Summary
Denne undersøgelse held tilpasset humane videofluoroscopic sluge undersøgelse (VFSS) metoder til brug med murine sygdomsmodeller for at lette translationel dysfagi forskning.
Abstract
Denne undersøgelse er tilpasset menneskelig videofluoroscopic synke Study (VFSS) metoder til brug med murine sygdomsmodeller for at lette translationel dysfagi forskning. Succesfulde resultater er afhængige af tre kritiske komponenter: testkamre, der tillader selv-fodring mens stående uhæmmet i et lukket rum, opskrifter, der maskerer afskrækningsmiddel smag / lugt af kommercielt tilgængelige orale kontrastmidler, og en trin-for-trin testprotokol, tillader kvantificering af svale fysiologi. Fjernelse af et eller flere af disse elementer vil have en skadelig virkning på undersøgelsens resultater. Desuden vil energiniveau evne til fluoroskopi systemet bestemme, hvilke sluge parametre kan undersøges. De fleste forskningscentre har høje energipriser fluoroscopes designet til brug med mennesker og større dyr, hvilket resulterer i usædvanlig dårlig billedkvalitet, når der testes mus og andre små gnavere. På trods af denne begrænsning, har vi identificeret syv VFSS parametre, der er konsekvent kvantificerbar i mus ved brug af en højenergi fluoroscope i kombination med den nye murine VFSS protokol. Vi har for nylig fået en lavenergi fluoroskopi-system med usædvanligt høje imaging opløsning og forstørrelse kapaciteter, der blev designet til brug med mus og andre små gnavere. Forarbejde ved hjælp af dette nye system, i kombination med den nye murine VFSS protokol, har identificeret 13 sluge parametre, der er konsekvent kvantificerbar i mus, hvilket er næsten dobbelt så mange opnås ved anvendelse af konventionelle (dvs. høj energi) fluoroscopes. Identifikation af yderligere sluge parametre forventes som vi optimerer mulighederne i dette nye system. Resultater hidtil demonstrere nytten af at anvende en lavenergi fluoroskopi system til at detektere og kvantificere subtile ændringer i svale fysiologi, som ellers kan blive overset, når du bruger høj energi fluoroscopes at undersøge murine sygdomsmodeller.
Introduction
Dysfagi (synke svækkelse) er et almindeligt symptom på mange medicinske tilstande, der påvirker folk i alle aldre. Eksempler indbefatter slagtilfælde, Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom, cerebral parese, muskelsvind, amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Batten sygdom, hoved- og halscancer, for tidlig fødsel og avanceret aldring. Dysfagi er stærkt korreleret med dødelighed, typisk som følge af alvorlig fejlernæring eller lungebetændelse, der udvikler sig, når bakteriel lastet fødevarer / væske / spyt aspireres i lungerne 1-4. Denne invaliderende og livstruende medicinsk tilstand påvirker over 15 millioner mennesker hvert år i USA alene 3. På trods af den høje forekomst og tilknyttede negative resultater, er de nuværende behandlingsmuligheder for dysfagi begrænset til palliativ (snarere end helbredende) tilgange, såsom kostændringer (fx undgå bestemte fødevarer / flydende konsistenser), posturale ændringer (f.eks tucking hagen, når synke), motoriske tilgange (f.eks øvelser rettet mod musklerne i mundhulen, svælget og larynx), sensoriske metoder (fx gennemførelse af smag, temperatur og / eller mekanisk stimulation), og sondeernæring (f.eks ernæring og hydrering administreret via nasogastrisk (NG) rør eller perkutan endoskopisk gastrostomi (PEG) rør). Disse behandlinger tjener blot som symptomatisk behandling snarere end målretning de underliggende årsager til problemet. Faktisk en stor hindring for opdagelsen af nye, effektive behandlinger for dysfagi er den begrænsede videnskabelige viden om de ansvarlige patologiske mekanismer, som sandsynligvis forskellig for hver sygdom.
Dysfagi diagnose overvejende fremstillet ved hjælp af en radiografisk procedure kaldes en videofluoroscopic synke undersøgelse (VFSS), også kendt som en modificeret bariumsynkning undersøgelse. I løbet af de sidste 30 plus år, har denne diagnostiske test været betragtet som gold-standard for evaluating sluge funktion 5-7. Denne test indebærer at have patienten sidde eller stå i vejen for røntgenstrålen af en fluoroskopi maskinen, mens frivilligt indtage mad og flydende konsistenser blandet med en mundtlig kontrastmiddel, typisk bariumsulfat 8,9 eller iohexol 10. Da patienten sluger, kan fødevarer og væske indeholdende kontrastmiddel ses i realtid via en computerskærm under rejser fra munden til maven. Bløde vævsstrukturer også er synlige og kan vurderes i forhold til struktur og funktion. Patienterne bliver bedt om at udføre flere svaler af hver mad og flydende konsistens, som alle er video optaget til senere visning og frame-by-frame-analyse for at kvantificere tilstedeværelsen og graden af dysfagi. Talrige fysiologiske komponenter af de sluger typisk analyseres, såsom anatomiske tærskelværdi i svælg svale, bolus transittiden gennem svælget og spiserøret, omfanget og varigheden af larynGEAL elevation, placering og mængden af post-sluge resten, og forekomsten af og fysiologiske årsag til aspiration 7,11.
Aspekter af den menneskelige VFSS protokollen blev for nylig tilpasset til at studere frit opfører rotter; resulterer imidlertid var begrænset, fordi rotterne ikke forblive i videofluoroscopic synsfelt under testen 12. VFSS har ikke tidligere været forsøgt med mus. Vellykket tilpasning af den humane VFSS protokol til brug med mus og rotter vil tilvejebringe en hidtil ukendt forskning metode til at undersøge de hundredvis af i øjeblikket eksisterende murine (mus og rotter) modeller af sygdomme, der vides at forårsage dysfagi hos mennesker. Denne nye metode (herefter benævnt murine VFSS) vil derfor fremskynde identifikation og validering af murine modeller af dysfagi som er egnede til at undersøge de underliggende neurofysiologiske mekanismer i muskler, nerver, og hjernevæv, der er patologisk og bidrager til dysfagi in mennesker. Desuden ville murine VFSS kan identificeres objektive foranstaltninger (biomarkører) i svale funktion / dysfunktion, der kan sammenlignes direkte med mennesker. Disse tværs af arterne videofluoroscopic biomarkører kan så tjene som nye resultatmål at kvantificere behandling effekt i prækliniske forsøg med mus og rotter, som bedre ville oversætte til kliniske forsøg med mennesker.
Til dette formål blev det murine VFSS protokol er fastlagt ved anvendelse af ~ 100 mus af begge køn. Alle mus blev enten C57 eller hybride C57 / SJL stammer. De C57-mus blev ikke genetisk ændret, hvorimod C57 / SJL var baggrunden stamme til en koloni af transgen SOD1-G93A (eller SOD1) mus, den mest udbredte dyremodel for ALS. Den SOD1 koloni var en omtrentlig 50-50 blanding af transgene (dvs. ALS-ramte) mus og ikke-transgene (dvs. upåvirket) kuld.
Den murine VFSS protokol består af tre komponenter:
- Opskrifter, der maskerer afskrækningsmiddel smag / lugt af orale kontrastmidler og producere tilstrækkelig radiodensiteten til at tillade tilstrækkelig visualisering af synke,
- En trin-for-trin forsøgsprotokollen, der maksimerer overholdelse dyr, minimerer den samlede testtid og stråling, og tillader kvantificering af flere sluge parametre for hvert trin i at synke (dvs. oral, svælg og spiserøret).
Den kombinerede virkning giver en behagelig, lav belastning, selv-fodring undersøgelse miljø, der tillader vurdering af typiske fodring og synke adfærd hos mus.
Protocol
Den murine VFSS protokol følger en godkendt Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) protokol og NIH retningslinjer.
1. Konstruer Observation Chambers af polycarbonat Tubing og Plader (figur 1)
- Skær 5 cm bred, firkantet polycarbonat rør (~ 2 mm vægtykkelse) i 16 cm længder ved hjælp af en manuel fræsemaskine. De fleste mus tilstrækkeligt passe indenfor disse dimensioner, hvilket resulterer i en smal testkammer, der tillader gå og dreje rundt som ønsket. En vægtykkelse på ~ 2 mm giver tilstrækkelig stivhed uden signifikant svækkelse af røntgenstråle.
- To typer af kamre er afgørende for denne protokol: "tud rør", designet til at levere væsker via tud, og "ventilation rør", designet til at levere væsker via peg-skål.
- For "tud rør", lave en lille aflangt hul (12 x 8 mm) i toppen af hvert rør nær den ene ende ved hjælp af en manuel fræsning machine. Dette hul bruges til at levere drikkevand løsninger via en sipper rør tud under adfærdsmæssige condition og VFSS test.
- For "ventilation rør", bore 9 små ventilationshuller i toppen af hvert rør nær den ene ende. Dette rør anvendes under VFSS test med en PEG-skål i stedet for Sipper rør.
- Det er muligt at anvende tud rør når leverer væske via PEG-skål; dog skal åbningen i loftet kammeret blokeres for at forhindre distraherende sonderende adfærd ved mus (se trin 6.2.2).
- To typer af kamre er afgørende for denne protokol: "tud rør", designet til at levere væsker via tud, og "ventilation rør", designet til at levere væsker via peg-skål.
- Cut polycarbonat folie (3/4 "tykkelse) i endekapper (50 x 50 mm, 2 pr rør) ved hjælp af et edb-fræser, også kaldet et edb numerisk kontrol (CNC) maskine.
- Mill en aflang rille (19 x 6 mm) nær en kant af den indre flade af hver endekappe. Brug denne rille til at sikre en pind-skål for mus til at drikke fra løbet VFSS test.
