Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

אלקטרופיזיולוגיה בזמן אמת: שימוש בפרוטוקולי לולאה סגורה לDynamics עצבי בדיקה ומעבר

Published: June 24, 2015 doi: 10.3791/52320

Abstract

מדעי מוח ניסיוניים עדים עניין מוגבר בפיתוח והיישום של רומן ופרוטוקולים לעתים קרובות מורכבים, לולאה סגורה, שבו הגירוי מיושם תלוי בזמן אמת על התגובה של המערכת. היישומים אחרונים נעים בין יישום מערכות מציאות מדומה ללימוד תגובות מנוע הן בעכברי 1 ובדג הזברה 2, לשלוט בהתקפים הבאים שבץ קליפת המוח באמצעות optogenetics 3. יתרון עיקרי של טכניקות לולאה סגורה מתגורר ביכולת של חיטוט תכונות ממדיות גבוהות יותר שאינן נגישים באופן ישיר או שתלויות במשתנים רבים, כגון רגישות עצבית 4 ואמינות, ואילו באותו הזמן למקסם את התפוקה הניסיונית. בתרומה זו ובהקשר של אלקטרופיזיולוגיה הסלולרית, אנו מתארים כיצד ליישם מגוון רחב של פרוטוקולי לולאה סגורה לחקר מאפייני התגובה של תאי עצב בקליפת המוח, rec פירמידהorded intracellularly עם טכניקת מהדק תיקון בפרוסות מוח חריפות מהקליפה החושית של חולדות צעירות. כמו שאף תוכנת קוד זמינה מסחרי או פתוחה מספקת את כל התכונות הנדרשות ליעילות ביצוע הניסויים שתוארו כאן, ארגז כלים תוכנה חדש בשם LCG 5 פותחו, שמודולרי מבנה למקסימום שימוש חוזר של קוד מחשב ומאפשר היישום של פרדיגמות ניסוי רומן. גל גירוי מצוין באמצעות מטא-תיאור קומפקטי ופרוטוקולי ניסוי מלאים מתוארים בקבצי תצורה מבוסס טקסט. בנוסף, יש LCG ממשק שורת הפקודה שמתאים לחזרה של ניסויים ואוטומציה של פרוטוקולי ניסוי.

Introduction

בשנים האחרונות, אלקטרופיזיולוגיה הסלולרית התפתחה מהפרדיגמה הלולאה הפתוחה המסורתית מועסקות בניסויי מתח ומהדק הנוכחי לפרוטוקולים לולאה סגורה מודרניים. טכניקת הלולאה סגורה הידועה ביותר היא אולי המהדק הדינמי 6,7, שאיפשר ההזרקה סינתטית של תעלות יונים מתח מגודרת מלאכותיות כדי לקבוע את מתח הקרום העצבי 8, הלימוד המעמיק של תופעות של אי-דטרמיניסטי מהבהבים ב תעלות יונים על דינמיקת תגובה עצבית 9, כמו גם הבילוי במבחנה של מציאותי בvivo- כמו פעילות רקע הסינפטית 10.

פרדיגמות לולאה סגורה אחרות שהוצעו כוללות את המהדק תגובתי 11, ללמוד במבחנה הדור של פעילות מתמשכת עצמית מתמשך, והתגובה לצבוט 4,12, כדי לחקור את המנגנונים התאיים רגישות עצבית בסיסית.

ontent "> כאן אנו מתארים מסגרת רבת עוצמה המאפשרת יישום מגוון רחב של פרוטוקולי אלקטרו לולאה סגורה בהקשר של הקלטות מהדק תיקון כל התא מתבצעות בפרוסות מוח חריפות. אנו מראים כיצד להקליט מתח קרום גופני באמצעות הקלטות מהדק התיקון בתאי עצב פירמידה מהקליפה החושית של חולדות צעירות וליישם שלושה פרוטוקולי לולאה סגורה שונים באמצעות LCG, ארגז כלים תוכנה מבוססת שורת פקודה שפותחו במעבדה לנוירוביולוגיה התיאורטית וNeuroengineering.

בקצרה, הפרוטוקולים המתוארים הם, ראשון ההזרקה האוטומטית של סדרה של צורות גל גירוי המהדק הנוכחיים, רלוונטיים לאפיון של קבוצה גדולה של תכונות קרום אקטיביות ופסיביות. אלה הציעו ללכוד את הפנוטיפ אלקטרו של תא במונחים של הנכסים את תגובתה לסדרה סטריאוטיפית של צורות גל גירוי. ידוע כדואר הקוד של תא (לדוגמא, ראה & #160; 13,14), אוסף כזה של תגובות חשמליות משמש על ידי מספר מעבדות לסווג אובייקטיבי נוירונים על בסיס התכונות החשמלית שלהם. זה כולל ניתוח של יחסי העברת קלט-פלט הנייח (עקומת Fi), על ידי טכניקה חדשנית המערב את הלולאה הסגורה, השליטה בזמן אמת של קצב הירי באמצעות בקר פרופורציונאלי נפרד נגזרים (PID) , שני הבילוי של in vivo דמוי פעילות הסינפטית רקע מציאותי בהכנות במבחנה 10 ו, החיבור המלאכותי שלישי בזמן אמת של שני נוירונים פירמידה נרשמו בו זמנית באמצעות interneuron GABAergic וירטואלי, אשר הוא מדומה על ידי המחשב.

בנוסף, LCG מיישם את הטכניקה המכונית אלקטרודה פעילה פיצויים (AEC) 15, המאפשר יישום פרוטוקולי מהדק דינמיים באמצעות אלקטרודה אחת. זה מאפשר פיצוי השפעות לא רצויות (rtifacts) של האלקטרודה ההקלטה שמתעוררות כאשר הוא משמש להעברת גירויים תאיים. השיטה מבוססת על הערכה שאינה פרמטרית של התכונות חשמליות שווי ערך של מעגל ההקלטה.

