Summary
この研究は、成功したトランスレーショナ嚥下障害の研究を促進する目的で、マウス疾患モデルで使用するための人間のvideofluoroscopic嚥下研究（VFSS）メソッドを適応さ。
Abstract
この研究は、トランスレーショナ嚥下障害の研究を促進する目的で、マウス疾患モデルで使用するための研究（VFSS）メソッドを飲み込む人間videofluoroscopicに適応。その限られたスペースで気ままに立っている間に自己供給を許可した試験室、市販の経口造影剤の嫌悪味/臭いをマスクするレシピ、ステップバイステップの試験プロトコル：成功の結果は3つの重要なコンポーネントに依存している嚥下生理学の定量を可能にする。これらのコンポーネントのうちの1つまたは複数の除去は、試験結果に悪影響を与えるであろう。また、X線透視システムのエネルギーレベル能力を調べることができる飲み込むパラメータ決定する。ほとんどの研究センターでは、マウスや他の小型げっ歯類をテストする際に非常に悪い画質になり、人とより大きな動物での使用のために設計された高エネルギー透視を持っている。この制限にもかかわらず、私たちは7 VFSを特定した新しいマウスVFSSプロトコルと組み合わせて、高エネルギーX線透視装置を使用した場合、マウスにおいて一貫して定量可能であるSパラメータ。我々は最近、マウスなどの小型げっ歯類で使用するために設計された非常に高い結像分解能と倍率機能と低エネルギーX線透視システムを得た。この新しいシステムを使用する準備作業は、新しいマウスVFSSプロトコルと組み合わせて、従来の（すなわち、高エネルギー）透視装置を用いて得られ、ほぼ倍の数であるマウスにおいて一貫して定量可能である13ツバメパラメータを特定した。我々は、この新しいシステムの機能を最適化するように追加の嚥下パラメータの同定が期待されている。結果は、これまでのマウス疾患モデルを調査するために、高エネルギー透視装置を使用する際に見過ごされてもよい嚥下生理学における微妙な変化を検出し、定量化するために、低エネルギーX線透視システムを使用しての有用性を実証する。
Introduction
（減損嚥下）嚥下障害は、すべての年齢層の人々に影響を与え、多くの病状の一般的な症状です。例としては、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳性麻痺、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、バッテン病、頭頸部癌、早産、および高度な老化を含む。嚥下障害は非常に一般的に細菌を含んだ食品/液体/唾液が肺に1-4内に吸引されたときに発症する重度の栄養失調や肺炎の結果として、死亡率と相関している。この衰弱と生命を脅かす医学的状態は、米国だけで3には毎年1500万人に影響を与えます。有病率が高いとそれに関連する否定的な結果にもかかわらず、嚥下障害のための現在の治療法の選択肢は、（むしろ治癒なく）姑息に限定されている（ 例えば、特定の食品/液体コンシステンシーを回避する）ようなダイエット変形例として、近づくと、姿勢の変化（ 例えば、tucki）、モータのアプローチ（ 例えば、エクササイズ）、口腔、咽頭、および喉頭の筋肉を標的とする、感覚的なアプローチ（ 例えば、実施味、温度、および/ または機械的刺激）を飲み込むときに顎ngを、そして管栄養（ 例えば、栄養と水和は経鼻胃（NG）チューブまたは経皮的内視鏡的胃瘻造設術（PEG）チューブ）を介して投与。これらの治療は、単にむしろ、問題の根本的な原因をターゲットによりなど対症療法を提供する。実際、小説、嚥下障害のための効果的な治療法の発見に大きな障壁は、各疾患のための可能性が異なっている責任の病理学的メカニズム、の限られた科学的な知識である。
嚥下障害の診断は、主にも修正されたバリウム嚥下研究として知られるvideofluoroscopic嚥下研究（VFSS）、と呼ばれるX線撮影の手順を使用して行われる。過去30年以上にわたり、この診断テストは、EV用のゴールドスタンダードを検討されているツバメ機能5-7 aluating。このテストは、典型的には、硫酸バリウム8,9またはイオヘキソール10は、患者が座ったり自発的に食品や経口造影剤と混合された液体の稠度を摂取しながら、X線透視機のX線ビームの経路内に立ったことを伴う。患者が飲み込むように口から胃へ移動しながら、食品や造影剤を含有する液体は、コンピュータモニタを介してリアルタイムで見ることができる。軟組織構造も表示され、構造および機能に関連して評価することができる。患者は、嚥下障害の有無と程度を定量化するために、その後の表示やフレームごとの解析のために記録された映像であるそのすべてが、それぞれの食品や液体の一貫性のいくつかのツバメを実行するように求められます。嚥下の多くの生理学的成分は、典型的には、larynの咽頭や食道、程度及び持続期間を通じて、そのような咽頭ツバメの解剖トリガーポイントとして、ボーラス通過時間を分析し、geal標高、場所およびポストツバメの残留物の量、およびの発生及び吸引7,11のための生理的な理由。
人間VFSSプロトコルの態様は、最近になって、自由に振る舞うラットを研究するために適応した。ラットは12のテスト中に、ビューのvideofluoroscopic視野に残っていなかったので、結果が制限されていました。 VFSSは以前にマウスと試みられていない。マウスおよびラットでの使用のためのヒトVFSSプロトコルの成功した適合は、現在、既存のマウス（マウスおよびラット）、ヒトにおける嚥下障害を引き起こすことが知られている疾患のモデルの数百を調べるための新規な研究方法を提供する。この新しい方法（以下マウスVFSSとも呼ばれる）は、従って病的である、筋肉、神経、脳組織内の基礎となる神経生理学的メカニズムを調査し、嚥下障害に寄与するのに適している嚥下障害のマウスモデルの同定および確認を早めるだろう私nの人間。また、マウスVFSS直接人間と比較することができる嚥下機能/機能不全の客観的尺度（バイオマーカー）の同定を可能にする。これらの異種間videofluoroscopicバイオマーカーは、その後、より良い人々との臨床試験に翻訳するでしょう、マウスやラットを用いた前臨床試験で治療効果を定量化するための新規なアウトカム指標を、役立つことができる。
このために、ネズミVFSSプロトコルはセックスのどちらかの〜100マウスを使用して設立されました。すべてのマウスは、C57またはハイブリッドC57 / SJL株のいずれかであった。 C57 / SJLトランスジェニックSOD1-G93A（またはSOD1）のコロニーのバックグラウンド株であったのに対し、C57マウスは、ALSの最も広く使用されている動物モデルマウスの遺伝的に改変されなかった。 SOD1のコロニーは、トランスジェニック（ すなわち、ALSの影響を受けた）マウスおよび非トランスジェニック（ すなわち、影響を受けない）同腹仔のおおよそ50-50ミックスだった。
ネズミVFSSプロトコルは、3つのコンポーネントで構成されています。
- 経口造影剤の嫌悪味/臭いをマスクし、嚥下の適切な可視化を可能にするのに十分な放射線濃度を生成するレシピ
- 動物のコンプライアンスを最大化するステップバイステップの試験プロトコルは、総試験時間および放射線被曝を最小限に抑え、かつ（ すなわち、口腔、咽頭、食道）の嚥下の各段階のためのいくつかの嚥下パラメータの定量化を可能にする。
複合効果は、典型的な給餌マウスの嚥下行動の評価を可能にする快適な、低応力、自己給電検査環境を生成する。
Protocol
ネズミVFSSプロトコルは、承認された施設内動物管理使用委員会（IACUC）プロトコルおよびNIHガイドラインに従います。
1.ポリカーボネートの管及びシート（図1）からの観察チェンバースを構築
- 手動フライス盤を使用して、16センチメートルの長さに幅5cm、正方形ポリカーボネートチューブ（〜2mmの肉厚）を切断した。ほとんどのマウスは、適切に、必要に応じて歩いて、周りに回転可能狭い試験室では、その結果、これらの寸法内に収まる。 〜2mmの壁厚は著しくX線ビームを減衰させることなく、十分な剛性を提供する。
- チャンバーの2つのタイプが、このプロトコルに不可欠：ペグボウルを介して液体を送達するために設計された注ぎ口を介して液体を送達するために設計された「スパウトチューブ」、および「換気チューブ」。
- 「注ぎ口チューブ」は、マニュアル製粉マッハを使用して一方の端部の近くに各チューブの上部に小さな楕円形の穴（12×8 mm）を作るINE。この穴は、行動調整およびVFSS試験中シッパーチューブ注ぎ口を介して飲料ソリューションを提供するために使用される。
- 「換気チューブ」は、一方の端部の近くに各チューブの上部に9小さな通気孔をドリル。このチューブは、代わりにシッパーチューブのペグボウルVFSS試験中に使用される。
- これは、ペグボウルを介して液体を送出するときスパウトチューブを使用することが可能である。しかし、チャンバ天井の開口部には、マウス（ステップ6.2.2を参照）で気が散る探索行動を防ぐためにブロックされなければならない。
