Introduction
Feltene utviklings og cellebiologi har vært sterkt påvirket av modellorganisme: Drosophila melanogaster. I denne modellen, har studier av øyets platen bidratt en stor del av kunnskap om signalisering, cellebiologi og andre områder. Den avdøde tredje larve instar øye plate har blitt studert mye og er en kraftig modell til å utnytte, da det gir et øyeblikksbilde av en rekke utviklingsmessige perioder, hver med sine egne unike signalmolekyler og prosesser, som morfogenetiske fure utvikler seg over øyet plate 8. Det er imidlertid et behov for ytterligere å øke vår forståelse av utviklingsprosesser inn i pupal fase. Mens det har vært studier på pupal øye plate 3-7, ikke vår kunnskap ikke nærme bredden i arbeidet som har blitt utført på den tredje stadium øye plate. Dette skyldes delvis til større problemer med å dissekere pupal øye plate. Derfor er en presentasjon avriktig metode for disseksjon kan i stor grad utvide forskningen på dette området.
Mens det er stadier innenfor pupal øye plate utvikling som er lett dissekert, spesielt rundt midten pupal periode, andre tidsperioder er mye mer utfordrende å dissekere. Denne protokollen representerer en metode for å dissekere pupal øye plater som kan være universelt brukes for alle pupal utviklingstidsrammer. Denne protokollen kan brukes som et alternativ til en annen protokoll 9 som viser en enklere og hurtigere fremgangsmåte for å dissekere øye plater fra de midpupal tidspunkter. Denne protokollen ble opprinnelig filmet og utviklet for opplæring av avanserte lavere grads studenter i UCLA Graduate Forskning Consortium i Funksjonell genom (URCFG) 10,11 i teknikken av pupal øye disseksjon. Mange studentene var i stand til å utnytte denne videoen og metoden for å lære dette utfordrende teknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne fremgangsmåten er en 2 dagers prosedyre.
Dag 1 (2 timer + dissekere tid)
1. pupal Eye Disc Dissection
- Velg en puppe for disseksjon.
MERK: I en alder av puppe å bli dissekert vil bli bestemt av de eksperimentelle behov. Imidlertid, hvis undersøke cellemorfologi, er dette ofte gjort ved 42 timer etter at dannelsen puparium (APF) ved 25 ° C, som er en alder av puppe vist i videoen. Samle hvite puppe (regnes 0 hr APF) med en fuktet pensel og arrangere dem i kronologisk rekkefølge (basert på innsamling tid) i en ny flue mat hetteglass holdes på 25 ° C. Dissekere alderen puppe i denne samme kronologisk rekkefølge for å holde tidsforskjeller mellom puppe så nært som mulig. - Overfør puppe i en dråpe av fosfat-bufret saltløsning (PBS, pH 7,4, se materialer for oppskriften) på en silikonplate dissekere.
- Hold toppen av pupal tilfelle med pinsett og pierce og åpne lower parti av pupal tilfelle med et par skarpe tang. Fjern puppe fra tilfelle i den nydannede hullet.
- Lag en diagonal kutt med saks, mid-thorax, i puppe. Fjern rusk eller overføre puppe hodet til en ny dråpe PBS. Rengjør med pipetten blåserøret (se materialer og Figur 1 for detaljer) og legge til ytterligere PBS etter behov. Sørg for å unngå dehydrering.
- Sikkert grep toppen av pupal hodet skjellaget med en pinsett. Ved å bruke tuppen av blåseslangen, forsiktig skyve på pupal saken å ekstrudere hjernen og andre vev, inkludert øyet plater, ut av pupal saken. Sørg for å unngå å gripe noen vev i skjellaget.
- Bruke blåser rør fylt med PBS, blåser du forsiktig fett kroppen vev og annet rusk ut av hodet saken å tydelig skille og identifisere hjerne og øye-plater.