הטכניקות ופרוטוקולי ניסוי מתוארים במאמר זה יכולים להיות מיושמים בקלות במתח לולאה הפתוחה קונבנציונלי וניסויים מהדק הנוכחיים וניתן להרחיב את תכשירים אחרים, כגון 4,16 תאיים או הקלטות תאיות in vivo 17,18. ההרכבה זהירה של ההתקנה לאלקטרופיזיולוגיה מהדק תא כל תיקון היא צעד חשוב מאוד להקלטות באיכות יציבה, גבוהות. בחלק הבא תניח שהגדרה כזו ניסיונית כבר זמינה לנסיין, ולמקד את תשומת הלב שלנו על המתאר את השימוש של LCG. הקורא הצביע על 19-22 לטיפים נוספים על אופטימיזציה וניפוי שגיאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול המתואר כאן תואם את ההמלצות וההנחיות של ועדת האתיקה של המחלקה למדעים ביו-רפואיים מאוניברסיטת אנטוורפן. פרוטוקול זה דורש ההכנה של חומר שאינו חיים מהמוח של חולדות explanted Wistar לנוער, שהושג על ידי טכניקות המתת חסד הומניות אושרו.

1. הכנת ציוד

  1. התקנה והגדרה של מערכת גירוי רכישת נתונים ו.
    1. להשתמש במחשב אישי (PC) מצויד ברכישת נתונים כרטיס (DAQ) הנתמכים על ידי Comedi להקליט אותות ולשלוח מתחי שליטה אנלוגיים למגבר אלקטרו.
      הערה: Comedi הוא מודול לינוקס וספרייה התומך במספר רב של כרטיסי DAQ מהיצרנים הנפוצים ביותר: לבקר http://www.comedi.org לקבלת מידע נוסף.
    2. במקרה מגבר מהדק תיקון מבוקר מחשב נמצא בשימוש, להעסיק מחשב שני מלבד אחד מוקדש למגברשליטה.
      הערה: בעוד זה האחרון עשוי להפעיל מערכת הפעלה קונבנציונלית, המחשב הנוסף יהיה הפועל בזמן אמת באמצעות מערכת הפעלה מיוחדת. בתנאים אלה, זה נוח להשתמש בצג, עכבר ומקלדת יחיד שצורפה למחשב הנוסף, תוך חיבור על ידי יישום שולחן עבודה מרוחק למחשב הייעודי.
    3. הורד את תמונת ISO של התקליטור חי המכיל מערכת הפעלה בזמן אמת לינוקס עם LCG מותקן מראש מhttp://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso ולצרוב אותו על תקליטור או USB מקל "ריק .
    4. פשוט הכנס את התקליטור לכונן של המחשב המכיל את כרטיס DAQ ולהפעיל אותו. לחלופין, להתקין LCG ממאגר המקור המקוון שלה על מחשב שמריץ את מערכת הפעלת לינוקס (למשל, דביאן או אובונטו). עיין במדריך המקוון לקבלת פרטים על הליך ההתקנה. המדריך לזמין באופן מקוון http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf.
    5. אתחול מהתקליטור החי: תישל יטען אוטומטית מערכת מוגדרת באופן מלא. כדי לעשות זאת, הנח את LCG Live CD בכונן התקליטורים המחשב ולאתחל את המחשב מתקליטור; בחר את הליבה בזמן אמת (ברירת מחדל) ברגע שמופיע תפריט האתחול ולחכות למערכת כדי לאתחל.
    6. כייל את כרטיס DAQ על ידי הקלדה בשורת הפקודה:
      sudo comedi_calibrate
      או
      sudo comedi_soft_calibrate
      תלוי אם לוח נתוני הרכישה תומך בחומרה או בתוכנת כיול, בהתאמה (להשתמש comedi_board_info sudo הפקודה כדי לקבל מידע על הלוח).
    7. הגדר את אנלוגית לדיגיטלי המתאימה ודיגיטלי לאנלוגיים גורמי גיור: זה מחייב גישה שיש למדריך של מגבר אלקטרו הסלולרי, ובמיוחד למפרט שלו בגורמי ההמרה שלה.
    8. השתמש בעורך טקסט כדי לציין את הערכים המספריים המתאימים ב/home/user/.lcg-env הקובץ, למשתני סביבת AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
      הערה: אלה מייצגים את הקלט (AI) ופלט רווחים (AO) למהדק נוכחי (CC) ומהדק מתח מצבים (VC), ומקדמי המרה בין פקודות מתח המסופקות על-ידי המחשב והנוכחי או מתח שנוצר על ידי המגבר , בהתאמה.
    9. לחלופין, השתמש בתסריט LCG סיפק (LCG למצוא המרה-גורמים-), כדי למצוא את מקדמי ההמרה של המערכת שלו או שלה.
      הערה: הערכים מחושבים על ידי LCG-מוצא-המרה-גורמים ניחושים, שבמקרים מסוימים נדרשים להיות מספרי קטועים או מעוגל כדי לשקף את הערכים של מקדמי ההמרה המדויקים.
    10. כדי להשתמש בLCG-מוצא-המרה-גורמים, להתחיל על ידי חיבור של תא המודל "שלעתים קרובות נרכש עם המגבר לheadstage המקבילה. לאחר מכן, פתח מסוף על מכונת לינוקס שבו אתה מפעיל את התקליטור חי והזן את הפקודה הבאה במעטפת הפקודה:
      LCG-מוצא-המרה-גורמי $ HOME / .lcg-env $ HOME / -o .lcg-env -i
      הערה: בשני המקרים (כלומר, שינוי הידני של /home/user/.lcg-env או שימוש בLCG-מוצאים-המרה-גורמים), קרוב ולפתוח את המסוף לשינויים ייכנסו לתוקף.
    11. אם headstages מרובה משמש, להגדיר את מקדמי ההמרה לאותם ערכים בכל הערוצים; אם זה לא אפשרי, עיין במדריך המקוון LCG להבין כיצד להשתמש במקדמי המרה מרובות בLCG-גירוי או כיצד לייצר קבצי תצורה שיתאימו יותר לצרכי המשתמש.