- チャンバーの2つのタイプが、このプロトコルに不可欠：ペグボウルを介して液体を送達するために設計された注ぎ口を介して液体を送達するために設計された「スパウトチューブ」、および「換気チューブ」。
- コンピュータ化されたフライス盤を使用して、エンドキャップ（チューブ当たり50×50ミリメートル、2）に切断されたポリカーボネートシート（3/4 "厚さ）は、また、コンピュータ数値制御（CNC）機械と呼ばれる。
- ミル1楕円形の溝、各エンドキャップの内面の一方の縁に近い（19×6ミリメートル）。マウスはVFSS試験中から飲むようにするために、PEG-ボウルを確保するために、この溝を使用してください。
- ミル5ラウンドの通気孔（直径6mm）各エンドキャップを介し。
- ミル直接長円形状溝上記エンドキャップを介して、小さい方の丸穴（直径5mm）。 VFSSテスト中にPEG-ボウルに液体を提供するためにこの穴を使用してください。
- エンドキャップの外面には、圧延機9/16深いこの小さい穴の周りに「そのザグリ直径が1/4である」。
- 離れミル容易にチューブの端部に挿入するステップを作る7mmの深さへのエンドキャップの内面の周囲に沿って2mmである。
- ミルは、エンドキャップの段階に1mmの溝がチューブの端から落下するエンドキャップを防止することが必要であるOリングを収容する。
- 露出したエッジを丸めるとマウスが咀嚼を防ぐために、エンドキャップのすべてのコーナーをベベル。
- CNCマシンを使用したポリカーボネートシートからのPEG-ボウルを行います。全体の寸法は、一端に10×3mmの2椀状のうつ病と、24×19×6ミリメートル3でなければなりません。 One PEG-ボウルはneedeです各チューブの研究開発。ペグ·ボウルは、エンドキャップ（ 図2）で長方形の溝にぴったりと挿入する必要があります。
図1：観測チャンバー観察室は、ビューのX線透視分野で自由に行動する動物を維持するように設計された。これらの写真は、VFSSを行うための必須のチャンバコンポーネントを示しています。トップ：注ぎ口を経由して液体を提供するために設計された "注ぎ口チューブ」、。下：「換気チューブ」、PEG-ボウルを経由して液体を提供するために設計された。 2つのエンドキャップは注ぎ口と換気管の間の互換性があります。
図2：ペグボウル各PEG-ボウルは、各エンドキャップの内 面の溝にはまる。左：組み立てられていないコンポーネント。ミドル：組み立てられた部品。右：エンドキャップの外面この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
2.遠心管、シリコーンストッパーと、金属の噴出（図3）からシッパーチューブボトルを構築
- 各シリコン栓を介してセンタ穴を作るために（5/16 "）ストッパーボーラーを使用してください。
- ボア穴にミネラルオイルを数滴を適用し、手動でストッパーの広い方の端に金属注ぎ口を挿入します。ストレートオープンエンドスパウト試験中の可視化に干渉することが観察チャンバー内の造影剤の過度の漏れや飛散が生じるので直球点スパウトが好ましい。
- それはシリコン栓の全長に及ぶとストッパーの広い方の端を越えて約3センチ伸びるように注ぎ口の長さを調整します。
- 30ミリリットル遠心管に（シッパーチューブを含む）を各ストッパの狭い方の端を挿入します。
- 注ぎ口の長さは、観測室の上部の楕円形の穴を介して挿入することで十分であることを確認します。注ぎ口の先端が到達するまでの健康な成人マウスについて十分に長い室の天井から約1cmを休まなければならない。
注：長い長さがVFSS中に嚥下の可視化を曖昧に首を、傾斜/回転しながら飲んでマウスになる。 - による四肢の運動障害に注ぎ口に到達できない若いマウスに、より小さなサイズのマウス系統、マウス疾患モデルに対応するために、注ぎ口の長さを延長する。
- 取扱い中の鉱物油、シリコーン破片、および他の汚染物質を除去するために使用前に新たに作られたスパウトを洗ってください。
図3：シッパー。チューブボトル左：組み立てられていないコンポーネント。ミドル：組み立てられた部品。右：観測室でのシッパーチューブからマウスを飲むこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
3.ペグ·ボウル（図4）で使用するためのシリンジ配信システムを構築
- 次のように、観察室のエンドキャップにポリエチレン（PE）チューブを接続するためのアダプタを作るために旋盤を使用して説明。
- ここにチューブアダプタ（またはアダプタ）と呼ばれる長さのセクション、「1 1/4に直径アセタール樹脂棒材「1/2をカット。
- 各アダプタの一方の端部に、直径「3/16に先端の長さは、「1/2を減らす、狭い端部と呼ぶ。
- 残りの3/4 "各アダプタの長さセクション（ すなわち、1/2"直径端）、私たちの間に手動把持するための機械の溝については、E。このセクションは、本明細書にワイド端とも呼ばれる。
- 各アダプタの広い方の端では、深い0.098 "直径と1"の中心穴を開けます。
- ドリルは、PEチューブ上の滑り嵌めを提供するために、「0.096に各アダプタの中心穴の残りの部分をリーマと。
- PEチューブ（PE 240、内径1.67ミリメートル）のはさみを使用して所望の長さに切断。 3-4足の長さが十分に放射線の安全性を向上させるためにVFSSテスト中に治験責任医師及びX線透視装置との間の距離を増加させる。
注：より長い長さが標準の30mlレシピよりも恐らく大きいVFSS試験中の造影剤溶液の大きな体積を利用する。 - PE管の一端に完全に鈍先端が15 G針を挿入します。フィッティングがぴったりする必要があります。
- Tから始まる、アダプターチューブの中心孔を通じてのPEチューブのもう一方の（自由）端を差し込み彼ワイド端。
- それは〜2ミリメートルを拡張するように、アダプタの狭い方の端の外にPEチューブを引き出します。
- 観測管のエンドキャップに（それから伸びる〜2mmのPEチューブで）アダプタの狭い方の端を挿入します。それは直接PEG-ボウルの上にあるザグリ穴にぴったりとフィットする必要があります。
- それはかろうじてペグボウルにボウルうつ病の上に延びるように、アダプタの狭い最後にPEチューブの長さを調整します。
- ビーカーから水（取り付けられた針なし）10ミリリットル注射器を記入し、すべての気泡を除去。
- PEチューブの針端部に充填されたシリンジを取り付けます。
- ゆっくりと観察室において、PEG-ボウルに水を提供するためにシリンジプランジャを押してください。 PEG-ボウルがほぼいっぱいになったときに停止します。飲酒時の飛散の原因となる、過剰充填しないでください。
- PEG-ボウルが適切に記入されない場合は、PEG-ボウル上に延びるPEチューブの長さを調整する。
- PEの過伸展チューブはむしろPEG-ボウルから飲むよりも、テスト中にそれをかむためにマウスを誘惑します。
- PEチューブが十分に拡張されていない場合は、液体ではなく、PEG-ボウルを埋めるよりも、観測室の床に実行されます。
- 使用後、注射器を取り外し、石鹸と水で全体の注射器送出システムを洗う。水を除去するために、PEチューブを通して空気をプッシュするために10ミリリットル注射器を使用してください。必要に応じてオートクレーブで滅菌する。
図4：シリンジデリバリーシステム左：組み立てられていないコンポーネント。ミドル：組み立てられた部品。右：観測室におけるPEG-ボウルからマウスを飲むこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
4.電動Scissを構築または観測所の遠隔位置決めするための表を持ち上げます（図5）
- 視野のX線透視視野内の異なる位置での表示マウスに対応するために、5センチメートルによって上げると下げることができます12×12センチプラットフォームシザーリフトを構築します。リフト材料は、消毒洗浄を容易にするために、金属またはプラスチックであるべきである。
- リフト高さと前後位置を調整するマウントステッピングモータ。
- カップルクロスバーを変換することによって高さを制御するシザーリフト機構への最初のステッピングモータ。この結合は、親ねじ、ラックアンドピニオンギアであることができる。
- カップルテーブルに対する全体リフトフレームを変換することによって、長手方向の位置を制御するシザーリフトフレームに対して第二ステッピングモータ。この結合は、親ねじ、ラックアンドピニオンギアであることができる。
- investigaを最小限に抑えながら撮影時の観察室位置の調整を可能にするステッピングモータにワイヤ遠隔制御システム放射線へのTor暴露。
- 各ステッピングモータの活性化及び方向を制御するマイクロコントローラチップハンドヘルドリモコンのボタンをインターフェース。
図5：リモート制御のシザーリフト表左：シザーリフトテーブルの側面図。右：X線透視装置内に位置観測室とリフトテーブル。リフトテーブルは、視野内にマウスを維持するために、観測室の位置を調整する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
5.最大参加を確保するためにVFSSテストする前に行動コンディショニングを行います
