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Neuroscience

वास्तविक समय इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी: जांच Neuronal गतिशीलता और परे करने के लिए बंद लूप प्रोटोकॉल का उपयोग

Published: June 24, 2015 doi: 10.3791/52320
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, University of Antwerp

Abstract

प्रायोगिक तंत्रिका विज्ञान प्रोत्साहन प्रणाली की प्रतिक्रिया पर वास्तविक समय में निर्भर करता है लागू किया जहां विकास और उपन्यास के आवेदन और अक्सर जटिल, बंद लूप प्रोटोकॉल, में वृद्धि हुई ब्याज देखी जा रही है। हाल के अनुप्रयोगों optogenetics 3 का उपयोग कॉर्टिकल स्ट्रोक निम्नलिखित बरामदगी के नियंत्रित करने के लिए, चूहों 1 में और zebrafish 2 में दोनों मोटर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए आभासी वास्तविकता प्रणाली के कार्यान्वयन से लेकर। बंद लूप तकनीक की एक प्रमुख लाभ सीधे सुलभ नहीं हैं या एक ही समय में प्रयोगात्मक throughput को अधिकतम जबकि, इस तरह के न्यूरोनल excitability के 4 और विश्वसनीयता के रूप में कई चर, पर निर्भर करती है कि उच्च आयामी संपत्तियों की जांच कर की क्षमता में रहता है। इस योगदान में और सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के संदर्भ में, हम पिरामिड cortical न्यूरॉन्स, आरईसी की प्रतिक्रिया गुणों का अध्ययन करने के लिए बंद लूप प्रोटोकॉल की एक किस्म को लागू करने के लिए कैसे का वर्णनकिशोर चूहों के somatosensory प्रांतस्था से तीव्र मस्तिष्क के स्लाइस में पैच दबाना तकनीक के साथ intracellularly orded। कोई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है या खुला स्रोत सॉफ्टवेयर कुशलता से यहाँ वर्णित प्रयोगों प्रदर्शन के लिए आवश्यक सभी सुविधाओं को प्रदान करता है के रूप में, LCG 5 नामक एक नया सॉफ्टवेयर उपकरण बॉक्स जिसका मॉड्यूलर संरचना कंप्यूटर कोड का पुन: उपयोग के अधिकतम और उपन्यास प्रयोगात्मक मानदंड के कार्यान्वयन की सुविधा विकसित किया गया था। उत्तेजना waveforms के एक कॉम्पैक्ट मेटा विवरण का उपयोग कर निर्दिष्ट कर रहे हैं और पूरी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पाठ आधारित विन्यास फाइल में वर्णित हैं। इसके अतिरिक्त, LCG परीक्षणों की पुनरावृत्ति और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के स्वचालन के लिए अनुकूल है कि एक कमांड लाइन इंटरफेस है।

Introduction

हाल के वर्षों में, सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी आधुनिक बंद लूप प्रोटोकॉल के लिए वोल्टेज और मौजूदा दबाना प्रयोगों में कार्यरत पारंपरिक खुले पाश प्रतिमान से विकसित किया गया है। सबसे अच्छा ज्ञात बंद लूप तकनीक शायद न्यूरोनल झिल्ली वोल्टेज 8 निर्धारित करने के लिए कृत्रिम वोल्टेज-गेटेड आयन चैनल का सिंथेटिक इंजेक्शन सक्षम है, जो गतिशील दबाना 6,7, है, गैर नियतात्मक पर चंचल के प्रभावों का गहन अध्ययन आयन न्यूरोनल प्रतिक्रिया गतिशीलता 9 पर चैनलों, साथ ही अन्तर्ग्रथनी पृष्ठभूमि गतिविधि 10 की तरह vivo- में यथार्थवादी के लिए इन विट्रो में मनोरंजन।

प्रस्तावित किया गया है कि अन्य बंद लूप लद सेलुलर तंत्र अंतर्निहित न्यूरोनल excitability के जांच करने के लिए, 4,12 दबाना प्रतिक्रियाशील दबाना 11, इन विट्रो आत्मनिर्भर लगातार गतिविधि की पीढ़ी में अध्ययन करने के लिए, और प्रतिक्रिया शामिल हैं।

"ontent> यहाँ हम तीव्र मस्तिष्क के स्लाइस में प्रदर्शन पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के संदर्भ में बंद लूप electrophysiological प्रोटोकॉल की एक किस्म को लागू करने की अनुमति देता है कि एक शक्तिशाली ढांचे का वर्णन है। हम पैच दबाना रिकॉर्डिंग के माध्यम से दैहिक झिल्ली वोल्टेज रिकॉर्ड करने के लिए कैसे दिखाने किशोर चूहों के somatosensory प्रांतस्था और से पिरामिड न्यूरॉन्स में LCG, सैद्धांतिक तंत्रिका जीव विज्ञान और Neuroengineering की प्रयोगशाला में विकसित एक कमांड लाइन आधारित सॉफ्टवेयर उपकरण बॉक्स का उपयोग करते हुए तीन अलग-अलग बंद लूप प्रोटोकॉल लागू होते हैं।

संक्षेप में, वर्णित प्रोटोकॉल सक्रिय और निष्क्रिय झिल्ली गुण का एक बड़ा सेट के लक्षण वर्णन के लिए प्रासंगिक वर्तमान दबाना प्रोत्साहन तरंग, की एक श्रृंखला के पहले स्वचालित इंजेक्शन, कर रहे हैं। ये प्रोत्साहन waveforms के एक टकसाली श्रृंखला के लिए अपनी प्रतिक्रिया गुण के मामले में एक सेल के electrophysiological फेनोटाइप कब्जा करने के लिए सुझाव दिया गया है। एक सेल का ई-कोड के रूप में जाना जाता है (उदाहरण के लिए, देखें & #160, 13,14), बिजली प्रतिक्रियाओं के इस तरह के एक संग्रह निष्पक्ष उनके बिजली के गुणों के आधार पर न्यूरॉन्स वर्गीकृत करने के लिए कई प्रयोगशालाओं द्वारा प्रयोग किया जाता है। यह एक आनुपातिक-अभिन्न व्युत्पन्न (पीआईडी) नियंत्रक के माध्यम से फायरिंग की दर से बंद लूप, वास्तविक समय नियंत्रण शामिल है कि एक नवीन तकनीक से स्थिर इनपुट, आउटपुट स्थानांतरण रिश्ता (Fi वक्र) का विश्लेषण भी शामिल इन विट्रो तैयारी के 10 और, कंप्यूटर से प्रेरित है जो एक आभासी GABAergic interneuron, के माध्यम से दो एक साथ दर्ज पिरामिड न्यूरॉन्स के वास्तविक समय में तीसरे कृत्रिम संबंध में यथार्थवादी इन विवो की तरह पृष्ठभूमि synaptic गतिविधि के दूसरे मनोरंजन।

