Abstract
实验神经学正在经历的发展和应用新颖的和往往是复杂的，闭环协议，其中的刺激施加实时取决于系统的响应的兴趣增加。最近的应用范围从虚拟现实系统的实施为研究运动 反应无论是在小鼠1和2斑马鱼，以控制使用以下3光遗传学皮质中风发作。闭环技术的关键优点在于，探测更高维属性不能直接访问或依赖于多个变量，如神经元兴奋4和可靠性，而在同一时间最大化实验吞吐量的能力。在这方面的贡献，并在细胞电的情况下，我们将描述如何各种闭环协议适用于锥体皮层神经元，REC响应特性的研究在从幼年大鼠躯体感觉皮层急性脑片膜片钳技术orded细胞内。由于没有市售或开源软件提供了所有必需的用于高效执行这里所描述的实验的特征，开发了一种新的软件工具箱称为LCG 5，其模块化结构最大化的计算机代码的重用，并且容易实现新的实验范例的实施。刺激波形使用的是紧凑元说明中指定和完整实验方案在基于文本的配置文件中描述。此外，LCG具有适合于反复试验和实验规程自动化的命令行界面。
Introduction
近年来，细胞电已从在电压和电流钳实验采用现代闭环协议传统的开环模式演变而来。最有名的闭环技术也许是动态钳6,7，这使合成注射人工电压门控离子通道，以确定神经元膜电压8中的非确定性闪烁的影响的深入研究离子通道在神经反应动力学9，以及娱乐的现实体外接近体内的突触背景活动10。
已经提出的其它闭环范例包括反应性夹具11，以研究在体外自我维持的持久性活动的生成，并且响应夹紧4,12，调查细胞机制底层神经元兴奋。
内容】“>这里，我们描述了允许应用各种闭环电协议中的急性脑切片进行全细胞膜片钳记录的上下文中，功能强大的框架。我们将展示如何通过膜片钳记录装置来记录体膜电压从幼年大鼠的躯体感觉皮层和锥体神经元使用申请LCG，在理论和神经生物学的神经工程实验室开发的一个命令行的软件工具箱三种不同的闭环协议。简要地，所描述的协议中，首先在自动注射的一系列电流钳刺激波，相关的一大组有源和无源膜性能的表征。这些已被建议来捕获的细胞的电生理学表型在其响应性质方面至刻板一系列刺激波形。称为小区的电子代码 （ 例如 ，参见＆＃160; 13,14），电反应这样的集合所使用的几个实验室的它们的电学性能的基础上，以客观地分类的神经元。这包括在固定输入输出传递关系（FI曲线），通过创新的技术，包括通过一个比例 - 积分 - 微分（PID）控制器的装置触发速率的闭环，实时控制的分析的，现实的体内样背景突触活动的第二体外制剂10和，由虚拟GABA能interneuron，这是由计算机模拟的装置在两个同时记录锥体细胞的实时第三人工连接的娱乐。
此外，LCG实现了被称为活跃的补偿电极（AEC）15，它允许使用实现单电极钳动态协议技术。这使得补偿的不良影响（一当它被用于输送细胞内的刺激出现的记录电极的rtifacts）。该方法是基于在记录电路的等效电特性的非参数估计。
在本文中描述的技术和实验方案可以在常规开环电压和电流钳实验可容易地提供，并且可以延伸到其他制剂，如胞外4,16或细胞内记录体内 17,18。设置为全细胞膜片钳电的精心组装是稳定的，高品质的录音非常重要的一步。在下文中，我们假设这样一个实验装置已经提供给实验者，和我们的注意力集中于描述LCG的使用。请读者指出，19-22关于优化和调试的其他提示。
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Protocol
这里描述的协议符合的建议和安特卫普大学生物医学科学系的伦理委员会的指导方针。此协议需要从幼年大鼠的移出脑，由批准人道的安乐死技术得到的制剂的非有情材料。
1，设备的准备
- 安装和配置数据采集和激励机制。
- 使用配有由喜剧作家支持的数据采集（DAQ）卡的个人计算机（PC）的记录信号和模拟控制电压发送到电放大器。
注：喜剧作家是一个Linux模块和库，支持从最常见的厂家众多的数据采集卡：参观http://www.comedi.org了解更多信息。 - 万一一个计算机控制的膜片钳放大器是在使用中，采用一个第二PC机除了一专用于放大器控制。