- 誘導する1晩（12〜16時間）、水規制期間に先立ってVFSS検査、対象マウスに1〜2週間渇き、その時間の水の間にホームケージから源泉徴収されている。動物は、脱水、のどが渇いていないであるために水の規制の目標である。動物は、アラートと応答性のままにしてください。この持続時間と時間枠が1週間以内に2水調節エピソードの結果として生じる可能性脱水を防ぐために必須である（ すなわち、行動調節用とVFSSテストのための別）。
- 新鮮な寝具材料を含むホームケージの床の上に（エンドキャップによって閉じ一端）シングル「注ぎ口チューブ」を配置。閉鎖端は、チャンバ天井に注ぎ口開口部に最も近いである必要があります。複数のマウスの睡眠は、チャンバの深さ一晩中で身を寄せ合っている間このステップでは、十分な換気を確実にします。開放端はマウスが自由に/室を出入力することができます。
- 一晩室（ 図6）で探索するマウスと睡眠を促進するために他の濃縮材料（ 例えば、nestletと小屋）を取り外します。このステップは、そのマウスを保証VFSSの試験の前に長い期間のためにチャンバー内にあることに順応させる。
- 一晩食べるためのケージの床の上でマウスごとに単一の標準食品ペレットを提供します。水または他の水和源を提供していない。
- 観測室の寸法はケージ内フィッティングからの標準ワイヤーの蓋を防ぐように、一晩ケージにマウスを含むように、標準的なフィルタートップを使用してください。ふたを圧迫し、エスケープからマウスを防ぐために、フィルタートップの上に（食料や水のボトルを含む）を取り外したワイヤーの蓋を保管してください。
- 次のように説明し、次の朝テスト嗜好性を実行します。
- 造影剤（ すなわち、イオヘキソールの代わりに水）を追加することなく、30ミリリットルシッパーチューブボトルにチョコレート風味試験溶液を作る。このレシピは、表1に記載されているケージごとに1つのボトルをテストすることを確認します。
- 観測室を取り外し、標準ワイヤーの蓋を交換してください。チョコレート風味を提供します溶液ワイヤ蓋を通して挿入ケージあたり2分間（室温、約22°C）。
- 2分間の試験期間中の飲酒行動を観察することにより、嗜好性を評価する。
- 以下の基準に従って嗜好性をスコア：
- 中断することなく、少なくとも5秒間注ぎ口での最初のマウスドリンクまで、レイテンシ。
- ソリューションを飲むケージあたりのマウスの割合。
- 同時に注ぎ口で飲むマウスの数。
- 解決策は、各ケージのマウスの大半は飲酒の複数の長い（> 5秒）の発作を持っている場合口当たりとみなされ、複数のマウスが同時に注ぎ口から飲めば（ 図7）。
- チョコレート風味ソリューションは口当たりでない場合は、単一の好ましい解決策を識別するために、様々な濃度で、他の調味料と嗜好性テストを繰り返します。
- 一度に（種々の濃度で）4別の解決策1にまで提供しています休薬期間または洗い出し液のない単一のテストの日のマウスの複数のケージにランダムな順で。マウスのために考慮すべき適当な香料増強剤は、砂糖、チーズ、ピーナッツバター、さまざまなフルーツとナッツの風味、そして牛乳が含まれています。
注：繰り返し水規制のエピソードから脱水を防ぐために、1週間に1回以上のテスト嗜好性を行わないでください。 - それは成功したマウスの各菌株のための好ましい解決策を識別するために数週間かかる場合があります。目標は、これらの資格が成功したVFSS成果を得るために不可欠とみなされるように、露光後に（<30秒）すぐにマウスが候補に複数の長い（> 5秒）になる味飲酒の発作を識別することである。
- 好ましいフレーバー溶液を識別された後、次のように説明し、行動の調節を継続するために、各ホームケージに観察室を返す。
- 最寄りの最後で観測室に1エンドキャップを取り付けますオーバル（注ぎ口）穴。
- チャンバーの上部の楕円形の穴を通ってシッパーチューブボトルを挿入することにより、マウスを2〜3時間のためのチョコレート風味ソリューションを提供します。このステップは、すべてのマウスが観測室内に深い飲みに調整されていることを保証します。
- 観測室に対応するために、ワイヤの蓋を外します。
- 試験期間中に自由摂取の消費のためにケージの床の上でマウスあたり1食のペレットを置きます。
- 行動の調整期間の残りのエスケープからマウスを防止するための標準的なフィルタートップケージをカバーしています。ふたを圧迫するためにフィルタートップの上に（食料や水のボトルを含む）を取り外したワイヤーの蓋を保管してください。
- 行動の調節が完了すると、ホームケージ内の水や食料を自由に提供する。
- 石鹸と水で観測室（チューブとエンドキャップ）とシッパーチューブボトル（注ぎ口と遠心管）を洗ってください。必要に応じてオートクレーブで滅菌する。避けるそれが不透明なのではなく、半透明のチューブを永久曇効果を引き起こすとしてアセトンを使用すると、チューブをきれいにする。
図6：観測チェンバースを探るマウスマウスは、自然に小さなスペースに避難を求めて傾斜している。その結果、自由に入力し、それはホームケージに置かれたときに観測管を探る。ほとんどのマウスは、午前中に室内で寝て発見された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| INGREDIENTS | （嗜好性テスト用）チョコレートソリューション | チョコレート風味（VFSSテスト用）イオヘキソール |
| 3ミリリットル | 3ミリリットル | |
| イオヘキソール（350mgのヨウ素/ ml）を | 0ミリリットル | 15ミリリットル |
| 水（DIまたはフィルタリング） | 30mlまで調整し、最終容量（27 ml）を | 30mlまで調整し、最終容量（12 ml）を |
| 最終容量 | 30ミリリットル | 30ミリリットル |
表1：C57とC57 / SJLマウス系統が好むチョコレート風味テストソリューション。
図7：。嗜好性テスト嗜好性試験中の味の嗜好の一つの指標は、同時にホームケージ内の単一の注ぎ口から飲むマウスの数である。この画像は、同時にとして同定されたチョコレート風味のソリューションを、飲んで4匹のマウスを示していますC57とC57 / SJL株による優先調味料。
6. VFSSテストの準備
- 上記の手順5で説明したように一晩水の規制期間の対象とマウスは、（ すなわち、12〜16時間のために水を差し控える）。
- 新鮮な寝具材料を含むホームケージの床の上に（エンドキャップによって閉じ一端）シングル「換気チューブ」を配置。閉鎖端は、チャンバ天井に通気孔の最も近くでなければなりません。複数のマウスの睡眠は、チャンバの深さ一晩中で身を寄せ合っている間このステップでは、十分な換気を確実にします。開放端はマウスが自由に/室を出入力することができます。
- 翌朝は、ケージから汚れた観測室を削除して、簡単に水道水ですすぎ、VFSS試験の準備のために完全に乾燥。
- その過度の探索行動を引き起こす可能性が、ケージの間にチャンバーを混合を防ぐために一度に1室を取り外し、きれいなかなりVFSSのテストを妨害する。
- 「注ぎ口管は「代わりにVFSSテストのために「換気チューブ」を使用している場合は、探索行動（ 図8）を防止するために、観測室の天井の注ぎ口開口部にシリコーンプラグを挿入します。
- ミックスアップを防止するために、（ホームケージ番号で、例えば ）各室にラベルを付けます。
注：ホームケージでそれをバックに配置する前に、各クリーンチューブにラベルを付け乾燥消去マーカーを使用してください。それはチューブ材料によって吸収され、さらに、アルコールまたはアセトンで洗い流していないため、永久的なマーカーは避けるべきである。
- チョコレート風味イオヘキソール溶液（または他の口に合うソリューション）を準備します。
- いくつかのケージについての試験液（ 表1）の単一のレシピ（30 ml）を作る。
- イオヘキソール上の注意：室温で保管未開封イオヘキソールボトルは、光から保護。使用して、24内イオヘキソールボトルを開けた粘度や味などのHRは、空気への暴露後日以内、またはので変更されることがあります。あるいはまた、長期保存のための遠心管中で、単一のサービング（15ml）中のアリコートを凍結する。準備イオヘキソールテスト·ソリューションは、新鮮さを確保し、マウスによる回避を防止するために、数時間以内に使用しなければなりません。ツバメ機能に対する温度効果による研究を交絡を避けるために、室温でイオヘキソールソリューションを管理します。チョコレートフレーバーは、マウスによる回避で凍結し、その結果と苦いなると、残りの調製した試験液を凍結しないでください。
- X線透視環境を準備します。
- 横（水平）面で飲んでの可視化を可能にするX線透視ビーム内の最適な高さと位置を決定するために予備の（空の）観測室およびPEG-ボウル（またはシッパーチューブ注ぎ口）を使用します。
- 毎秒30フレームにX線透視フレームレートを設定する。利用可能な場合（低下はなく）は、より高いフレームレートを使用することができる。