इसके अतिरिक्त, LCG एक एकल इलेक्ट्रोड का उपयोग कर गतिशील दबाना प्रोटोकॉल को लागू करने की अनुमति देता है जो सक्रिय इलेक्ट्रोड मुआवजा (एईसी) के 15, के रूप में जाना तकनीक लागू करता है। यह अवांछित प्रभाव प्रतिकारी अनुमति देता है (एकrtifacts) यह इंट्रासेल्युलर उत्तेजनाओं पहुंचाने के लिए प्रयोग किया जाता है उठता है कि जब रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की। विधि रिकॉर्डिंग सर्किट के बराबर बिजली के गुणों की एक गैर पैरामीट्रिक अनुमान पर आधारित है।

इस पत्र में वर्णित तकनीकों और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल आसानी से पारंपरिक खुले पाश वोल्टेज और मौजूदा दबाना प्रयोगों में लागू किया जा सकता है और इन विवो 17,18 में इस तरह के बाह्य 4,16 के रूप में अन्य की तैयारी, या intracellular रिकॉर्डिंग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए सेटअप के सावधान विधानसभा स्थिर, उच्च गुणवत्ता रिकॉर्डिंग के लिए एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है। निम्नलिखित में हम इस तरह के एक प्रयोगात्मक स्थापना प्रयोगकर्ता के लिए पहले से ही उपलब्ध है कि मान, और LCG के उपयोग का वर्णन करने पर हमारा ध्यान केन्द्रित। पाठक अनुकूलन और डीबगिंग के बारे में अतिरिक्त सुझाव के लिए 19-22 की ओर इशारा कर रहा है।

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Protocol

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल सिफारिशों और एंटवर्प विश्वविद्यालय के बायोमेडिकल साइंसेज विभाग के आचार समिति के दिशा निर्देशों के अनुरूप है। इस प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी मानवीय इच्छामृत्यु तकनीक के द्वारा प्राप्त किशोर Wistar चूहों की explanted मस्तिष्क से गैर संवेदनशील सामग्री की तैयारी की आवश्यकता है।

1. उपकरण तैयारी

  1. स्थापित करें और डाटा अधिग्रहण और उत्तेजना प्रणाली विन्यस्त करें।
    1. संकेत रिकॉर्ड और electrophysiological एम्पलीफायर को एनालॉग नियंत्रण voltages के लिए भेजने के लिए Comedi द्वारा समर्थित एक डाटा अधिग्रहण (DAQ) कार्ड के साथ सुसज्जित एक पर्सनल कंप्यूटर (पीसी) का प्रयोग करें।
      नोट: अधिक जानकारी के लिए http://www.comedi.org जाएँ: Comedi सबसे आम निर्माताओं से DAQ ताश के पत्तों की एक भीड़ का समर्थन करता है कि एक लिनक्स मॉड्यूल और पुस्तकालय है।
    2. एक कंप्यूटर नियंत्रित पैच दबाना एम्पलीफायर का उपयोग में है मामले में, एम्पलीफायर को समर्पित एक के अलावा एक दूसरे पीसी को रोजगारनियंत्रण।
      नोट: उत्तरार्द्ध एक पारंपरिक ऑपरेटिंग सिस्टम चलाने के लिए कर सकते हैं, अतिरिक्त पीसी एक विशेष ऑपरेटिंग सिस्टम के माध्यम से वास्तविक समय में सक्रिय हो जाएगा। समर्पित पीसी के लिए एक दूरस्थ डेस्कटॉप अनुप्रयोग से कनेक्ट करते समय इन शर्तों के तहत, यह अतिरिक्त पीसी से जुड़ा एक मॉनिटर, माउस, और कीबोर्ड का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है।
    3. Http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso से LCG के साथ एक वास्तविक समय लिनक्स ऑपरेटिंग सिस्टम युक्त लाइव सीडी से आईएसओ छवि पहले से इंस्टॉल डाउनलोड करने और एक खाली सीडी या यूएसबी स्टिक "पर जला ।
    4. बस DAQ कार्ड युक्त पीसी की ड्राइव में सीडी डालें और इसे शुरू करते हैं। वैकल्पिक रूप से, लिनक्स ऑपरेटिंग सिस्टम (जैसे, डेबियन या Ubuntu) चल रहा एक पीसी पर अपनी ऑनलाइन स्रोत भंडार से LCG स्थापित करें। स्थापना प्रक्रिया पर जानकारी के लिए ऑनलाइन मैनुअल से परामर्श करें। पुस्तिका http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf पर ऑनलाइन उपलब्ध है।
    5. लाइव सीडी से बूट: थीस्वचालित रूप से एक पूरी तरह से विन्यस्त सिस्टम लोड होगा। ऐसा करने के लिए, कंप्यूटर CD-ROM ड्राइव में LCG लाइव सीडी जगह और सीडी से कंप्यूटर बूट; बूट मेनू प्रकट होता है कि जैसे ही वास्तविक समय गिरी (डिफ़ॉल्ट विकल्प) का चयन करें और प्रणाली को प्रारंभ करने के लिए प्रतीक्षा करें।
    6. कमांड प्रॉम्प्ट पर टाइप करके DAQ कार्ड जांचना:
      sudo का comedi_calibrate
      या
      sudo का comedi_soft_calibrate
      डाटा अधिग्रहण बोर्ड क्रमशः हार्डवेयर या सॉफ्टवेयर अंशांकन, (बोर्ड के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए आदेश में sudo comedi_board_info का उपयोग करें) का समर्थन करता है पर निर्भर करता है।
    7. उपयुक्त एनालॉग से डिजिटल और डिजिटल करने वाली एनालॉग रूपांतरण कारकों सेट: इस सेलुलर electrophysiological एम्पलीफायर का मार्गदर्शन करने के लिए उपयोग की आवश्यकता है, और विशेष रूप से अपने रूपांतरण कारकों पर अपनी विशिष्टताओं के लिए।
    8. पर्यावरण चर के लिए, फ़ाइल /home/user/.lcg-env में उपयुक्त संख्यात्मक मान निर्दिष्ट करने के लिए एक पाठ संपादक का उपयोग AI_CONVERSION_FACTOR_सीसी, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC।
      नोट: ये एम्पलीफायर द्वारा उत्पन्न इनपुट (एअर इंडिया) और वर्तमान दबाना (सीसी) और वोल्टेज दबाना (कुलपति) मोड के लिए निर्गम (एओ) लाभ, और कंप्यूटर द्वारा प्रदान की वोल्टेज आदेश और वर्तमान या voltages के बीच रूपांतरण कारकों का प्रतिनिधित्व , क्रमशः।
    9. वैकल्पिक रूप से, अपने या अपने सिस्टम के रूपांतरण के कारकों को खोजने के लिए, (LCG खोजने-रूपांतरण कारक) प्रदान की LCG स्क्रिप्ट का उपयोग करें।
      नोट: द्वारा गणना मूल्यों LCG खोजने-रूपांतरण कारक है कि कुछ मामलों में संख्यानुसार छोटा किया जा करने की आवश्यकता है या रूपांतरण कारकों का सही मूल्यों को प्रतिबिंबित करने के लिए गोल कर रहे हैं जो अनुमान कर रहे हैं।
    10. का उपयोग करने के लिए, LCG-रूपांतरण-कारकों को खोजने के लिए अक्सर इसी headstage के लिए एम्पलीफायर के साथ खरीदा जाता है कि 'मॉडल सेल' को जोड़ने के द्वारा शुरू करते हैं। उसके बाद, आप लाइव सीडी चल रहा है और शेल प्रांप्ट पर निम्न आदेश में प्रवेश कर रहे हैं जहां लिनक्स मशीन पर एक टर्मिनल खोलने के लिए:
      नियंत्रण रेखाजी पाते हैं-रूपांतरण कारक है -मैं $ घर / .lcg-वातावरण -o $ घर / .lcg-लि
      नोट: दोनों ही मामलों में (यानी, मैनुअल /home/user/.lcg-env या LCG खोजने-रूपांतरण कारकों के उपयोग के संशोधन), बंद करो और परिवर्तनों को प्रभावी करने के लिए टर्मिनल खुला।
    11. कई headstages उपयोग किया जाता है, तो सभी चैनलों में एक ही मूल्यों के लिए रूपांतरण कारकों सेट; यह संभव नहीं है, तो उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के अनुरूप है कि विन्यास फ़ाइलों का उत्पादन करने के लिए LCG-उत्तेजना या कैसे में कई रूपान्तरण कारकों का उपयोग करने के लिए समझने के लिए कैसे LCG ऑनलाइन मैनुअल से परामर्श करें।