注意：虽然后者可能运行的常规操作系统，额外的PC将通过一个特殊的操作系统的装置中的实时操作系统。在这些条件下，方便的是使用一个单一的显示器，鼠标和键盘连接于额外的PC，在连接由远程桌面应用程序的专用PC。 - 下载包含一个实时Linux操作系统的LCG的Live CD的ISO映像预装从http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso并刻录在一张空白CD或USB记忆棒“ 。
- 只需将CD插入包含数据采集卡的PC的驱动器，并启动它。另外，来自其在线源代码库运行Linux操作系统（ 例如，Debian的还是Ubuntu）的PC上安装LCG。咨询在线手册上的安装过程的详细信息。该手册可在网上http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf。
- 引导从Live CD：THI旨意自动加载一个完全配置的系统。要做到这一点，将LCG的Live CD放入计算机的CD-ROM驱动器，并从CD引导计算机;选择实时内核（默认选项）只要启动菜单出现，并等待系统初始化。
- 通过键入在命令提示符下校准数据采集卡：
须藤comedi_calibrate
要么
须藤comedi_soft_calibrate
根据数据采集板是否支持硬件或软件校准，分别为（使用命令sudo comedi_board_info获得在董事会的信息）。 - 设置适当的模拟 - 数字和数字 - 模拟转换因子：这需要具有进入蜂窝电放大器的说明书，特别是涉及其规格上其转换系数。
- 使用文本编辑器来指定适当的数值在文件/home/user/.lcg-env，对于环境变量AI_CONVERSION_FACTOR_CC，AI_CONVERSION_FACTOR_VC，AO_CONVERSION_FACTOR_CC，AO_CONVERSION_FACTOR_VC。
注意：这些代表输入（AI）和输出（AO）增益电流钳（CC）和电压钳（VC）的模式，并且由计算机中提供的电压指令和电流或电压之间的转换系数由放大器产生的分别。 - 另外，使用提供（LCG找到的转换因子）的LCG脚本，找他或她的系统的转换系数。
注意：通过计算出的值LCG-找到转换因子是猜测，这在某些情况下需要是数字截断或舍入，以反映转换系数的精确值。 - 使用LCG找到的转换因子，通过连接“细胞模型”与该放大器到相应的探头经常购买的开始。然后，打开您正在运行的Live CD，并在shell提示符下输入以下命令在Linux机器上的终端：
LCG-找到转换因子-I $ HOME / .lcg-ENV -o $ HOME / .lcg-ENV
注：在这两种情况下（ 即 /home/user/.lcg-env或使用的LCG找到的转换因子手动修改），关闭和打开，以使更改生效终端。 - 如果多个的探头的使用，设置转换因子所有通道中的相同的值;如果这是不可能的，请咨询在线LCG手册，以了解如何使用LCG刺激或如何将多个换算系数，以产生更好的满足用户的需求配置文件。
- 使用配有由喜剧作家支持的数据采集（DAQ）卡的个人计算机（PC）的记录信号和模拟控制电压发送到电放大器。
从体感皮层2.准备急性脑片
- 准备电的解决方案。
- 通过混合（以mM计）125氯化钠，2.5氯化钾，制备人工脑脊髓液（ACSF）1.25的NaH 2 PO 4，26的NaHCO 3，25葡萄糖，2的CaCl 2，和1的MgCl 2。制备10倍储备溶液，以减少准备时间上的实验当天。准备2升，其中的一个将被用于制备切片的，另一个用于记录。
- 饱和用95％ 的 O 2和5％的CO 2的ACSF为之前的程序的开头至少30分钟。
- 对于电流钳记录，使用含有（以mM计）的胞内溶液（ICS）115葡萄糖酸钾，20的KCl，10 HEPES，4的ATP的Mg，0.3的Na 2 -GTP，10的Na 2 -phosphocreatine。制备在冰冷溶液中，并事先将其过滤到记录的开始到消除堵塞吸管的风险。
- 大脑提取。
- 麻醉动物放置在动物感应室4％，异氟醚和快速使用断头台或大剪刀杀头的。
- 削减沿中线的皮肤，其滑动至耳根。
- 用细剪刀剪沿中线的头骨。保持刀片尽可能靠近到日E面，以便最小化损坏底层大脑。用镊子打开颅骨，用刮刀切断视神经和脑干，轻轻放下大脑在冰冷的学联。
- 分离小脑和两个半球用手术刀（刀24）。
- 从两个半球中卸下多余的水分和胶水使用一滴强力胶的倾斜平台上。迅速在脑中添加几滴ACSF的，并将其传输到vibratome室。