- Eそれは全体のテスト中にディスプレイに表示されるように、放射線不透過性の較正マーカーを適切にX線透視カメラ/検出器上に配置されていることをnsure。このステップは、嚥下のパラメータを定量化するために使用される長さの測定の較正を可能にするために必要である。
図8：。シリコーンプラグペグボウルを使用して、左：シリコーンプラグ。右：シリコーンプラグは観察室の上部のシッパーチューブ開口部を通って引き込まれる。このプラグはVFSSテスト中にPEG-ボウルではなく、シッパーチューブを使用する際に噴出口に気を取らになるのマウスを防ぐことができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
マウスの7 VFSSテスト
- マウス（特に尾）を挟まないように注意しながら、ケージの外室を持ち上げ、ゆっくりと（シッパーチューブを使用しない場合、PEG-ボウル添付して） 第 2エンドキャップを取り付ける。
注：このアプローチは、初めてテストされているマウスのために特に重要である原因取り扱いにマウスのストレス応答を、最小限に抑えることができます。 - 反復試験で、マウスを簡単にケージ内部に彼らの前に置かれたとき、またはチャンバ開口部の上に尾で吊り下げたときにチャンバに入るなだめすることができる。
- ペグ·ボウルを使用している場合、上記のステップ3で説明した注射器デリバリーシステムを介してソリューションを提供します。このシステムは、必要に応じて、PEG-ボウルの高速かつ簡単に再充填することを可能にする。
- シッパーチューブボトルを使用している場合は、観測室の上部の楕円形の開口部を通ってシッパーチューブを挿入します。注ぎ口は、室の中心に向けられているように、ボトルを傾けます。
- 嚥下機構が視野内に表示されるように、（工程4に記載の遠隔制御シザーリフトテーブルを用いて）観察室の位置を調整する。
- マウスは放射線暴露の持続時間を最小にするために離れたペグボウルまたは注ぎ口から回転する毎に記録を一時停止する。
- 録音を再開すると注ぎ口またはPEG-ボウルにマウスが戻る。
- 必要に応じて、PEG-ボウルを補充。
- マウスは5分以内に飲んでいない場合は、テストを停止します。目標は、いくつかの経度を記録することであるGテストの最初の2分以内にほとんどのマウスに典型的である（> 5秒）連続飲酒の発作、。
- 同じ日後の時点で再試験のために（水なし）ホームケージに準拠していないマウスを返します。 24時間水の規制期間を超えないようにしてください。 3試験のために準拠していないまま、マウスを研究から削除されます。
- ペグ·ボウル（とPEチューブの先端）またはマウスの間乾燥したペーパータオルでシッパーチューブ注ぎ口を清掃してください。
- チャンバ壁上の任意の飛び散ったイオヘキソールを削除するには、マウスとの間で、必要に応じて、観察室を清掃してください。ペーパータオルで水道水とドライでチャンバーをすすぐ。
- 新しいペグボウルを使用します（またはシッパーチューブ注ぎ口を変更する）。そうしないと、マウスは同じPEG-ボウルやシッパーチューブから飲んだ他のマウスの匂いに気を取られてもよい。ペグボウルおよびシッパーチューブは混乱を避けるために標識されるべきである。
8.ビデオ分析
- 関心（ 表2）の嚥下パラメータを定量化するvideofluoroscopy記録のフレームごとの分析を可能にするビデオ編集ソフトウェアプログラムを使用する。 盲検法で各ビデオを分析するには、少なくとも2つの訓練を受けた査読者を特定し、プライマリレビューおよび1つまたは2つの二次のレビュー。
- プライマリレビュアー：3-5時間（約5秒）飲み発作を同定および分析するために、各映像を表示します。スワローパラメータごとに5措置統計分析のために十分である-この基準は3があることを示し、ラット12匹のマウス13,14とVFSSとともに公開非X線撮影ツバメの研究に基づいています。
- 二次査読：個別に最初に同定し、プライマリのレビューで分析した各マウススワローパラメータごとに3-5の対策を分析する。
- 各マウスのためのレビューアの不一致を特定します。レビューア·グループなど、すべての矛盾が100％の合意に達するために再分析。
- 各嚥下パラメーター3-5コンセンサス（ すなわち、議論の余地のない）の値が統計分析に使用するための各マウスの平均値を得るために平均。ときはより少ない3 measurESは、対応するツバメパラメータの統計データ·ベースに欠損値（ すなわち、ゼロではない）を入力して、与えられたマウスのための単一のツバメパラメータに対して得られる。
| SWALLOWパラメータ | DESCRIPTION |
| インターツバメ間隔（ISI） | ビデオの数は、2つの連続した、中断されない嚥下の間にフレーム。 ISIを計算するための開始フレームは、直ちにvalleculaeから食道へのボーラスの可視転送に先行する「静止フレーム」である。エンドフレームは、次のツバメの「残りフレーム」である。二つの連続嚥下間のフレーム数は、時間（秒）に変換するために毎秒30フレーム（fps）で除算する。 |
| ジョーエクスカーションレート（リック·レート換算） | 舌は明らかではないなめる率の定量化を可能にするVFSS中に見える。しかし、顎遠足率が容易に定量である。舐めるの間に、顎、口から突出する舌を可能にするために開く必要があります。したがって、毎秒顎オープン/クローズ（遠足）サイクル数（30フレーム）の飲酒は、レートをなめると等価である間。各ジョー遠足サイクルが（舌突起と一致する）最大限に開いた顎で始まり、顎が最大限にポジションを開いたに戻ったときに終了します。顎閉鎖と再オープンのその後のサイクルは、個々の顎の遠足エピソードとしてカウントされます。 |
| ジョーエクスカーション距離 | 顎遠足サイクル中の顎が開くの距離は、上顎と下顎切歯の間にmm単位で測定する。 |
| リック·ツバメ比 | （二つの連続、中断のないツバメの間すなわち、）それぞれのISIの間に起こる顎遠足サイクルの数。 |
| ツバメレート | 注ぎ口で途切れない飲酒の各2秒のエピソードの間に発生するツバメの数。 |
| 咽頭通過時間（PTT） | それはボーラスのにかかる時間は、咽頭を通じて飲み込まれる。開始フレームは、ISI開始フレームと同じである（ すなわち、すぐにvalleculaeからボーラスの可視転送に先行する「静止フレーム」）。ボーラスの尾が完全にマウスの頚椎の中で最も明白な解剖学的ランドマークである第 2頚椎（C2）を、経過すると終了フレームである。開始フレームと終了フレーム間のフレーム数が30フレームで割り、ミリ秒（ミリ秒）に変換される。 |
| 咽頭を通してボーラススピード | 咽頭ボーラス速度はPTT（上記）と比較して測定される。 ImageJソフトウェアを使用して、C2の椎骨valleculaeからの距離（mm）を、測定された校正指標を用いてスケーリングされる。このdistanc電子さ（mm）をボーラス速度（ミリメートル/秒）を決定するためにPTT（ミリ秒）で除算する。 |
| 食道トランジット時間（ETT） | ETT開始フレームは、（上述の）PTT終了フレームと同一である。ボーラスが完全に食道からのボーラスの消失として定義され、胃に入ったときにETTの終了フレームである。 ETTの開始フレームと終了フレーム間のフレーム数が30フレームで分割されてミリ秒に変換される。 |
| 食道を通っボーラススピード | 食道ボーラス速度ETT（上記）と比較して測定される。 ImageJソフトウェアを使用して、測定された距離（mm）とC2の椎骨から胃食道接合部にある、校正指標を用いてスケーリング。この距離（mm）を次にETTボーラス速度（ミリメートル/秒）を決定する（ミリ秒）で除算する。 |
| 咽頭と食道を通っボーラススピード | C2は容易に見える解剖学的ランドマークでない場合、このパラメータは使用されます。したがって、それは嚥下の咽頭と食道の段階を区別することはできません。このような場合には、咽頭および喉頭を介してボーラス速度は、単一の嚥下パラメータに結合される。開始フレームがPTT開始フレームと同じである（ すなわち、すぐにvalleculaeからボーラスの可視転送に先行する「静止フレーム」）。終了フレームはETTの終了フレームと同一である（ すなわち、ボーラスが完全に胃に入ったとき）。これら二つの事象間のフレーム数は毎秒30フレームで割り、ミリ秒に変換される。 |
| ボーラスエリア | ImageJソフトウェアを使用して、ボーラス領域が咽頭嚥下の開始前vallecular「静止フレーム」で測定され、校正指標を用いてスケーリング。 |
| 咽頭残留エリア | 咽頭残基領域をImageJソフトウェアを使用して測定され、校正指標を用いてスケーリング。 |
| 液体Consuの巻MED | シッパーチューブボトルから消費された液体の体積に起因注ぎ口からの漏れを推定することは困難である。ただし、次のようにペグボウルから消費された液体の体積をより正確に算出することができる：1）の濃度を決定する（ すなわち、ペグボウル内に投与した液体の較正された体積の重量対体積の比）、2 ）残液を含むPEG-ボウルの重量を決定する、3）ボリュームコンバータ（ 例えば、重量にこれらの値を入力してくださいhttp://www.thecalculatorsite.com/conversions/weighttovolume.php 。 |