Somatosensory प्रांतस्था से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की 2. तैयारी

  1. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के समाधान के लिए तैयार करना।
    1. 125 NaCl, 2.5 KCl, (मिमी में) के मिश्रण से कृत्रिम Cerebro-रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ (ACSF) तैयार 1.25 नाह 2 पीओ 4, 26 3 NaHCO, 25 ग्लूकोज, 2 2 CaCl, और 1 2 MgCl। कम करने के लिए 10x स्टॉक समाधान तैयारप्रयोग के दिन पर तैयारी का समय है। एक स्लाइस की तैयारी और रिकॉर्डिंग के लिए दूसरे के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, जिनमें से 2 एल, तैयार करें।
    2. प्रक्रिया की शुरुआत करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए 95% ओ 2 और 5% सीओ 2 के साथ ACSF तर।
    3. वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग के लिए, (मिमी में) युक्त एक intracellular समाधान (आईसीएस) का उपयोग 115 कश्मीर gluconate, 20 KCl, 10 HEPES, 4 एटीपी मिलीग्राम, 0.3 ना 2 -GTP, 10 2 -phosphocreatine ना। बर्फ में समाधान तैयार है और पिपेट clogging के खतरे को समाप्त करने के लिए रिकॉर्डिंग की शुरुआत करने से पहले यह फिल्टर।
  2. ब्रेन निष्कर्षण।
    1. 4% isoflurane के साथ एक प्रेरण कक्ष में पशु रखकर पशु anesthetize और तेजी से एक गिलोटिन या बड़ी कैंची का उपयोग कर इसे सिर काटना।
    2. Midline के साथ त्वचा में कटौती और यह कान के लिए स्लाइड।
    3. कैंची का जुर्माना जोड़ी का उपयोग midline के साथ खोपड़ी में कटौती। वें करने के लिए संभव के रूप में बंद ब्लेड रखेंई सतह अंतर्निहित मस्तिष्क को क्षति को कम करने के लिए इतनी के रूप में। चिमटी की एक जोड़ी के साथ खोपड़ी ओपन के ऑप्टिक तंत्रिका और brainstem तोड़ और धीरे ठंडा aCSF में मस्तिष्क ड्रॉप करने के लिए एक रंग का उपयोग करें।
    4. सेरिबैलम और एक स्केलपेल (ब्लेड 24) के साथ दो गोलार्द्धों अलग।
    5. दो गोलार्द्धों में से एक से अतिरिक्त पानी निकालने और superglue की एक बूंद का उपयोग कर एक झुका मंच पर यह गोंद। जल्दी से मस्तिष्क अधिक ACSF की कुछ बूँदें जोड़ने और vibratome चैम्बर को हस्तांतरण।
      नोट: बाण के समान स्लाइस की तैयारी, मंच के कोण टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान पिरामिड कोशिकाओं की डेन्ड्राइट को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. स्लाइस की तैयारी।
    1. मस्तिष्क से अधिक ब्लेड स्थिति और प्रथम 2.5 त्यागने - 3 मिमी। जबकि टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के लिए आवश्यक समय कम से कम एक ही समय में टुकड़ा की सतह को नुकसान को सीमित करने के लिए गति और आवृत्ति समायोजित करें।
    2. 300 μ मोटाई निर्धारित करेंमी और टुकड़ा करने की क्रिया शुरू करते हैं। ब्लेड कॉर्टेक्स अतीत चला गया है एक बार, एक रेजर ब्लेड या हिप्पोकैम्पस से ऊपर है और ब्याज की cortical क्षेत्र के किनारों पर कटौती करने के लिए एक तुला सुई का उपयोग करें।
    3. 34 डिग्री सेल्सियस - एक बहु अच्छी तरह से ऊष्मायन कक्ष में स्लाइस 32 में रखा रखें।
    4. ब्लेड वापस लेना और 5 तक अंक 2.3.2 और 2.3.3 दोहराना - 8 स्लाइस काट रहे हैं। सबसे अच्छा स्लाइस आमतौर पर रक्त वाहिकाओं की सतह के समानांतर हैं जहां लोग कर रहे हैं।
    5. पिछले टुकड़ा कक्ष में रखा गया है के बाद 30 मिनट के लिए स्लाइस सेते हैं।