注意：当制备矢状切片，该平台的角度是非常重要的，以避免在切割过程期间损坏锥体细胞的树突。
- 制备切片。
- 定位在叶片上的大脑，并丢弃所述第一2.5 - 3毫米。调整的速度和频率以限制损坏片的表面，而在同一时间最小化所需的切片过程的时间。
- 设置厚度为300μ米和开始切片。一旦刀片已经过去皮层，用剃刀刀片或弯曲的针，以切割上述海马和在感兴趣的皮层区的边缘。
- 放置在一个多井孵育室的切片保持在32 - 34℃。
- 缩回刀片和重复点2.3.2和2.3.3至5 - 8片切割。最好片通常是那些其中血管平行于表面。
- 孵育切片30分钟后，最后一个切片被放置在腔室中。
从5层锥体神经元3.膜片钳记录
- 将切片录音室中和搜索健康细胞。这些细胞通常具有较低的对比度，平滑的外观和不肿大。
- 检查用40X放大倍率透镜在显微镜下的切片，并搜索细胞层5中，位于约600至1000微米，从大脑的表面。 一旦合适的细胞被发现，使用ICS微量的负荷三分之一，并将其放置在探头。
- 在运行的live CD或预配置的Linux操作系统的个人电脑上，启动命令shell（ 如 bash）的，并在其提示符下键入命令LCG零。这保证了数据采集板被不驱动放大器。
- 申请30 - 50毫巴的正压通过按下一个普通的注射器，通过管道到吸液管保持和，与显微镜的帮助下连接的活塞，将吸管约100微米的片以上。
注：放置吸管的位置，使可直达靶细胞，最好采用显微操作的方法模式。 - 作用在控制电放大器，调整吸移管偏移和输出的测试脉冲（10毫伏）在电压钳模式。
- 通过撤回30毫巴（取决于移液器大小） - 降低压力至10注射器的活塞;轻轻接近细胞并通过观察图像的摄像机监视器上检查一个凹坑的形成。监视测试脉冲，以便随时阻力的增加，通过观看在连接到电放大器，示波器显示的电流波形（或者可以使用命令LCG-密封试验以监测移液器电阻）。
- 释放压力并在必要时施加轻柔负压吸移管，以帮助形成密封时发现的增加吸液管电阻和细胞上的“凹坑”的形成。
- 而密封形式，逐渐减少控股潜力-70毫伏。
- 一旦千兆欧密封已经获得，确保保持电流为0 - 30 PA。施加负压（吸力）来打破隔膜和建立全细胞构型短脉冲。或者，你可以注入电压和强短脉冲（
- 切换到电流钳模式，并验证静息电位是典型的健康细胞。对于使用钾葡糖基溶液皮层锥体神经元，该值通常在-65和-75毫伏。
一个神经元的电响应性能4.半自动表征
- 创建一个目录来存储用户的数据。为了做到这一点的脚本包含在LCG的live CD创建基于日期的文件夹中聘用。在命令提示符下使用它，类型
CD〜/实验
LCG创建-实验文件夹-s PSP，in_vivo_like
这将创造一个为单元格中的数据将被保存的文件夹（和'PSP'和'in_vivo_like“子文件夹），它会打印它的名字到终端窗口;它也可以存储其他信息，例如吸液管电阻和使用该脚本的细胞类型。 - 使用命令将目录更改为新创建的文件夹
CD〜/ <文件夹>
文件夹名称是由命令LCG创建-实验文件夹，将有当天的时间戳（ 即年-月-日）显示的一个，因为在20140331A01。 - 确保该放大器被设置在电流钳模式中操作，该电缆连接和放大器的外部电压指令，如果存在的话，被启用。
- 输入命令LCG-ecodeat命令提示符。这需要一系列命令（即LCG-AP，LCG-VI，LCG斜坡，LCG-tau蛋白和LCG步），用于表征细胞的基本反应特性。 LCG-ECODE要求用户指定两个参数：当前的1毫秒长的脉冲用于诱发单个尖峰在细胞的幅度，和当前柱塞的最大振幅p注入盒，发现其rheobase。
使用以下命令语法：
LCG-ECODE --pulse振幅X --ramp幅度ÿ
同的值X和Y（以pA）在足以使细胞火响应于1毫秒长的脉冲并持续注入电流的，分别的一个的选择。
注意：这些协议需要以使用活动电极补偿（AEC）15执行“电极内核”的数值的估计。嘈杂的电流注入用于估计内核和系统会提示用户确认样本构成的内核数量。对电极内核的意义以及如何选择内核的样本数量的详细信息，请参阅15。
通过模拟突触和模拟体内般的背景活动5.注射电导
- 注射模拟兴奋性突触后电位
- 更改的目录，你会救下的实验，通过在shell命令提示符下键入以下命令：
