Introduction
Os campos de biologia do desenvolvimento e celular têm sido grandemente impactada pelo organismo modelo: Drosophila melanogaster. Dentro desse modelo, os estudos sobre o disco olho têm contribuído uma grande quantidade de conhecimento a respeito de sinalização, biologia celular e outras áreas. O terceiro disco instar larval olho ultimamente tem sido estudado extensivamente e é um modelo poderoso de utilizar, uma vez que dá um instantâneo de uma série de períodos de desenvolvimento, cada um com suas moléculas e processos de sinalização único, como o sulco morfogenético progride através do disco olho 8. No entanto, existe uma necessidade para expandir ainda mais a nossa compreensão dos processos de desenvolvimento na fase de pupa de desenvolvimento. Embora tenha havido estudos sobre o disco olho pupal 07/03, o nosso conhecimento não se aproxima a amplitude do trabalho que tem sido realizado no disco terceiro instar olho. Isto é devido, em parte, à maior dificuldade em dissecar o disco olho pupa. Portanto, uma apresentação dométodo adequado de dissecção poderia expandir a pesquisa nesta área.
Enquanto há estágios no âmbito do desenvolvimento do disco olho pupa que são facilmente dissecados, particularmente em torno do período de meados de pupa, outros períodos de tempo são muito mais desafiador para dissecar. Este protocolo representa um método para dissecar discos de pupa de olho que pode ser universalmente utilizados para todos os prazos de desenvolvimento de pupa. Este protocolo pode ser utilizado como uma alternativa para um outro protocolo 9 que mostra um método mais fácil e mais rápido para dissecar discos oculares a partir dos pontos de tempo midpupal. Este protocolo foi originalmente filmado e desenvolvido para a formação de estudantes de graduação avançados na UCLA Research Consortium Graduação em Genômica Funcional (URCFG) 10,11 na técnica de dissecção olho pupa. Muitos estudantes de graduação foram capazes de utilizar este vídeo e método para aprender esta técnica desafiadora.
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Protocol
Este procedimento é um procedimento de dois dias.
Dia 1 (2 horas + tempo dissecando)
1. Pupal Disco Eye Dissection
- Selecione uma pupa para dissecção.
NOTA: A idade da pupa a ser dissecado será determinado pelas necessidades experimentais. No entanto, se examinar a morfologia das células, isto é frequentemente realizado a 42 horas após a formação pupário (APF) a 25 ° C, que é a idade do pupas mostrado no vídeo. Colete pupas branco (considerado APF 0 hr) com um pincel molhado e organizá-los em ordem cronológica (com base no tempo de coleta) em um novo frasco alimentos mosca mantida a 25 ° C. Dissecar as pupas idade nesta mesma ordem cronológica para manter as diferenças de tempo entre pupas o mais próximo possível. - Transferir a pupa em uma gota de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4, ver materiais para receita) em uma placa de dissecação de silicone.
- Segurar o início do processo de pupa com uma pinça e perfuram e abrir o lower porção do processo de pupa com um par de pinças cortantes. Remover a pupa do caso no furo recentemente formado.
- Faça um corte diagonal com uma tesoura, meados de tórax, na pupa. Retirar os detritos ou transferir a cabeça pupa para uma nova gota de PBS. Limpe com o tubo ventilador pipeta (ver materiais e Figura 1 para detalhes) e adicione PBS adicional conforme necessário. Certifique-se de evitar a desidratação.
- Aperto firmemente a parte superior da cabeça cutícula pupal com um par de fórceps. Usando a ponta do tubo de sopro, empurre o caso de pupa para extrudir o cérebro e outros tecidos, incluindo os discos oculares, para fora do processo de pupas. Certifique-se de evitar pegar qualquer tecido dentro da cutícula.
- Usando o tubo de sopro preenchido com PBS, sopre suavemente o tecido de gordura corporal e outros detritos fora do caso cabeça para separar e identificar claramente os discos do cérebro e dos olhos.
NOTA: Manter o cérebro ligado ao caso cabeça pupa vai permitir ao pesquisador a usar o que elecaso anúncio como uma "alavanca" para a manipulação futuro do tecido sem danificar os discos de olho ou cérebro. No entanto, é comum para desalojar os discos do cérebro e do olho a partir da cabeça e caso este não é prejudicial para o processo global e os resultados. É muitas vezes leva várias tentativas de sopro e empurrando para extrair com sucesso os discos do olho e cérebro a partir de dentro da caixa da cabeça de pupas e de modo a que eles estão claramente separados do tecido circundante. O mais limpo e mais uma separada pode obter os discos de olho a partir do tecido circundante irá ajudar a evitar tecido estranho de fixação para os discos de olho. - Após a dissecção, imediatamente transferir o tecido para a 3 bem prato de vidro no gelo com 0,5 ml de solução de correcção (ver materiais). Flutuador do tecido sobre a superfície da solução de correcção para a poucos minutos (tipicamente o tempo que leva para dissecar o próximo conjunto de discos oculares).
NOTA: Se este não é o primeiro disco de olho a ser dissecada nesta rodada de dissecação, completely submergir o disco anterior do olho para a solução Fix. Se a execução de procedimentos de coloração especiais (por exemplo, espécies reativas de oxigênio, lisossomos, etc.) isso deve ser feito antes da fixação. A fim de fazer isso, armazenar os discos oculares dissecados em PBS gelado antes de continuar com o protocolo de coloração apropriada. - Após dissecção e submersão de todos os discos do olho sendo dissecado, mova a 3 bem prato de vidro para um roqueiro e rock em temperatura ambiente por 30 min.
2. Immunostaining
- Remova cuidadosamente a solução Fix e adicionar 0,5 ml de PBS com 0,3% de Triton X-100 (0,3% PBT, ver materiais) e lavar o tecido em uma cadeira de balanço para 10 min. Repetir esta etapa mais três vezes, para um total de quatro lavagens (10 minutos cada).
NOTA: a remoção cuidadosa da solução do poço pode ser realizada sob um microscópio de dissecação para evitar danos ou perda de tecido. A solução pode ser aspirado cuidadosamente com uma pipeta; preferimos uma multa-tipped, pipeta de transferência descartável que tem tido a abertura achatada para reduzir a possibilidade de aspirar tecido. - No final da quarta lavagem, remover a lavagem e adicionar 0,5 ml de solução de bloqueio (ver materiais) para o poço e incubar durante 30 min.
NOTA: Este prazo pode ser estendido de acordo com suas necessidades. - No final do tempo de bloqueio 30 min, pipeta 10 ul de solução de anticorpo primário (diluído em solução de Bloco) para um número adequado de poços de uma placa de micropoços.
NOTA: Um poço de uma placa de micropoços irá acomodar cerca de 4 pares de discos oculares associadas ao caso de pupa ou 8 pares isolados de cérebros com discos oculares anexas. Os anticorpos primários utilizados no presente protocolo para os dados são representativos de anti-fosfotirosina (diluição 1: 500) e anti-Cut (diluição 1: 200). - Transferir o tecido dissecados para os poços de placas de micropoços cheias com a solução de anticorpo primário a partir do 3 bem prato de vidro.
- Lugara microplaca numa toalha de papel humedecido (para evitar a desidratação) em uma caixa vazia pipeta de ponta (ou outro recipiente similar) e armazenar a 4 ° C durante a noite.
Dia 2 (+ 4 h de tempo de montagem)
- Transferir o tecido a partir da placa de micropoços para uma nova 3 bem prato de vidro com 0,3% de PBT (≈0.5 ml) e lava-se o tecido durante 10 minutos no agitador. Repetir esta etapa mais três vezes, para um total de quatro lavagens (10 minutos cada)
- Remover a última lavagem e adicionar 0,5 ml de solução de Bloco para o poço. Bloquear por 30 min.
NOTA: Este prazo pode ser estendido de acordo com suas necessidades. - Remover a solução de bloqueio e adicionar 0,5 ml da solução de anticorpo secundário (feita a partir de anticorpos marcados com fluorescência adequados para o seu anticorpo primário e do comprimento de onda fluorescente, diluída em solução de Bloco) para o poço e proteger o prato 3 bem vidro da luz com uma cobertura ou de alumínio despistar e incubar durante pelo menos 2 horas a salatemperatura.