परत 5 पिरामिड न्यूरॉन्स से 3. पैच दबाना रिकॉर्डिंग

  1. रिकॉर्डिंग कक्ष में एक टुकड़ा प्लेस और स्वस्थ कोशिकाओं के लिए खोज करते हैं। इन कोशिकाओं को आमतौर पर कम विपरीत, एक चिकनी उपस्थिति है और सूजन नहीं कर रहे हैं।
  2. मस्तिष्क की सतह से लगभग 600 माइक्रोन से 1000 स्थित, 40x बढ़ाई लेंस के साथ खुर्दबीन के नीचे टुकड़ा का निरीक्षण किया और परत 5 में कोशिकाओं के लिए खोज करते हैं। एक उपयुक्त सेल पाया जाता है एक बार, आईसीएस के साथ micropipette के भार एक तिहाई और headstage में जगह है।
  3. लाइव सीडी या पूर्व विन्यस्त लिनक्स ऑपरेटिंग सिस्टम चल रहा है पर्सनल कंप्यूटर, एक कमांड खोल (जैसे, पार्टी की योजना बनाई) शुरू करने और अपनी त्वरित प्रकार में आदेश LCG-शून्य। इस DAQ बोर्ड एम्पलीफायर ड्राइविंग नहीं है कि यह सुनिश्चित करता है।
  4. 30 लागू करें - माइक्रोस्कोप की मदद से, पिपेट धारक के लिए ट्यूबिंग और से जुड़े एक आम सिरिंज के पिस्टन पर दबाव द्वारा सकारात्मक दबाव के 50 एम्बार, टुकड़ा से ऊपर पिपेट लगभग 100 माइक्रोन जगह है।
    नोट: अधिमानतः micromanipulator के दृष्टिकोण मोड का उपयोग कर, लक्ष्य सेल के लिए एक सीधा मार्ग की अनुमति देता है कि एक स्थिति में पिपेट रखें।
  5. नियंत्रण पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एम्पलीफायर अभिनय, ऑफसेट पिपेट और उत्पादन में वोल्टेज दबाना मोड में एक परीक्षण पल्स (10 एम वी) समायोजित करें।
  6. वापस लेकर 30 एम्बार (पिपेट आकार पर निर्भर करता है) - 10 के लिए दबाव कमसिरिंज के पिस्टन; धीरे सेल दृष्टिकोण और वीडियो कैमरे की निगरानी पर छवि देख कर एक डिंपल के गठन के लिए जाँच करें। सभी समय पर प्रतिरोध में वृद्धि के लिए परीक्षण पल्स मॉनिटर, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एम्पलीफायर से जुड़ा आस्टसीलस्कप पर प्रदर्शित वर्तमान तरंग देख कर (वैकल्पिक रूप से आप पिपेट प्रतिरोध पर नजर रखने के आदेश LCG सील-परीक्षण का उपयोग कर सकते हैं)।
  7. दबाव जारी है और आप पिपेट प्रतिरोध में वृद्धि हुई है और सेल पर एक 'डिंपल' के गठन की सूचना है जब यदि आवश्यक हो तो सील गठन में मदद करने के लिए पिपेट कोमल नकारात्मक दबाव लागू होते हैं।
  8. सील रूपों करते हैं, धीरे-धीरे एम वी -70 के लिए होल्डिंग क्षमता कम होती है।
  9. 30 फिलीस्तीनी अथॉरिटी - एक gigaohm मुहर प्राप्त हो जाने के बाद, पकड़े वर्तमान 0 के बीच है कि सुनिश्चित करते हैं। झिल्ली तोड़ने के लिए और पूरे सेल विन्यास की स्थापना के लिए नकारात्मक दबाव (चूषण) दालों की कमी को लागू करें। वैकल्पिक रूप से, आप (वोल्टेज के मजबूत और संक्षिप्त दालों इंजेक्षन कर सकते हैं
  10. वर्तमान दबाना मोड में स्विच करें और आराम झिल्ली क्षमता एक स्वस्थ कोशिका की खासियत है कि यह पुष्टि। एक पोटेशियम gluconate-आधारित समाधान का उपयोग कॉर्टिकल पिरामिड न्यूरॉन्स के लिए, यह मूल्य के बीच आमतौर पर -65 और -75 एम वी है।

एक न्यूरॉन की विद्युत प्रतिक्रिया गुण 4. अर्द्ध स्वचालित विशेषता

  1. उपयोगकर्ता के डाटा स्टोर करने के लिए एक निर्देशिका बनाएँ। एक स्क्रिप्ट तिथि के आधार पर फ़ोल्डर्स बनाता है कि लाइव LCG सीडी में शामिल इस रोजगार ऐसा करने के लिए। कमांड प्रॉम्प्ट पर इसका इस्तेमाल करने के लिए
    सीडी ~ / प्रयोगों
    LCG-बनाने-प्रयोग-फ़ोल्डर PSP, in_vivo_like -s
    मतलब यह है कि सेल के लिए डेटा सहेजा जाएगा, जहां एक फ़ोल्डर (और subfolders 'in_vivo_like' ए 'PSP' और) पैदा करेगा और यह टर्मिनल के लिए इसका नाम मुद्रित होगाखिड़की; यह इस तरह के पिपेट प्रतिरोध और इस स्क्रिप्ट का उपयोग सेल प्रकार के रूप में अतिरिक्त जानकारी स्टोर करने के लिए भी संभव है।
  2. कमांड के प्रयोग से नव निर्मित फ़ोल्डर में बदल निर्देशिका
    सीडी ~ / <foldername>
    फ़ोल्डर नाम 20140331A01 में के रूप में कमान LCG-प्रयोग-फ़ोल्डर बना सकते हैं और वर्तमान दिन के टाइमस्टैम्प होगा (यानी, वर्ष माह दिन) द्वारा प्रदर्शित एक है।
  3. एम्पलीफायर वर्तमान दबाना मोड में संचालित करने के लिए सेट कर दिया जाता है कि केबल जुड़े हुए हैं और एम्पलीफायर के बाहरी वोल्टेज कमांड, अगर वर्तमान में सक्षम है, सुनिश्चित करें।
  4. आदेश LCG-ecodeat कमांड प्रॉम्प्ट दर्ज करें। इस सेल की बुनियादी प्रतिक्रिया गुण विशेषताएँ इस्तेमाल किया आदेशों की एक श्रृंखला (अर्थात् LCG-AP, LCG-VI, LCG रैंप, LCG-ताऊ और LCG-कदम), कहता है। LCG-ecode उपयोगकर्ता दो मापदंडों को निर्दिष्ट की आवश्यकता है: सेल में एक भी कील प्रकाश में लाना करने के लिए इस्तेमाल वर्तमान की 1 एमएस-लंबे नाड़ी का आयाम है, और वर्तमान राम की अधिकतम आयामपी अपनी rheobase खोजने के लिए सेल में इंजेक्ट किया।
    निम्न कमांड सिंटैक्स का उपयोग करें:
    LCG-ecode --pulse-आयाम एक्स --ramp-आयाम वाई
    क्रमश: एक 1 एमएस-लंबे नाड़ी और वर्तमान की एक निरंतर इंजेक्शन, के जवाब में सेल आग बनाने के लिए पर्याप्त हैं कि मूल्यों एक्स और (देहात में) वाई के विकल्प के साथ।
    नोट: इन प्रोटोकॉल सक्रिय इलेक्ट्रोड मुआवजा (एईसी) 15 उपयोग करने के क्रम में 'इलेक्ट्रोड गिरी' की संख्यात्मक अनुमान प्रदर्शन करने की आवश्यकता है। एक शोर वर्तमान इंजेक्शन गिरी अनुमान लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है और उपयोगकर्ता गिरी है कि मेकअप नमूनों की संख्या की पुष्टि करने के लिए कहा जाता है। इलेक्ट्रोड गिरी का अर्थ और कैसे गिरी नमूनों की संख्या का चयन करने के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए 15 देखें।

नकली synapses और इन विवो की तरह पृष्ठभूमि गतिविधि का अनुकरण के माध्यम से प्रवाहकत्त्व 5. इंजेक्शन

