10 мкл) из монтажной среды вдоль одной стороны колонны глаз диска и поместить на покровное ткани таким образом, чтобы распространить монтажную среду на глаз дисков.
  5. Пусть слайд сидеть за 1 до 2 мин, чтобы ткань / монтажа средних распространяться полностью.
  6. Протрите каких-либо дополнительных крепления среду от от по краям покровного стекла и запечатать его с прозрачным лаком для ногтей.
  7. Захват флуоресцентные изображения глаз диски с использованием конфокальной микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В качестве примера использования этого протокола, иллюстрирующая результаты midpupal (42 ч АПФ при 25 ° С) глазные диски иммунному окрашиванию с различными антителами представлены на рисунке 2. С помощью антитело, направленное против фосфотирозиновых остатков, мембрана из клеток может быть Наблюдаемый (2А). Это может быть использовано, чтобы определить правильное расположение ommatidial клеток в куколки глаза, следующий за последним процессов, происходящих паттерна до midpupal стадии. Еще один представитель изображение изображает ядра колбочек может идентифицированы с использованием антитела против фактора транскрипции Вырезать (Фигура 2В).

Рисунок 1
Рисунок 1:. Схема сборки из трубы воздуходувки, используемого в процедуре вскрытия Смотрите раздел материалы для подробной информации о гое отдельные компоненты трубы воздуходувки.

Рисунок 2
Рисунок 2:. Иммуноокрашивание midpupal глаз дисков представитель иммуноокрашивание демонстрации использования этого протокола для визуализации) верхушечный морфологию омматидиев (фосфотирозина) и б) конус клеточных ядер (Cut) из куколок глаз дисков на 42 часов НПФ. Шкала бары = 50 мкм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) 80 g NaCl, 2g  KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using.
Triton X-100 Promega H5142 Caution: Irritant! Wear gloves.
0.3% PBT 1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS.
37% formaldehyde solution Fisher Scientific F75P1GAL Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. 
Fix Solution (≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use
Normal goat serum Rockland antibodies & assays B304 Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C
Block Solution 10% NGS in PBT.  This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use.
DAPI stock solution Life Technologies D3571 For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O.
VectaShield Mounting Medium Vector Labs H-1000 Mounting medium
Glycerol Sigma G5516 For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O.
Equipment
Nutating mixer VWR 82007-202 Used to rock tissue in 3 well glass dish
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit Krayden NC9897184 Used to make silicone dissection dish
Silicone dissecting dish Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator.
3 well glass dish Corning 7220-85 The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product.
72 well microwell minitray Nunc 438733
Sharp forceps (Dumont #55) Fine Science Tools 11255-20
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade Ted Pella 1346
100 mm Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B100-4 Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow.
Disposable Transfer Pipets, Fine Tip Samco Scientific 231
Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches
PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32) Nalgene 8000-0010 Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2.
Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32) Saint Gobain Performance Plastics ABW00004
Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32) Saint Gobain Performance Plastics ABW00001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
  2. Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
  3. Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
  4. Bao, S., Cagan, R. Preferential adhesion mediated by Hibris and Roughest regulates morphogenesis and patterning in the Drosophila eye. Dev cell. 8 (6), 925-935 (2005).
  5. Grzeschik, N. A., Knust, E. IrreC/rst-mediated cell sorting during Drosophila pupal eye development depends on proper localisation of DE-cadherin. Development. 132 (9), 2035-2045 (2005).
  6. Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454 (7203), 533-537 (2008).
  7. Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40 (4), 851-858 (1985).
  8. Voas, M. G., Rebay, I. Signal integration during development: insights from the Drosophila eye. Dev Dyn. 229 (1), 162-175 (2004).
  9. Hsiao, H. Y., et al. Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas. J Vis Exp. , 4347 (2012).
  10. Call, G. B., et al. Genomewide clonal analysis of lethal mutations in the Drosophila melanogaster eye: comparison of the X chromosome and autosomes. Genetics. 177 (2), 689-697 (2007).
  11. Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3 (2), 59 (2005).
  12. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
  13. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. 37, 1936 (2010).
  14. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  15. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).

Tags

Биология развития выпуск 93 дрозофилы диск глаз Вскрытие Монтаж Pupa биология развития фоторецепторов имагинальная диск иммуноокрашивание
Вскрытие и Монтаж<em&gt; Drosophila</em&gt; Куколочные глаз Диски
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson,More

Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. J. Vis. Exp. (93), e52315, doi:10.3791/52315 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter