Introduction
초파리 melanogaster : 개발 및 세포 생물학의 분야는 크게 모델 생물에 의해 영향을하고있다. 이 모델 내에서 눈 디스크의 연구는 지식에 관한 신호 전달, 세포 생물학 및 다른 분야의 큰 거래를 기여했다. 후반 세 번째 애벌레 령 눈 디스크가 광범위하게 연구하고 개발 기간의 일련의 스냅 샷을 제공합니다으로 활용하는 강력한 모델 된, 고유의 신호 분자 및 프로세스 각각은, 형태 형성 고랑은 눈 디스크에 걸쳐 진행 8. 그러나, 앞으로의 개발 번데기 단계로 발달 과정에 대한 이해를 확장 할 필요가있다. 번데기 눈 디스크 3-7에 연구가되었지만, 우리의 지식은 세 번째 령 눈 디스크에 수행 된 작업의 폭을 접근하지 않습니다. 이 번데기 눈 디스크를 해부에 큰 어려움으로 부분적 때문이다. 따라서, 프레 젠 테이션해부의 적절한 방법은 크게이 지역에서 연구를 확장 할 수있다.
쉽게 특히 중반 번데기 기간의 주위에, 해부 번데기 눈 디스크 개발 내에서 단계가 있지만, 다른 기간은 훨씬 더 도전적인 해부한다. 이 프로토콜은 보편적으로 모든 번데기 발달 타임 프레임에 사용될 수 번데기 눈 디스크를 해부위한 하나의 방법을 나타낸다. 이 프로토콜은 midpupal 시점에서 눈 디스크를 해부 쉽고 빠른 방법을 나타낸 다른 프로토콜 (9)의 대안으로 사용될 수있다. 이 프로토콜은 원래 촬영 및 기능 유전체학 (URCFG) 번데기 눈 해부의 기술에서 10, 11에서 UCLA 학부 연구 컨소시엄에서 고급 학부 학생들을 훈련을 위해 개발되었다. 많은 학부 학생들이 도전적인 기술을 알아 보려면이 비디오 및 방법을 활용할 수 있었다.
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Protocol
이 절차는 이일 절차이다.
1 일 (2 시간은 + 시간 해부)
1. 번데기 아이 디스크 해부
- 해부의 번데기를 선택합니다.
참고 : 해부하는 번데기의 나이는 실험의 필요에 따라 결정됩니다. 세포 형태를 조사하는 경우에는,이 자주 비디오에 도시 번데기의 나이 인 25 ° C에서 puparium 형성 (APF) 후 42 시간에서 수행된다. 유체가 접촉되는 페인트 브러시와 흰색 번데기 (고려 0 시간의 APF)를 수집하고 25 ° C로 유지 새로운 플라이 식품 유리 병에 (수집 시간 기준) 시간 순서대로 배열합니다. 최대한 가까운 번데기 사이의 시간 차이를 유지하는 동일한 시간 순서로 세 번데기 해부. - 인산염 완충 식염수 한 방울에 번데기로 이동 실리콘 해부 접시에 (PBS, pH를 7.4, 조리법에 대한 자료를 참조).
- 집게와 피어스와 번데기 케이스의 상단을 잡고 L을 엽니 다날카로운 집게 한 쌍의 번데기 케이스의 된 ower 부분. 새로 형성된 구멍의 경우에서 번데기를 제거합니다.
- 번데기에서 가위, 중반 흉부와 대각선 컷을 확인합니다. 이물질을 제거 또는 PBS의 새로운 하락 번데기 머리를 전송합니다. 청소 피펫 송풍 튜브 (재료 및 자세한 내용은 그림 1 참조)를 사용하고 필요에 따라 추가 PBS를 추가합니다. 탈수를 방지해야합니다.
- 안전하게 그립 집게 한 쌍의 번데기 머리 표피의 맨. 송풍 튜브의 끝 부분을 사용하여 부드럽게 뇌와 번데기 케이스의 밖으로 눈 디스크를 포함하여 다른 조직을 돌출 번데기 케이스에 밀어 넣습니다. 표피 내의 모든 조직을 잡아 않도록해야합니다.
- PBS로 가득 송풍 튜브를 사용하여, 부드럽게 명확하게 분리하는 헤드 케이스에서 지방 신체 조직, 먼지 등을 날려 뇌와 눈 디스크를 식별합니다.
참고 : 번데기 헤드 케이스에 부착 된 뇌를 유지하는 것은 연구자가 자신을 사용하실 수 있습니다눈 디스크 나 뇌 손상을주지 않고 조직의 미래 조작에 대한 "핸들"로 광고하는 경우. 그러나, 헤드 케이스로부터 디스크 뇌와 눈을 제거하는 것이 일반적이며, 이것은 전체적인 절차 및 결과에 유해하지 않다. 그것은 종종 불고 성공적으로 그들이 분명히있는 주변 조직에서 분리하는 번데기 헤드 케이스 등 내에서 눈 디스크와 뇌를 추출하기 위해 추진하는 여러 시도를합니다. 깨끗하고 별도의 하나는 눈 디스크에 고정에서 외부 조직을 예방하는 데 도움이됩니다 주변 조직에서 눈 디스크를 얻을 수 있습니다. - 해부 이어 즉시 수정 용액 0.5 ㎖ (재료 참조) 얼음 3 웰 유리 접시에 조직을 전송. 몇 분 (이것은 눈 디스크의 다음 세트를 해부 걸리는 전형적 시간)에 대한 수정 용액의 표면 조직을 플로트.
참고 :이 해부, completel이 라운드에서 해부하는 최초의 아이 디스크가 아닌 경우Y는 수정 솔루션으로 이전 아이 디스크 잠수함. (등 예를 들어, 활성 산소 종, 리소좀,) 특수 염색 절차를 수행하면이 정착하기 전에 수행해야합니다. 이를 위해, 종래 적절한 염색 프로토콜로 계속 빙냉 PBS에서 해부 눈 디스크를 저장한다. - 모든 눈 디스크의 해부 및 침수를 수행하면 해부하고, 실온에서 30 분 동안 로커 바위에 3도 유리 접시를 이동합니다.
2. 면역 염색
- 조심스럽게 수정 용액을 제거하고 0.3 % 트리톤 X-100과 0.5 ml의 PBS를 추가 (0.3 % PBT, 자료 참조)와 10 분 동안 로커에 조직을 씻어. 4 세척 (10 분 각각)의 단계를 총 세 번 이상 반복합니다.
NOTE : 웰로부터의 용액을 조심스럽게 제거는 조직 손상 또는 손실을 방지하기 위해 해부 현미경 하에서 수행 될 수있다. 용액을 피펫으로 조심스럽게 흡인 될 수있다; 우리는 미세 tippe을 선호D, 조직의 흡인을 줄이려 평탄화 개구를 갖고 전사 일회용 피펫. - 넷째 세척이 끝나면, 세척을 제거하고 웰에 (재료 참조) 0.5 ml의 블록 용액을 추가 30 분 동안 배양한다.
참고 : 사용자의 필요에 따라 기간을 연장 할 수 있습니다. - 30 분의 시간 블록의 끝에서, 마이크로 웰 플레이트에서 웰의 적절한 수에 (블록 용액에 희석) 1 차 항체 용액 10 ㎕를 피펫.
주 : 마이크로 웰 플레이트 잘 하나가 번데기 케이스에 부착 된 눈 디스크의 약 4 쌍 또는 부착 두뇌와 눈 디스크의 8 격리 된 쌍을 수용 할 것입니다. (: 500 희석 (1)) 및 항 - 컷 (1 : 200 희석) 대표 데이터는이 프로토콜에서 사용 된 주요 항체는 항 - 포스이다. - 3 잘 유리 접시에서 일차 항체 용액으로 충전 마이크로 웰 플레이트의 우물에 해부 조직을 전송합니다.
- 장소젖은 종이 타월에 마이크로 웰 플레이트는 4 ° C에서 하룻밤 빈 피펫 팁 상자 (또는 기타 유사한 용기) 및 저장소 (탈수를 방지하기 위해).
2 일 (4 시간 + 시간 장착)
- 0.3 % PBT (≈0.5 ml)로 새로운 3 웰 유리 접시에 마이크로 웰 플레이트에서 조직을 전송하고 로커에 10 분 동안 조직을 씻는다. (4)의 세척 단계를 총 (10 분마다)을 세 번 이상 반복
- 마지막 세척을 제거하고 잘에 차단 솔루션의 0.5 ml를 추가합니다. 30 분 동안 차단합니다.
참고 : 사용자의 필요에 따라 기간을 연장 할 수 있습니다. - 덮개 또는 알루미늄의 빛에서 3 웰 유리 접시를 차단 솔루션을 제거하고 잘에 (블록 용액에 희석 기본 항체와 형광 파장에 적합한 형광 표지 항체에서 만든) 차 항체 용액 0.5 ml의 추가 및 보호 박 및 방에서 적어도 2 시간 동안 배양온도.
주 : 이후의 모든 단계가 유사하게 빛 노출로부터 보호되어야한다. 이 배양 차 항체 인큐베이션 유사한 설정에서, 4 ° C에서 밤새 확장 될 수 있지만, 또한 실험실 막 또는 항체 절약이 요구되는 경우에는 마이크로 웰 플레이트로 덮여 3 웰 유리 접시에 수행 될 수있다. - 항체 인큐베이션의 끝에, 차 항체 용액을 제거하고 웰에 0.3 % PBT 0.5를 가하여 10 분간 로커에 씻는다. 4 세척의 총에 대해이 단계 (10 분마다)를 반복합니다.
NOTE : (: 1000 희석 한) DAPI 염색이 필요한 경우, 첫 번째 세척을 시작하기 전에, 처음 세탁에 사용되는 PBT의 500 μL에 DAPI 저장 용액 0.5 μl를 (자료를 참조)에 추가.
3. 장착
- 마지막 세척이 끝나면, BR을 제거하는 매체로서 70 % 글리세롤 또는 PBS를 사용하여 슬라이드 더듬이 / 눈 디스크 마운트아인과 슬라이드의 일측에 풀 기타 원치 않는 조직.
- 조심스럽게 집게 사이의 수압을 이용하여 조직을 이동하거나 아주 부드럽게 포셉 팁, 및 상기 슬라이드의 중심을 향해 열에 눈 디스크를 일렬로.
- 조직 주위에서 모든 외부 글리세롤 또는 PBS를 제거 (실험실의 위킹 조치를 닦아 사용하거나 집게이 작동).
- 눈 디스크 열의 일측을 따라 장착 매체의 소량 (≈10 μL)을 놓고 눈 디스크에 장착 매질을 전파하도록 조직에 커버 슬립을 배치.
- 1 ~ 2 분은 조직 / 설치 매체가 완전히 확산 할 수 있도록하는 슬라이드 쉬십시오.
- 커버 슬립의 가장자리에서 모든 추가 설치 매체를 닦아 맑은 매니큐어로 밀봉.
- 공 초점 현미경을 이용하여 안구 디스크의 형광 이미지를 캡처.
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Representative Results
이 프로토콜의 사용의 예로서, 결과 midpupal (42 시간 동안 25 ° C에서 APF) 상이한 항체로 면역 염색 눈 디스크를 나타내는 주 포스 포 티로신 잔기에 대해 유도 된 항체를 사용하여도 2에 제시되어, 세포의 멤브레인 일 수있다 관찰 (그림 2A). 이것은 midpupal 단계 이전에 발생하는 최종 패터닝 공정 다음 번데기 눈 ommatidial 세포의 정규 배열을 식별하는 데 사용될 수있다. 또 다른 대표 화상은 원추 세포의 핵이 컷 전사 인자 (도 2B)에 대한 항체를 사용하여 식별된다 수 도시한다.
그림 1 :. 해부 절차에 사용되는 송풍기 튜브의 조립도 일에 대한 자세한 내용은 자료 섹션을 참조하십시오송풍 튜브의 전자 별도의 구성 요소.
그림 2 :. midpupal 눈 디스크의 면역 염색 42 시간 APF에서) ommatidia, 개안 (포스)와 번데기 눈 디스크에서 B) 원뿔 세포 핵 (잘라 내기)의 혀끝의 형태를 시각화하기 위해이 프로토콜의 사용을 보여주는 대표적인 면역 염색. 스케일 바는 50 μm의 =.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) | 80 g NaCl, 2g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Caution: Irritant! Wear gloves. |
| 0.3% PBT | 1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. |
| Fix Solution | (≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use | ||
| Normal goat serum | Rockland antibodies & assays | B304 | Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C |
| Block Solution | 10% NGS in PBT. This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use. | ||
| DAPI stock solution | Life Technologies | D3571 | For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O. |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Labs | H-1000 | Mounting medium |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O. |
| Equipment | |||
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | Used to rock tissue in 3 well glass dish |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Krayden | NC9897184 | Used to make silicone dissection dish |
| Silicone dissecting dish | Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator. | ||
| 3 well glass dish | Corning | 7220-85 | The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product. |
| 72 well microwell minitray | Nunc | 438733 | |
| Sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade | Ted Pella | 1346 | |
| 100 mm Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow. |
| Disposable Transfer Pipets, Fine Tip | Samco Scientific | 231 | |
| Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches | |||
| PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2. |
| Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00001 |
References
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