  1. नकली उत्तेजक बाद synaptic क्षमता का इंजेक्शन
    1. आप खोल के कमांड प्रॉम्प्ट पर निम्न आदेश टाइप करके, अगले प्रयोग की बचत होगी, जहां निर्देशिका को बदलें:
      सीडी PSP / 01
    2. वर्तमान निर्देशिका के लिए एक LCG विन्यास फाइल को कॉपी और (इस उदाहरण विन्यास फाइल स्रोत कोड और लाइव सीडी में शामिल है) खोल के कमांड प्रॉम्प्ट पर निम्न आदेश टाइप करके (इस उदाहरण में नैनो) एक पाठ संपादक के साथ खुला :
      सी.पी. ~ / स्थानीय / src / LCG / विन्यास / epsp.xml
      नैनो epsp.xml
      नोट: यह बस एक दूसरे से जुड़े विभिन्न संस्थाओं के साथ एक पाठ फ़ाइल है। अधिक जानकारी के लिए प्रतिनिधि परिणाम खंड देखें।
    3. आवश्यक संपादित inputChannel, outputChannel, inputConversionFactor और इस फाइल में outputConversionFactor उपयोगकर्ता की स्थापना करने के लिए मैच है।
    4. कॉम जारी करके 'एक इलेक्ट्रोड गतिशील दबाना प्रदर्शन करने के लिए LCG द्वारा प्रयोग विधि' सक्रिय इलेक्ट्रोड मुआवजा प्रदर्शन करने की जरूरत इलेक्ट्रोड गिरी कंप्यूटमंड
      LCG-गिरी
      यह कर्नेल में अंकों की संख्या के लिए संकेत देगा। इलेक्ट्रोड गिरी घातीय क्षय पूंछ के अंत को शामिल किया गया है, ताकि फिर से, एक नंबर का चयन करें।
    5. आदेश का उपयोग कर गतिशील दबाना प्रयोग
      ग epsp.xml LCG-प्रयोग
    6. फाइलों की सूची और आदेश का उपयोग कर परिणामों की कल्पना
      रास -l
      पिछले च LCG-प्लाट-फ़ाइल
  2. नकली निरोधात्मक बाद synaptic क्षमता का इंजेक्शन
    1. एक फ़ोल्डर बनाएँ और खोल के कमांड प्रॉम्प्ट पर निम्न आदेश टाइप करके इसे करने के लिए epsp.xml फाइल कॉपी:
      mkdir ../02
      सी.पी. epsp.xml ../02/ipsp.xml
      सीडी ../02
    2. एक पाठ संपादक का उपयोग करके विन्यास फ़ाइल को संपादित करें: अन्तर्ग्रथनी उलटा संभावित परिवर्तन और निम्न के मॉडल अन्तर्ग्रथन Exp2Synapse की स्थिरांक वृद्धि और क्षय समय:
      मापदंडों>
      <ई> -80 </ ई>
      <TauRise> 0.8e-3 </ tauRise>
      <TauDecay> 10E-3 </ tauDecay>
      <मापदंडों>
      पाठ संपादक से बाहर निकलें।
    3. इलेक्ट्रोड गिरी कंप्यूट और खोल के कमांड प्रॉम्प्ट पर निम्न आदेश टाइप करके, 5.1 में के रूप में प्रयोग करते हैं:
      LCG-गिरी
      ग ipsp.xml LCG-प्रयोग
    4. फाइलों की सूची और खोल के कमांड प्रॉम्प्ट पर निम्न आदेश टाइप करके, परिणाम की कल्पना:
      रास -l
      LCG-प्लाट-फ़ाइल च <filename.h5>
  3. इन विवो की तरह पृष्ठभूमि गतिविधि के सिमुलेशन:
    1. यदि आप पहले खोल के कमांड प्रॉम्प्ट पर निम्न आदेश टाइप करके दिखाया गया है, निम्नलिखित प्रयोग को बचाने के लिए चाहते हैं, जहां निर्देशिका को बदलें:
      सीडी ../../in_vivo_like/01
    2. LCG स्रोत निर्देशिका से, खोल के कमांड प्रॉम्प्ट पर निम्न आदेश टाइप करके विन्यास फाइल कॉपी:
      सी.पी. ~ / स्थानीय / src / LCG / विन्यास / in_vivo_like.xml
      नैनो in_vivo_like.xml
    3. 5.1.3 में वर्णित के रूप में, उपयोगकर्ता की स्थापना के लिए DAQ विन्यास मापदंडों को समायोजित करें और संपादक से बाहर निकलें।
    4. इलेक्ट्रोड गिरी कंप्यूट और खोल के कमांड प्रॉम्प्ट पर निम्न आदेश टाइप करके, 5.1 में के रूप में प्रयोग करते हैं:
      LCG-गिरी
      10 -मैं 3 -n ग in_vivo_like.xml LCG-प्रयोग
      '-n 10' और '-मैं 3' स्विच उत्तेजना तीन सेकंड के अंतराल पर 10 बार दोहराया जाना चाहिए कि संकेत मिलता है।
    5. खोल के कमांड प्रॉम्प्ट पर निम्न आदेश का उपयोग करके कच्चे निशान कल्पना:
      LCG-प्लाट-फ़ाइल च सभी

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Representative Results

पिछले वर्गों में, हम L5 के पिरामिड कोशिकाओं की electrophysiological गुण चिह्नित करने के लिए सॉफ्टवेयर उपकरण बॉक्स LCG उपयोग करने के लिए और एक टुकड़ा तैयारी में इन विवो की तरह synaptic गतिविधि विश्राम करने के लिए कैसे का वर्णन किया है। एक कमांड लाइन इंटरफेस और अर्द्ध स्वचालित प्रोटोकॉल का उपयोग उत्पादित डेटा के उत्पादन और गुणवत्ता पर एक बड़ा प्रभाव हो सकता है जो प्रयोग के reproducibility और दक्षता के पक्ष में। डेटा एक सुसंगत तरीके से सहेजा जाता है क्योंकि इसके साथ ही, यह एक विशेष लक्ष्य के लिए विश्लेषण का विस्तार करने के लिए आसान है। 1 छह अलग प्रोटोकॉल का उपयोग एक सेल की बुनियादी electrophysiological गुण विशेषता किया गया है, जिसमें एक प्रयोग के विशिष्ट परिणाम से पता चलता है।

कार्रवाई संभावित आकार और सीमा (चित्रा 1 ए) के मापन: एक संक्षिप्त और वर्तमान depolarizing की मजबूत नाड़ी औसत कार्रवाई संभावित आकार को मापने के लिए इंजेक्शन है। कील दहलीज हैकार्रवाई संभावित 24 के तीसरे व्युत्पन्न की पहली शिखर के रूप में गणना। वोल्टेज वर्तमान वक्र (चित्रा 1 बी) के मापन: उप दहलीज वर्तमान दालों इस तरह के इनपुट प्रतिरोध और उप दहलीज आयनिक धाराओं के लक्षण वर्णन के रूप में निष्क्रिय प्रतिक्रिया गुणों की माप के लिए अनुमति देता है, सेल में इंजेक्ट किया जाता है।

निरंतर फायरिंग (चित्रा 1C) eliciting के लिए कम से कम वर्तमान पर्याप्त के मापन। वर्तमान में इंजेक्ट रैंप एक प्रकार मैं या द्वितीय प्रकार थरथरानवाला 25 के रूप में सेल के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है। आवृत्ति वर्तमान (FI) वक्र (चित्रा -1) के मापन: इंजेक्ट वर्तमान तात्कालिक फायरिंग आवृत्ति के एक समारोह है और 5 में वर्णित बंद लूप प्रोटोकॉल का उपयोग, हर समय सेल spikes के अद्यतन किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग करना, फाई की अवस्था का एक विश्वसनीय अनुमान कम से कम 30 सेकंड में प्राप्त किया जा सकता है। Membran के मापनई समय (चित्रा 1E) स्थिर: एक छोटी hyperpolarizing वर्तमान नाड़ी झिल्ली के निष्क्रिय छूट गुणों को मापने के लिए दिया जाता है। इस नाड़ी तो निरंतर झिल्ली समय (इस मामले में 44 एमएस) की गणना करने के लिए एक डबल घातीय के लिए फिट है।