2. הכנת פרוסות המוח חריפה מהקליפה החושית

  1. הכנה של פתרונות לאלקטרופיזיולוגיה.
    1. הכן נוזל המלאכותי Cerebro-השדרה (ACSF) על ידי ערבוב (מ"מ) 125 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 לאא 2 PO 4, 26 3 NaHCO, 25 גלוקוז, 2 CaCl 2, ו- 1 MgCl 2. הכן 10x פתרונות מניות כדי להפחית אתזמן הכנה ביום של הניסוי. הכן 2 L, אשר אחד מהם ישמש להכנת פרוסות והאחרת להקלטה.
    2. להרוות את ACSF עם 95% O 2, 5% CO 2 לפחות 30 דקות לפני תחילת ההליך.
    3. עבור הקלטות מהדק הנוכחיות, להשתמש פתרון תאיים (ICS) המכיל (במ"מ) 115 K-גלוקונאט, 20 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 Na 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. הכן את הפתרון בקרח ולסנן אותו לפני תחילת ההקלטות לחסל את הסיכון לסתימת פיפטה.
  2. חילוץ מוח.
    1. להרדים את החיה הצבת בעלי החיים בתא אינדוקציה עם 4% Isoflurane ומהירות לערוף אותו באמצעות הגיליוטינה או מספריים גדולים.
    2. חותך את העור לאורך קו האמצע והחלק אותו לאוזניים.
    3. בעזרת זוג נאה של מספריים לחתוך את הגולגולת לאורך קו האמצע. שמור את הלהב קרוב ככל האפשר לthמשטח דואר כדי למזער את הנזק למוח הבסיסי. פתח את הגולגולת עם פינצטה, להשתמש במרית כדי לנתק את עצב הראייה וגזע המוח ובעדינות שחרר את המוח בACSF קר כקרח.
    4. הפרד את המוח הקטן ושתי ההמיספרות עם אזמל (להב 24).
    5. להסיר את עודפי מים מאחת משתי ההמיספרות ולהדביק אותו על פלטפורמה נוטה באמצעות טיפה של דבק מגע. במהירות להוסיף כמה טיפות של ACSF על המוח ולהעביר אותו לתא vibratome.
      הערה: בעת הכנת פרוסות sagittal, את הזווית של הפלטפורמה חשובה כדי למנוע נזק לדנדריטים של תאי פירמידה במהלך הליך החיתוך.
  3. הכנת פרוסות.
    1. מקם את הלהב על המוח וזורקי 2.5 ראשון - 3 מ"מ. התאם את המהירות ותדירות להגביל נזק למשטח של הפרוסה ואילו באותו הזמן למזער את הזמן הנדרש להליך החיתוך.
    2. הגדר את העובי 300 μמ 'ולהתחיל חיתוך. ברגע שהלהב נעלם עבר הקליפה, להשתמש בסכין גילוח או מחט כפופה לחתוך מעל היפוקמפוס ובקצוות של אזור קליפת המוח של עניין.
    3. מניחים את הפרוסות בתא דגירה רב גם המשיכו ב32-34 מעלות צלזיוס.
    4. לחזור הלהב ולחזור נקודות 2.3.2 ו2.3.3 עד 5-8 פרוסות לחתוך. פרוסות הטובות ביותר הן בדרך כלל אלה שבם כלי הדם מקבילים למשטח.
    5. דגירה את הפרוסות למשך 30 דקות לאחר הפרוסה האחרונה ממוקמת בתא.

3. הקלטות תיקון מהדק מהשכבה 5 עצב פירמידליים

  1. מניחים פרוסה בחדר ההקלטה ולחפש את תאים בריאים. בדרך כלל יש לי תאים אלה ניגוד נמוך, מראה חלק ואינם נפוחים.
  2. בדוק את הפרוסה מתחת למיקרוסקופ עם עדשת הגדלה 40X ולחפש את תאים בשכבה 5, ממוקם כ -600 עד 1,000 מיקרומטר מפני שטח של המוח. ברגע שתא מתאים נמצא, שלישי של micropipette עם ICS עומס אחד ולמקם אותו בheadstage.
  3. במחשב האישי פועל במערכת ההפעלה לינוקס מוגדרת מראש CD או החי, להשיק שורת פקודה (לדוגמא, bash) וLCG-אפס בסוג הפקודה שלו בפקודה. זה מבטיח שלוח DAQ לא נוהג המגבר.
  4. החל 30-50 mbar של לחץ חיובי על ידי לחיצה על הבוכנה של מזרק משותף, שמחובר בצינור לבעל פיפטה ו, בעזרת מיקרוסקופ, למקם את פיפטה כ 100 מיקרומטר מעל הפרוסה.
    הערה: הנח את פיפטה בעמדה המאפשרת מסלול ישיר לתא המטרה, רצוי באמצעות מצב הגישה של micromanipulator.
  5. פועל על פקדי מגבר אלקטרופיזיולוגיה, להתאים את פיפטה לקזז ופלט דופק בדיקה (10 mV) במצב מהדק מתח.
  6. להפחית את הלחץ ל10-30 mbar (תלוי בגודל פיפטה) על ידי הנסיגהבוכנה של המזרק; בעדינות להתקרב התא ולבדוק ליצירת גומה על ידי התבוננות בתמונה על מסך מצלמת וידאו. צג דופק המבחן לעלייה בהתנגדות בכל העת, על ידי צפייה בצורת הגל הנוכחית מוצג על אוסצילוסקופ מחובר למגבר אלקטרופיזיולוגיה (לחלופין אתה יכול להשתמש בLCG-חותם מבחן הפקודה כדי לפקח על התנגדות פיפטה).
  7. לשחרר את הלחץ ובמידת צורך להפעיל לחץ שלילי עדין לפיפטה כדי לעזור היווצרות חותם כאשר אתה שם לב לעלייה בהתנגדות פיפטה והיווצרות של 'גומה' בתא.
  8. בעוד צורות החותם, להקטין בהדרגה את הפוטנציאל מחזיק ל-70 mV.
  9. ברגע שחותם gigaohm הושג, להבטיח כי ההחזקה הנוכחית הוא בין 0-30 הרשות הפלסטינית. החל פולסים קצרים של לחץ שלילי (יניקה) כדי לשבור את הקרום ולהקים את תצורת כל התא. לחלופין, ניתן להזריק פולסים חזקים וקצרים של מתח (
  10. עבור למצב נוכחי מהדק ולוודא שפוטנציאל הממברנה מנוחה אופייני לתאים בריאים. לתאי עצב בקליפת המוח פירמידה באמצעות פתרון מבוסס אשלגן גלוקונאט, ערך זה הוא בדרך כלל בין -65 ו-75 mV.

