Introduction
Områderne for udviklingsmæssige og cellebiologi er blevet stærkt påvirket af modelorganismen: Drosophila melanogaster. Inden for denne model, har undersøgelser i øjet skive bidraget med en stor viden om signal-, cellebiologi og andre områder. Den sene tredje larve instar øje disk er undersøgt grundigt, og er en kraftfuld model til at udnytte, da det giver et øjebliksbillede af en række udviklingsmæssige perioder, hver med sine egne unikke signalmolekyler og processer, som det morfogenetiske fure skrider hen over øjet disken 8. Der er imidlertid et behov for yderligere at udvide vores forståelse af udviklingsprocesser i puppe udviklingsfase. Mens der har været undersøgelser af puppe øje skiven 3-7, er vores viden ikke nærme bredden af arbejde, der er udført på tredje stadie øje disk. Dette skyldes til dels den større vanskeligheder med at dissekere den puppe øje disken. Derfor er en præsentation afrette metode til dissektion kunne i høj grad udvide forskningen på dette område.
Mens der er stadier inden puppe udvikling øje disc, som er let dissekeret, især omkring midten af puppe periode, andre perioder er langt mere udfordrende at dissekere. Denne protokol udgør en metode til at dissekere puppe øje diske, der kan bruges alment til alle puppe udviklingsmæssige tidsrammer. Denne protokol kan anvendes som et alternativ til en anden protokol 9, som viser en lettere og hurtigere metode til at dissekere øjet diske fra midpupal tidspunkter. Denne protokol blev oprindeligt filmet og udviklet til at træne avancerede bachelorstuderende i UCLA Undergraduate Research Consortium i Functional Genomics (URCFG) 10,11 i teknikken med puppe øje dissektion. Mange studerende var i stand til at udnytte denne video og metode til at lære denne udfordrende teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne procedure er en 2 dages procedure.
1 dag (2 timer + dissekere tid)
1. puppe Eye Disc Dissection
- Vælg en puppe til dissektion.
BEMÆRK: alder puppe til dissekeres vil blive bestemt af de eksperimentelle behov. Men hvis behandlingen cellemorfologi, dette sker ofte ved 42 timer efter puparium formation (APF) ved 25 ° C, hvilket er en alder af pupperne vist i videoen. Saml hvid pupper (betragtet 0 HR APF) med en fugtet pensel og arrangere dem i kronologisk rækkefølge (baseret på indsamling tid) i en ny flue fødevare hætteglas holdt ved 25 ° C. Dissekere alderen pupper i samme kronologiske rækkefølge at holde tidsforskelle mellem pupper så tæt som muligt. - Overfør puppe i en dråbe phosphatbufret saltvand (PBS, pH 7,4, se materialer til opskrift) på en silicone dissekere plade.
- Hold toppen af puppe tilfældet med pincet og gennembore og åbn lower del af puppe tilfældet med et par skarpe pincet. Fjern puppe fra tilfældet i den nydannede hul.
- Lav en diagonal snit med en saks, mid-brystkasse, i puppe. Fjern snavs eller overdrage puppe hovedet til en ny dråbe PBS. Rengør ved hjælp af pipette blæser rør (se materialer og figur 1 for detaljer) og tilføje ekstra PBS efter behov. Sørg for at undgå dehydrering.
- Sikkert greb toppen af puppe hoved kutikula med en pincet. Med spidsen af blæserrøret, forsigtigt den puppe tilfælde at ekstrudere hjernen og andre væv, herunder øjet diske, ud af puppe sag. Vær sikker på at undgå at snuppe noget væv i neglebånd.
- Brug af blæser rør fyldt med PBS, skal du forsigtigt puste fedt kroppen væv og andet snavs ud af hovedet sagen til klart adskilt og identificere hjernen og øjet diske.
BEMÆRK: Hold hjernen knyttet til puppe hoved sagen vil gøre det muligt for forskeren at bruge hanannonce sagen som et "håndtag" til fremtidig manipulation af vævet uden at beskadige øjet diske eller hjerne. Det er imidlertid almindeligt at løsne hjerne og øjne diske fra hovedet tilfældet, og ikke er til skade for den samlede procedure og resultater. Det tager ofte flere forsøg på at blæse og presser på for at held udtrække øjet diske og hjerne inde fra puppe hoved sagen og så at de er klart adskilt fra det omgivende væv. Den renere og mere særskilt man kan få øjet diske fra det omgivende væv, vil hjælpe med at forhindre uvedkommende væv fra fastsættelse for øjet diske. - Efter dissektion straks overføre vævet til en 3 godt glasskål på is med 0,5 ml Fix opløsning (se materialer). Flyde væv på overfladen af Fix løsning for et par minutter (typisk den tid det tager at dissekere det næste sæt af øjet disks).
BEMÆRK: Hvis det ikke er det første øje disken, der skal dissekeres i denne runde af dissektion, completely nedsænkes tidligere øjet disken i Fix løsning. Hvis der udføres særlige farvningsprocedurer (f.eks reaktive ilt arter, lysosomer, etc.) skal dette gøres før fiksering. For at gøre dette, opbevarer de dissekerede øjet diske i iskoldt PBS før at fortsætte med den passende farvningsprotokol. - Efter dissektion og nedsænkning af alle øjet diske bliver dissekeret, flytte 3 godt glas fad til en rocker og rock ved stuetemperatur i 30 min.
2. Immunfarvning
- Fjern forsigtigt Fix og der tilsættes 0,5 ml PBS med 0,3% Triton X-100 (0,3% PBT, se materialer) og vaskes vævet på en rocker for 10 min. Gentag dette trin tre gange for i alt 4 gange (10 min hver).
BEMÆRK: Forsigtig fjernelse af opløsningen fra brønden kan udføres under et dissektionsmikroskop for at forhindre vævsbeskadigelse eller tab. Kan opløsningen suget forsigtigt med en pipette; vi foretrækker en fin Tipped, engangs overførselspipette, der har haft åbningen fladtrykt for at reducere chancen for opsugning væv. - Ved udgangen af 4. vask, fjern vask og tilsættes 0,5 ml blok opløsning (se materialer) til brønd og inkuberes i 30 min.
BEMÆRK: Denne tidsramme kan udvides i henhold til dine behov. - Ved afslutningen af 30 min blok tid, pipette 10 pi af Primary Antibody opløsning (fortyndet i Block opløsning) i det passende antal brønde i en plade med mikrobrønde.
BEMÆRK: En brønd i en mikrobrøndsplade vil rumme omkring 4 par af øjet diske fastgjort til puppe sag eller 8 isolerede par af øjet diske med hjerner tilknyttet. De primære antistoffer anvendt i denne protokol for de repræsentative data er antiphosphotyrosin (1: 500 fortynding) og anti-Cut (1: 200 fortynding). - Overfør det dissekerede væv i mikrobrønd brønde fyldt med det primære antistof Solution fra 3 godt glasskål.
- Stedmikrobrøndovertrækket plade på en papirserviet fugtet (for at undgå dehydrering) i en tom pipettespids boks (eller anden lignende beholder) og opbevares ved 4 ° C natten over.
Dag 2 (4 hr + monterings tid)
- Overfør væv fra mikrobrønden pladen til et nyt 3 godt glas skål med 0,3% PBT (≈0.5 ml) og vaskes på vævet i 10 minutter på rocker. Gentag dette trin tre gange for i alt 4 gange (10 min hver)
- Fjerne den sidste vask, og der tilsættes 0,5 ml Block opløsning til brønden. Blokere i 30 minutter.
BEMÆRK: Denne tidsramme kan udvides i henhold til dine behov. - Fjern Block og der tilsættes 0,5 ml af det sekundære antistof Solution (fremstillet af fluorescens-mærkede antistoffer egnede til primære antistof og fluorescerende bølgelængde, fortyndet i blokeringsopløsning) til brønden og beskytte 3 godt glasskål fra lys med et dæksel eller aluminium folie og inkuberes i mindst 2 timer ved stuetemperaturtemperatur.
BEMÆRK: Alle efterfølgende skridt bør ligeledes beskyttes mod lys eksponering. Denne inkubation kan udvides til natten over ved 4 ° C, i en opsætning svarer til det primære antistof inkubering, men det kan også udføres i en 3 godt glasskål dækket med laboratorium film eller en plade med mikrobrønde, hvis der ønskes antistof bevaring. - Ved udgangen af antistoffet inkubation fjernes sekundære antistof Solution og tilsæt 0,5 ml 0,3% PBT til brønden og vaske på rocker i 10 min. Gentag dette trin for i alt 4 gange (10 min hver).
BEMÆRK: Hvis der ønskes DAPI farvning, før du starter den første vask, tilsæt 0,5 ul DAPI stamopløsning (se materialer), til 500 gi PBT, der vil blive anvendt til den første vask (1: 1000 fortynding).
3. Montering
- Ved afslutningen af den sidste vask montere antennal / øje diske på et dias ved hjælp af 70% glycerol eller PBS som et medium for at fjerne brain og andre uønskede væv i en pulje på den ene side af slæden.
- Flyt forsigtigt vævet med hydrostatiske tryk mellem pincet eller meget forsigtigt med en pincet spids, og line up øjet diske i en kolonne mod midten af slæden.
- Fjern alle uvedkommende glycerol eller PBS fra hele væv (ved hjælp af vægevirkning af et laboratorium tørre eller pincet arbejde for dette).
- Placer en lille mængde (≈10 pi) til montering medium langs den ene side af kolonnen øjet disken og placere et dækglas på vævet, således at sprede montering medium på øjet diske.
- Lad slide sidde i 1 til 2 minutter for at tillade væv / mounting medium til at sprede sig fuldstændigt.
- Tør nogen ekstra montering medium off fra omkring kanterne af dækglasset og forsegle det med klar neglelak.
- Capture fluorescerende billeder af øjet diske med konfokalmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et eksempel på anvendelsen af denne protokol resultater illustrerer midpupal (42 timer APF ved 25 ° C) øjet diske immunofarvede med forskellige antistoffer er vist i Figur 2. Ved hjælp af et antistof rettet mod phosphotyrosinresterne kan membranen af cellerne være observeret (figur 2A). Dette kan anvendes til at identificere den regelmæssige arrangement af ommatidial celler i puppe øje efter de endelige mønsterdannende processer, der foregår før midpupal fase. En anden repræsentativ billede afbilder kerner af kegle celler kan identificeres ved anvendelse af et antistof mod Cut transkriptionsfaktor (figur 2B).
Figur 1:. Montering diagram af blæserrøret anvendes i dissektion procedure Se stoffer, afsnit for detaljer om the separate elementer af blæserøret.
Figur 2:. Immunofarvning af midpupal øjet diske Repræsentant immunfarvning demonstrerer brugen af denne protokol til at visualisere A) den apikale morfologi ommatidia (phosphotyrosin) og b) Tap kerner (Klip) fra puppe eye-diske med 42 hrs APF. Skalapanelerne = 50 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) | 80 g NaCl, 2g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Caution: Irritant! Wear gloves. |
| 0.3% PBT | 1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. |
| Fix Solution | (≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use | ||
| Normal goat serum | Rockland antibodies & assays | B304 | Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C |
| Block Solution | 10% NGS in PBT. This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use. | ||
| DAPI stock solution | Life Technologies | D3571 | For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O. |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Labs | H-1000 | Mounting medium |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O. |
| Equipment | |||
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | Used to rock tissue in 3 well glass dish |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Krayden | NC9897184 | Used to make silicone dissection dish |
| Silicone dissecting dish | Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator. | ||
| 3 well glass dish | Corning | 7220-85 | The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product. |
| 72 well microwell minitray | Nunc | 438733 | |
| Sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade | Ted Pella | 1346 | |
| 100 mm Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow. |
| Disposable Transfer Pipets, Fine Tip | Samco Scientific | 231 | |
| Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches | |||
| PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2. |
| Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00001 |
References
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential adhesion mediated by Hibris and Roughest regulates morphogenesis and patterning in the Drosophila eye. Dev cell. 8 (6), 925-935 (2005).
- Grzeschik, N. A., Knust, E. IrreC/rst-mediated cell sorting during Drosophila pupal eye development depends on proper localisation of DE-cadherin. Development. 132 (9), 2035-2045 (2005).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454 (7203), 533-537 (2008).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40 (4), 851-858 (1985).
- Voas, M. G., Rebay, I. Signal integration during development: insights from the Drosophila eye. Dev Dyn. 229 (1), 162-175 (2004).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas. J Vis Exp. , 4347 (2012).
- Call, G. B., et al. Genomewide clonal analysis of lethal mutations in the Drosophila melanogaster eye: comparison of the X chromosome and autosomes. Genetics. 177 (2), 689-697 (2007).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3 (2), 59 (2005).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. 37, 1936 (2010).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