MERK: Holde hjernen knyttet til pupal hodet saken vil tillate forskeren å bruke hanad tilfelle som et "håndtak" for fremtidig manipulering av vevet uten å skade øyet plater eller hjernen. Imidlertid er det vanlig å løsne hjernen og øye-plater fra hodet tilfellet, og dette er ikke skadelig for den generelle prosedyre og resultatene. Det tar ofte flere forsøk på å blåse og presser for å lykkes trekke øyet plater og hjernen innenfra pupal hodet saken og slik at de er tydelig atskilt fra omkringliggende vev. Jo renere og mer separat man kan få øye plater fra omkringliggende vev vil bidra til å forhindre overflødig vev fra å fikse for øyet plater. - Etter disseksjon, umiddelbart overføre vevet til en 3 godt glassform på is med 0,5 ml av løsning løsning (se materialer). Flyte vev på overflaten av Fix løsning for noen minutter (vanligvis den tiden det tar å dissekere det neste settet med øye-plater).
MERK: Hvis dette ikke er det første øyet plate å bli dissekert i denne runden av disseksjon, completely senk forrige øye plate i Fix løsning. Hvis du utfører spesielle fargingsprosedyrer (f.eks reaktive oksygenforbindelser, lysosomer, osv) dette må gjøres før fiksering. For å gjøre dette, lagre dissekert øye plater i iskald PBS før du fortsetter med egnet farging protokollen. - Etter disseksjon og neddykking av alle øyen plater blir dissekert, flytte tre godt glassfat til en rocker og rock i romtemperatur i 30 min.
2. Farging
- Fjern forsiktig Fix løsning og tilsett 0,5 ml PBS med 0,3% Triton X-100 (0,3% PBT, se materialer) og vaske vevet på en rocker i 10 min. Gjenta dette trinnet tre ganger for totalt fire vasker (10 min hver).
MERK: Forsiktig fjerning av løsningen fra brønnen kan utføres under et disseksjonsmikroskop for å forhindre vevskade eller tap. Løsningen kan aspirert forsiktig med en pipette; vi foretrekker en fin-Tipped, engangsoverføring pipette som har hatt åpningen avflatet for å redusere sjansen for å aspirere vev. - På slutten av den fjerde vask, fjerner vaske og tilsett 0,5 ml blokk-løsning (se materialer) til brønn og inkuber i 30 min.
MERK: Denne tidsrammen kan forlenges i henhold til dine behov. - Ved slutten av den 30 min blokk tid, pipette 10 ul av primær antistoffoppløsning (fortynnet i blokk løsning) i det passende antall brønner i en mikrobrønnplate.
MERK: En godt av en mikroplate vil romme ca 4 par eye plater festet til pupal tilfelle eller 8 isolerte par av øyet plater med hjerner vedlagt. De primære antistoffene som anvendes i denne protokoll for de representative data er anti-fosfotyrosin (1: 500 fortynning) og anti-Cut (1: 200 fortynning). - Overfør dissekert vevet inn i mikroplatebrønnene fylt med primær antistoff Solution fra tre godt glassfat.
- Stedpå mikrobrønnplate på en fuktet papirhåndkle (for å hindre dehydrering) i en tom boks pipettespiss (eller annen lignende beholder) og oppbevares ved 4 ° C over natten.
Dag 2 (4 timer + monteringstiden)
- Overfør vev fra mikrobrønnplate i et nytt tre godt glassform med 0,3% PBT (≈0.5 ml) og vaske vevet i 10 minutter på vippe. Gjenta dette trinnet tre ganger for totalt fire vasker (10 min hver)
- Fjern det siste vask og tilsett 0,5 ml av blokk-løsning til brønnen. Blokkere for 30 min.
MERK: Denne tidsrammen kan forlenges i henhold til dine behov. - Fjern Blokk-løsning og tilsett 0,5 ml av Sekundær antistoffløsning (laget av fluorescensmerkede antistoffer som passer til det primære antistoff og fluorescerende bølgelengde, fortynnet i blokk-løsning) til brønnen og beskytte 3 brønnen glassform mot lys med et dekke eller aluminium folie og inkuberes i minst 2 timer ved værelsestemperatur.
MERK: Alle etterfølgende trinn skal på samme måte beskyttet mot lys eksponering. Denne inkubasjon kan utvides til over natten ved 4 ° C, i et oppsett tilsvarende det primære antistoff inkubering, men den kan også utføres i en 3 godt glasstallerken dekket med laboratoriefilm, eller en mikrobrønnplate hvis konservering antistoff er ønsket. - Ved slutten av antistoffet inkubering, fjernes Sekundær antistoffløsning og tilsett 0,5 ml av 0,3% PBT til brønnen og vaskes på vippe i 10 min. Gjenta dette trinnet for totalt fire vasker (10 min hver).