- Mill 5 runde ventilationshuller (6 mm diameter) Gennem hver endehætte.
- Mill en mindre rundt hul (diameter 5 mm) gennem endekappe, direkte over den aflange rille. Brug dette hul til at levere væske ind i pind-skål under VFSS test.
- På den ydre flade af endekappe, mølle en 9/16 "diameter forsænkning, der er 1/4" dyb omkring dette mindre hul.
- Mill væk 2 mm langs omkredsen af den indre flade af endekappe til en dybde på 7 mm for at gøre et trin, der let indsættes i enden af røret.
- Mill et 1 mm rille i trin af endekappe til at rumme en O-ring, som er nødvendige for at forhindre endekappe falder ud af enden af røret.
- Afrund udsatte kanter og smig alle hjørner af endekapper for at forhindre at tygge med mus.
- Gør PEG-skåle fra polycarbonat folie ved hjælp af en CNC-maskine. Overordnede dimensioner skal være 24 x 19 x 6 mm 3, med en 10 x 3 mm 2 skålform depression i den ene ende. En PEG-skål er needed for hvert rør. PEG-skåle skal indsætte stramt ind i aflange rille i endekapper (figur 2).
Figur 1:. Observation Chambers Observation kamre blev designet til at opretholde frit opfører dyr i fluoroskopi synsfelt. Disse billeder viser kammer komponenter uundværligt i VFSS. Top: "tud rør", der er designet til at levere væsker via tud. Nederst: "ventilation tube", designet til at levere væsker via peg-skål. De to endekapper er udskiftelige mellem tud og ventilation rør.
Figur 2:. PEG-skåle hver pind-skål klikker ind i en rille i den indre flade af hver endekappe. Venstre:ikke samlede komponenter. Middle: samlede komponenter. Til højre:. Udvendige flade af endekappe Klik her for at se en større udgave af dette tal.
2. Construct Sipper Tube flasker fra centrifugerør Silikone Propper og Metal drikketude (figur 3)
- Brug en prop borer (5/16 ") for at gøre et center hul gennem hver silicone prop.
- Påfør et par dråber mineralsk olie i borehullet og manuelt indsætte en metal tud i den brede ende af proppen. Lige kuglepen tude foretrækkes, fordi lige open-end tude medfører overdreven lækker og sprøjt af kontrastmidlet i observation kammer, som kan forstyrre visualisering under testen.
- Juster tuden længde, således at det spænder over hele længden af silikone prop og strækker ca. 3 cm ud over den brede ende af proppen.
- Sæt den smalle ende af hver prop (indeholdende en Sipper rør) i et 30 ml centrifugerør.
- Kontroller, at tuden længde er tilstrækkelig ved at indsætte den gennem det aflange hul i toppen af observation kammeret. Tuden spids skal hvile ca. 1 cm fra loftet kammeret, som er tilstrækkelig lang til raske voksne mus at nå.
BEMÆRK: Længere længder resulterer i mus drikke, mens du drejer / vippe hovedet, som tilslører visualisering af synke under VFSS. - Forlæng tuden længde til at rumme yngre mus, mindre størrelse musestammer og mus sygdomsmodeller, der ikke kan nå tuden på grund af motorisk svækkelse af lemmerne.
- Vask nylavede tude før brug for at fjerne mineralolie, silikone snavs og andre forureninger under håndteringen.
Figur 3: Sipper. Tube Flasker Venstre: ikke samlede komponenter. Middle: samlede komponenter. Til højre:. Mus drikke fra sipper rør i observation kammer Klik her for at se en større udgave af dette tal.
3. konstruere en Sprøjte Delivery System til brug med PEG-skåle (figur 4)
- Brug en drejebænk til at adaptere til polyethylen (PE) rør tilslutning til observationskammeret endekapper, beskrives som følger.
- Skær 1/2 "diameter acetalharpiks stang materiale i 1 1/4" længde sektioner, i det følgende benævnt røradaptorer (eller adaptere).
- I den ene ende af hver adapter, reducere en 1/2 "længde sektion ved spidsen til 3/16" diameter, henvist til heri som den smalle ende.
- For de resterende 3/4 "længde sektion af hver adapter (dvs. 1/2" diameter ende), machine riller til manuel gribning under ose. Dette afsnit er heri benævnt den brede ende.
- I den brede ende af hver adapter, bore et hul i midten, der er 0,098 "diameter og 1" dyb.
- Bor og ream den resterende del af midterhullet i hver adapter til 0,096 "at give en pasform på PE rør.
- Skær PE rør (PE 240, indvendig diameter 1,67 mm) til den ønskede længde ved hjælp af en saks. En 3-4 fods længde tilstrækkeligt øger afstanden mellem investigator og fluoroscope under VFSS test for at forbedre strålingssikkerhed.
BEMÆRK: Længere længder vil udnytte et større volumen af kontrastmidlet løsning under VFSS test, måske større end den standard 30 ml opskrift. - Indsæt en stump spids 15 G kanylen helt ind den ene ende af PE slangen. Beslaget skal sidde.
- Sæt den anden (frie) ende af PE rør gennem hullet i midten af adapteren rør, der starter ved tHan brede ende.
- Træk PE slangen ud af den smalle ende af adapteren, så at den strækker ~ 2 mm.
- Sæt den smalle ende af adapter (med ~ 2 mm PE rør strækker sig fra det) ind i enden-cap af en observation rør; Det skal passe stramt ind i den forsænkede hul placeret direkte over PEG-skål.
- Juster PE slangelængde ved den smalle ende af adapteren, så at den strækker sig næsten over skålen depression i PEG-skål.
- Fyld en 10 ml sprøjte (uden nål) med vand fra et bæger, og fjern eventuelle luftbobler.
- Sæt den fyldte sprøjte til nåleenden af PE slangen.
- Skub langsomt sprøjtens stempel til at levere vand i PEG-skålen i observationskammeret. Stop når PEG-bowl er næsten fuld. Undgå overfyldning, hvilket vil forårsage sprøjt under drikke.
- Hvis PEG-skål ikke fylder korrekt, justere længden af PE rør strækker sig over PEG-skål.
- Over-forlængelse af PEslanger vil lokke mus til at tygge på det i løbet af test, i stedet for at drikke fra den pind-skål.
- Hvis PE slangen ikke udvides langt nok, vil væske løber gulv observation kammer snarere end at udfylde PEG-skål.
- Efter brug afmontere sprøjten og hele levering sprøjtesystem vaskes med sæbe og vand. Brug en 10 ml sprøjte til at skubbe luft gennem PE rør for at fjerne vand. Steriliseres ved autoklavering efter behov.
Figur 4:. Syringe Delivery System Venstre: ikke samlede komponenter. Middle: samlede komponenter. Til højre:. Mus drikke fra pind-skål i observation kammer Klik her for at se en større udgave af dette tal.
4. Konstruer en motoriseret Scisseller Lift Tabel til Fjernbetjening Placering af Observation Afdeling (figur 5)
- Byg en scissor lift med en 12 x 12 cm platform, som kan hæves og sænkes med 5 cm til at rumme set mus i forskellige positioner inden for fluoroskopi synsfelt. Lift materiale skal være af metal eller plast for at lette rengøring med desinfektionsmidler.
- Mount stepmotorer at justere højden og langsgående position af elevatoren.
- Par den første stepmotor til scissor lift mekanisme til at styre højden ved at oversætte en overligger. Denne kobling kan være en ledende skrue eller rack-and-pinion gearing.
- Par den anden stepmotor til saksen løfterammen til at styre den langsgående stilling ved at omsætte hele løfterammen i forhold til bordet. Denne kobling kan være en ledende skrue eller rack-and-pinion gearing.
- Wire et fjernstyringssystem til stepmotorer til at tillade justering af position observationskammeret under billedbehandling samtidig minimere UNDERSØGELSEtor udsættelse for stråling.
- Interface håndholdt fjernbetjening knapper med en microcontroller chip til at styre aktiveringen og retningen af hver stepmotor.
Figur 5:. Fjernstyret Scissor Lift Tabel Venstre: fra siden af sakselift bord. Til højre: løftebord med observation kammer placeret i fluoroscope. Liften Tabellen justerer positionen af observationskammeret at opretholde mus i synsfeltet. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
5. Udfør Behavioral Conditioning Før VFSS test for at sikre Maksimal deltagelse
- 1-2 uger før VFSS prøvning, såfremt mus til én natten over (12-16 timer) vandregulering periode at fremkaldetørst, i hvilket tidsrum vand tilbageholdes fra hjemmet bur. Målet med vand regulering er for dyr til at være tørstig, ikke dehydreret. Dyrene skal være opmærksom og lydhør. Denne varighed og tidsramme er afgørende for at undgå dehydrering, som kan opstå som følge af 2 vandregulering episoder inden for 1 uge (dvs. en for adfærdsmæssige condition og en anden for VFSS afprøvning).
- Placer et enkelt "tudrøret" (med den ene ende lukket med en endekappe) på gulvet i et bur, der indeholder frisk strøelse. Den lukkede ende skal være nærmest tudåbning i loftet kammeret. Dette trin sikrer tilstrækkelig ventilation mens flere mus søvn krøb i kammeret dybde natten over. Den åbne ende giver mus frit indtaste / forlade kammeret.
- Fjern anden tilsætning materiale (f.eks, nestlet og hytte) at tilskynde mus til at udforske og sove i kammeret natten (figur 6). Dette trin sikrer, at muser akklimatiseret til at være i kammeret for lange varigheder før VFSS test.
- Giv en enkelt standard mad pellet pr mus på gulvet i buret for overnatning spise; giver ikke vand eller andre hydrering kilder.