CD PSP / 01 - 一个LCG配置文件复制到当前目录，并用文本编辑器（纳米在这个例子中）打开它通过键入以下命令在shell命令提示符（此示例配置文件包含在源代码和活CD） ：
CP〜/ local / src目录/ LCG /配置/ epsp.xml
纳米epsp.xml
注意：这是简单地与连接到彼此不同的实体的文本文件。欲了解更多详情，请参阅代表结果部分。 - 如有必要，编辑inputChannel，outputChannel的inputConversionFactor并在此文件中的outputConversionFactor来匹配用户的设置。
- 通过发出COM计算进行有效电极补偿“使用LCG的方法来执行单电极钳动态”所需的电极内核普通话
LCG内核
这将提示在内核的点数。再次，选择使得电极内核覆盖的指数衰减尾部的端部的数量。 - 使用命令执行动态钳实验
LCG-实验-c epsp.xml - 列出的文件和通过使用命令可视化的结果
ls -l命令
LCG积文件-f最后
- 更改的目录，你会救下的实验，通过在shell命令提示符下键入以下命令：
- 注射模拟抑制性突触后电位
- 创建一个文件夹，并通过在shell命令提示符下键入以下命令epsp.xml文件复制到它：
MKDIR ../02
CP epsp.xml ../02/ipsp.xml
CD ../02 - 通过使用文本编辑器编辑配置文件：改变突触逆转潜力和上升和下降时间的模型突触Exp2Synapse常数以下几点：
参数>
<E> -80 </ E>
<tauRise> 0.8E-3 </ tauRise>
<TauDecay> 10E-3 </ tauDecay>
<参数>
退出文本编辑器。 - 计算电极内核和5.1进行实验，通过在shell命令提示符下键入以下命令：
LCG内核
LCG-实验-c ipsp.xml - 列表中的文件和可视化的结果，通过在shell命令提示符下键入以下命令：
ls -l命令
LCG-情节文件-f <filename.h5>
- 创建一个文件夹，并通过在shell命令提示符下键入以下命令epsp.xml文件复制到它：
- 模拟体内样的背景活动：
- 更改为要保存下面的实验，如前所示，通过在shell命令提示符下键入以下命令目录：
CD ../../in_vivo_like/01 - 复制配置文件从LCG源目录，在shell的命令提示符下键入以下命令：
CP〜/ local / src目录/ LCG /配置/ in_vivo_like.xml
纳米in_vivo_like.xml - 调整DAQ配置参数，为用户的设置，如5.1.3节并退出编辑器。
- 计算电极内核和5.1进行实验，通过在shell命令提示符下键入以下命令：
LCG内核
LCG-实验-c in_vivo_like.xml -n 10 -i 3
该'-n 10'和'-i 3'开关指示的刺激应重复10次在3秒的时间间隔。 - 可视化的原始痕迹通过在shell命令提示符下使用以下命令：
LCG积文件-f所有
- 更改为要保存下面的实验，如前所示，通过在shell命令提示符下键入以下命令目录：
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Representative Results
在前面的章节中，我们已经描述了如何使用该软件工具箱LCG表征L5锥体细胞的电生理特性和重新体内样突触活性的切片准备。使用命令行界面和半自动化协议的有利于实验，这可能对所产生的数据的输出和质量有很大的影响的再现性和效率。另外，由于数据被保存在一个一致的方式，很容易扩展分析，以一个特定的目标。 图1示出了一个实验，其中使用六个不同的协议的小区的基本电性能已经表征的典型结果。
测量动作电位的形状和阈值（ 图1A）：一个简短和去极化电流的强脉冲注入到测量平均动作电位形状。穗门槛计算为的动作电位24第三衍生物的第一峰值。电压-电流曲线（ 图1B）的测量：亚阈值电流脉冲被注入细胞，允许被动响应性能如输入电阻和亚阈值的离子电流的表征测定。
测量的最小电流足以引发持续焙烧（ 图1C）。电流的注入斜坡允许细胞作为I型或II型振荡器25的表征。频率电流（FI）曲线（ 图1D）的测定：注入的电流是瞬时点火频率的函数，并且每次更新小区尖峰，使用在5中描述的闭环协议。使用这种技术，可以在不到30秒而获得的FI曲线的可靠估计。在MEMBRAN测量e时代常数（ 图1E）：短超极化电流脉冲被传递到测量膜的被动松弛性能。此脉冲然后被装配到双指数来计算膜的时间常数（44毫秒在这种情况下）。
适应系数和响应于去极化电流（ 图1F）：当前两个超阈值被注入到测量（第一个和最后间穗间隔之间的比例）的适配系数。一系列象描述的那些协议的自动化应用允许表征每个记录单元中的其关键电生理特性方面，并且构成为旨在比较不同神经元类型和它们的作用的任何努力的基本步骤，无论是在健康和疾病。
虽然LCG包含实施专业化协议的几个剧本，大部分功率和工具箱的灵活性居住在能力S按配置文件的装置来描述的实验。在秒。 5，描述如何执行动态钳位到模拟背景活动注入神经元。这里的配置文件和实体的概念被引入。配置文件是简单地包含所有的基本构造块（称为实体 ）所必需的执行给定的实验的名称和互连的文本文件;为此，通过连接实体设计新颖的范例是一个相对容易的任务，因为是共享和重用实验范式。在图2中所示的实验中，五个实体被使用：
H5Recorder：记录所连接的实体的压缩文件。该HDF5文件格式已经被选择，因为它支持大多数编程语言如Python和MATLAB。
RealNeuron：提供了一个抽象层以实时重新的技术方面盘带和注射。它包含关于数据采集板中的信息，并在网上进行主电极的补偿。当动作电位是通过阈值交叉检测，实时神经元也输出在一个事件的形式的尖峰：这可以用于例如监视在实验过程中的燃烧率或人工突触连接。
泊松：产生脉冲序列以下的指数分布的特定速率。这个过程的种子可以是固定的，使得试验能够始终如一地被再现。
SynapticConnection：接收尖峰从发电机和一个给定的延迟之后它们转发到适当的突触。
Exp2Synapse：双指数突触模型。它包含了逆转潜力和上升和衰减时间常数。
如前面提到的，每个实体被连接到一个或多个其他吨Ø撰写实验。在二段中描述的兴奋性突触后电流的仿真的例子。 5.1，两者RealNeuron和Exp2Synapse连接到H5Recorder，保存到文件膜电压和突触电流。泊松实体将在2赫兹到SynapticConnection，这反过来后1毫秒交付事件至Exp2Synapse频率产生尖峰。最后，Exp2Synapse实体被连接到RealNeuron。使用该配置文件的小的变化，如图秒]。 5.2和5.3，可以抑制模拟电流，并重新在体内样活性。
在图2中示出了如何通过动态夹紧结构的装置，可以通过模拟电流感应到一个神经元通过人工突触研究以受控方式突触融合。 图2A（顶）示出单独的突触后电位（顶）连同每次注射ected电流。红（蓝）的痕迹表示兴奋性（抑制）事件。需要注意的是注入的电流是关联到虚拟突触的活化在电导变化的膜电压和的函数。
通过提供泊松脉冲序列在较高频率的突触， 在体内式的背景活动可以模拟（ 图2B和2D）。即使在当大电流注入（黑色迹线在图2B的底部）时，电极活性补偿保证了尖峰形状不受影响（ 图2C），即使单电极用于同时注入电流和尖峰记录膜的电压。重复多个试验具有相同的电导波形允许23的工作延伸到更真实的框架，从而能够分离不同synapti的贡献ç电流的可靠性和精度峰值时。
图3显示了混合网络，通过从两个未连接锥体细胞同时记录和使用虚拟GABA能interneuron模拟disynaptic抑制的形式获得的一个简单的例子，一个普遍的机制，在大脑皮层涉及马丁诺蒂细胞的活化。26， 27 图3A示出的实验装置的示意图：一对真实的，未连接的锥体细胞（黑色和红色三角形）是通过一个模拟的GABA能interneuron人工连接，建模为一个漏水整合和-火神经元。该突触前锥体细胞连接到interneuron显示根据Tsodyks-马克拉姆模型28同突触短期便利实现，而突触连接interneuron和突触后锥体细胞突触是一个双指数突触上升和衰减钛我常数1和10毫秒，分别。
两个连接的权值进行调整以具有在约2的突触后膜电位毫伏。 图3B和3C示出了突触前锥体神经元到90赫兹递送细胞内脉冲序列的响应的偏转，并在模拟相应EPSP的interneuron：突触连接的参数，以具有人工神经发出冲动突触前突发3后调整- 4尖峰在高频率，如报道实验26,29 图3D示出了在disynaptic抑制的效果真正的突触后锥体细胞：10次试验重叠，其中，所述神经元被刺激与冷冻体内样背景类似于图2中描述的一种活性注意的增加可靠性响应于三个抑制IPSPs，反映在抑制性细胞的活化后的小尖峰抖动，通过低于电压痕迹红色虚线所指示的。