अनुकूलन गुणांक और depolarizing वर्तमान (चित्रा 1F) के जवाब: वर्तमान के दो पूर्व दहलीज मूल्यों (पहली और आखिरी अंतर-स्पाइक अंतराल के बीच का अनुपात) अनुकूलन गुणांक को मापने के लिए इंजेक्ट कर रहे हैं। वर्णित लोगों की तरह प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला के स्वचालित आवेदन स्वास्थ्य और रोग में दोनों, उसके प्रमुख electrophysiological गुण के मामले में प्रत्येक दर्ज सेल निस्र्पक अनुमति देता है और विभिन्न प्रकार के न्यूरॉन और उनकी भूमिका की तुलना करने के उद्देश्य से किसी भी प्रयास के लिए बुनियादी कदम का गठन किया।

LCG विशेष प्रोटोकॉल को लागू कि कई लिपियों में शामिल है हालांकि, बिजली और उपकरण बॉक्स के लचीलेपन का सबसे रहते हैंक्षमता में विन्यास फाइल के माध्यम से प्रयोगों का वर्णन है। सेकंड में। 5 यह न्यूरॉन में नकली पृष्ठभूमि गतिविधि इंजेक्षन करने के लिए गतिशील दबाना प्रदर्शन करने के लिए वर्णित है। यहाँ विन्यास फाइल और संस्थाओं की अवधारणा शुरू की है। एक विन्यास फाइल बस एक दिया प्रयोग का प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हैं कि सभी बुनियादी इमारत ब्लॉकों (बुलाया संस्थाओं) के नाम और interconnections के साथ कोई टेक्स्ट फाइल है; साझा करने और प्रयोगात्मक लद पुन: उपयोग के रूप में है इस कारण से, जोड़ने संस्थाओं द्वारा उपन्यास लद डिजाइनिंग, एक अपेक्षाकृत आसान काम नहीं है। चित्रा 2 में दिखाया गया प्रयोग में, पांच संस्थाओं इस्तेमाल कर रहे हैं:

H5Recorder: एक संकुचित फ़ाइल से जुड़ा संस्थाओं रिकॉर्ड करता है। यह इस तरह के अजगर और MATLAB के रूप में सबसे प्रोग्रामिंग भाषा के द्वारा समर्थित है के बाद से HDF5 फ़ाइल स्वरूप में चुना गया है।

RealNeuron: वास्तविक समय पुनः के तकनीकी पहलू के लिए एक अमूर्त परत प्रदान करता हैमुताबिक और इंजेक्शन। यह डाटा अधिग्रहण बोर्ड बारे में जानकारी है और ऑनलाइन सक्रिय इलेक्ट्रोड मुआवजा प्रदर्शन करती है। एक संभावित कार्रवाई दहलीज पार करके पता लगाया जाता है, तो रियल न्यूरॉन भी एक घटना के रूप में एक कील Outputs: इस प्रयोग के दौरान फायरिंग दर पर नजर रखने के लिए या कृत्रिम synapses के साथ इंटरफेस करने के लिए उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

पॉसों: एक विशेष दर के साथ एक घातीय वितरण निम्नलिखित स्पाइक गाड़ियों उत्पन्न करता है। परीक्षणों लगातार reproduced किया जा सकता है, ताकि इस प्रक्रिया के बीज तय किया जा सकता है।

SynapticConnection: जनरेटर से spikes प्राप्त करता है और एक दिया देरी के बाद उचित अन्तर्ग्रथन करने के लिए उन्हें रिले।

Exp2Synapse: एक डबल घातीय अन्तर्ग्रथन की मॉडल। यह पलटने की क्षमता और वृद्धि और क्षय समय स्थिरांक होता है।

जैसा कि पहले उल्लेख, प्रत्येक इकाई एक या एक से अधिक दूसरों की टी से जुड़ा हैओ एक प्रयोग लिखें। धारा में वर्णित एक उत्तेजक बाद synaptic वर्तमान के अनुकरण के उदाहरण में। 5.1, RealNeuron और Exp2Synapse दोनों क्रमश: झिल्ली वोल्टेज और synaptic वर्तमान फ़ाइल को बचाने के लिए, H5Recorder से जुड़े हैं। पॉसों इकाई बदले में 1 एमएस के बाद Exp2Synapse करने की घटनाओं से बचाता है, जो SynapticConnection, करने के लिए 2 हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर उत्पन्न spikes के बचाता है। अंत में, Exp2Synapse इकाई RealNeuron से जुड़ा है। सेकेंड में दिखाया गया है, इस विन्यास फाइल के छोटे बदलाव का उपयोग करना। 5.2 और 5.3, एक निरोधात्मक धाराओं अनुकरण और इन विवो की तरह गतिविधि विश्राम कर सकते हैं।

चित्रा 2 में यह एक गतिशील दबाना विन्यास के माध्यम से, एक कृत्रिम synapses के द्वारा एक न्यूरॉन में प्रेरित वर्तमान अनुकरण करके एक नियंत्रित फैशन में synaptic एकीकरण का अध्ययन कर सकते हैं, कैसे दिखाया गया है। 2A चित्रा (ऊपर) व्यक्तिगत बाद synaptic क्षमता से पता चलता है (ऊपर ) एक साथ inj के साथected धाराओं। लाल (नीला) निशान उत्तेजक (निरोधात्मक) की घटनाओं को दर्शाते हैं। इंजेक्शन के वर्तमान झिल्ली वोल्टेज की और आभासी अन्तर्ग्रथन के सक्रियण के लिए जुड़े चालकता में परिवर्तन का एक समारोह है कि ध्यान दें।

अन्तर्ग्रथन से उच्च आवृत्तियों पर पॉसों स्पाइक गाड़ियों देने से, इन विवो की तरह पृष्ठभूमि गतिविधि (चित्रा 2 बी और 2 डी) प्रेरित किया जा सकता है। यहां तक कि बड़े धाराओं एक एकल इलेक्ट्रोड एक साथ वर्तमान इंजेक्षन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, भले ही, (चित्रा 2B के तल में काला ट्रेस) spikes के आकार (चित्रा -2) प्रभावित नहीं है कि सक्रिय इलेक्ट्रोड मुआवजा की गारंटी देता है इंजेक्ट कर रहे हैं और जब spiking के दौरान झिल्ली वोल्टेज रिकॉर्ड है। एक ही प्रवाहकत्त्व waveforms के साथ कई परीक्षणों दोहरा यह संभव अलग synapti के योगदान को अलग करने के लिए कर रही है, एक और अधिक यथार्थवादी ढांचे के लिए 23 के काम को विस्तार देने की अनुमति देता हैविश्वसनीयता और कील समय की शुद्धता के लिए सी धाराओं।