表2：マウスVFSS中にパラメータの定量化スワロー。
Representative Results
我々は、試験の自己給電を可能にするチャンバ、経口造影剤、香味剤のレシピ、および嚥下生理学の定量を可能にするステップバイステップの試験プロトコルを含む新規かつ複製可能なマウス固有VFSSプロトコルを成功裏に設計した。透視システムのエネルギーレベル機能は、パラメータがマウスにおいて調査することができる飲み込むが決定。私たちは、最初は人で使用するために設計された高エネルギー透視、より大きな動物（ 例えば、GE Advantx、GE OEC 9600、およびオメガ心臓カテーテル検査CS-25、毎秒30フレームの各）を使用した。しかしながら、これらのシステムは、動物の充填で、視野のわずかな部分をもたらした、試験マウスには不十分な拡大機能を有していた （ 図9）。その結果、画質は不可能嚥下機構のほとんどの構造を視覚化する、レンダリング、非常に不良であった。この制限にもかかわらず、私たちは7客観VFSを特定しSは、新しいマウスVFSSプロトコル（ 表3）と組み合わせて、従来の（ すなわち、高エネルギー）蛍光透視鏡を使用した場合のマウスについて一貫して定量可能であったパラメータを飲み込む。さらに、我々は高齢（> 18ヶ月）と末期ALSの条件vallecularの健康な成体マウスに嚥下解剖トリガ·ポイントとして空間（生後3-17ヶ月）、ならびにマウスを同定した。
図9：。高エネルギーX線透視システム左：高エネルギー（ すなわち、従来の）X線透視システムを使用して得られたマウスの代表的なイメージ。マウスは、それによってイメージングげっ歯類のための従来の透視の不十分な倍率能力を実証する、ビューのX線透視視野のごく一部を埋めることに注意してください。右：同じ画像拡大ポストcaptuビデオ編集ソフトウェアプログラムを使用して再。黒矢印：トリガーポイント（valleculae）を飲み込む。白矢印：遠位食道内ボーラス、GE接合（白アスタリスク）を通過する直前に、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| SWALLOWパラメータ | 高エネルギーシステム | 低エネルギーシステム |
| インターツバメ間隔（ISI） | X | X |
| ジョーエクスカーションレート（リック·レート換算） | X | X |
| ジョーエクスカーション距離 | X | X |
| リック·ツバメ比 | X | X |
| ツバメレート | X | X |
| PharyngEALトランジット時間（PTT） | X | |
| 咽頭を通してボーラススピード | X | |
| 食道トランジット時間（ETT） | X | |
| 食道を通っボーラススピード | X | |
| 咽頭と食道を通っボーラススピード | X | X |
| ボーラスエリア | X | |
| 咽頭残留エリア | X | |
| 液体の体積が消費 | X | X |
表3：低エネルギーX線透視システムバーサスハイを使用してパラメータ定量化スワロー。
我々は最近、特にで使用するために私たちの研究室のために設計されましたLabScope（Glenbrookのテクノロジーズ、ランドルフ、ニュージャージー州）と呼ばれる低エネルギー倍率X線透視システムを得マウスなどの小型げっ歯類（ 図10）。しかし、このシステムの顕著に大きな倍率レベルは、それが不可能な単一の視野でのマウスの全体嚥下メカニズムを表示するレンダリング。 図11の位置1を許可するヘッド全体の可視化および近位胸部に示されるように代わりに二つの試験位置は、必要とされる。この位置は、嚥下の口腔咽頭の段階を評価するために必要である。胃食道（GE）接合部にスワロートリガ点（ すなわち、valleculae）からポジション2許可の可視化。この位置は、嚥下の食道段階を評価するために必要である。新しいマウスVFSSプロトコルと組み合わせLabScopeを用いた予備研究は、高エネルギー（ すなわち、従来の）透視した（ 表3）を用いて得倍近い数である、マウスにおいて一貫して定量化され13、対物嚥下パラメータを特定した。このO 例えば、舌骨、気管、および頸椎：utcomeは、従来のシステムを使用する場合、本質的に見えなかった多数の解剖学的構造の可視化を可能にするLabScope、（ 図12）の高度な拡大能力に起因する。その結果、我々はまた、喉頭侵入や誤嚥の証拠ビデオを分析することができました。浸透も誤嚥どちらもかかわらず、健康や病気の状態の、この研究では任意のマウスを観察した。
図10：。LabScope左：LabScopeは小動物用のデスクトップ透視装置として実行されます。右：標識成分とのLabScopeのクローズアップ図。シザーリフトテーブル、ビューのX線透視フィールド内の観察室を位置づけている。 tp_upload / 52319 / 52319fig10highres.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図11：低エネルギーX線透視システムを使用して得られたマウスの低エネルギーX線透視システムイメージ。高倍率能力がビューのX線透視視野内全体のツバメ機構の可視化を妨げることに注意してください。左：ポジション1は - 全体の頭と近位胸部領域の可視化を可能にする。嚥下トリガー点（黒矢印）は、本質的に視野内の中心にある。右：ポジション2 - スワロートリガーポイント（黒矢印）からGE接合（白アスタリスク）に可視化を可能にします。遠位食道（白矢印）を通過ボーラスに注意してください。 g11highres.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図12：低エネルギー透視システムを使用して、解剖学的構造の可視でも最低の倍率設定では、（左）、マウスの頭と首のボニー構造は、私たちの低エネルギーX線透視システム（ すなわち、LabScope）を用いて容易に見ることができます。黒い四角内の解剖学的構造を示す（およびラベル）を右に、より高い倍率でされている。ボニー構造の改善された可視化は、高エネルギー透視を使用して分析することが不可能であったいくつかの追加ツバメパラメータの定量化を可能にします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図13：予備調査結果は、この図は、ネズミVFSSプロトコルを使用して定量2 VFSSスワローパラメータの代表予備調査結果を示しています。レート（左）とインターツバメ間隔（右）飲み込む。スワロー率は高齢のC57マウスと対照と比較して、SOD1マウスで有意に遅かった。有意な群差は、インターツバメの間のために確認されなかったヴァル。バーの上部の行は、ボンフェローニのペアワイズ比較を用いて同定されたグループの間に統計的に有意な差（p <0.05）を示す。エラーバーは±1 SEMを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
ネズミ（マウスおよびラット）モデルの何百ものヒト疾患を研究する市販されている。しかし、3つだけのマウス疾患モデルは、具体的には嚥下障害に関連して検討されている：パーキンソン病および脳卒中12,15-17 18のALS 13,14およびラットモデルのマウスモデル。これらの予備的研究の各々は、それが不可能な種と疾患との間の意味のある比較を導出するために、レンダリング、嚥下障害を評価するために異なる方法を利用した。この主な制限は、自給動物における多数の嚥下パラメータの客観的定量化を可能にする新たに開発されたマウスVFSSプロトコルを利用することによって、将来の研究で克服することができる。
限られたスペースで気ままに立っている間に自己供給を許可1）試験室、市販の経口コントラストAGの嫌悪味/臭いをマスク2）レシピ：成功VFSSの成果は、3つの重要なコンポーネントに依存しているエント、および3）嚥下生理学の定量を可能にするステップバイステップの試験プロトコル。複合効果は、典型的な摂食嚥下行動を呼び起こす、快適、低応力、自己給電検査環境を生成します。これらのコンポーネントのうちの1つまたは複数の除去は、試験結果に悪影響を与えるであろう。否定的な結果の例としては、ビューのX線透視分野で動物を維持することができないこと、飲むこと、経口造影剤への嫌悪、及び不十分な飲料のエピソードに起因するツバメパラメータを定量化することができないことからそらす望ましくない行動を含む。
最適VFSSの成果を得るための主要な課題は、適切な試験室を設計した。私たちのプロトタイプ設計の多数のリビジョンが十分に視野内にマウスを維持し、飲酒からそらす行動を防ぐ観測室で絶頂に達した。チャンバは番目の均一な寸法を得るために、フライス盤を使用して作製されたEチューブとエンドキャップは、それによって、同じ直径のいくつかの観察室のためのコンポーネントの互換性を確保する。内側の寸法（直径および長さ）を十分に一直線に歩いて周りの旋回可能狭い試験チャンバをもたらし成体マウスの体サイズよりも若干大きくなるように一致させた。狭いデザインは、唯一の終わりに注ぎ口およびPEG-ボウルの戦略的ポジショニングとの組み合わせで、飲みながら、チャンバの長さに沿って整列したマウスの頭と体を維持します。飲酒に従事した後、マウスは検査を妨害し、最小限の動きアーチファクトで、その結果、一度に著しく自己安定化し、注ぎ口またはボウルに数秒間残る。これにより、歪みのない、クローズアップ観測/映像記録及び側面と背腹面に飲みながらマウスのvideofluoroscopicイメージングを得ることができる。
マウス（および他の小型げっ歯類は）見て自然に傾斜している小さな空間におけるkの避難所。それは手動で配置し、動物を拾って、それによって（ すなわち取り扱いによるストレス/不安を排除する、ホームケージに置かれたとき、結果として、それらは自由に（既にエンドキャップによって閉じ一端）試験室に入るチャンバー内）。マウスがチャンバに入ると、他端が第 2 エンドキャップを取り付けることによって塞がれている。このデザインは自由に探索するマウス用の低不安試験室の作成中に逃げるのを防ぐことができます。
チャンバーの正方形は、組み込まれていそれは、このように標準的なげっ歯類のケージ内でのテストの必要性を排除し、自立形で使用されることを可能にする運動の安定性。装置全体は、軽量でポータブル、貯蔵目的のためにスタック可能、頑丈な、きれいに簡単で、オートクレーブ処理することができます。チャンバは、最初にX線透視で使用するために設計されたが、それらはまた、スポットフィルム撮影、神経画像（ 例えば、MRI、PET、CT）、及び映像設備と互換性があるL観測/さまざまな行動のビデオ録画。
克服する第二の主要な課題は、経口造影剤（ 例えば、硫酸バリウム、イオヘキソール）の嫌悪味/臭いをマスキングした。味覚感度マウス系統19-21、おそらく年齢22,23との間で大きく変動することを考えると、それは関係なく、歪みや年齢、すべてのマウスに口に合うた単一のテストソリューションを特定する必要があった。この結果は、原因試験溶液のレオロジー（ 例えば、粘度、密度、 など ）および化学的性質の違いに交絡結果を排除しながら、株および経年嚥下機能/機能不全の直接比較を可能にするために不可欠である。この目的のために、我々は、マウスVFSS中の経口造影剤の嫌悪味/臭いをマスキングすることが好ましい風味増強剤を同定するための簡単、迅速な嗜好スクリーニングアプローチを開発した。方法はなめるを必要とする短時間の暴露試験、後にモデル化されたオーメーター（ すなわち、なめるセンサ）渇き24,25を誘導する水の規制期間（ すなわち、源泉水で一晩）の後の最初の2分の間になめる率を記録する。 lickometerは、この研究のために利用できなかった。従って、好ましいのは、行動観察、ならびに以前に我々の研究室13,14に検証されているなめる率のための標準的なビデオ記録方法により評価した。この嗜好性スクリーニングアプローチを使用して、チョコレートC57及びC57 / SJL株による好ましい風味増強剤として同定された。具体的には、各ケージ内のマウスの100％が容易に複数のマウスが同時に注ぎ口で飲んで、露出の30秒以内にチョコレート風味のソリューションを飲んだ。しかし、バリウムのほかにかかわらず、バリウムまたはチョコレート濃度の、ほとんどのマウスのみで簡単な飲酒の試合となった。
バリウムの代替は、ごく最近がsuiとして認識されているヨウ素ベースの造影剤イオヘキソールある人間VFSS 10用の硫酸バリウムにテーブル代わる。従って、それはまだ、この目的のために標準化されていない。チョコレート風味イオヘキソールのいくつかの異なる濃度は、マウスに提供された。在庫イオヘキソール（1ml当たり350mgのヨウ素）の50％溶液まで含有するレシピは、容易に一晩水の調節期間の後、ほとんどのマウスが飲んた。より高い濃度が回避行動をもたらした。 50％のイオヘキソール（1ml当たり350 mgのヨウ素）ソリューションは、より低い濃度が著しく少なく見えたとツバメ生理学の定量化を妨げ、一方、マウスに飲み込まれながら十分な放射線濃度を生産した。チョコレート風味50％イオヘキソール溶液を添加したがって、マウスでのVFSSための最適試験液を同定した。繰り返し嗜好性試験は、回避行動や有害事象を生じなかった。
克服するための第三の課題は、可視化を不明瞭飲みながら自分の頭を、傾斜/回転からマウスを防止したVFSS中の嚥下メカニズムの。 PEG-ボウルから飲むだけで、この問題を解決し、チャンバの一端に床の上方に位置する。ペグボウルの代わりにシッパーチューブボトルを使用して、いくつかの追加の利点がある。例えば、液体の較正容積を観測管のエンドキャップで通気孔を介してペグボウル内にピペッティングすることができる。このアプローチは、簡単なVFSS試験時間中に消費試験溶液の微小体積の定量化を可能にする。また、小型のシッパーチューブ開口部に比べて、ペグボウルに試験液の表面積を増加させ、さらにやる気を飲むまで増加嗅覚刺激を与えることができる。ボウルの高さが床面から標準化された距離であるようにペグボウルは、若い以下系マウスを研究するために適しているであろう。これとは対照的に、シッパーチューブの長さは考慮すべき別の潜在的な交絡変数を追加している、異なるサイズのマウスに対応するように調整されなければならない。また、マウスモードそれらは容易にペグボウルに達することができるのに対し、神経疾患のlsが困難により四肢の運動障害にシッパー管瓶に到達していてもよい。舌および/または顎機能障害を持つマウスは、十分に液体にアクセスするための注ぎ口にボールを押すできないことがあります。ペグ·ボウルを使用すると、この交絡を排除することができます。これらの理由から、シッパーチューブボトル上のペグボウルの使用は、ネズミVFSS試験の好ましい方法である。しかし、観察室は、必要に応じて噴出飲料を収容するように設計された。考慮すべき重要な注意点がなめる率は注ぎ口とボウル飲酒13,26間で異なることが知られているということです。したがって、VFSSための注ぎ口またはPEG-ボウルのどちらかの選択は、実験内および間で一貫している必要があります。
第四の課題は、一般的に人間の調査研究および臨床診療で使用VFSSパラメータに匹敵するマウスについての定量可能な嚥下のパラメータを同定することであった。私たちの予備調査結果が示された透視システムのタイプは、パラメータは、マウスにおいて調べることができる飲み込むかを決定します。ほとんどの研究センターや医療の設定が高エネルギー（75〜95 kVの1-5 mA）を持っているマウスや他の小動物をテストする際に非常に貧弱な画質になるもの、人々とより大きな動物で使用するために設計された透視。例として、ラットを用いた高エネルギーX線透視装置を使用した最近の研究では、唯一の4定量化可能なツバメパラメータ12を識別することができた、と私たちはこの本研究では、マウスのためにのみ7ツバメのパラメータを識別することができました。この主要な制限を克服するために、我々は最近LabScope（Glenbrookのテクノロジーズ）と呼ばれる低エネルギーX線透視システムを得た。システムは、15と40 40kVおよび0.2ミリアンペア（最大電力W 8）のピーク管電流との間の光子エネルギーを有するX線の連続的なコーンビームを発生する小型のX線透視装置である。このシステムの低エネルギーレベルは、よりよいマウスの薄い骨および軟組織によって減衰され、したがってhighe提供されている従来の（ すなわち、高エネルギー）透視よりもRのコントラスト分解能。 LabScopeのX線ビームは、従来の透視の15〜57センチメートル直径イメージインテンシファイアよりも著しく小さい直径5cmイメージインテンシファイア、に向けられている。 LabScopeの最小ソース - テンシ距離（SID）が増加倍率機能を提供5~6センチメートル（従来の透視用の約30センチメートルとは対照的に）である。また、LabScopeはSIDを変更することなく、デジタルでリアルタイムに40倍まで画像を拡大する特許技術を使用しています。結果は、本質的にそのようなマウスの嚥下メカニズムとして興味のある小領域を表示するには、リアルタイムでズームイン、ズームアウトができるX線顕微鏡です。
この低エネルギーX線透視システムの主な利点は、放射線の安全性を向上させることができる。 LabScopeに低い放射線量を受けた動物に加えて、システムを使用して研究者に露出される有意レ複数の放射線散乱。コントロールパネルで直接ユニットの前の放射線被ばくは10.3レントゲン/ hrである。ユニットの前面に距離1メートルで、露出が580μR/時まで低下する。客室内に他のほとんどの場所は10μR/時以下の非常に低いエクスポージャーを持っている。この改善にもかかわらず、我々は、放射線の安全性を改善するための余分な対策をとっている。例えば、有鉛アクリルシールドは（エプロン、甲状腺シールド、眼鏡を導く、例えば ）個人的なシールドを着用していなくて、ネズミVFSSテストを実施するために、研究者を可能にする、散乱X線光子をブロックするLabScopeを中心に追加されました。また、透明なアクリルが遠くからマウスの可視化を可能にする。さらに放射線安全は、研究者によってリモートで制御される電動式シザーリフトテーブル、によって提供されます。 X線透視装置から3メートルまでの距離から、研究者は、X線ブロガー内観察室の垂直および水平位置を調整するために遠隔制御装置を使用することができM。マウスは自由に観察チャンバ内を移動しつつ、関心の解剖学的領域は、視野の蛍光透視視野内に維持することができる。シザーリフトLabScopeで使用するために設計されたが、それはまた、研究者、放射線の安全性を改善するための従来の透視装置との使用に互換性がある。マウスVFSS中に放射線の安全性を向上させるための最後のステップは、液体用シリンジ送達システムの使用を伴う。このシステムは3-4フィート（以上、必要に応じて）距離からペグボウルに液体を迅速かつ効率的な送達を可能にPEチューブの長さを含む。液体のためのこの注射器送達システムは、観察室と組み合わせて、従来の透視装置と共に使用することができる。
新しいマウスVFSSプロトコルと組み合わせLabScopeを用いて予備的作業は、従来のシステムに勝る大きな利点を示しています。私を確実に定量化することができる嚥下パラメータの数よほぼ倍増した。低または高エネルギーX線透視システムを使用している際ただし、マウスの嚥下メカニズム（ 例えば、舌、軟口蓋、咽頭後壁、及び喉頭蓋）の軟組織構造は、容易には見えません。したがって、我々は、ボーラスの流れを測定するのではなく、嚥下の生体力学を定量化に焦点を当てた。我々は、むしろリッカート型尺度の尺度を使用しても、時間、面積、距離、体積、 等の単位に基づいて定量することができるパラメータで主に興味があった。多数のボーラス流れパラメータ会は、この要件はごく一例を挙げれば、このような経口輸送時間27-29、咽頭通過時間27-33、および食道の通過時間が34〜36として、人間のVFSSの文献に記載されている。口腔を通してボーラス輸送が自発飲酒中の小さなボーラスサイズにおそらく、マウスでは容易には見えませんでした。しかし、我々としても、確実に咽頭と食道の通過時間を定量化することができましたボーラスの流れとクリアランスに関するいくつかの他の措置として。我々はLabScopeの機能を最適化するように追加の翻訳スワローパラメータの同定が期待されている。
この研究の結果は、マウスが咽頭ツバメをトリガする前にvallecular空間を満たす各小液体ボーラス順次で、自発的な飲酒中にツバメごとに複数のリズミカルななめを取ることを示した。液体37-40を摂取するための主要な手段として舐める使用の哺乳動物のための典型的なものであるこの動作は、一般的に人間の乳児嚥下およびすべての乳児の哺乳動物のリズミカルサックツバメパターンに似ている。生理学は、いくつかのリズミカルなことを特徴としている嚥下幼児は、一般的にサックツバメサイクル37,41-43として記述反射的咽頭ツバメ、続い吸う。このように、マウスの摂食舐める行動に関与してリズミカルな舌やあごの動きはハムの吸引行動を摂食する方が匹敵し得る子供と大人による乳幼児のではなく、カップを飲む。したがって、我々は、人間の乳児の割合を吸うとサックツバメ比で将来の比較のために、マウスのなめる率となめる-ツバメ比を定量化されています。おそらく、ネズミVFSSの研究が発達嚥下障害への洞察を提供します。
新たな研究方法と同様に、改善のための領域が同定されている。例えば、マウスVFSSプロトコルは、唯一のC57とC57 / SJLマウス株を用いて開発されました。それはまだラットでテストされていません。観察室は、ラットの大きいボディサイズに対応するサイズ（直径及び長さ）にスケールアップする必要がある。チョコレート風味イオヘキソールユニバーサルマウスVFSSの試験液として好適である場合も、それは不明である。そのため、マウスとラットの複数の株を持つ大規模なテストは、この目的のために保証されています。また、ネズミVFSS用造影剤としてバリウムを使用することは排除すべきではありません。マウスは、明らかにiohex好ましいバリウムオーバーオールレシピ。しかしバリウムの嫌悪味/臭いをマスキングでより厳格かつ体系的な試みがイオヘキソールの口に合う代替案を提供することができる。味の好みにイオヘキソールと硫酸バリウムの効果を比較今後の研究（だけでなく、他の潜在的な経口造影剤）とは間違いなく人間VFSSに直接関連および翻訳で重要な情報を提供するマウスやラットで生理を飲み込む。
人間とVFSSは食品や液体のいくつかのコンシステンシーが含まれており、薄い液体および乾燥、固形食品44,45を飲み込むとき嚥下障害は最も明らかである。マウスVFSSプロトコルは、従って、疾患モデルにおける嚥下障害の検出および定量を容易にすることができる追加のコンシステンシーを含むように拡張されている。また、人間のVFSS中に使用されるものと一致するように粘度を調整するために、マウスVFSS用液体レシピの粘度試験を実施する必要がある。これらの制限に対処する管理ポイントを直接マウス、ラット、およびヒトの間で比較することができる嚥下障害の並進VFSSバイオマーカーの同定を容易にする。
マウスVFSSの有用性は著しく、それによって嚥下の生体力学の調査を可能にする、そうでなければ見えない嚥下機構の軟組織構造に放射線不透過性マーカーを注入することによって向上させることができる。このアプローチは、正常に金属クリップとワイヤ37,42の品揃えを使用して、乳児ブタ嚥下の生体力学を研究するために長年使用されている。我々は、同様の使用を期待するが、より小さい、マウスでのマーカーは、ヒトを含む大型哺乳動物との比較のためにいくつかの追加の嚥下パラメータの定量化を可能にする。我々は現在、舌への放射線不透過性マーカー、軟口蓋、咽頭、喉頭、およびこの仮説をテストするために、マウスの近位食道を移植するための方法論を開発している。
ビデオrecordinLabScope従来透視gのフレームレートは毎秒30フレーム（fps）に制限される。しかしながら、我々の予備的結果は、健康なマウスで嚥下の全体咽頭段階が約10倍速くヒト以外未満66ミリ秒（ すなわち、2フレーム）で発生することを示した。このように、マウスでは嚥下の咽頭相は、詳細は30 fpsのカメラでかなりのないように、すぐに発生します。高いフレームレート（おそらく> 100 FPS）が十分にマウスや他のげっ歯類で嚥下の咽頭段階の非常に迅速かつ複雑な動きを可視化し、定量化することが必要であろう。より高いフレームレートに関連して、3次元透視画像化のために二平面技術を組み込むことは、確かに実用マウスVFSSを拡大する。そのため、将来の設計上の考慮事項は、より高いフレームレートカメラと二平面イメージング機能を含める必要があります。
最後に、低線量放射線のに無菌性を引き起こすことが示されている寿命の研究46を混乱も卵巣刺激されたホルモンのレベルの変化をもたらし、女性C57マウス、。 VFSSのテストに関連する繰り返される低線量放射線被曝の影響に特異的に関連する成果はまだ、マウス、他の動物、またはヒトで調べられていない。しかし、人間の女性における卵巣機能不全（放射線被曝に関連していない）47、場合によっては、胃腸運動性障害に、特に嚥下障害に関連している、雌（動物およびヒトを含む将来のVFSS研究を設計する際に考慮すべき更に別の警告を提供する）。嚥下機能の有意な性差は人48,49について報告されていると検出し、ならびに動物疾患モデルにおいて特徴づけることが重要であるように、女性の排除は、避けるべきである。そのため、両方の性のマウスとラットにおける縦VFSS研究からの成果は、Dに対する相対人間のための多大な翻訳可能性を秘めているysphagia、ならびに反復VFSSのテストに関連する低線量放射線被曝のリスク。
Disclosures
この記事のオープンアクセスはGlenbrookのが主催している。
Acknowledgments
私たちは、優雅に、データ収集（アンドリース·フェレイラ、Danaraeアレマン、アレクシスモク、Kaitlinフリン、エリザベスBearce、およびマタンKadosh）と原稿レビュー（アンドリース·フェレイラ、レベッカシュナイダー、そしてケイト·ロビンズ）に貢献したレバーラボの追加のメンバーに感謝。また、本研究で用いたげっ歯類の観測管の彼らの設計入力および製造のためのMU物理マシンショップからロデリックSchlotzhauerとエドウィンHonseを認める。とヤンアイビー（ミズーリ大学の研究動物キャスラボのマネージャー - 医学部） - 私たちは、Maleaヤンクンケル（獣医学の大学ミズーリ大学の獣医医療および外科手術部門の放射線スーパーバイザー）の特に感謝してい我々はネズミVFSSプロトコルを開発したとして、高エネルギー透視を動作させながら一定の忍耐と意欲を実証するため。この研究のための資金源は、NIH / NIDCD（TEレバー）、NIH / NINDS（GK Pavlath）、Otolaryngoを含まLOGY - 頭頸部外科起動資金（TEレバー）、MU PRIME基金（TEレバー）、ミゾーアドバンテージ（TEレバー）、及びエイジング上のMUセンター（TEレバー）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycarbonate tubing for observation chambers | McMaster-Carr | 3161T41 | Body of observation tubes, 2"X2" diameter, 0.080" thick wall |