MERK: Hvis DAPI farging er ønsket, før du starter første vask, tilsett 0,5 mL av DAPI stamløsning (se materialer) til 500 mL av PBT som skal brukes for første vask (1: 1000 fortynning).
3. Montering
- På slutten av siste vask, montere antennal / øye plater på et lysbilde som bruker 70% glyserol eller PBS som et medium for å fjerne brain og andre uønskede vev i et basseng på den ene siden av raset.
- Flytt forsiktig vevet ved hjelp av hydrostatiske trykket mellom tang, eller svært forsiktig med en tang tips, og linje opp øyet plater i en kolonne mot midten av lysbildet.
- Fjern all overflødig glyserol eller PBS fra hele vev (ved hjelp av fukttransporterende virkning av et laboratorium klut eller pinsett arbeide for dette).
- Plassere en liten mengde (≈10 ul) av monteringsmedium langs den ene side av søylen øyenskiven og plassere et dekkglass på vev, slik som å spre monteringsmedium på øyet plater.
- La glide sit i 1 til 2 minutter for å tillate at vev / monteringsmedium til å spre seg helt ut.
- Tørk noen ekstra monteringsmedium av fra rundt kantene på dekkglass og forsegle den med klar neglelakk.
- Fange fluorescerende bilder av øyet plater ved hjelp konfokalmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et eksempel på bruk av denne protokollen, som illustrerer resultatene midpupal (APF 42 timer ved 25 ° C) øye immunostained plater med forskjellige antistoffer er presentert i figur 2. Ved å bruke et antistoff rettet mot fosfotyrosin-rester, kan membranen være av cellene observerte (Figur 2A). Dette kan brukes til å identifisere det faste arrangement av ommatidial celler i pupal øyet etter den endelige mønstringsprosesser som forekommer før den midpupal stadium. Et annet representativt bilde avbilder kjerner av kjegle-celler kan identifiseres ved bruk av et antistoff mot Cut transkripsjonsfaktor (figur 2B).
Figur 1:. Montering diagram av blåserøret brukes i disseksjon prosedyren Se avsnittet materialer for detaljer om the separate komponenter av blåserøret.
Figur 2:. Farging av midpupal øye plater Representant immunofarging demonstrere bruken av denne protokollen for å visualisere A) den apikale morfologi ommatidia (fosfotyrosin) og b) kjegle cellekjerner (Klipp) fra pupal øye plater på 42 timer APF. Skala barer = 50 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) | 80 g NaCl, 2g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Caution: Irritant! Wear gloves. |
| 0.3% PBT | 1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. |
| Fix Solution | (≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use | ||
| Normal goat serum | Rockland antibodies & assays | B304 | Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C |
| Block Solution | 10% NGS in PBT. This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use. | ||
| DAPI stock solution | Life Technologies | D3571 | For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O. |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Labs | H-1000 | Mounting medium |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O. |
| Equipment | |||
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | Used to rock tissue in 3 well glass dish |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Krayden | NC9897184 | Used to make silicone dissection dish |
| Silicone dissecting dish | Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator. | ||
| 3 well glass dish | Corning | 7220-85 | The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product. |
| 72 well microwell minitray | Nunc | 438733 | |
| Sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade | Ted Pella | 1346 | |
| 100 mm Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow. |
| Disposable Transfer Pipets, Fine Tip | Samco Scientific | 231 | |
| Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches | |||
| PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2. |
| Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00001 |
References
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential adhesion mediated by Hibris and Roughest regulates morphogenesis and patterning in the Drosophila eye. Dev cell. 8 (6), 925-935 (2005).
- Grzeschik, N. A., Knust, E. IrreC/rst-mediated cell sorting during Drosophila pupal eye development depends on proper localisation of DE-cadherin. Development. 132 (9), 2035-2045 (2005).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454 (7203), 533-537 (2008).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40 (4), 851-858 (1985).
- Voas, M. G., Rebay, I. Signal integration during development: insights from the Drosophila eye. Dev Dyn. 229 (1), 162-175 (2004).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas. J Vis Exp. , 4347 (2012).
- Call, G. B., et al. Genomewide clonal analysis of lethal mutations in the Drosophila melanogaster eye: comparison of the X chromosome and autosomes. Genetics. 177 (2), 689-697 (2007).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3 (2), 59 (2005).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. 37, 1936 (2010).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