चित्रा 3 दो असंबद्ध पिरामिड कोशिकाओं से एक साथ रिकॉर्डिंग और disynaptic निषेध के एक फार्म के अनुकरण के लिए एक आभासी GABAergic interneuron का उपयोग करके प्राप्त संकर नेटवर्क है, का एक सरल उदाहरण से पता चलता है, एक व्यापक तंत्र सेरेब्रल कॉर्टेक्स में Martinotti कोशिकाओं की सक्रियता शामिल है। 26 27 चित्रा 3A प्रयोगात्मक स्थापना के एक योजनाबद्ध से पता चलता है: असली, असंबद्ध पिरामिड कोशिकाओं (काले और लाल त्रिकोण) की एक जोड़ी कृत्रिम रूप से एक टपकाया एकीकृत व आग न्यूरॉन के रूप में मॉडलिंग, एक नकली GABAergic interneuron के माध्यम से जुड़ा हुआ है। अन्तर्ग्रथन interneuron और पोस्टअन्तर्ग्रथनी पिरामिड सेल कनेक्ट करते समय, Homo अन्तर्ग्रथनी लघु अवधि के सरलीकरण Tsodyks-Markram मॉडल 28 के अनुसार लागू interneuron प्रदर्शित करने के लिए प्रीसानेप्टिक पिरामिड सेल जोड़ता है कि अन्तर्ग्रथन वृद्धि और क्षय तिवारी के साथ एक biexponential अन्तर्ग्रथन हैमुझे क्रमश: 1 और 10 एमएस की स्थिरांक।

दोनों कनेक्शन का भार एम वी। 3B चित्रा और -3 सी 90 हर्ट्ज पर दिया इंट्रासेल्युलर दालों की एक ट्रेन को प्रीसानेप्टिक पिरामिड न्यूरॉन की प्रतिक्रिया दिखाने के लगभग 2 की पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली क्षमता में एक विक्षेपन और नकली में इसी EPSPs पास करने के लिए समायोजित किया गया interneuron:। अन्तर्ग्रथनी कनेक्शन के मापदंडों कृत्रिम न्यूरॉन 3 के एक प्रीसानेप्टिक फट के बाद एक कील का उत्सर्जन के क्रम में समायोजित किया गया - प्रयोगात्मक रिपोर्ट के रूप में, उच्च आवृत्ति पर 4 spikes के 26,29 चित्रा 3 डी पर disynaptic निषेध के प्रभाव से पता चलता है असली पोस्टअन्तर्ग्रथनी पिरामिड सेल:। 10 परीक्षणों आरोपित कर रहे हैं, न्यूरॉन चित्रा 2 में वर्णित एक करने के लिए इसी तरह जमे हुए इन विवो की तरह पृष्ठभूमि गतिविधि के साथ प्रेरित है, जिसमें तीन निरोधात्मक IPSPs के जवाब में विश्वसनीयता में वृद्धि के नोटवोल्टेज निशान से नीचे लाल डैश द्वारा संकेत के रूप में, निरोधात्मक सेल की सक्रियता के बाद छोटे कील घबराना में परिलक्षित।

चित्र 1
चित्रा 1. एक विशिष्ट पिरामिड सेल के लिए ई-कोड प्रोटोकॉल का एक समझौता L5 के पिरामिड न्यूरॉन आउटपुट आंकड़ा के electrophysiological लक्षण वर्णन। quantifications स्वचालित रूप से प्रदर्शन कर रहे हैं और आगे कोई संपादन की आवश्यकता है। संभावित कार्रवाई दहलीज (धराशायी लाइन -50.5 एम वी) (ए) गणना। एक rheobase वर्तमान (123 PA) को मापने के लिए वर्तमान depolarizing बढ़ रही है। (डी) फायरिंग आवृत्ति करने के लिए रेड लाइन औसत कार्रवाई संभावित आकार है। Hyperpolarizing धाराओं (नीचे) को निष्क्रिय प्रतिक्रिया (ऊपर) (बी) माप। (सी) रिस्पांस इंजेक्शन के वर्तमान के एक समारोह के रूप में, एक बंद लूप दृष्टिकोण का उपयोग मापा जाता है। प्रत्येक ग्रे बिंदु जोड़ी पर स्थित है(वर्तमान, interspike अंतराल के उलटा इंजेक्ट)। सेल के बुनियादी सक्रिय गुण के लाल वक्र डेटा अंक करने के लिए रेखीय फिट है और धराशायी लाइन पैनल (सी) में मापा rheobase इंगित करता है। लगातार झिल्ली समय (43.8 एम एस) (ई) उपाय। (एफ) पहचान सेल एक नियमित रूप से spiking न्यूरॉन है कि पता चलता है और कम से कम अनुकूलन नहीं है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
गतिशील क्लैंप का उपयोग कर गतिविधि की तरह में vivo- चित्रा 2. मनोरंजन। (ए) उत्तेजक के सिमुलेशन (लाल, सेक। 5.1) और निरोधात्मक (नीले, सेक। 5.2) अन्तर्ग्रथन, ग्रे निशान ही प्रयोग के अन्य प्रतीति कर रहे हैं। (बी ) (सी) आकृतियों में प्रयोग (बी) के दौरान। 20 परीक्षण के पार उत्पन्न spikes के (डी) रेखापुंज साजिश न्यूरॉन 23 के रूप में देखा ही इनपुट के जवाब में अत्यंत विश्वसनीय और सटीक हो सकता है कि पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3A


एक नकली निरोधात्मक interneuron के माध्यम से disynaptic निषेध की चित्रा 3. सिमुलेशन रिकॉर्डिंग सेटअप की (ए) योजनाबद्ध:। काले और लाल पिरामिड एक साथ दर्ज की असली पिरामिड कोशिकाओं की एक जोड़ी का प्रतिनिधित्व करते हैं। काले और लाल क्रमशः, presynaptic और postsynaptic न्यूरॉन संकेत मिलता है। नीले वृत्त बदले में लाल पिरामिड सेल को रोकता है, काले पिरामिड सेल द्वारा संपर्क एक आभासी GABAergic interneuron, का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) 90 हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर दिया दालों की एक ट्रेन के लिए असली प्रीसानेप्टिक पिरामिड न्यूरॉन की प्रतिक्रिया, ने संकेत दिया वोल्टेज का पता लगाने के ऊपर नारंगी डैश। वोल्टेज का पता लगाने के नीचे काले डैश बार कार्रवाई क्षमता प्रीसानेप्टिक सेल द्वारा उत्सर्जित कर रहे थे संकेत मिलता है। प्रीसानेप्टिक सेल द्वारा उत्सर्जित spikes के प्रशिक्षित करने के लिए नकली interneuron (सी) रिस्पांस। (डी)नकली interneuron के सक्रियण के जवाब में असली पोस्टअन्तर्ग्रथनी पिरामिड सेल से दर्ज 10 वोल्टेज निशान के superposition। पोस्टअन्तर्ग्रथनी सेल विश्वसनीय वोल्टेज गतिशीलता प्राप्त करने के लिए, जमे हुए इन विवो की तरह पृष्ठभूमि गतिविधि के साथ प्रेरित किया गया था। वोल्टेज निशान से नीचे लाल डैश लगातार ट्रायल के दौरान जिस पर बार, एक संभावित कार्रवाई उत्सर्जित पोस्टअन्तर्ग्रथनी न्यूरॉन्स संकेत मिलता है। परीक्षण के पार एक कम कील घबराना ने संकेत दिया interneuron की सक्रियता के बाद बढ़ा सटीक, ध्यान दें।