- Brug et standard filter top til at indeholde mus i buret natten over, dimensionerne af observation kammer forhindrer en standard wire låget fra montering i buret. Opbevar fjernet wire låg (indeholdende mad og vand flaske) på toppen af filteret top at tynge låget og forhindre mus i at undslippe.
- Udfør velsmag teste den følgende morgen, beskrives som følger.
- Lav en chokoladesmag prøveopløsning i en 30 ml sipper rør flaske, uden at tilføje kontrastmiddel (dvs. erstatning vand til iohexol). Denne opskrift er beskrevet i tabel 1. Lav en flaske pr bur skal testes.
- Fjern observation kammer og erstatte standard wire låg. Tilbyd den chokolade-flavoredopløsning (stuetemperatur, ~ 22 ° C) i 2 minutter pr bur, indsat gennem tråden låget.
- Vurdere velsmag ved at observere drikke adfærd under 2 min testperiode.
- Score smagen efter følgende kriterier:
- Latency indtil den første mus drikkevarer i tuden i mindst 5 sek uden afbrydelse.
- Andel af mus pr bur, der drikker løsningen.
- Antallet af mus, der samtidig drikke på tuden.
- Opløsningen anses spiselig, hvis størstedelen af mus i hvert bur have flere lange (> 5 sek) anfald af drikkevand og hvis flere mus samtidigt drikke fra tuden (figur 7).
- Hvis chokoladesmag løsning ikke spiselig, gentages velsmag test med andre smagsforstærkere i forskellige koncentrationer til at identificere en enkelt foretrukken løsning.
- Tilbyde op til fire forskellige løsninger (ved forskellige koncentrationer) en ad gangeni randomiserede for at flere bure af mus i en enkelt test dag, uden en udvaskningsperiode eller udvaskning løsning. Egnede smagsstoffer forstærkere at overveje for mus omfatter sukker, ost, jordnøddesmør, diverse frugt og nødder varianter, og mælk.
BEMÆRK: Udfør ikke velsmag teste mere end en gang om ugen for at undgå dehydrering fra gentagne vandregulering episoder. - Det kan tage flere uger til at identificere den foretrukne løsning for hver stamme af mus. Målet er at identificere kandidat varianter, der resulterer i flere lange (> 5 sek) anfald af drikke af mus straks (<30 sek) efter eksponering, da disse beviser virkelig er betragtes som afgørende for at opnå vellykkede VFSS resultater.
- Efter en foretrukken smag løsning er identificeret, returnere observationskammeret til hvert hjem bur til at fortsætte adfærdsmæssige conditioning, beskrives som følger.
- Sæt den ene ende-cap til observationskammeret i slutningen nærmestoval (tud) hul.
- Offer mus med chokoladesmag opløsning i 2-3 timer ved at indsætte Sipper rør flasken gennem den ovale hul i toppen af kammeret. Dette trin sikrer, at alle mus er blevet konditioneret til at drikke dybt i observationskammeret.
- Fjern wire låg til at rumme observation kammer.
- Placer 1 foderpellet pr musen på buret gulvet for ad libitum forbrug i løbet af testperioden.
- Dæk bur med en standard filter top for at forhindre mus i at undslippe til den resterende del af den adfærdsmæssige conditioning periode. Opbevar fjernet wire låg (indeholdende mad og vand flaske) på toppen af filteret top at tynge låget.
- Giv vand og mad ad libitum i hjemmet bur når adfærdsmæssige conditioning er afsluttet.
- Vask observation kamre (rør og endekapper) og sipper rør flasker (tude og centrifugeglas) med sæbe og vand; steriliseres ved autoklavering efter behov. Undgåanvendelse af acetone til at rense rørene, som det forårsager en permanent uklarhed effekt, der gør røret uigennemsigtig snarere end gennemskinnelig.
Figur 6:. Mus Exploring Observation Chambers Mus er naturligvis tilbøjelige til at søge ly i små rum. Som et resultat, de frit ind og udforske tubus, når den anbringes i bur. De fleste mus findes sovende i kammeret i morgen. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| INGREDIENSER | Chokolade Solution (for Smag Testing) | Chokoladesmag Iohexol (for VFSS Testing) |
| 3 ml | 3 ml | |
| Iohexol (350 mg jod / ml) | 0 ml | 15 ml |
| Vand (DI eller filtreret) | Juster til 30 ml slutvolumen (27 ml) | Juster til 30 ml slutvolumen (12 ml) |
| Slutvolumen | 30 ml | 30 ml |
Tabel 1: chokoladesmag Test Solution Foretrukket af C57 og C57 / SJL musestammer.
Figur 7:. Smag Testing En indikator for præference smag under velsmag test er antallet af mus, der samtidig drikke fra en enkelt tud i hjemmet bur. Dette billede viser fire mus samtidigt drikke en chokolade-flavored løsning, der blev identificeret somforetrukket smagsforstærker af C57 og C57 / SJL stammer.
6. VFSS Test Forberedelse
- Om mus til en overnatning vandregulering periode (dvs. tilbageholde vand i 12-16 timer), som beskrevet i trin 5 ovenfor.
- Placer et enkelt "ventilation tube" (med den ene ende lukket med en endekappe) på gulvet i et bur, der indeholder frisk strøelse. Den lukkede ende skal være nærmest ventilationshullerne i loftet kammeret. Dette trin sikrer tilstrækkelig ventilation mens flere mus søvn krøb i kammeret dybde natten over. Den åbne ende giver mus frit indtaste / forlade kammeret.
- Den følgende morgen, fjerne snavsede observationskamre fra bure og kort skylles med hanevand og helt tørre som forberedelse til VFSS test.
- Fjern og rengør kun et kammer ad gangen for at undgå at blande op kamre mellem bure, der kan forårsage store sonderende adfærd,væsentligt forstyrre VFSS test.
- Hvis "tud rør" anvendes i stedet for "ventilation rør" for VFSS test, indsætte en silikone stik i tuden åbning loftet observationskammeret at forhindre sonderende adfærd (Figur 8).
- Mærk hvert kammer (fx med hjem bur nummer) for at forhindre mix op.
BEMÆRK: Brug en tør slette markør til at mærke hver renset rør inden det sættes tilbage i hjemmet bur. Permanent markør bør undgås, da den absorberes af røret materiale og ikke vaske, selv med alkohol eller acetone.
- Forbered chokoladesmag iohexol opløsning (eller anden spiselig løsning).
- Lav en enkelt opskrift (30 ml) i analyseopløsningen (tabel 1) i flere bure.
- FORHOLDSREGLER iohexol: Opbevar uåbnede iohexol flasker ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Brug åbnet iohexol flasker inden 24HR, som viskositeten og smag kan ændre inden for en dag eller så efter udsættelse for luft. Alternativt fryse portioner af single-portioner (15 ml) i centrifugerør til langtidsopbevaring. Tilberedte iohexol testopløsninger skal bruges inden for et par timer for at sikre friskhed og forhindre unddragelse af mus. Administrer iohexol opløsninger ved stuetemperatur for at undgå confounding undersøgelsen på grund af temperatur effekter på svale funktion. Må ikke fryses resterende forberedt test løsning, da den chokolade smag bliver bitter med frost og resulterer i undgåelse af mus.
- Forbered fluoroskopi miljø.
- Brug et ekstra (tom) observation kammer og PEG-skål (eller sipper rør tud) at bestemme den optimale højde og position i fluoroscope stråle, der tillader visualisering af drikkevand i den laterale (vandret) plan.
- Indstil fluoroskopi billedhastighed til 30 billeder pr sekund; højere (men ikke lavere) frame rates kan anvendes, hvis tilgængeligt.
- Ensure at en røntgenfaste kalibrering markør hensigtsmæssigt placeres på fluoroskop kamera / sensor, så den er synlig på skærmen skærmen under hele testen. Dette trin er nødvendigt for at muliggøre kalibrering af længde målinger anvendes til at kvantificere sluge parametre.
Figur 8:. Silikone stik ved brug PEG-Bowls Venstre: silikone stik. Højre: En silicone plug trækkes gennem Sipper rør åbning i toppen af observation kammeret. Dette stik forhindrer mus i at blive distraheret af tudåbningen når du bruger en pind-skål i stedet sipper røret under VFSS test. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
7. VFSS Test af mus
- Løft kammer ud af buret og forsigtigt vedhæfte 2. endekappe (med PEG-skål vedhæftet, hvis en sipper rør ikke vil blive brugt), og pas på ikke at klemme musen (især halen).
BEMÆRK: Denne fremgangsmåde minimerer musens stress respons på grund af håndtering, hvilket er særligt vigtigt for mus, der testes for første gang. - Ved gentagen testning, kan musene let lokket ind i kammeret, når det er placeret foran dem inde i buret eller når det suspenderes i halen over åbningen kammeret.
- Hvis du bruger en pind-skålLeverer opløsningen via forsyningssprøjte systemet beskrevet i trin 3 ovenfor. Dette system muliggør hurtig og nem genopfyldning af PEG-skål efter behov.
- Hvis der anvendes en Sipper rør flaske, indsætte Sipper rør gennem den ovale åbning i toppen af observation kammeret. Vip flasken, således at tuden er rettet mod midten af kammeret.
- Justér observation kammer (ved hjælp af fjernstyrede scissor lift tabel beskrevet i trin 4), således at synke mekanisme er synlig i synsfeltet.
- Pause optagelsen hver gang musen vender sig bort fra den pind-skål eller tud at minimere varigheden af stråling.
- Genoptage optagelsen, når musen tilbage til tuden eller PEG-skål.
- Fyld PEG-skål efter behov.
- Stop teste om musen ikke drikker inden for 5 min. Målet er at optage flere long (> 5 sek) anfald af kontinuerlig drikke, som er typisk for de fleste mus inden for den første 2 min ved test.