4. אפיון חצי אוטומטי של מאפייני התגובה חשמליים של תא עצב

  1. ליצור ספרייה לאחסון נתונים של המשתמש. כדי לעשות את זה להעסיק תסריט כלול בLCG Live CD שיוצר תיקיות המבוססות על התאריך. כדי להשתמש בו, סוג בשורת הפקודה
    cd ~ / ניסויים
    LCG-ליצור-ניסוי-תיקיית -s PSP, in_vivo_like
    הפעולה זו תיצור תיקייה שבה נתונים לתא שיישמרו (ו'PSP 'ו' in_vivo_like 'תיקיות משנה) וזה יהיה להדפיס את שמה למסוףחלון; אפשר גם לאחסן מידע נוסף, כגון התנגדות פיפטה וסוג התא באמצעות תסריט זה.
  2. מדריך שינוי לתיקייה החדשה שנוצרה באמצעות הפקודה
    cd ~ / <שם התיקייה>
    שם התיקייה הוא אחד המוצג על ידי LCG-ליצור-ניסוי-תיקייה ולא תהיה לי חותמת של היום הנוכחי (כלומר, שנה-חודש-היום) הפקודה, כמו ב20140331A01.
  3. ודא שהמגבר מוגדר לפעול במצב נוכחי מהדק, שהכבלים מחוברים ואת פקודת המתח החיצונית של המגבר, אם קיימים, מופעלת.
  4. הזן את LCG-ecodeat פקודת שורת הפקודה. זה קורא סדרה של פקודות (כלומר LCG-AP, LCG-VI, LCG-רמפה, LCG-טאו וLCG-שלבים), המשמשת לאפיון תכונות תגובה בסיסיות של התא. LCG-ecode דורש שהמשתמש לציין שני פרמטרים: המשרעת של הדופק 1 MS-הארוך של נוכחי משמש כדי לעורר ספייק יחיד בתא, ואת המשרעת המרבית של האיל הנוכחיעמ 'מוזרק לתוך התא למצוא rheobase.
    השתמש בתחביר הפקודה הבא:
    Y X --ramp-משרעת-משרעת --pulse LCG-ecode
    עם מבחר של X ו- Y הערכים (ברשות) שיש בם כדי להפוך את תא האש בתגובה לדופק 1 MS-ארוך ומתמשכת של הזרקה נוכחית, בהתאמה.
    הערה: פרוטוקולים אלה דורשים ביצוע האומדן המספרי של "ליבת אלקטרודה 'כדי להשתמש באלקטרודה הפיצויים הפעילים (AEC) 15. הזרקה נוכחית רועשת משמשת להעריך את הליבה והמשתמש מתבקש לאשר את מספר הדגימות שמרכיבות את הליבה. ראה 15 למידע מפורט על המשמעות של הקרנל אלקטרודה ואיך לבחור את מספר דגימות ליבה.