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Discussion

इस पाठ वास्तविक समय के कार्यान्वयन के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल में, बंद लूप एकल कक्ष electrophysiological प्रयोगों पैच दबाना तकनीक और LCG नामक एक हाल ही में विकसित सॉफ्टवेयर उपकरण बॉक्स का उपयोग करते हुए बताया गया था। रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता का अनुकूलन करने के लिए यह रिकॉर्डिंग सेटअप ठीक से जमीन मुक्त परिरक्षित और कंपन होना महत्वपूर्ण है कि इस सेल, स्थिर और स्थायी पूरे सेल का उपयोग सुनिश्चित साथ उत्तेजना प्रोटोकॉल के पूरे वर्गों को स्वचालित करने की संभावना के साथ है, जो प्रयोग के throughput को अधिकतम करने के लिए अनुमति देता है।

LCG प्रस्तुत किया गया है लागू किया जा सकता है जिसमें दो मामलों, अर्थात् एक न्यूरॉन की सक्रिय इनपुट, आउटपुट रिश्ते की तेजी अभिकलन सहित अपने electrophysiological गुण (चित्रा 1), के मामले में एक सेल के लक्षण, और इन विवो की तरह का मनोरंजन एक मस्तिष्क टुकड़ा में गतिविधि (चित्रा 2)। सफलताएच अनुप्रयोगों कैसे अलग प्रोटोकॉल का निर्माण करने से पता चला है और LCG के सबसे प्रमुख सुविधाओं में से कुछ पर प्रकाश डाला: अपने कमांड लाइन अंतरफलक प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला के स्वचालित आवेदन सक्षम बनाता है जो पटकथा, के लिए यह अनुकूल बनाता है। चित्रा 1 में किया गया था के रूप में इसके साथ ही, एक प्रोटोकॉल से निकाले मूल्यों बाद प्रोटोकॉल के दर्जी मापदंडों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

यह (जैसे, चित्रा -1 में दिखाया गया के रूप में अपनी तात्कालिक फायरिंग दर,) वास्तविक समय में विश्लेषण के तहत सेल की प्रतिक्रिया के उच्च आदेश सुविधाओं पर नजर रखने और वर्तमान गणना करने के लिए एक पीआईडी ​​नियंत्रक का उपयोग करके उदाहरण के लिए, तदनुसार उत्तेजना को संशोधित करने के लिए संभव है एक निरंतर या समय-बदलती फायरिंग दर बनाए रखने के लिए आवश्यक है।

LCG साथ चालकता और गतिशील दबाना प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन सरल है और केवल एक पाठ विन्यास फाइल लिखने के के उपयोग से स्वचालित किया जा सकता है कि एक प्रक्रिया की आवश्यकता हैimple लिपियों। LCG नई प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल वसीयत करने के लिए परस्पर जा सकता है कि 30 से अधिक संस्थाओं में शामिल हैं। हम फिर भी एक ग्राफिकल प्रयोग लांचर प्रयोगों के शुरू करने और गैर-अनुभवी उपयोगकर्ताओं की अनुमति के द्वारा मानकों को बदलने की सुविधा के लिए डिजाइन किया गया है एक कमांड लाइन इंटरफेस, का उपयोग कर LCG उपयोग LCG अपने स्वयं के चित्रमय इंटरफेस बनाने के लिए आदेश गठबंधन करने के लिए कैसे का वर्णन किया।

RELACS और RTXI: दो मौजूदा toolboxes LCG के समान functionalities के प्रदान करते हैं। पूर्व electrophysiological प्रयोगों का प्रदर्शन करने के लिए और दर्ज आंकड़ों का विश्लेषण करने और टिप्पणी करने के लिए एक मंच के दोनों है। LCG और मौजूदा समाधान के बीच मुख्य अंतर यह है कि एक कमांड लाइन के आधार पर अपने यूजर इंटरफेस है। इस दृष्टिकोण के लाभ कई हैं: सबसे पहले, एक कमांड लाइन इंटरफेस संभवतः जटिल स्क्रिप्ट के माध्यम से मानकीकृत और दोहराव कार्य स्वचालित अनुमति देता है और दूसरी बात, यह कार्यान्वित अधिक जटिल कार्यप्रणाली में प्रयोगात्मक परीक्षण एम्बेड करने की अनुमति देता हैऐसे Matlab या अजगर के रूप में उच्च स्तर पटकथा भाषा में।

सारांश में, LCG की मॉड्यूलर प्रकृति के दो तरीके में उपलब्ध प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की संख्या के विस्तार की अनुमति देता है: पहला और सबसे सीधा एक उपन्यास प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए मौजूदा वस्तुओं का उपयोग करने वाले तदर्थ विन्यास फाइल लिख कर रहा है। C ++ का उपयोग कर - - आगे LCG की क्षमताओं और सुविधाओं का विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि नए प्राथमिक वस्तुओं दूसरा एक को लागू करने से है। उदाहरण इस प्रोटोकॉल चिंता में मस्तिष्क के स्लाइस में व्यक्ति की कोशिकाओं के अध्ययन प्रस्तुत किया। हालांकि, इसी तरह प्रोटोकॉल भी सफलतापूर्वक दोनों intracellular और बाह्य संकेतों रिकॉर्ड करने के लिए, vivo तैयारी में कार्यरत हैं, और उदाहरण के लिए रिकॉर्ड करने के लिए इस तरह के neuronal संस्कृतियों के रूप में पूर्व vivo तैयारी,,, बहु इलेक्ट्रोड सरणियों के माध्यम से कोशिकी क्षमता में closed- में उत्तेजक जबकि किया जा सकता है पाश 4।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue slicer Leica VT-1000S
Pipette puller Sutter P-97
Pipettes WPI 1B150F-4 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament
Vibration isolation table TMC 20 Series
Microscope Leica DMLFS 40X Immersion Objective
Manipulators Scientifica PatchStar
Amplifiers Axon Instruments MultiClamp 700B Computer controlled
Data acquisition card National Instruments PCI-6229 Supported by Comedi Linux Drivers
Desktop computer Dell Optiplex 7010 Tower OS: real-time Linux
Oscilloscopes Tektronix TDS-1002
Perfusion Pump Gibson MINIPULS3 Used with R4 Pump head (F117606)
Temperature controller Multichannel Systems TC02 PH01 Perfusion Cannula
Manometer Testo 510 Optional
Incubator Memmert WB14
NaCl Sigma 71376 ACSF
KCl Sigma P9541 ACSF, ICS
NaH2PO4 Sigma S3139 ACSF
NaHCO3 Sigma S6014 ACSF
CaCl2 Sigma C1016 ACSF
MgCl2 Sigma M8266 ACSF
Glucose Sigma G7528 ACSF
K-Gluconate Sigma G4500 ICS
HEPES Sigma H3375 ICS
Mg-ATP Sigma A9187 ICS
Na2-GTP Sigma 51120 ICS
Na2-Phosphocreatine Sigma P7936 ICS

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References

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वास्तविक समय इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी: जांच Neuronal गतिशीलता और परे करने के लिए बंद लूप प्रोटोकॉल का उपयोग
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