- Retur noncompliant mus til hjemmet bur (uden vand) til re-test på et senere tidspunkt samme dag; ikke overstiger en 24 hr vand regulering periode. Mus, der forbliver noncompliant tre forsøg fjernet fra undersøgelsen.
- Rengør PEG-skål (og spidsen af PE rør) eller sipper rør tud med en tør papirserviet mellem mus.
- Rengør observation kammer efter behov mellem mus for at fjerne enhver sprøjtede iohexol på kammervæggene. Skyl kammeret med vand fra hanen og tør med køkkenrulle.
- Brug en ny peg-skål (eller ændre sipper rør tud). Ellers kan musene blive distraheret af lugten af andre mus, der drak af den samme pløk-skål eller sipper rør. PEG-skåle og sipper rør skal mærkes for at undgå forvirring.
8. Video Analyse
- Brug en video redigeringssoftware program, der tillader frame-by-frame analyse af videofluoroscopy optagelser at kvantificere svalen parametre af interesse (tabel 2). Identificer mindst to uddannede korrekturlæsere til at analysere hver video i en blindet måde: En primær korrekturlæser og en eller to sekundære anmeldere.
- Primær korrekturlæser: Se hver video at identificere og analysere 3-5 lange (ca. 5 sek) drikke anfald. Dette kriterium er baseret på offentliggjorte ikke-radiografiske sluge studier med mus 13,14 og VFSS med rotter 12 viser, at 3-5 foranstaltninger pr svale parameter er tilstrækkelige til statistiske analyser.
- Sekundære korrekturlæsere: Selvstændigt analysere de 3-5 foranstaltninger pr svale parameter for hver mus, der oprindeligt identificeret og analyseret af den primære korrekturlæser.
- Identificer anmelder uoverensstemmelser for hver mus. Re-analysere alle uoverensstemmelser som korrekturlæser gruppe at nå 100% konsensus.
- Gennemsnittet af 3-5 konsensus (dvs. ubestridte) værdier for hver sluge parameter for at opnå middelværdien for hver mus til brug i statistiske analyser. Hvis færre end 3 measures opnås for en enkelt svale parameter for en given mus, skal du indtaste en manglende værdi (dvs. ikke nul) i det statistiske database for den tilsvarende svale parameter.
| Swallow PARAMETRE | BESKRIVELSE |
| Inter-Swallow Interval (ISI) | Antallet af video frames mellem to på hinanden, uafbrudt svaler. Starten ramme til beregning ISI er "resten ramme", der går umiddelbart forud for synligt overførsel af bolus fra vallecula til spiserøret. Enden rammen er "resten frame" af den næste svale. Antallet af rammer mellem de to successive svaler divideres derefter med 30 frames per sekund (fps) for at konvertere til tid (sek). |
| Jaw Udflugt Rate (Lick Rate Equivalent) | Tungen er ikke klartsynlig under VFSS at tillade kvantificering af lick rate; dog kæbe udflugt sats er let kvantificerbare. Under slikning skal kæben åbnes for at tillade tungen at rage fra munden. Derfor er antallet af kæbe åben / luk (udflugt) cyklusser per sekund (30 billeder), mens drikker svarer til at slikke sats. Hver kæbe udflugt cyklus begynder med kæben maksimalt åbnet (som falder sammen med tungen fremspring) og slutter, når kæben vender tilbage til maksimalt åben stilling. Efterfølgende cykler af kæben lukning og genåbning tælles som individuel kæbe udflugt episoder. |
| Jaw Excursion Afstand | Afstanden kæben åbnes under kæben udflugt cykler, måle i mm mellem maxillary og mandibulære fortænder. |
| Lick-Swallow Ratio | Antallet af kæben udflugt cykler, der opstår under hver ISI (dvs. mellem to på hinanden, uafbrudt svaler). |
| Swallow Rate | Antallet af svalerne, der opstår under hver 2 sek episode af uafbrudt drikke på tuden. |
| Faryngeal Transit Time (PTT) | Den tid det tager bolusen til at blive slugt gennem svælget. Starten rammen er identisk med ISI startramme (dvs. "resten ramme", der går umiddelbart forud for synligt overførsel af bolus fra vallecula). Enden ramme er, når halen af bolus har fuldstændig bestået 2. halshvirvel (C2), som er den mest indlysende anatomiske milepæl i halshvirvelsøjlen af musen. Antallet af rammer mellem start og slut rammer divideres derefter med 30 fps og konverteret til millisekunder (ms). |
| Bolus Hastighed gennem svælg | Pharyngeal bolus hastighed måles i forhold til PTT (beskrevet ovenfor). Brug ImageJ software, er afstanden (mm) fra vallecula til C2 ryghvirvel måles, skaleret ved hjælp af en kalibrering markør. Denne distance (mm) divideres derefter med PTT (ms) for at bestemme bolus hastighed (mm / ms). |
| Esophageal Transit Time (ETT) | Den ETT startramme er identisk med PTT ende ramme (beskrevet ovenfor). Den ETT ende ramme er, når bolusen er helt ind i maven, som er defineret som forsvinden af bolusen fra spiserøret. Antallet af frames mellem ETT start og slut rammer divideres derefter med 30 fps og omdannes til msek. |
| Bolus Hastighed gennem spiserøret | Esophageal bolus hastighed måles i forhold til ETT (beskrevet ovenfor). Brug ImageJ software, afstanden (mm) målt er fra C2 ryghvirvel til gastroesophageal junction, skaleret ved hjælp af kalibrering markør. Denne afstand (mm) divideres derefter med ETT (ms) for at bestemme bolus hastighed (mm / ms). |
| Bolus Hastighed gennem svælg og spiserør | Denne parameter anvendes, når C2 er ikke en let synlig anatomisk vartegn; Derforer det ikke muligt at skelne mellem svælg og esophageal stadier af synke. I sådanne tilfælde er bolus hastighed gennem svælget og strubehovedet kombineres i en enkelt svale parameter. Starten rammen er identisk med PTT startramme (dvs. "resten ramme", der går umiddelbart forud for synligt overførsel af bolus fra vallecula). Enden rammen er identisk med ETT ende ramme (dvs. når bolusen er helt ind i maven). Antallet af rammer mellem disse to begivenheder er divideret med 30 fps og omdannes til msek. |
| Bolus Area | Brug ImageJ software, er bolus område målt ved vallecular "hvile frame" før initiering af svælg svale, skaleret ved hjælp af en kalibrering markør. |
| Faryngeal Rest Area | Pharyngeal rest område måles ved anvendelse ImageJ software, skaleret ved hjælp af en kalibrering markør. |
| Væskevolumen consuMed | Mængden af væske forbruges fra en sipper rør flaske er vanskeligt at vurdere på grund af lækage fra tuden. Dog kan mængden af væske, der forbruges fra en pind-skål være mere præcist beregnes som følger: 1) bestemme densitet (dvs. forholdet mellem vægt til volumen) af det kalibrerede volumen af væske, der blev indgivet i den pind-skål, 2 ) bestemme vægten af PEG-skål med restvæsken, 3) træder disse værdier i et vægt til volumen-konverter (fx http://www.thecalculatorsite.com/conversions/weighttovolume.php . |
Tabel 2: Swallow Parametre kvantificerbare Under Murine VFSS.
Representative Results
Vi har med succes udviklet en ny og replicerbar murine-specifikke VFSS protokol, der omfatter testkamre, der tillader selv-fodring, opskrifter til smagsstoffer orale kontrastmidler, og en trin-for-trin forsøgsprotokollen, der tillader kvantificering af svale fysiologi. Den energi niveau evne til fluoroskopi system, der fastsættes som sluge parametre kunne undersøges i mus. Vi oprindeligt brugt høje energipriser fluoroscopes designet til brug med mennesker og større dyr (fx GE Advantx, GE OEC 9600, og Omega Cardiac Cath CS-25, hver med 30 billeder per sekund). Men disse systemer havde tilstrækkelige forstørrelse kapaciteter for afprøvning mus, hvilket resulterede i fyldet dyr kun en lille del af synsfeltet (Figur 9). Som et resultat, billedkvalitet var usædvanlig dårlig, hvilket gør det umuligt at visualisere de fleste strukturer i synke mekanisme. På trods af denne begrænsning, vi identificeret 7 mål VFSS sluge parametre, som konsekvent kvantificerbar for mus ved anvendelse af en konventionel (dvs. højenergi) fluoroscope i kombination med den nye murine VFSS protokol (tabel 3). Desuden har vi identificeret vallecular rummet som den anatomiske udløsningspunkt for at synke i raske voksne mus (3-17 måneder), samt mus med betingelser for fremskreden alder (> 18 måneder), og end-stage ALS.
Figur 9:. High Energy fluoroskopi Systems Venstre: Repræsentant billede af en mus opnået under anvendelse af høj energi (dvs. konventionelle) fluoroskopi systemer. Bemærk, at musen udfylder kun en lille del af fluoroskopi synsfelt, hvilket viser den utilstrækkelige forstørrelse kapacitet af konventionelle fluoroscopes til billeddannelse gnavere. Til højre: Samme billede forstørret efter captubruger en video redigeringssoftware program. Sort pil: sluge tærskelprocent (vallecula). Hvid pil:. Bolus i den distale esophagus, umiddelbart før passerer gennem GE krydset (hvid stjerne) Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Swallow PARAMETRE | High Energy System | Low Energy System |
| Inter-Swallow Interval (ISI) | X | X |
| Jaw Udflugt Rate (Lick Rate Equivalent) | X | X |
| Jaw Excursion Afstand | X | X |
| Lick-Swallow Ratio | X | X |
| Swallow Rate | X | X |
| PharyngEAL Transit Time (PTT) | X | |
| Bolus Hastighed gennem svælg | X | |
| Esophageal Transit Time (ETT) | X | |
| Bolus Hastighed gennem spiserøret | X | |
| Bolus Hastighed gennem svælg og spiserør | X | X |
| Bolus Area | X | |
| Faryngeal Rest Area | X | |
| Væskevolumen Forbrugt | X | X |
Tabel 3: Swallow Parametre kvantificerbare Brug High Versus Low Energy fluoroskopi Systems.
Vi har for nylig fået en lavenergi forstørrelse fluoroskopi system kaldet LabScope (Glenbrook Technologies, Randolph, NJ), som er specielt designet til vores laboratorium til brug medmus og andre små gnavere (Figur 10). Imidlertid markant større forstørrelser af dette system gjorde det umuligt at se hele synke mekanisme af en mus i en enkelt synsfelt. I stedet er to test positioner påkrævet, som vist i figur 11. Position 1 tillader visualisering af hele hovedet og proksimale thorax region. Denne holdning er nødvendig for bedømmelsen af de mundtlige og svælg stadier af synke. Position 2 tillader visualisering fra svalen tærskelprocent (dvs. vallecula) til gastroøsofageal (GE) krydset. Denne holdning er nødvendig for bedømmelsen esophageal fase af synke. Forarbejde bruge The LabScope i kombination med den nye murine VFSS protokol har identificeret 13 objektive sluge parametre, der er konsekvent kvantificerbar i mus, hvilket er næsten dobbelt så mange opnået ved hjælp af høj energi (dvs. konventionelle) fluoroscopes (tabel 3). Denne o utcome tilskrives de avancerede forstørrelse kapaciteter af LabScope, som giver mulighed for visualisering af talrige anatomiske strukturer (figur 12), der i det væsentlige var usynlig, når anvendelse af konventionelle systemer: f.eks hyoidbenet, luftrør og halshvirvlerne. Som et resultat, vi var også i stand til at analysere de videoer for tegn på larynx penetration og aspiration. Hverken penetration eller aspiration blev observeret for enhver mus i denne undersøgelse, uanset sundhed eller sygdomstilstande.
Figur 10:. Den LabScope venstre: LabScope udfører som en desktop fluoroscope til små dyr. Til højre: Nærbillede af The LabScope med mærkede komponenter. The scissor lift tabel positionering en observation kammer inden i fluoroscope synsfelt. tp_upload / 52319 / 52319fig10highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 11:. Lavenergi Fluoroskopi System billeder af en mus opnået under anvendelse af en lavenergi fluoroskopi-systemet. Bemærk, at høj forstørrelse evne forhindrer visualisering af hele sluge mekanisme i fluoroskopi synsfelt. Venstre: Position 1 - tillader visualisering af hele hovedet og proksimale thorax region. Den svale trigger punkt (sort pil) i det væsentlige centreret inden for synsfeltet. Til højre: Position 2 - tillader visualisering fra svalen tærskelprocent (sort pil) til GE krydset (hvid stjerne). Bemærk bolus passerer gennem den distale esophagus (hvid pil). g11highres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 12:. Anatomiske strukturer Synlig hjælp af en lav energi Fluoroskopi System Selv ved den laveste forstørrelse indstilling (til venstre), boney strukturer i hoved og hals af en mus er let synlige ved hjælp af vores lavenergi fluoroskopi-system (dvs. LabScope). Anatomiske strukturer inden for det sorte firkant er vist (og mærket) ved højere forstørrelse til højre. Forbedret visualisering af boney strukturer tillader kvantificering af adskillige yderligere sluge parametre, der var umuligt at analysere ved hjælp af høj energi fluoroscopes. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 13:. Foreløbige resultater Figuren viser repræsentative foreløbige resultater for to VFSS sluge parametre kvantificeres ved hjælp af det murine VFSS protokol: sluge rate (venstre) og inter-sluge interval (til højre). Swallow var signifikant langsommere for SOD1 mus sammenlignet med alderen C57 mus og kontroller. Der blev ikke konstateret væsentlige forskelle gruppe for inter-sluge interval. Linjer i toppen af søjlerne angiver statistisk signifikante forskelle (p <0,05) mellem grupper, der er konstateret ved hjælp af Bonferroni parvise sammenligninger. Error søjler repræsenterer ± 1 SEM. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Discussion
Hundreder af murine (mus og rotter) modeller er kommercielt tilgængelige til at studere humane sygdomme. Imidlertid har kun tre murine sygdomsmodeller blevet specifikt undersøgt i forhold til dysfagi: en musemodel af ALS 13,14 og rotte modeller af Parkinsons sygdom 12,15-17 og slagtilfælde 18. Hver af disse forundersøgelser udnyttet forskellige metoder til at vurdere dysfagi, hvilket gør det umuligt at udlede meningsfulde sammenligninger mellem arter og sygdomme. Denne store begrænsning kan overvindes i fremtidige undersøgelser ved at udnytte den nyudviklede murine VFSS protokol, der tillader objektiv kvantificering af talrige sluge parametre i selvstændige fodring af dyr.
Succesfulde VFSS resultater er afhængige af tre kritiske komponenter: 1) testkamre, der tillader selv-fodring mens stående uhæmmet i et lukket rum, 2) opskrifter, der maskerer den afskrækningsmiddel smag / lugt af kommercielt tilgængelige orale kontrast agenser, og 3) en trin-for-trin forsøgsprotokollen, der tillader kvantificering af sluge fysiologi. Den kombinerede virkning giver en behagelig, lav stress, selv-fodring eksamen miljø, der fremkalder typiske fodring og synke adfærd. Fjernelse af et eller flere af disse elementer vil have en skadelig virkning på undersøgelsens resultater. Eksempler på negative resultater omfatter manglende evne til at opretholde dyr i fluoroskopi synsfelt uønsket adfærd, der distraherer fra at drikke, aversion mod den mundtlige kontrastmiddel, og manglende evne til at kvantificere sluge parametre på grund af utilstrækkelige drikke episoder.
En stor udfordring i at opnå optimale VFSS resultater var at designe en egnet test kammer. Talrige revisioner af vores prototype design kulminerede i en observation kammer, der i tilstrækkelig grad fastholder mus i synsfeltet og forhindrer adfærd, der distraherer fra at drikke. Kamrene blev fremstillet under anvendelse fræsemaskiner at opnå ensartede dimensioner the rør og endekapper og dermed sikre ombyttelighed af komponenter til flere observation kamre i samme diameter. De indre dimensioner (diameter og længde) blev matchet til at være lidt større end en voksen mus kropsstørrelse, hvilket resulterede i en smal testkammer der i tilstrækkelig grad tillader gå i en lige linje og dreje rundt. Den smalle design i kombination med strategisk positionering af tuden og PEG-skål på kun enden opretholder hoved og krop af mus linie langs længden af kammeret, når man drikker. Når engageret i drikke, mus forbliver bemærkelsesværdigt selv stabiliseret ved tuden eller skål i flere sekunder ad gangen, hvilket resulterer i minimal bevægelse artefakt at interferere med test. Det er således muligt at opnå uforvrænget, close-up observation / videooptagelse og videofluoroscopic billeddannelse af mus, når man drikker i de laterale og dorsale-ventral fly.
Mus (og andre små gnavere) er naturligt tilbøjelige til at sek ly i små rum. Som et resultat, de frit ind i testkammeret (med den ene ende allerede lukket ved en ende-cap), når den er anbragt i bur, for derved at eliminere stress / angst som følge af håndtering (dvs. manuelt optagning dyret at placere det i kammeret). Når musen kommer ind i kammeret, er den anden ende lukket ved at fastgøre en 2. endekappe. Dette design forhindrer flugt og samtidig skabe en lav angst test kammer for mus til frit at udforske.
Den firkantede form af kammeret har indbygget motion stabilitet, tillader, at den anvendes i en fritstående mode, hvilket eliminerer behovet for test inden for en standard gnaver bur. Hele apparatet er letvægts, bærbar, stabelbar til opbevaring, robuste, lette at rengøre, og kan autoklaveres. Mens kamrene oprindeligt blev designet til brug med fluoroskopi, de også er kompatible med spot-film radiografi, neuroimaging (f.eks MRI, PET, CT), og udstyr og forretningssel observation / videooptagelse af forskellige adfærd.
En anden stor udfordring at overvinde var at skjule afskrækningsmiddel smag / lugt af orale kontrastmidler (dvs. barium sulfat og iohexol). Da smag følsomhed varierer meget fra musestammer 19-21 og måske med alderen 22,23, var det nødvendigt at identificere en enkelt test løsning, der var spiselig for alle mus, uanset belastning og alder. Dette resultat er vigtigt for at skabe direkte sammenligninger af svale funktion / dysfunktion tværs stammer og aldre, og samtidig fjerne forstyrrende resultater på grund af forskelle i rheologisk (f.eks viskositet, densitet, etc.) og kemiske egenskaber af de test-løsninger. Til dette formål har vi udviklet en enkel, hurtig velsmag screening tilgang til at identificere den foretrukne smagsforstærker at maskere aversiv smag / duft af orale kontrastmidler i murine VFSS. Metoder blev modelleret efter kortvarig test, som kræver en lickometer (dvs. slikke sensor) for at optage lick satser i de første 2 minutter efter en vandregulering periode (dvs. tilbageholde vand natten over) for at inducere tørst 24,25. En lickometer var ikke tilgængelig for denne undersøgelse; Derfor blev præference vurderet af adfærdsmæssige observationer, såvel som standard videooptagelse metoder til slikke sats, der tidligere er blevet valideret i vores laboratorium 13,14. Brug af denne velsmag screening fremgangsmåde blev chokolade identificeret som den foretrukne smagsforstærker af C57 og C57 / SJL stammer. Specifikt 100% af musene i hvert bur let drak chokoladesmag løsninger inden for 30 sek eksponering med flere mus samtidigt drikke på tuden. Men tilsætning af barium resulterede i kun korte drukture af de fleste mus, uanset barium eller chokolade koncentration.
Et alternativ til barium er iohexol, en jod-baseret kontraststof, der først for nylig er blevet anerkendt som en suitabel alternativ til bariumsulfat for human VFSS 10; Således er det endnu ikke blevet standardiseret til dette formål. Flere forskellige koncentrationer af chokoladesmag iohexol blev tilbudt til mus. Opskrifter indeholdende op til en 50% opløsning af lager iohexol (350 mg iod pr ml) blev let drak af de fleste mus efter en nats vandregulering periode. Højere koncentrationer resulterede i undgåelse adfærd. En 50% iohexol (350 mg jod pr ml) opløsning fremstillet tilstrækkelig radiodensiteten samtidig være slugt af mus, mens lavere koncentrationer var markant mindre synlige og hindret kvantificering af svale fysiologi. Derfor blev den optimale testopløsning for VFSS med mus identificeret som en 50% iohexol opløsning med chokoladesmag tilsættes. Gentag velsmag test resulterede ikke i undgåelse adfærd eller bivirkninger.
En tredje udfordring at overvinde forhindrede mus i at dreje / vippe deres hoved, mens drikke, som tilslører visualiseringaf synke mekanisme under VFSS. Drikke fra en PEG-skål placeret lige over gulvet i den ene ende af kammeret løst dette problem. Der er adskillige yderligere fordele ved anvendelse af en PEG-skål i stedet for en Sipper rør flaske. For eksempel kan et kalibreret volumen af væske pipetteres i PEG-skålen gennem et ventilationshul i endekappe af tubus. Denne fremgangsmåde tillader kvantificering af minutvolumen testopløsning forbruges i den korte VFSS testens varighed. Desuden øgede overfladeareal af prøveopløsning i PEG-skål, i forhold til en lille Sipper rør åbning, kan give en øget olfaktoriske stimulation yderligere motivere drikke. PEG-skåle kan være bedre egnet til at studere unge eller mindre stamme mus, som skålen højde er en standardiseret afstand fra gulvet. I modsætning hertil skal sipper rørlængder justeres for at imødekomme forskellige størrelse mus, som tilføjer en anden potentielt confounding variable til at overveje. Også musetilstandls af neurologiske sygdomme kan have svært ved at nå en sipper rør flaske pga motorisk svækkelse af arme og ben, mens de let kan nå en pind skål. Mus med tunge og / eller kæben dysfunktion kan være ude af stand til i tilstrækkelig grad at trykke bolden i tuden at få adgang til væske; hjælp PEG-skåle kan eliminere dette forvirre. Af disse grunde er anvendelsen af PEG-skåle i Sipper rør flasker er den foretrukne metode til murine VFSS test. Imidlertid blev observationskamre designet til at rumme tuden drikke efter behov. En vigtig advarsel til at overveje, er, at slikke satser er kendt for at variere mellem tud og skål drikke 13,26. Derfor skal valget af enten tud eller PEG-skål til VFSS være konsistente inden for og mellem forsøgene.
En fjerde udfordring var at identificere målbare sluge parametre for mus, der er sammenlignelige med de VFSS parametre, der almindeligvis anvendes i humane undersøgelser og klinisk praksis. Vores foreløbige resultater vistetype fluoroskopi systemet afgør hvilke sluge parametre kan undersøges i mus. De fleste forskningscentre og medicinske indstillinger har høj energi (75-95 kV, 1-5 mA) fluoroscopes designet til brug med mennesker og større dyr, der resulterer i usædvanlig dårlig billedkvalitet, når der testes mus og andre smådyr. Som et eksempel, en nylig undersøgelse ved hjælp af en høj energi fluoroscope med rotter var i stand til at identificere kun 4 kvantificerbare sluge parametre 12, og vi var i stand til at identificere kun 7 sluge parametre for mus i nærværende undersøgelse. For at overvinde denne store begrænsning, vi for nylig fået en lavenergi fluoroskopi system kaldet LabScope (Glenbrook Technologies). Systemet er en miniature fluoroscope der genererer en kontinuerlig kegle-stråle af røntgenstråler med fotonenergier mellem 15 og 40 kV og en top rør strøm på 0,2 mA (8 W maksimal effekt). De lavere energiniveauer af dette system er bedre dæmpet af den tynde knogler og blødt væv i mus og således higher kontrast opløsning end konventionelle (dvs. høj energi) fluoroscopes. X-ray stråle af The LabScope er rettet på en 5 cm billede diameter forstærker, hvilket er markant mindre end 15-57 cm billede diameter forstærker konventionelle fluoroscopes. Den mindste source-til-forstærker afstand (SID) i LabScope er ~ 6 cm (i modsætning til ~ 30 cm for traditionelle fluoroscopes), som giver øget forstørrelse kapaciteter. Hertil kommer, at LabScope bruger patenteret teknologi, der digitalt forstørrer billedet op til 40 gange i realtid, uden at ændre SID. Resultatet er i det væsentlige et røntgenbillede mikroskop, der kan zoome ind og ud i realtid at se små områder af interesse, såsom synke mekanisme på en mus.
En stor fordel ved denne lav-energi fluoroskopi systemet forbedres stråling sikkerhed. Ud over dyr, der modtager lavere doser stråling med The LabScope forskerne anvender systemet udsættes for markant less stråling scatter. Eksponeringen direkte foran aggregatet på kontrolpanelet stråling er 10,3 mR / time. På afstand 1 m foran enheden, eksponering falder til 580 μR / time. De fleste andre steder i rummet har meget lav eksponering under 10 μR / time. Trods denne forbedring har vi taget ekstra foranstaltninger til forbedring strålingssikkerhed. For eksempel har blyholdig akryl afskærmning blevet tilføjet omkring The LabScope at blokere spredte X-ray fotoner, som gør det muligt for forskerne at udføre murine VFSS test uden at bære personlige afskærmning (f.eks bly forklæder, thyreoidea skjolde, og briller). Derudover klar akryl tillader visualisering af musen fra en afstand. Yderligere stråling sikkerhed leveres af en motoriseret scissor lift bord, som fjernstyres af investigator. Fra en afstand på op til 3 m fra fluoroscope kan forskerne bruge fjernstyret anordning til at justere den lodrette og vandrette position observationskammeret i røntgen beam. Som et resultat heraf kan de anatomiske områder af interesse opretholdes inden for fluoroskopi synsfelt mens musen bevæger sig frit inden for observation kammeret. Selvom sakselift er designet til brug med The LabScope det også er kompatibel til brug med konventionelle fluoroscopes at forbedre strålingssikkerhed for forskere. Et sidste trin for at forbedre stråling sikkerheden under murine VFSS indebærer anvendelse af en forsyningssprøjte for væsker. Dette system omfatter en 3-4 fod (eller længere, hvis det er nødvendigt) længde PE slange, som muliggør hurtig og effektiv levering af væsker i PEG-skål fra en afstand. Denne sprøjte leveringssystem til væsker, i kombination med den observation kamre, også kan anvendes med konventionelle fluoroscopes.
Forarbejde bruge The LabScope, i kombination med den nye murine VFSS protokol, viser en stor fordel på over konventionelle systemer: det antal sluge parametre, der kan foretages en pålidelig beløbsmæssig is næsten fordoblet. Men blødt væv strukturer i synke mekanisme (fx tunge, velum, posterior svælg væg, og strubelåget) af mus er ikke umiddelbart synlige, når du bruger lav eller høj energi fluoroskopi systemer. Derfor har vi fokuseret på at kvantificere bolus flow foranstaltninger snarere end de biomekanik synke. Vi var overvejende interesserede i parametre, der kan kvantificeres ud fra tidsenheder, område, distance, volumen osv, frem for at bruge Likert-type målestok. Talrige bolus strømningsparametre møde dette krav er blevet beskrevet i den menneskelige VFSS litteratur, såsom oral transittid 27-29, svælg transittid 27-33, og esophageal transittid 34-36, for blot at nævne et par stykker. Bolus transport gennem mundhulen ikke var umiddelbart synlige i mus, sandsynligvis på grund af den lille bolus størrelse under spontan drikke. Men kunne vi pålideligt kvantificere svælg og esophageal transittider, samtsom flere andre foranstaltninger vedrørende bolus flow og clearance. Identifikation af yderligere translationel sluge parametre forventes som vi optimerer mulighederne i LabScope.
Resultaterne af denne undersøgelse viste, at mus tage flere rytmiske licks pr svale under spontan drikke, med hver lille flydende bolus sekventielt fylder vallecular plads, før udløse svælg svale. Denne adfærd, der er typisk for pattedyr, der anvender slikke som det primære middel til at indtage væske 37-40, ligner den rytmiske suge sluge mønster af human spædbarn synke og alle spædbarn pattedyr i almindelighed. Spædbarn synke fysiologi er præget af flere rytmiske sucks efterfulgt af en refleksiv svælg svale, almindeligvis beskrevet som suge sluge cyklus 37,41-43. Således kan de rytmiske tungen og kæben bevægelser, der er involveret i ingestive slikke adfærd af mus være mere sammenlignelig med ingestive sugende adfærd af humen spædbørn stedet cup drikke af børn og voksne. Vi har derfor været at kvantificere den slikke sats og slikke sluge forhold på mus for fremtidige sammenligninger med suge sats og sutte-sluge forholdet menneskelige spædbørn. Måske murine VFSS forskning vil give indsigt i udviklingsforstyrrelser synkebesvær.
Som med enhver ny forskningsmetode, har forbedringsområder blevet identificeret. For eksempel blev det murine VFSS protokol udviklet ved hjælp af kun C57 og C57 / SJL musestammer; det er endnu ikke blevet testet med rotter. Observationen kamre skal skaleres op i størrelse (diameter og længde) til at rumme den større kropsstørrelse hos rotter. Det er også uvist, om chokoladesmag iohexol er velegnet som en universel murine VFSS testopløsning. Derfor er større skala test med flere stammer af mus og rotter berettiget til dette formål. Desuden bør anvendelsen af barium som et kontrastmiddel til murine VFSS ikke udelukkes. Mus klart foretrak iohexol opskrifter end barium; dog strengere og systematiske forsøg på at skjule afskrækningsmiddel smag / lugt af barium kan tilvejebringe velsmagende alternativer til iohexol. Fremtidige studier, der sammenligner effekten af iohexol og barium sulfat (samt andre potentielle orale kontrastmidler) på præference smag og sluge fysiologi hos mus og rotter uden tvivl vil give vigtige oplysninger, som er direkte relevante og translationel for menneskers VFSS.
VFSS med mennesker omfatter flere konsistenser af fødevarer og flydende, og dysfagi er tydeligst, når synke tynde væsker og tørre, fast føde 44,45. Den murine VFSS protokollen er derfor udvides til at omfatte yderligere konsistenser, der kan lette detektion og kvantificering af dysfagi i sygdomsmodeller. Det vil også være nødvendigt at foretage viskositet test af de flydende opskrifter på murine VFSS for at justere viskositeter til at matche dem, der anvendes under human VFSS. At tage disse grænsetioner vil lette identifikationen af translationelle VFSS biomarkører for dysfagi, der direkte kan sammenlignes mellem mus, rotter og mennesker.
Anvendeligheden af murine VFSS kan forbedres betydeligt ved at implantere røntgenfaste markører i bløde vævsstrukturer af synke mekanisme, som ellers ikke er synlige, hvilket tillader undersøgelser af biomekanik synke. Denne fremgangsmåde er med held blevet anvendt i mange år til at studere biomekanik sluge i spædbarn grise, ved hjælp af en sortiment af metalclips og ledninger 37,42. Vi forventer, at brugen af lignende, men mindre, markører i mus vil tillade kvantificering af flere ekstra sluge parametre for sammenligning med større pattedyr, herunder mennesker. Vi er ved at udvikle metoder til at implantere røntgenfaste markører ind i tungen, bløde gane, svælg, strube, og proksimal spiserør af mus til at teste denne hypotese.
Videoen recording frame rate af The LabScope og konventionelle fluoroscopes er begrænset til 30 billeder pr sekund (fps). Vores foreløbige resultater viste imidlertid, at hele pharyngeal fase af indtagelse for sunde mus forekommer i mindre end 66 msek (dvs. 2 rammer), som er cirka 10 gange hurtigere end mennesker. Således svælg fase synke i mus optræder så hurtigt, at oplysningerne ikke er mærkbar med en 30 fps kamera. En højere rammehastighed (sandsynligvis> 100 fps) vil være nødvendigt til tilstrækkelig visualisere og kvantificere de ekstremt hurtige og komplekse bevægelser svælg fase af indtagelse hos mus og andre gnavere. I forbindelse med en højere rammehastighed, ville inkorporering biplanare teknologi til 3D fluoroskopisk billeddannelse bestemt udvide nytten murine VFSS. Derfor bør fremtidige design overvejelser omfatte en højere frame rate kamera og biplanare billeddannelse kapaciteter.
Endelig har lavdosisstråling vist sig at forårsage sterilitet ikvindelige C57 mus, resulterer i ændrede niveauer af æggestokkene-stimulerede hormoner, der kan forvirre levetid undersøgelser 46. Resultater vedrørende specifikt til virkningerne af gentagen udsættelse for stråling i lav dosis er forbundet med VFSS test er endnu ikke blevet undersøgt i mus og andre dyr eller mennesker. Imidlertid har dysfunktion i æggestokkene (ikke relateret til stråling) i humane hunner været knyttet til gastrointestinal motilitet lidelser, og specifikt til dysfagi i nogle tilfælde 47, som giver endnu en advarsel til at overveje, når designe fremtidige VFSS undersøgelser, der omfatter kvinder (dyr og mennesker ). Udelukkelse af kvinder bør undgås, da der er rapporteret betydelige kønsforskelle i svale funktion for folk 48,49 og ville være vigtigt at opdage og karakterisere i animalske sygdomsmodeller samt. Derfor resultater fra langsgående VFSS undersøgelser på mus og rotter af begge køn har enorm translationel potentiale for mennesker i forhold til dysphagia, samt risikoen for lavdosis-stråling er forbundet med gentagen VFSS test.
Disclosures
Open Access for denne artikel er sponsoreret af Glenbrook.
Acknowledgments
Vi allernådigst takker yderligere medlemmer af Lever Lab, der har bidraget til dataindsamling (Andries Ferreira, Danarae Aleman, Alexis Mok, Kaitlin Flynn, Elizabeth Bearce, og Matan Kadosh) og manuskript revision (Andries Ferreira, Rebecca Schneider, og Kate Robbins). Vi anerkender også Roderic Schlotzhauer og Edwin Hønse fra MU Fysik Machine Shop for deres design input og fabrikation af gnaver observation rør, der anvendes i denne undersøgelse. Vi er særligt taknemmelige for Malea Jan Kunkel (Radiologi tilsynsførende i Veterinærmedicin og kirurgi afdeling på University of Missouri - College of Veterinary Medicine) og Jan Ivey (manager Research Animal Cath Lab ved University of Missouri - School of Medicine) til demonstration konstant tålmodighed og motivation, mens du betjener de høje energipriser fluoroscopes da vi udviklede den murine VFSS protokollen. Finansiering kilder for denne undersøgelse omfattede NIH / NIDCD (TE Lever), NIH / NINDS (GK Pavlath), Otolaryngologiske - hoved- og halskirurgi nystartede fonde (TE Lever), MU PRIME Fund (TE Lever), Mizzou Advantage (TE Lever), og MU Center på Aging (TE Lever).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycarbonate tubing for observation chambers | McMaster-Carr | 3161T41 | Body of observation tubes, 2"X2" diameter, 0.080" thick wall |
| Polycarbonate sheet for observation chambers | McMaster-Carr | 9115K71 | End-caps for observation tubes, 2"x12"x3/4" |
| Polycarbonate sheet for observation chambers | McMaster-Carr | 8574K281 | Peg-bowls for observation tubes |
| Silicone O-rings for end-caps of observation chambers | McMaster-Carr | 9396K108 | S1138 AS568-029, pack of 25 http://www.mcmaster.com/#o-rings/=t0wt5r |
| Silicone stoppers for observation chambers | McMaster-Carr | 2903K22 | Package of 10 stoppers to plug the oval opening in the top of the observation chamber when using a peg-bowl http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3803/=t0y5at |
| Centrifuge tubes for sipper tube bottles | Evergreen Scientific | 222-3530-G80 | 30 ml freestanding centrifuge tubes, with caps, sterile https://www.evergreensci.com/labware-catalog/tubes-and-vials/30-and-50-ml-centrifuge-tubes/ |
| Silcone stoppers for sipper tube bottles | Saint-Gobain Performance Plastics | DX263031-10 | Number 31D, size: 26 mm bottom, 32 mm top, 30 mm high; 10 pack; http://www.labpure.com/en/Products.asp?ID=179&PageBrand=STOPPERS |
| Stopper borers for sipper tube bottles | Thomas Scientific | 3276G40 | Cork Borer Set that ranges from 3/16-15/16 inch http://www.thomassci.com/Supplies/Corks/_/CORK-BORER-SET-316-1516-IN?q=Humboldt |
| Drinking tubes for sipper tube bottles | Ancare | TD-100 | 2 1/2” long drinking tubes with 5/16” opening, straight ball-spout http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point |
| Iohexol for making oral contrast agent solution | GE Healthcare | 350 mg iodine per ml http://www3.gehealthcare.com/en/products/categories/contrast_media/omnipaque |
|
| Chocolate syrup for flavoring oral contrast agent | Herseys | ||
| 10 ml syringe for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 309604 | Luer lock tip syringe without needle, 100 per box http://www.bd.com/hypodermic/products/syringeswithoutneedles.asp |
| Catheter tubing for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 427451 | Polyethylene Tubing (Non-Sterile) (PE 240) 100' http://www.bd.com/ds/productCenter/427451.asp |
| Needle for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 427560 | 15-gauge needle, fits into PE 240 catheter tubing http://www.bd.com/ds/productCenter/427560.asp |
| Delrin acetal resin rod for syringe delivery system | McMaster-Carr | 8576K15 | 1/2 inch diameter, black http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3609/=t0wvaf |
| Acrylic sheeting for scissor lift | Ponoko | Laser cut http://www.ponoko.com |
|
| 3D printed ABS frame | Engineering Rapid Prototyping Facility, University of Missouri | ||
| Brass rods for scissor lift | Amazon | TTRB-03-12-03 | made into axles http://www.amazon.com/Brass-Seamless-Round-Tubing-Length/dp/B000FN898M |
| Drawer slide for scissor lift | Richelieu | 10292G116 | Attaches to base of scissor lift http://www.lowes.com/pd_380986-93052-T35072G16_0__?productId=50041754 |
| 28BYJ-48 stepper motor for scissor lift | 2 each | ||
| ULN2003 Darlington transistor array for scissor lift | Toshiba | ULN2003APG | Used as stepper drivers (2 each) |
| ATTINY85 microcontroller for scissor lift | Atmel | ATTINY85-20PU | 2 each http://www.taydaelectronics.com/attiny85-attiny85-20pu-8-bit-20mhz-microcontroller-ic.html |
| Nylon spur gear | McMaster-Carr | 57655K34 | 2 each http://www.mcmaster.com/#57655k34/=t0yaqz |
| Nylon spur gear rack | McMaster-Carr | 57655K62 | 2 each http://www.mcmaster.com/#57655k62/=t0ybh9 |
| 4-40 nylon machine screws | McMaster-Carr | 95133A315 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#95133a315/=t0yd8q |
| 4-40 nylon hex nuts | McMaster-Carr | 94812A200 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#94812a200/=t0ye29 |
| Buna-N O-Ring AS568A Dash No. 104 | McMaster-Carr | 9452K318 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#9452k318/=t0yem7 |
References
- Shigemitsu, H., Afshar, K. Aspiration pneumonias: under-diagnosed and under-treated. Curr Opin Pulm Med. 13 (2), 192-198 (2007).