5. הזרקה של מוליכות דרך סינפסות סימולציה וסימולציה של in vivo דמוי פעילות רקע

  1. הזרקה של פוטנציאלי פוסט-סינפטי מעוררים מדומים
    1. לשנות את הספרייה שבה תוכל לחסוך הניסוי הבא, על ידי הקלדת הפקודה הבאה בשורת הפקודה של המעטפת:
      PSP cd / 01
    2. העתק קובץ תצורת LCG לספרייה הנוכחית ולפתוח אותו עם עורך טקסט (Nano בדוגמא זו) על ידי הקלדת הפקודות הבאות בשורת הפקודה של המעטפת (קובץ תצורת דוגמא זו כלול בקוד המקור והתקליטור החי) :
      cp ~ / מקומי / src / LCG / תצורות / epsp.xml
      epsp.xml ננו
      הערה: זה פשוט קובץ טקסט עם גורמים שונים הקשורים זה לזה. לפרטים נוספים, ראה סעיף נציגי תוצאות.
    3. אם לערוך צורך inputChannel, outputChannel, inputConversionFactor וoutputConversionFactor בקובץ זה כדי להתאים את תוכנית ההתקנה של המשתמש.
    4. לחשב את ליבת אלקטרודה הדרושה כדי לבצע את פיצוי אלקטרודה הפעיל 'השיטה בשימוש על ידי LCG לבצע מהדק דינמי אלקטרודה אחת' על ידי הנפקת comמאנד
      LCG-ליבה
      זו תנחה את מספר הנקודות בליבה. שוב, בחר מספר כדי שהליבה אלקטרודה מכסה את הקצה של זנב הדעיכה מעריכית.
    5. בצע את ניסוי המהדק הדינמי באמצעות הפקודה
      LCG-להתנסות epsp.xml -c
    6. רשימת הקבצים ולדמיין את התוצאות על ידי שימוש בפקודה
      ls -l
      LCG-עלילה-קובץ -f האחרון
  2. הזרקה של פוטנציאלי פוסט-סינפטי המעכבים מדומים
    1. צור תיקייה ולהעתיק את קובץ epsp.xml לה על ידי הקלדת הפקודות הבאות בשורת הפקודה של המעטפת:
      mkdir ../02
      cp epsp.xml ../02/ipsp.xml
      CD ../02
    2. ערוך את קובץ התצורה באמצעות עורך טקסט: לשנות את פוטנציאל ההיפוך הסינפטי ולעלות וזמן דעיכה קבוע של Exp2Synapse סינפסה המודל לפעולות הבאות:
      פרמטרים>
      <E> -80 </ E>
      <TauRise> 0.8e-3 </ tauRise>
      <לאauDecay> </ tauDecay> 10E-3
      <פרמטרים>
      צא מעורך הטקסט.
    3. לחשב את ליבת אלקטרודה ולבצע את הניסוי כב 5.1, על ידי הקלדת הפקודות הבאות בשורת הפקודה של המעטפת:
      LCG-ליבה
      LCG-להתנסות ipsp.xml -c
    4. רשימת הקבצים ולדמיין את התוצאות, על ידי הקלדת הפקודות הבאות בשורת הפקודה של המעטפת:
      ls -l
      -f LCG-עלילה-קובץ <filename.h5>
  3. סימולציה של in vivo דמוי פעילות רקע:
    1. לשנות את הספרייה שבה ברצונך לשמור את הניסוי הבא, כפי שהוצג קודם, על ידי הקלדת הפקודות הבאות בשורת הפקודה של המעטפת:
      CD ../../in_vivo_like/01
    2. העתק את קובץ התצורה מספריית מקור LCG, על ידי הקלדת הפקודות הבאות בשורת הפקודה של המעטפת:
      cp ~ / מקומי / src / LCG / תצורות / in_vivo_like.xml
      in_vivo_like.xml ננו
    3. להתאים את הפרמטרים תצורת DAQ להתקנה של המשתמש, כפי שמתואר ב5.1.3 וצא מהעורך.
    4. לחשב את ליבת אלקטרודה ולבצע את הניסוי כב 5.1, על ידי הקלדת הפקודות הבאות בשורת הפקודה של המעטפת:
      LCG-ליבה
      LCG-להתנסות in_vivo_like.xml -c -n 10 -i 3
      המתגים '10 -n' ו '-i 3' מצביעים על כך שהגירוי יש לחזור 10 פעמים במרווחים של שלוש שניות.
    5. דמיינו את עקבות גלם באמצעות הפקודה הבאה בשורת הפקודה של המעטפת:
      LCG-עלילה-קובץ -f כל

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בסעיפים הקודמים, שתארנו כיצד להשתמש בארגז הכלים LCG תוכנה כדי לאפיין את תכונות אלקטרו של תאי פירמידה L5 ולשחזר in vivo דמוי פעילות הסינפטית בהכנת פרוסה. השימוש בממשק שורת הפקודה ופרוטוקול חצי אוטומטי להעדיף את שחזור ויעילות של הניסוי, אשר יכולה להיות השפעה גדולה על התפוקה ואיכות הנתונים שהופקו. בנוסף, מאחר והנתונים נשמר באופן עקבי, קל להאריך את הניתוח למטרה מסוימת. איור 1 מציג את התוצאה האופיינית של ניסוי שבו תכונות אלקטרו בסיסיות של תא באמצעות שישה פרוטוקולים שונים מתאפיינות.

מדידה של צורת פוטנציאל פעולה וסף (איור 1 א): קצרה ודופק חזק של depolarizing הנוכחי מוזרקת למדוד את צורת פוטנציאל פעולה הממוצעת. סף ספייק הואמחושב כשיא הראשון של הנגזרת השלישית של פוטנציאל הפעולה 24. מדידה של עקומת מתח שוטף (איור 1): קטניות הנוכחיות תת-סף מוזרקות לתוך התא, ומאפשרות המדידה של מאפייני תגובה פסיביים כגון התנגדות קלט והאפיון של זרמים יוניים תת-סף.

מדידה של מספיק נוכחי המינימלי לגילוי ירי מתמשך (איור 1 ג). הרמפה המוזרקת של נוכחי מאפשרת לאפיון של התאים כאני סוג או הסוג השני מתנד 25. מדידה של עקומת תדירות שוטפת (אלחוטי) (1D איור): הנוכחית הזריק היא פונקציה של תדירות הירי המיידי ומתעדכנת בכל פעם שקוצי התא, באמצעות פרוטוקול הלולאה הסגורה מתואר ב5. שימוש בטכניקה זו, ניתן לקבל הערכה אמינה של העקומה אלחוטית בפחות מ -30 שניות. מדידה של membranזמן דואר קבוע (איור 1E): דופק נוכחי hyperpolarizing קצר מועבר למדוד את תכונות הרפיה פסיביות של הקרום. דופק זה אז להתאים למעריכים כפולים כדי לחשב את זמן הקרום הקבוע (44 מילישניות במקרה זה).

מקדם הסתגלות ותגובה לזרם depolarizing (איור 1F): שני ערכים העל-סף של זרם מוזרקים כדי למדוד את מקדם ההסתגלות (יחס בין המרווחים בין-ספייק הראשונים והאחרונים). היישום האוטומטי של סדרה של פרוטוקולים כמו אלה שתוארו מאפשר אפיון כל תא שנרשם במונחים של נכסי אלקטרו המפתח שלה ומהווה הצעד הבסיסי לכל מאמץ שמטרתו השוואה בין סוגים שונים נוירון ותפקידם, שניהם בבריאות ובחוליים.

למרות LCG מכיל כמה תסריטים שליישם פרוטוקולים מיוחדים, רוב הכח והגמישות של ארגז הכלים מתגורריםים ביכולת לתאר ניסויים באמצעות קבצי תצורה. בסעיף. 5 זה מתואר כיצד לבצע מהדק דינמי להזריק פעילות רקע מדומה לנוירון. הנה הרעיון של קבצי תצורה וגופים הוא הציג. קובץ הגדרות הוא פשוט קובץ טקסט המכיל את השמות וקשרי גומלין של כל אובניים היסוד (גופים הנקראים) הנדרשים לביצוע ניסוי נתון; מסיבה זו, עיצוב פרדיגמות רומן על ידי גופי חיבור הוא משימה קלה יחסית, כמו שיתוף ושימוש חוזר בפרדיגמות ניסוי. בניסוי שמוצג באיור 2, חמישה גופים משמשים:

H5Recorder: רושם את הישויות הקשורות לקובץ דחוס. פורמט קובץ HDF5 נבחר כן הוא נתמך על ידי רוב שפות תכנות כמו פייתון וMATLAB.

RealNeuron: מספק שכבת הפשטה להיבט הטכני של זמן אמת מחדשcording והזרקה. הוא מכיל את המידע על לוח רכישת נתונים ומבצע את פיצוי אלקטרודה הפעיל באינטרנט. כאשר פוטנציאל פעולה הוא זוהה על ידי מעבר לסף, ריאל Neuron גם פלטי ספייק בצורה של אירוע: זה יכול לשמש למשל לפקח על קצב הירי במהלך הניסוי או לממשק עם סינפסות מלאכותיות.

פואסון: מייצר רכבות ספייק הבאים התפלגות מעריכית עם שיעור מסוים. הזרעים של תהליך זה יכול להיות קבוע, כך שניתן לשחזר ניסויים באופן עקבי.

SynapticConnection: מקבל את הקוצים מגנרטור ומשדר אותם לסינפסה המתאימה באיחור מסוים.

Exp2Synapse: מודל של סינפסה כפולה מעריכי. הוא מכיל את פוטנציאל ההיפוך וקבועי זמן עלייה ודעיכה.

כאמור, כל ישות מחוברת ללא אחר אחד או יותרo להלחין ניסוי. בדוגמא של הסימולציה של זרם פוסט-סינפטי מעורר המתואר בסעיף. 5.1, שני RealNeuron וExp2Synapse מחוברים לH5Recorder, כדי לחסוך להגיש מתח קרום ונוכחי הסינפטי, בהתאמה. ישות פואסון מספקת קוצים שנוצרו בתדירות של 2 הרץ לSynapticConnection, אשר בתורו מספק את האירועים לExp2Synapse לאחר 1 ms. לבסוף, ישות Exp2Synapse מחוברת לRealNeuron. שימוש בוריאציות קטנות של קובץ תצורה זו, כפי שמוצג בשניות. 5.2 ו -5.3, אפשר לדמות זרמים מעכבים ולשחזר in vivo דמוי פעילות.

באיור 2 הוא הראה כיצד, באמצעות תצורת מהדק דינמית, אחד יכול ללמוד אינטגרציה הסינפטי באופן מבוקר על ידי ההדמיה הנוכחית מושרה לנוירון ידי סינפסות מלאכותיות. איור 2 א (למעלה) מראה פוטנציאל פוסט-סינפטי בודד (למעלה ) יחד עם injזרמים השתקפו. עקבות אדומות (כחולה) נסמן מעורר אירועים (מעכבים). שים לב שהזרם המוזרק הוא פונקציה של מתח הקרום ושל השינוי במוליכות הקשורים להפעלה של סינפסה הווירטואלית.

על ידי אספקת רכבות ספייק פואסון בתדרים גבוהים יותר לסינפסות, in vivo דמוי פעילות רקע יכולה להיות מדומה (איור 2 ו 2 ד). גם בspiking כאשר זרמים גדולים מוזרקים (זכר שחור בחלק התחתון של איור 2), ערבויות פיצויי אלקטרודה הפעילים שהצורה של הקוצים אינה מושפעת (איור 2 ג), למרות שאלקטרודה אחת משמשת להזריק בו זמנית נוכחי ו להקליט את מתח הקרום. חוזר ניסויים מרובים עם אותו גל המוליכות מאפשר הארכת העבודה של 23 למסגרת מציאותית יותר, מה שמאפשר להפריד את תרומתם של synapti שונהזרמי ג לאמינות ודיוק של עיתוי ספייק.

איור 3 מראה דוגמא פשוטה של רשת היברידית, שהושגה על ידי הקלטה בו זמנית משני תאים פירמידליים שאינם קשורים ובאמצעות interneuron GABAergic וירטואלי כדי לדמות צורה של עיכוב disynaptic, מנגנון נרחב שבקליפת המוח כרוך הפעלת תאי Martinotti. 26, 27 איור 3 א מציג סכמטי של הגדרת הניסוי: זוג תאים אמיתיים, שאינם קשורים בצורת פירמידה (משולשים שחורה ואדום) מחובר באופן מלאכותי באמצעות interneuron GABAergic מדומה, דגם כמו נוירון לשלב-ואש דולפת. סינפסה שמחברת את תא הפירמידה presynaptic למציג interneuron יושמה הנחיית טווח קצר homosynaptic פי מודל Tsodyks-Markram 28, בעוד סינפסה חיבור interneuron ותא הפוסט-סינפטי הפירמידה היא סינפסה biexponential עם עלייה והדעיכה tiשלי קבוע של 1 ו -10 מילי-שניות, בהתאמה.

המשקולות של שני החיבורים הותאמו ליש סטייה בפוטנציאל הממברנה הפוסט-סינפטי של כ 2 mV. איור 3 ו3C להראות את התגובה של נוירון פירמידלי presynaptic לרכבת של פולסים תאיים נמסרו ב -90 הרץ וEPSPs המקביל בהדמיה interneuron:. הפרמטרים של החיבור הסינפטי הותאמו על מנת שיהיה נוירון המלאכותי לפלוט ספייק לאחר פרץ presynaptic של 3 - 4 קוצים בתדירות גבוהה, כפי שדווח בניסוי 26,29 איור 3D מציג את ההשפעה של עיכוב disynaptic ב תא הפוסט-סינפטי האמיתי פירמידה:. 10 ניסויים על גבי, שבתא עצב מגורה עם in vivo דמוי פעילות רקע קפוא דומה לזה שתואר באיור 2 הערה העלייה באמינות בתגובה לשלוש IPSPs המעכב,בא לידי ביטוי בעלייה החד להתעצבן הקטן יותר לאחר הפעלת התא המעכב, כפי שצוין על ידי המקפים האדומים מתחת לעקבות המתח.

איור 1
איור 1. אפיון אלקטרו של דמות פלט שתוקנה L5 פירמידת נוירון של פרוטוקול דואר הקוד לתא פירמידה טיפוסי.; quantifications נעשית באופן אוטומטי ולא עריכה נוספת נדרשת. () חישוב סף פוטנציאל פעולה (קו מקווקו -50.5 mV). תגובת קו אדום הוא צורת פוטנציאל פעולה הממוצעת. מדידה (ב ') בתגובה פסיבית (למעלה) לזרמי hyperpolarizing (תחתונה). (ג) לתדירות ירי גובר depolarizing נוכחי למדידה הנוכחית rheobase (123 PA). (ד) כפונקציה של הזרם המוזרק, נמדד תוך שימוש בגישה לולאה סגורה. כל נקודה אפורה ממוקמת בזוג(נוכחי הזריק, ההופכי של מרווח interspike). זיהוי (F) העקומה האדומה היא בכושר ליניארי לנקודות נתונים והקו המקווקו מציין את rheobase נמדד בפנל (C). מדד (ה) לזמן הקרום הקבוע (43.8 ms). נכסים פעילים בסיסיים של התא מגלה כי התא הוא נוירון spiking קבוע ושיש התאמה מינימאלית. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. נופש של בvivo- כמו פעילות באמצעות מהדק דינמי. (א) סימולציה של מעורר (אדום, Sec. 5.1) ומעכב (כחול, Sec. 5.2) סינפסות, עקבות אפורות הם מימושים אחרים של אותו הניסוי. (B ) טרונג> למעלה, עקבות מתח נרשמו מנושא נוירון פירמידלי L5 להפגזה של מעורר זרמים (מעכבים) פוסט-סינפטי בשיעור של 7,000 הרץ (3000). מימושים מרובים עם זרע אקראי קבוע מוצגים באיור (עקבות אפורות). תחתון, מתאים מעורר (אדום), מעכב (כחול) וסך הכל (שחור) נוכחי מוזרק לתוך התא. צורות (C) של הקוצים במהלך הניסוי ב( ב '). (ד) עלילת סריקה של הקוצים שנוצרו על פני 20 ניסויים מראה כי נוירון יכול להיות מאוד אמין ומדויק בתגובה לאותו הקלט כפי שניתן לראות ב -23. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3 א

= "תמיד"> 3 ב איור
סימולציה איור 3. עיכוב disynaptic באמצעות interneuron המעכב מדומה סכמטי (א) להגדרת ההקלטה:. הפירמידות השחורות ואדום מייצגים זוג של תאי פירמידה אמיתית נרשמו בו זמנית. שחור ואדום מצביע נוירון presynaptic והפוסט-סינפטי, בהתאמה. העיגול הכחול מייצג interneuron GABAergic וירטואלי, קשר תא הפירמידה השחור, אשר בתורו מעכב את תא הפירמידה האדום. (ב) תגובה של נוירון פירמידלי presynaptic האמיתי לרכבת של פולסים נמסרו בתדירות של 90 הרץ, שצוין על ידי המקפים הכתומים מעל עקבות המתח. המקפים השחורים מתחת לזכר המתח מצביעים פוטנציאלי פעולת פעמים נפלטו תא הקדם-סינפטי. תגובה (C) של interneuron המדומה לרכבת של קוצים הנפלטים על ידי תא הקדם-סינפטי. (ד)סופרפוזיציה של 10 עקבות מתח נרשמו מתא הפוסט-סינפטי הפירמידה האמיתי בתגובה להפעלה של interneuron המדומה. תא הפוסט-סינפטי היה מגורה עם in vivo דמוי פעילות רקע קפוא, כדי להשיג דינמיקת מתח אמינה. המקפים האדומים מתחת לעקבות המתח לציין את הזמנים שבם, במהלך ניסויים רצופים, תאי עצב הפוסט-סינפטי הנפלטים פוטנציאל פעולה. שים לב לדיוק המוגבר לאחר הפעלת interneuron, שצוין על ידי להתעצבן ספייק נמוך על פני ניסויים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בטקסט זה פרוטוקול מלא ליישום בזמן אמת, ניסויי אלקטרו תא בודד לולאה סגורה תוארו, באמצעות טכניקת מהדק תיקון וארגז כלים תוכנה שפותח לאחרונה בשם LCG. כדי לייעל את האיכות של הקלטות זה קריטי, כי הגדרת ההקלטה להיות מוארקת כהלכה, מוגן ורטט חופשי: זה מבטיח גישה כל התא יציבה וברה-קיימא לתא, אשר, יחד עם האפשרות של מיכון חלקים שלמים של פרוטוקולי הגירוי , מאפשר למקסום התפוקה של הניסוי.

שני מקרים שבהם ניתן ליישם LCG הוצג, כלומר האפיון של תאים במונחים של נכסיה אלקטרו (איור 1), כוללים החישוב המהיר של יחסי קלט-הפלט הפעיל של תא עצב, והבילוי של in vivo דמוי פעילות בפרוסת מוח (איור 2). SUCיישומי h הראו כיצד לבנות פרוטוקולים שונים, והדגישו כמה מהתכונות הבולטות של LCG: ממשק שורת הפקודה שלו הופך אותו מתאים ל- scripting, המאפשר את היישום האוטומטי של סדרה של פרוטוקולים. בנוסף, כפי שנעשה באיור 1, ערכים שחולצו מפרוטוקול אחד יכול לשמש לפרמטרי חייט של הפרוטוקולים הבאים.