图1的电子代码协议对于典型锥体细胞的修补L5锥体神经元输出数字电表征。量词将自动执行，并没有进一步的编辑是必需的。动作电位的阈值（虚线-50.5毫伏）（A）计算。红线是平均动作电位形状。被动应对（上）到超极化电流（底部）（B）测量。（C）响应增加去极化电流测量rheobase电流（123帕）。（D）发射频率作为注入的电流的函数，使用闭环方法测定。每个灰度点位于一对（电流注入，所述峰峰间隔的倒数）。的小区的基本活性性能的红色曲线是线性拟合到数据点和虚线表示在面板（℃）测定的rheobase。（E）测量的膜的时间常数（43.8毫秒）。（F）的识别发现该小区是一个普通的扣球神经元，并且有最小的适应。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.娱乐的接近体内的使用动态钳活动。（A）模拟兴奋性（红，秒5.1）和抑制（蓝色，秒。5.2）突触，灰色的痕迹是相同的实验等的实现。（B ） （B）中底部，对应兴奋（红色），抑制（蓝色）和总（黑）的电流注入到细胞中。尖峰的（C）的形状。（D）的栅格跨越20次试验所产生的尖峰的情节表明，神经元可以非常可靠和精确的响应在23看到了同样的意见。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.通过模拟抑制interneuron模拟disynaptic抑制（一）示意图的录像设置的：黑色和红色金字塔代表一对同时记录真实的锥体细胞。黑色和红色表示突触前和突触后神经元，分别。蓝色圆圈代表一个虚拟GABA能interneuron，由黑色锥体细胞接触，这反过来抑制红色锥体细胞。（B）中的实突触前锥体神经元的响应，在90赫兹的频率传送脉冲串中，由橙色虚线以上的电压跟踪。低于电压跟踪的黑色虚线表示的次动作电位是由突触前细胞射出。模拟interneuron由突触前细胞发射尖峰的列车的（C）的反应。（D）的叠加来自真实突触后锥体细胞响应于模拟interneuron的激活记录，10电压痕迹。突触后细胞受到刺激冷冻体内般的背景活动，获得可靠的电压动态。低于电压痕迹红色虚线表示的次其中，在连续的试验中，所发射的动作电位的突触后神经元。注意interneuron的活化后增加的精度，通过在各试验低级尖峰抖动指示。
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Discussion
在该文本的完整协议的实时实施，闭环单细胞电生理实验进行了说明，使用膜片钳技术和最近开发的软件工具箱称为LCG。要优化录音的质量是至关重要的录音设置正确接地，屏蔽和无振动：这可确保稳定持久的全细胞进入细胞，这与自动化的刺激方案整个路段的可能性在一起允许对实验的吞吐量最大化。
两种情况，即LCG可以应用已经提出，一个单元的即在其电生理特性（ 图1），包括一个神经元的活性输入输出关系的快速计算方面的表征，并在体内样的娱乐在脑切片的活性（ 图2）。 SUC^ h应用程序演示了如何构建不同的协议和强调了LCG的最突出的特点：它的命令行界面使得它适合的脚本，使一系列协议的自动化应用。另外，如已经在图1进行，从一个协议提取的值可以用于后续协议裁缝参数。
能够实时监测被分析的细胞的响应的高阶功能（ 例如 ，它的瞬时燃烧率， 如图1D），并通过使用PID控制器计算当前修改刺激因此，比如以保持恒定或随时间变化的燃烧率必需的。
电导和动态钳位协议与LCG的实现很简单，只需要编写一个文本配置文件，可以通过s的使用情况进行自动化的程序imple脚本。 LCG包括可以相互连接以制定新的实验方案30的实体。我们描述了如何使用LCG使用命令行界面，但是图形试验发射已被设计为便于起动试验，通过让非经验的用户更改参数组合LCG命令来创建自己的图形界面。
现有两个工具箱提供类似于LCG功能：RELACS和RTXI。前者是既用于进行电生理实验和用于分析和注释所记录的数据的平台。 LCG和现有的解决方案之间的主要区别是其基于命令行用户界面。这种方法的优点有几个：首先，一个命令行界面允许通过的可能是复杂的脚本自动化手段和标准化重复的任务;其次，它允许嵌入实验性试验为实现更复杂的工作流程在高层次的脚本语言，如Matlab或Python。
综上所述，LCG的模块化特性允许扩大在两个方面现有的实验协议的数量：第一，最简单的一种是通过编写使用现有的对象执行新的协议特设的配置文件。第二个是通过实施 - 使用C ++ - 可用于进一步扩大LCG的功能和特性的新的基本对象。这些示例介绍了该协议的关注单个细胞在大脑切片的研究。然而，类似的协议，也可以成功地用于体内制剂中，记录细胞内和细胞外信号，并在体外制剂，如神经元培养物，来记录，例如，通过多电极阵列外电位而在闭环刺激环4。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
References
- Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
- Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
- Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
- Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
- Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
- Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
- White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
- Destexhe, a, Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
- Fellous, J. -M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
- Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
- Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
- Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
- Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
- Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
- Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
- Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , (1995).
- Molleman, A. Patch Clamping. , John Wile., & Sons, Ltd. Chichester, UK. (2002).
- Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
- Gold, R. The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
- Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).
- Koch, C., Segev, I. Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , MIT Press. Cambridge, MA, USA. (1988).
- Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
- Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
- Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).
