Introduction
Het gebied van ontwikkelings- en celbiologie zijn sterk beïnvloed door het modelorganisme: Drosophila melanogaster. Binnen dit model, hebben studies van het oog schijf een veel kennis met betrekking tot signalering, celbiologie en andere gebieden bijgedragen. De late derde larvale oog instar disc is uitgebreid bestudeerd en is een krachtig model te gebruiken, want het geeft een momentopname van een reeks van ontwikkelings periodes, elk met zijn eigen unieke signaalmoleculen en processen, het morfogenetisch groef vordert in het oog disc 8. Er is echter behoefte aan begrip van ontwikkelingsprocessen verder uit in het popstadium ontwikkelingsfase. Hoewel er studies zijn geweest op de pupal oog disc 3-7, heeft onze kennis niet de aanpak van de breedte van het werk dat is uitgevoerd op het derde oog instar disc. Dit is deels te wijten aan de grotere moeilijkheid ontleden het popstadium oog disc. Daarom is een presentatie van dejuiste methode van dissectie kan sterk uitbreiden van onderzoek op dit gebied.
Terwijl er stadia binnen pupal oog disc ontwikkeling die gemakkelijk kunnen worden ontleed, met name rond de mid-pupal periode, andere perioden zijn veel moeilijker te ontleden. Dit protocol is een werkwijze voor het ontleden popstadium oog schijven die universeel toepasbaar is voor alle popstadium ontwikkelingstijd frames. Dit protocol kan worden gebruikt als een alternatief voor een ander protocol 9 dat een eenvoudiger en snellere methode in oog discs ontleden van de midpupal tijdstippen toont. Dit protocol werd oorspronkelijk gefilmd en ontwikkeld voor de opleiding gevorderde studenten in het UCLA Undergraduate Research Consortium in Functional Genomics (URCFG) 10,11 in de techniek van pupal oog dissectie. Veel studenten waren in staat om deze video en de methode gebruiken om deze uitdagende techniek te leren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze procedure is een 2 daagse procedure.
Dag 1 (2 uur + ontleden tijd)
1. Pupal Disc Eye Dissection
- Selecteer een pop voor dissectie.
OPMERKING: De leeftijd van de pop ontleed wordt bepaald door de experimentele behoeften. Indien behandeling celmorfologie wordt dit vaak gedaan op 42 uur na verpopping formatie (APF) bij 25 ° C, de leeftijd van het in beeld poppen. Verzamel witte poppen (beschouwd 0 hr APF) met een bevochtigde penseel en schik ze in chronologische volgorde (op basis van de collectie tijd) in een nieuwe vlieg voedsel flacon gehandhaafd op 25 ° C. Ontleden oude poppen in dezelfde chronologische volgorde de tijdsverschillen tussen poppen zo dicht mogelijk te houden. - Breng de pop in een druppel-fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4, zie materialen voor recept) op een siliconen dissectie plaat.
- Houd de bovenkant van het popstadium geval pincet en doorboren en open de lower deel van de pupal geval met een paar scherpe tang. Verwijder de pop van de behuizing in de nieuw gevormde gat.
- Maak een diagonale knippen met een schaar, mid-thorax, in de pop. Verwijder het vuil of de overdracht van de pop hoofd om een nieuwe druppel PBS. Reinig met behulp van de pipet blaaspijp (zie materialen en Figuur 1 voor details) en voeg extra PBS als dat nodig is. Zorg ervoor om uitdroging te voorkomen.
- Stevig greep de bovenkant van het popstadium kop cuticula met een pincet. Met de punt van de blaaspijp, duw op het popstadium naar de hersenen en andere weefsels, waaronder het oog schijven uit het popstadium extruderen. Vermijd het grijpen elk weefsel in de cuticula.
- Met behulp van de blower buis gevuld met PBS, zachtjes blazen het vet lichaamsweefsel en ander vuil uit het hoofd zaak om duidelijk te scheiden en identificeren van de hersenen en de ogen schijven.
OPMERKING: Het houden van de hersenen verbonden aan de pupal hoofd geval zal de onderzoeker aan het gebruik dat hijad geval als een "handvat" voor toekomstige manipulatie van het weefsel, zonder beschadiging van het oog schijven of de hersenen. Het is echter gebruikelijk om de hersenen en ogen schijven uit het hoofd zaak los en dit is niet schadelijk voor de algemene procedure en de resultaten. Het duurt vaak meerdere pogingen blazen en duwen het oog schijven en hersenen winnen uit vanuit het popstadium hoofdgeval en zodat ze duidelijk onderscheiden van het omringende weefsel. De schonere en meer afzonderlijke men kan de ogen schijven uit de omliggende weefsel te krijgen zal helpen voorkomen dat vreemde weefsel van de bevestiging aan het oog schijven. - Na dissectie, onmiddellijk het weefsel naar een goed 3 glazen schaal op ijs met 0,5 ml oplossing Fix (zie materialen). Drijven het weefsel op het oppervlak van de Fix-oplossing voor een paar minuten (meestal de tijd die het kost om de volgende set eye discs ontleden).
OPMERKING: Als dit niet het eerste oog disc worden ontleed in deze ronde van de dissectie, completely dompel de vorige oog disc in de Fix-oplossing. Als het uitvoeren van speciale kleuringen (bijv reactive oxygen species, lysosomen, etc.) moet dit voorafgaand aan de fixatie worden gedaan. Om dit te doen, bewaar de ontleed oog schijven in ijskoude PBS voordat ze doorgaan met de juiste kleuringsprotocol. - Na dissectie en onderdompeling van alle eye discs worden ontleed, bewegen de 3 goed glazen schaal op een rocker en rock bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
2. Immunokleuring
- Verwijder voorzichtig de Fix-oplossing en voeg 0,5 ml PBS met 0,3% Triton X-100 (0.3% PBT, zie materialen) en was het weefsel op een rocker gedurende 10 min. Herhaal deze stap drie keer voor een totaal van 4 wassen (10 minuten elk).
OPMERKING: Zorgvuldige verwijdering van de oplossing uit de put kan onder een dissectie microscoop weefsel schade voorkomen. De oplossing kan zorgvuldig worden opgezogen met een pipet; we de voorkeur aan een fine-Tipped, wegwerp transfertpipet dat de opening afgeplat om de kans opzuigen weefsel verminderen heeft. - Aan het einde van de 4e wassen, verwijdert de was en voeg 0,5 ml blokkeeroplossing (zie materialen) om de putje en incubeer gedurende 30 minuten.
LET OP: Deze termijn kan worden verlengd op basis van uw behoeften. - Aan het eind van de 30 min bloktijdfactor Pipetteer 10 ul van primair antilichaam oplossing (verdund in blok-oplossing) in hun aantal putten in een microwell plaat.
OPMERKING: Een put van een microwell plaat zal geschikt voor ongeveer 4 paar ogen schijven bevestigd aan de pupal zaak of 8 geïsoleerde paar eye discs with brains bevestigd. De primaire antilichamen gebruikt in dit protocol voor de representatieve gegevens zijn antifosfotyrosine (1: 500 verdunning) en anti-Cut (1: 200 verdunning). - Breng de ontleed weefsel in de microwell putjes gevuld met het primaire antilichaam oplossing van de 3 goed glas schotel.
- Plaatsde microwell plaat op een natte papieren handdoek in een lege pipet tip box (of soortgelijke houder) en opslag (ter voorkoming van uitdroging) bij 4 ° C overnacht.
Dag 2 (4 uur + montage tijd)
- Breng het weefsel uit de microwell plaat aan een nieuwe 3 goed glas schotel met 0,3% PBT (≈0.5 ml) en was het weefsel gedurende 10 minuten op de rocker. Herhaal deze stap drie keer voor een totaal van 4 wassen (10 minuten elk)
- Verwijder de laatste wasbeurt en voeg 0,5 ml Block oplossing voor de put. Blokkeren gedurende 30 min.
LET OP: Deze termijn kan worden verlengd op basis van uw behoeften. - Verwijder de Block oplossing en voeg 0,5 ml van het secundaire antilichaam oplossing (gemaakt van fluorescerend gemerkte antilichamen geschikt primaire antilichaam en fluorescerende golflengte, verdund in blok-oplossing) aan de put en beschermen de 3 en glazen schaal tegen licht met een deksel of aluminium folie en incubeer gedurende minimaal 2 uur bij kamertemperatuurtemperatuur.
OPMERKING: Alle volgende stappen moet op dezelfde manier worden beschermd tegen blootstelling aan licht. Deze incubatie kan overnacht worden verlengd bij 4 ° C, in een opstelling vergelijkbaar met het primaire antilichaam incubatie, maar het kan ook een goed 3 glazen schaal bedekt met laboratorium film of een microwell plaat als bescherming antilichaam gewenst worden uitgevoerd. - Aan het einde van het antilichaam incubatie, verwijder het secundaire antilichaam Solution en voeg 0,5 ml van 0,3% PBT naar de put en was op de wip voor 10 min. Herhaal deze stap voor in totaal 4 wasbehandelingen (10 min elk).