אפשר לפקח בזמן אמת תכונות מסדר גבוהה יותר של התגובה של התא תחת ניתוח (לדוגמא, שיעורה המיידי ירי, כפי שמוצג באיור 1D) ולשנות את הגירוי בהתאם, למשל באמצעות בקר PID לחשב הנוכחי נדרש לשמור על קצב ירי קבוע או משתנה עם זמן.

היישום של פרוטוקולי מוליכות ומהדק דינמי עם LCG הוא פשוט ורק דורש כתיבת קובץ תצורת טקסט, הליך שיכול להיות אוטומטי על ידי השימוש ביםתסריטי imple. LCG כולל מעל 30 גופים שיכולים להיות מקושר ללהמציא פרוטוקולי ניסוי חדשים. אנו תיארנו כיצד להשתמש LCG באמצעות ממשק שורת הפקודה, עם זאת משגר ניסוי גרפי תוכנן כדי להקל מתחיל ניסויים ושינוי פרמטרים על ידי ומאפשר למשתמשים שאינם מנוסים לשלב LCG פקודות כדי ליצור ממשקים הגרפיים שלהם.

שני ארגזי כלים קיימים מציעים פונקציות דומות לLCG: RELACS וRTXI. לשעבר הוא גם פלטפורמה לביצוע ניסויי אלקטרו ולניתוח וביאורי הנתונים שנרשמו. ההבדל העיקרי בין LCG ופתרונות קיימים הוא ממשק המשתמש שלה המבוסס על שורת הפקודה. היתרונות של גישה זו הם מספר: קודם כל, ממשק שורת הפקודה מאפשר אוטומציה של משימות סטנדרטיות וחוזרות על עצמו באמצעות תסריטים אולי מורכבים ושנית, היא מאפשרת הטבעת ניסויים ניסיוניים לזרימות עבודה מורכבות יותר מיושמותבשפת סקריפטים ברמה גבוהה, כגון Matlab או פייתון.

לסיכום, הטבע המודולרי של LCG מאפשר להרחיב את מספר פרוטוקולי ניסוי זמינים בשתי דרכים: אחת הראשון והפשוט ביותר הוא על ידי אד הוק קבצי תצורה המשתמשים באובייקטים הקיימים לבצע פרוטוקולי רומן כתיבה. השני הוא על ידי יישום - באמצעות C ++ - אובייקטים יסודיים חדשים, שניתן להשתמש כדי להרחיב עוד יותר את היכולות ותכונות של LCG. דוגמאות שהוצגו בדאגת פרוטוקול זה המחקר של תאים בודדים בפרוסות מוח. עם זאת, פרוטוקולים דומים יכולים גם להיות מועסקים בהצלחה בהכנות in vivo, להקליט שני אותות תאיים ותאיים, ובהכנות vivo לשעבר כגון תרבויות עצביות, להקליט, למשל, פוטנציאל תאי באמצעות מערכים רב-אלקטרודה תוך גירוי בסגרו לולאה 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue slicer Leica VT-1000S
Pipette puller Sutter P-97
Pipettes WPI 1B150F-4 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament
Vibration isolation table TMC 20 Series
Microscope Leica DMLFS 40X Immersion Objective
Manipulators Scientifica PatchStar
Amplifiers Axon Instruments MultiClamp 700B Computer controlled
Data acquisition card National Instruments PCI-6229 Supported by Comedi Linux Drivers
Desktop computer Dell Optiplex 7010 Tower OS: real-time Linux
Oscilloscopes Tektronix TDS-1002
Perfusion Pump Gibson MINIPULS3 Used with R4 Pump head (F117606)
Temperature controller Multichannel Systems TC02 PH01 Perfusion Cannula
Manometer Testo 510 Optional
Incubator Memmert WB14
NaCl Sigma 71376 ACSF
KCl Sigma P9541 ACSF, ICS
NaH2PO4 Sigma S3139 ACSF
NaHCO3 Sigma S6014 ACSF
CaCl2 Sigma C1016 ACSF
MgCl2 Sigma M8266 ACSF
Glucose Sigma G7528 ACSF
K-Gluconate Sigma G4500 ICS
HEPES Sigma H3375 ICS
Mg-ATP Sigma A9187 ICS
Na2-GTP Sigma 51120 ICS
Na2-Phosphocreatine Sigma P7936 ICS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
  2. Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
  3. Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
  4. Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
  5. Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
  6. Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
  7. Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
  8. Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
  9. White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
  10. Destexhe, a, Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
  11. Fellous, J. -M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
  12. Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
  13. Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  14. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
  15. Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
  16. Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
  17. Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
  18. Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , (1995).
  20. Molleman, A. Patch Clamping. , John Wile., & Sons, Ltd. Chichester, UK. (2002).
  21. Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
  22. Gold, R. The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
  23. Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
  24. Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).
  25. Koch, C., Segev, I. Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , MIT Press. Cambridge, MA, USA. (1988).
  26. Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
  27. Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
  28. Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
  29. Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).

Tags

Neuroscience גיליון 100 אלקטרופיזיולוגיה נוירוביולוגיה הסלולרית מהדק דינמי פיצויי אלקטרודה פעילים מחשוב בזמן אמת לולאה סגורה אלקטרופיזיולוגיה, ממשק שורת הפקודה,, תסריט.
אלקטרופיזיולוגיה בזמן אמת: שימוש בפרוטוקולי לולאה סגורה לDynamics עצבי בדיקה ומעבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. More

Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond. J. Vis. Exp. (100), e52320, doi:10.3791/52320 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter