Abstract
Eksperimentel neurovidenskab er vidne til en øget interesse for udvikling og anvendelse af nye og ofte komplekse, lukkede kredsløb protokoller, hvor stimulus anvendte afhænger i real-tid på respons af systemet. Seneste applikationer spænder fra gennemførelsen af virtual reality-systemer til at studere motoriske respons både mus 1 og i zebrafisk 2, til at kontrollere anfald efter kortikal slagtilfælde hjælp optogenetics 3. En væsentlig fordel ved lukkede kredsløb teknikker ligger i evnen til sondering højere dimensionelle egenskaber, som ikke er direkte tilgængelige eller som er afhængige af flere variabler, såsom neuronal excitabilitet 4 og pålidelighed, mens på samme tid at maksimere den eksperimentelle gennemløb. I dette bidrag og i forbindelse med cellulære elektrofysiologi, beskriver vi, hvordan man anvender en række lukkede kredsløb protokoller til studiet af respons egenskaber af pyramideformede kortikale neuroner, recbestilte intracellulært med patch clamp-teknik i akutte hjernen skiver fra somatosensoriske cortex af unge rotter. Da der ikke kommercielt tilgængelige eller open source-software indeholder alle de funktioner, der kræves for effektivt at udføre forsøgene beskrevet her blev en ny software værktøjskasse kaldet LCG 5 udviklet, hvis modulære opbygning maksimerer genbrug af computer-kode og letter gennemførelsen af nye eksperimentelle paradigmer. Stimulation kurveformer angives ved hjælp af et kompakt meta-beskrivelse og fuld forsøgsprotokoller er beskrevet i tekstbaserede konfigurationsfiler. Derudover LCG har en kommando-line interface, der er velegnet til gentagelse af forsøg, og automatisering af forsøgsprotokoller.
Introduction
I de senere år har cellulær elektrofysiologi udviklet sig fra den traditionelle åben sløjfe paradigme anvendes i spænding og strøm clamp-forsøg til moderne lukkede kredsløb protokoller. Den bedst kendte lukkede kredsløb teknik er måske den dynamiske klemme 6,7, hvilket gjorde det muligt for syntetiske injektion af kunstige spændingsafhængige ionkanaler at bestemme den neuronale membran spænding 8, den tilbundsgående undersøgelse af virkningerne af ikke-deterministisk flimmer på ionkanaler på neuronale respons dynamik 9, samt rekreation in vitro af realistiske i vivo- ligesom synaptisk baggrund aktivitet 10.
Andre lukkede kredsløb paradigmer, der er blevet foreslået omfatter den reaktive klemme 11, for at studere in vitro generering af selvbærende vedvarende aktivitet, og svaret klemme 4,12, til at undersøge de cellulære mekanismer underliggende neuronal uro.
Indholdsproduktion "> Her beskriver vi en kraftig ramme, der tillader anvendelse af en bred vifte af lukkede elektrofysiologiske protokoller i forbindelse med hel-celle patch clamp optagelser udført i akutte hjernen skiver. Vi viser hvordan man optager membran spænding somatisk ved hjælp af patch clamp optagelser i pyramideformede neuroner fra somatosensoriske cortex af unge rotter og anvende tre forskellige lukkede kredsløb protokoller bruger LCG, en kommando-linje-baseret software værktøjskasse udviklet i laboratoriet af Teoretisk neurobiologi og Neuroengineering.Kort fortalt de beskrevne protokoller er først automatiseret injektion af en række aktuelle klemme stimulus kurveformer, der er relevante for karakterisering af et stort sæt egenskaber aktive og passive membran. Disse er blevet foreslået at fange den elektrofysiologiske fænotype af en celle med hensyn til dets respons egenskaber til en stereotyp serie af stimulus bølgeformer. Kendt som e-koden af en celle (f.eks, se & #160; 13,14), er en sådan samling af elektriske reaktioner, der anvendes af flere laboratorier for objektivt klassificere neuroner på grundlag af deres elektriske egenskaber. Dette omfatter en analyse af den stationære input-output transfer forhold (FI kurve), som en innovativ teknik, der involverer lukket kredsløb, real-time kontrol af satsen for fyring ved hjælp af en proportional-integral-derivat (PID) controller andet genskabelse af realistiske in vivo-lignende baggrund synaptisk aktivitet i in vitro præparater 10 og for det tredje den kunstige forbindelse i realtid af to samtidigt konstateret pyramideformede neuroner ved hjælp af en virtuel GABAerg interneuron, der simuleres ved computeren.
Derudover LCG gennemfører teknik kendt som aktive elektrode Compensation (AEC) 15, som tillader gennemførelsen af dynamiske clamp-protokoller under anvendelse af en enkelt elektrode. Dette gør det muligt at kompensere uønskede virkninger (artifacts) af optagelsen elektrode, der opstår, når det anvendes til at levere intracellulære stimuli. Fremgangsmåden er baseret på en ikke-parametrisk skøn over de tilsvarende elektriske egenskaber af optagelsen kredsløb.