NOTA: Todas as etapas subseqüentes devem ser igualmente protegidas da exposição à luz. Esta incubação pode ser estendido a noite a 4 ° C, em uma configuração semelhante à incubação do anticorpo primário, mas também pode ser realizada em um prato de vidro de 3 bem coberto com filme de laboratório, ou uma placa de micropoços se a conservação de anticorpo for desejado. - No final da incubação do anticorpo, remover a solução de anticorpo secundário e adicionar 0,5 ml de 0,3% para o PBT e lava-se bem no agitador durante 10 min. Repetir esta etapa para um total de quatro lavagens (10 minutos cada).
NOTA: Se a coloração DAPI é desejado, antes de iniciar a primeira lavagem, adicionar 0,5 ml de solução de estoque de DAPI (ver materiais) aos 500 ul de PBT que serão usados para a primeira lavagem (1: 1000 de diluição).
3. Montagem
- No final da última lavagem, montar os discos de antenas / olho sobre uma lâmina, usando 70% de glicerol ou PBS como um meio para remover a lgain e outros tecidos não desejados em uma associação de um lado da lâmina.
- Mova cuidadosamente o tecido utilizando pressão hidrostática entre a pinça, ou muito suavemente com a ponta de uma pinça, e alinhar os discos de olho em uma coluna em direção ao centro da lâmina.
- Remova todo o glicerol externa ou PBS de todo o tecido (o uso da ação de drenagem de um laboratório wipe ou a pinça trabalhar para isso).
- Colocar uma pequena quantidade (≈10 uL) de meio de montagem ao longo de um lado da coluna disco olho e colocar uma lamela sobre o tecido, de modo a espalhar o meio de montagem para os discos oculares.
- Deixe corrediça sente durante 1 a 2 minutos para permitir que o tecido / meio de montagem para espalhar-se completamente.
- Limpe qualquer meio de montagem extra fora em torno das bordas da lamínula e selá-lo com unhas polonês claro.
- Capturar imagens fluorescentes dos discos olho usando microscopia confocal.
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Representative Results
Como um exemplo da utilização deste protocolo, que ilustra os resultados midpupal (42 horas APF a 25 ° C) discos oculares imunocoradas com anticorpos diferentes são apresentadas na Figura 2. Ao utilizar um anticorpo dirigido contra os resíduos fosfotirosina, a membrana das células podem ser observado (Figura 2A). Isto pode ser usado para identificar o arranjo regular de células ommatidial no olho de pupa seguindo os processos de padronização finais que ocorrem antes da fase de midpupal. Uma outra imagem representativa descreve os núcleos de células cone pode são identificados utilizando um anticorpo contra o factor de transcrição corte (Figura 2B).
Figura 1:. Diagrama de montagem do tubo de sopro usado no procedimento de dissecção Veja seção de materiais para obter detalhes sobre thE, os componentes separados do tubo de sopro.
Figura 2:. Immunostaining de discos olho midpupal immunostaining Representante demonstrando a utilização deste protocolo para visualizar A) a morfologia apical de omatídeos (antifosfotirosina) e B) os núcleos das células cone (CUT) de discos de pupa de olho em 42 hrs da APF. Barras de escala = 50 um.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) | 80 g NaCl, 2g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Caution: Irritant! Wear gloves. |
| 0.3% PBT | 1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. |
| Fix Solution | (≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use | ||
| Normal goat serum | Rockland antibodies & assays | B304 | Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C |
| Block Solution | 10% NGS in PBT. This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use. | ||
| DAPI stock solution | Life Technologies | D3571 | For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O. |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Labs | H-1000 | Mounting medium |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O. |
| Equipment | |||
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | Used to rock tissue in 3 well glass dish |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Krayden | NC9897184 | Used to make silicone dissection dish |
| Silicone dissecting dish | Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator. | ||
| 3 well glass dish | Corning | 7220-85 | The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product. |
| 72 well microwell minitray | Nunc | 438733 | |
| Sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade | Ted Pella | 1346 | |
| 100 mm Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow. |
| Disposable Transfer Pipets, Fine Tip | Samco Scientific | 231 | |
| Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches | |||
| PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2. |
| Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00001 |
References
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