OPMERKING: Indien DAPI kleuring gewenst, voordat de eerste wasbeurt, voeg 0,5 pl DAPI voorraadoplossing (zie materialen) van 500 gl PBT die gebruikt worden voor de eerste wasbeurt (1: 1000 verdunning).
3. Montage
- Aan het einde van de laatste wasbeurt, monteer de antennal / oog schijven op een dia met behulp van 70% glycerol of PBS als een medium om de br verwijderenain en andere ongewenste weefsel in een pool aan een zijde van de slede.
- Duw het weefsel met hydrostatische druk tussen de tangen of zeer voorzichtig met een pincet tip, en lijn het oog schijven in een kolom naar het midden van de schuif.
- Verwijder alle vreemde glycerol of PBS uit de hele weefsel (met behulp van wicking actie van een laboratorium afvegen of de tang werken voor dit).
- Plaats een kleine hoeveelheid (≈10 pl) van fixeermiddel langs één zijde van de oogkolom schijf en plaats een dekglaasje op het weefsel teneinde het fixeermiddel op het oog schijven spreiden.
- Laat slide zitten gedurende 1 tot 2 minuten zodat de weefsels / fixeermiddel volledig spreiden.
- Veeg eventuele extra montage medium af van rond de randen van het dekglaasje en verzegelt het met duidelijke nagellak.
- Leg fluorescerende beelden van het oog schijven met behulp van confocale microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als voorbeeld van het gebruik van dit protocol, resultaten illustreren midpupal (42 uur APF bij 25 ° C) oog discs immunostained verschillende antilichamen zijn weergegeven in figuur 2. Door een antilichaam gericht tegen fosfotyrosine residu kan het membraan van de cellen waargenomen (Figuur 2A). Dit kan worden gebruikt om de regelmatige rangschikking van ommatidial cellen in het popstadium oog identificeren na het laatste patroon processen die vóór de midpupal stadium plaatsvinden. Een ander representatief beeld toont de kernen van kegeltjes kunnen worden geïdentificeerd met behulp van een antilichaam tegen het Cut transcriptiefactor (Figuur 2B).
Figuur 1:. Assemblage diagram van de blaaspijp gebruikt in de dissectie procedure Zie de sectie materialen voor meer informatie op the afzonderlijke componenten van de blaaspijp.
Figuur 2:. Immunokleuring van midpupal oog schijven Vertegenwoordiger immunostaining aantonen van het gebruik van dit protocol om te visualiseren A) de apicale morfologie van ommatidia (fosfotyrosine) en B) conus celkernen (Snij) uit pupal oog schijven op 42 hrs APF. Schaalbalken = 50 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) | 80 g NaCl, 2g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Caution: Irritant! Wear gloves. |
| 0.3% PBT | 1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. |
| Fix Solution | (≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use | ||
| Normal goat serum | Rockland antibodies & assays | B304 | Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C |
| Block Solution | 10% NGS in PBT. This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use. | ||
| DAPI stock solution | Life Technologies | D3571 | For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O. |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Labs | H-1000 | Mounting medium |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O. |
| Equipment | |||
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | Used to rock tissue in 3 well glass dish |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Krayden | NC9897184 | Used to make silicone dissection dish |
| Silicone dissecting dish | Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator. | ||
| 3 well glass dish | Corning | 7220-85 | The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product. |
| 72 well microwell minitray | Nunc | 438733 | |
| Sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade | Ted Pella | 1346 | |
| 100 mm Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow. |
| Disposable Transfer Pipets, Fine Tip | Samco Scientific | 231 | |
| Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches | |||
| PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2. |
| Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00001 |
References
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential adhesion mediated by Hibris and Roughest regulates morphogenesis and patterning in the Drosophila eye. Dev cell. 8 (6), 925-935 (2005).
- Grzeschik, N. A., Knust, E. IrreC/rst-mediated cell sorting during Drosophila pupal eye development depends on proper localisation of DE-cadherin. Development. 132 (9), 2035-2045 (2005).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454 (7203), 533-537 (2008).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40 (4), 851-858 (1985).
- Voas, M. G., Rebay, I. Signal integration during development: insights from the Drosophila eye. Dev Dyn. 229 (1), 162-175 (2004).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas. J Vis Exp. , 4347 (2012).
- Call, G. B., et al. Genomewide clonal analysis of lethal mutations in the Drosophila melanogaster eye: comparison of the X chromosome and autosomes. Genetics. 177 (2), 689-697 (2007).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3 (2), 59 (2005).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. 37, 1936 (2010).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