| Polycarbonate sheet for observation chambers | McMaster-Carr | 9115K71 | End-caps for observation tubes, 2"x12"x3/4" |
| Polycarbonate sheet for observation chambers | McMaster-Carr | 8574K281 | Peg-bowls for observation tubes |
| Silicone O-rings for end-caps of observation chambers | McMaster-Carr | 9396K108 | S1138 AS568-029, pack of 25 http://www.mcmaster.com/#o-rings/=t0wt5r |
| Silicone stoppers for observation chambers | McMaster-Carr | 2903K22 | Package of 10 stoppers to plug the oval opening in the top of the observation chamber when using a peg-bowl http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3803/=t0y5at |
| Centrifuge tubes for sipper tube bottles | Evergreen Scientific | 222-3530-G80 | 30 ml freestanding centrifuge tubes, with caps, sterile https://www.evergreensci.com/labware-catalog/tubes-and-vials/30-and-50-ml-centrifuge-tubes/ |
| Silcone stoppers for sipper tube bottles | Saint-Gobain Performance Plastics | DX263031-10 | Number 31D, size: 26 mm bottom, 32 mm top, 30 mm high; 10 pack; http://www.labpure.com/en/Products.asp?ID=179&PageBrand=STOPPERS |
| Stopper borers for sipper tube bottles | Thomas Scientific | 3276G40 | Cork Borer Set that ranges from 3/16-15/16 inch http://www.thomassci.com/Supplies/Corks/_/CORK-BORER-SET-316-1516-IN?q=Humboldt |
| Drinking tubes for sipper tube bottles | Ancare | TD-100 | 2 1/2” long drinking tubes with 5/16” opening, straight ball-spout http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point |
| Iohexol for making oral contrast agent solution | GE Healthcare | 350 mg iodine per ml http://www3.gehealthcare.com/en/products/categories/contrast_media/omnipaque |
|
| Chocolate syrup for flavoring oral contrast agent | Herseys | ||
| 10 ml syringe for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 309604 | Luer lock tip syringe without needle, 100 per box http://www.bd.com/hypodermic/products/syringeswithoutneedles.asp |
| Catheter tubing for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 427451 | Polyethylene Tubing (Non-Sterile) (PE 240) 100' http://www.bd.com/ds/productCenter/427451.asp |
| Needle for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 427560 | 15-gauge needle, fits into PE 240 catheter tubing http://www.bd.com/ds/productCenter/427560.asp |
| Delrin acetal resin rod for syringe delivery system | McMaster-Carr | 8576K15 | 1/2 inch diameter, black http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3609/=t0wvaf |
| Acrylic sheeting for scissor lift | Ponoko | Laser cut http://www.ponoko.com |
|
| 3D printed ABS frame | Engineering Rapid Prototyping Facility, University of Missouri | ||
| Brass rods for scissor lift | Amazon | TTRB-03-12-03 | made into axles http://www.amazon.com/Brass-Seamless-Round-Tubing-Length/dp/B000FN898M |
| Drawer slide for scissor lift | Richelieu | 10292G116 | Attaches to base of scissor lift http://www.lowes.com/pd_380986-93052-T35072G16_0__?productId=50041754 |
| 28BYJ-48 stepper motor for scissor lift | 2 each | ||
| ULN2003 Darlington transistor array for scissor lift | Toshiba | ULN2003APG | Used as stepper drivers (2 each) |
| ATTINY85 microcontroller for scissor lift | Atmel | ATTINY85-20PU | 2 each http://www.taydaelectronics.com/attiny85-attiny85-20pu-8-bit-20mhz-microcontroller-ic.html |
| Nylon spur gear | McMaster-Carr | 57655K34 | 2 each http://www.mcmaster.com/#57655k34/=t0yaqz |
| Nylon spur gear rack | McMaster-Carr | 57655K62 | 2 each http://www.mcmaster.com/#57655k62/=t0ybh9 |
| 4-40 nylon machine screws | McMaster-Carr | 95133A315 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#95133a315/=t0yd8q |
| 4-40 nylon hex nuts | McMaster-Carr | 94812A200 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#94812a200/=t0ye29 |
| Buna-N O-Ring AS568A Dash No. 104 | McMaster-Carr | 9452K318 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#9452k318/=t0yem7 |
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