- Gresham, S. L. Clinical assessment and management of swallowing difficulties after stroke. Med J Aust. 153 (7), 397-399 (1990).
- Marik, P. E., Kaplan, D. Aspiration pneumonia and dysphagia in the elderly. Chest. 124 (1), 328-336 (2003).
- Marik, P. E. Pulmonary aspiration syndromes. Curr Opin Pulm Med. 17 (3), 148-154 (2011).
- Logemann, J. A., Larsen, K. Oropharyngeal dysphagia: pathophysiology and diagnosis for the anniversary issue of. Diseases of the Esophagus. Dis Esophagus. 25 (4), 299-304 (2012).
- Logemann, J. A. Swallowing disorders. Best practice & research Clinical gastroenterology. 21 (4), 563-573 (2007).
- Martin-Harris, B., Jones, B. The Videofluorographic Swallowing Study. Physical Medicine and Rehabilitation. Clinics of North America. 19 (4), 769-785 (2008).
- Dietsch, A. M., Solomon, N. P., Steele, C. M., Pelletier, C. A. The effect of barium on perceptions of taste intensity and palatability. Dysphagia. 29 (1), 96-108 (2014).
- Stokely, S. L., Molfenter, S. M., Steele, C. M. Effects of barium concentration on oropharyngeal swallow timing measures. Dysphagia. 29 (1), 78-82 (2014).
- Harris, J. A., et al. The Use of Low-Osmolar Water-Soluble Contrast in Videofluoroscopic Swallowing Exams. Dysphagia. , (2013).
- Hillel, A., Miller, R. Bulbar Amyotrophic Lateral Sclerosis: Patterns of Progression and Clinical Management. Head & Neck. 11, 51-59 (1989).
- Russell, J. A., Ciucci, M. R., Hammer, M. J., Connor, N. P. Videofluorographic assessment of deglutitive behaviors in a rat model of aging and Parkinson disease. Dysphagia. 28 (1), 95-104 (2013).
- Lever, T. E., et al. An animal model of oral dysphagia in amyotrophic lateral sclerosis. Dysphagia. 24 (2), 180-195 (2009).
- Lever, T. E., et al. A mouse model of pharyngeal dysphagia in amyotrophic lateral sclerosis. Dysphagia. 25 (2), 112-126 (2010).
- Ciucci, M. R., et al. Tongue force and timing deficits in a rat model of Parkinson disease. Behavioural Brain Research. 222 (2), 315-320 (2011).
- Ciucci, M. R., Schaser, A. J., Russell, J. A. Exercise-induced rescue of tongue function without striatal dopamine sparing in a rat neurotoxin model of Parkinson disease. Behavioural Brain Research. 252, 239-245 (2013).
- Plowman, E. K., Kleim, J. A. Behavioral and neurophysiological correlates of striatal dopamine depletion: A rodent model of Parkinson’s disease. Journal of Communication Disorders. 44 (5), 549-556 (2011).
- Sugiyama, N., et al. A novel animal model of dysphagia following stroke. Dysphagia. 29 (1), 61-67 (2014).
- Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Li, X., Beauchamp, G. K. Genetics of sweet taste preferences. Pure Appl Chem. 74 (7), 1135-1140 (2002).
- Ishiwatari, Y., Bachmanov, A. A. NaCl taste thresholds in 13 inbred mouse strains. Chem Senses. 37 (6), 497-508 (2012).
- Pinhas, A., et al. Strain differences in sucrose- and fructose-conditioned flavor preferences in mice. Physiol Behav. 105 (2), 451-459 (2012).
- Midkiff, E. E., Bernstein, I. L. The influence of age and experience on salt preference of the rat. Dev Psychobiol. 16 (5), 385-394 (1983).
- Niimi, K., Takahashi, E. Differences in saccharin preference and genetic alterations of the Tas1r3 gene among senescence-accelerated mouse strains and their parental AKR/J strain. Physiol Behav. , (2014).
- Weijnen, J. A. Licking behavior in the rat: measurement and situational control of licking frequency. Neurosci Biobehav Rev. 22 (6), 751-760 (1998).
- Weijnen, J. A. Lick sensors as tools in behavioral and neuroscience research. Physiol Behav. 46 (6), 923-928 (1989).
- Kobayashi, M., et al. Electrophysiological analysis of rhythmic jaw movements in the freely moving mouse. Physiol Behav. 75 (3), 377-385 (2002).
- Dantas, R., et al. Effect of swallowed bolus variables on oral and pharyngeal phases of swallowing. 258, G675-681 (1990).
- Johnsson, F., Shaw, D., Gabb, M., Dent, J., Cook, I. Influence of gravity and body position on normal oropharyngeal swallowing. American Journal of Physiology. 35 (5), G653-G658 (1995).
- Han, T. T., Paik, N. -J., Park, J. W. Quantifying swallowing function after stroke: A functional dysphagia scale based on videofluoroscopic studies. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 82 (5), 677-682 (2001).
- Molfenter, S. M., Steele, C. M. Kinematic and temporal factors associated with penetration-aspiration in swallowing liquids. Dysphagia. 29 (2), 269-276 (2014).
- Kendall, K. A., McKenzie, S., Leonard, R. J., Goncalves, M. I., Walker, A. Timing of events in normal swallowing: A videofluoroscopic study. Dysphagia. 15, 74-83 (2000).
- Choi, K. H., Ryu, J. S., Kim, M. Y., Kang, J. Y., Yoo, S. D. Kinematic analysis of dysphagia: Significant parameters of aspiration related to bolus viscosity. Dysphagia. 26, 392-398 (2011).
- Molfenter, S. M., Steele, C. M. Variation in temporal measures of swallowing: Sex and volume effects. Dysphagia. 28, 226-233 (2013).
- Alves, L. M. T., Secaf, M., Dantas, R. Effect of a bitter bolus on oral, pharyngeal, and esophageal transit of healthy subjects. Arquivos de gastroenterologia. 50 (1), 31-34 (2013).
- Dalmazo, J., Aprile, L. R. O., Dantas, R. O. Esophageal contractions, bolus transit and perception of transit after swallows of liquid and solid boluses in normal subjects. Arquivos de gastroenterologia. 49 (4), 250-254 (2012).
- Kahrilas, P. J., Dodds, W. J., Hogan, W. J. Effect of peristaltic dysfunction on esophageal volume clearance. Gastroenterology. 94 (1), 73-80 (1988).
- German, R. Z., Crompton, A. W., Levitch, L. C., Thexton, A. J. The mechanism of suckling in two species of infant mammal: Miniature pigs and long-tailed macaques. Journal of Experimental Zoology. 261 (3), 322-330 (1992).
- Herring, S. W., Scapino, R. P. Physiology of feeding in miniature pigs. Journal of Morphology. 141 (4), 427-460 (1973).
- Gordon, K. R., Herring, S. W. Activity patterns within the genioglossus during suckling in domestic dogs and pigs: Interspecific and intraspecific. Brain, Behavior, and Evolution. 30 (5-6), (1987).
- Hiiemae, K. M., Palmer, J. B. Food transport and bolus formation during complete feeding sequences on foods of different initial consistency. Dysphagia. 14 (1), 31-42 (1999).
- Thexton, A. J., Crompton, A. W., German, R. Z. EMG activity in the hyoid muscles during pig suckling. Journal of Applied Physiology. 112, 1512-1519 (2012).
- Thexton, A. J., Crompton, A. W., German, R. Z. Transition from suckling to drinking at weaning: A kinematic and electromyographic study in miniature pigs. Journal of Experimental Zoology. 280 (5), 327-343 (1998).
- Goldfield, E. C., Richardson, M. J., Lee, K. G., Margetts, S. Coordination of sucking, swallowing, and breathing and oxygen saturation during early infant breast-feeding and bottle-feeding. Pediatric Research. 60 (4), 450-455 (2006).
- Ottaviano, F. G., Linhares Filho, T. A., Andrade, H. M., Alves, P. C., Rocha, M. S. Fiberoptic endoscopy evaluation of swallowing in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Braz J Otorhinolaryngol. 79 (3), 349-353 (2013).
- Inamoto, Y., et al. The effect of bolus viscosity on laryngeal closure in swallowing: kinematic analysis using 320-row area detector CT. Dysphagia. 28 (1), 33-42 (2013).
- Spalding, J. F., Thomas, R. G., Tietjen, G. L. Los Alamos National Laboratory. Rein, S. erene , Los Alamos, N.M. (1982).
- Palomba, S., Di Cello, A., Riccio, E., Manguso, F., La Sala, G. B. Ovarian function and gastrointestinal motor activity. Minerva Endocrinol. 36 (4), 295-310 (2011).
- Alves, L. M., Cassiani Rde,, Santos, A., M, C., Dantas, R. O. Gender effect on the clinical measurement of swallowing. Arq Gastroenterol. 44 (3), 227-229 (2007).
- Logemann, J. A., Pauloski, B. R., Rademaker, A. W., Kahrilas, P. J. Oropharyngeal swallow in younger and older women: videofluoroscopic analysis. J Speech Lang Hear Res. 45 (3), 434-445 (2002).