De teknikker og eksperimentelle protokoller, der er beskrevet i dette papir kan let anvendes i konventionel åben sløjfe spænding og nuværende clamp-forsøg, og kan udvides til andre præparater, såsom ekstracellulær 4,16 eller intracellulære optagelser in vivo 17,18. Den omhyggelige samling af opsætningen for hele celle patch clamp elektrofysiologi er et meget vigtigt skridt for en stabil, høj kvalitet optagelser. I det følgende antager vi, at en sådan forsøgsopstilling er allerede tilgængelig for forsøgslederen, og fokusere vores opmærksomhed på at beskrive brugen af LCG. Læseren bliver peget på 19-22 for yderligere tips om optimering og debugging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den her beskrevne protokol følger anbefalingerne og retningslinjer for den etiske komité for Biomedicinsk Institut ved universitetet i Antwerpen. Denne protokol skal der udarbejdes ikke-sansende materiale fra eksplanterede hjerne af unge Wistar rotter opnås ved godkendte humane eutanasi teknikker.
1. Udstyr Forberedelse
- Installere og konfigurere erhvervelse data og stimulering system.
- Brug en personlig computer (PC) er udstyret med en dataopsamling (DAQ) kort understøttes af Comedi at registrere signaler og sende analoge styrespændinger til elektrofysiologiske forstærker.
BEMÆRK: Comedi er en Linux-modul og bibliotek, som understøtter et væld af DAQ kort fra de mest almindelige producenter: besøg http://www.comedi.org for mere information. - I tilfælde en computerstyret patch clamp-forstærker er i brug, anvender en anden pc foruden en dedikeret til forstærkerenkontrol.
BEMÆRK: Mens sidstnævnte kan løbe et konventionelt styresystem, vil den ekstra PC være i drift i realtid ved hjælp af et specielt operativsystem. Under disse betingelser, er det praktisk at bruge en enkelt skærm, mus og tastatur er knyttet til den ekstra pc, mens du tilslutter med en remote desktop applikation til den dedikerede PC. - Download ISO image af Live CD med en real-time Linux operativsystem med LCG forudinstalleret fra http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso og brænde det på en tom cd eller USB-stick " .
- Du skal blot indsætte cd'en i drevet på pc'en, som indeholder DAQ-kortet og starte den. Alternativt installere LCG fra dens online-kilde repository på en pc med Linux operativsystemet (f.eks Debian eller Ubuntu). Konsultere online manual for detaljer om installationen. Manualen er tilgængelig online på http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf.
- Boot fra live-cd: this vil automatisk indlæse en fuldt konfigureret system. For at gøre dette, skal du placere LCG Live CD'en i computerens cd-rom-drev, og start computeren fra cd; vælg realtid kerne (standard option), så snart startmenuen vises, og vent på, at systemet initialiseres.
- Kalibrere DAQ-kortet ved at skrive ved kommandoprompten:
sudo comedi_calibrate
eller
sudo comedi_soft_calibrate
afhængig af om data-erhvervelse bord understøtter hardware eller software kalibrering henholdsvis (brug kommandoen sudo comedi_board_info at indhente oplysninger på tavlen). - Indstil den passende analog-til-digital og digital-til-analog omregningsfaktorer: det kræver at have adgang til den manuelle af den cellulære elektrofysiologisk forstærker, og især dens specifikationer på sine omregningsfaktorer.
- Brug en teksteditor til at angive de relevante numeriske værdier i filen /home/user/.lcg-env for de miljøvariabler AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
BEMÆRK: Disse repræsenterer input (AI) og output (AO) gevinster for strømtang (CC) og spænding clamp (VC) tilstande, og de omregningsfaktorer mellem spænding kommandoer, som computeren, og den nuværende eller spænding genereres af forstærkeren henholdsvis. - Alternativt kan du bruge LCG script forudsat (LCG-find-konvertering-faktorer), for at finde de omregningsfaktorer i hans eller hendes system.
BEMÆRK: De beregnede af værdier LCG-find-konvertering-faktorer er gæt, som i nogle tilfælde er forpligtet til at være numerisk afkortet eller afrundede at afspejle de nøjagtige værdier af de omregningsfaktorer. - At bruge LCG-find-konvertering-faktorer, starte ved at forbinde den "model celle", der ofte købes med forstærkeren til den tilsvarende hovedtrin. Derefter åbner en terminal på Linux maskine, hvor du kører Live CD og indtast følgende kommando ved shell prompt:
lcg-find-konvertering-faktorer -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env
BEMÆRK: I begge tilfælde (dvs. manuel ændring af /home/user/.lcg-env eller brug af LCG-find-konvertering-faktorer), lukke og åbne terminalen for at ændringerne kan træde i kraft. - Hvis der anvendes flere headstages, indstille omregningsfaktorer til de samme værdier i alle kanaler; hvis dette ikke er muligt, konsultere LCG online manual til at forstå, hvordan man bruge flere omregningsfaktorer i LCG-stimulus eller hvordan man producerer konfigurationsfiler, der bedre passer til brugerens behov.
- Brug en personlig computer (PC) er udstyret med en dataopsamling (DAQ) kort understøttes af Comedi at registrere signaler og sende analoge styrespændinger til elektrofysiologiske forstærker.
2. Udarbejdelse af akut Brain Skiver fra Somatosensory Cortex
- Udarbejdelse af løsninger til elektrofysiologi.
- Forbered Kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) ved blanding (i mM) 125 NaCl, 2,5 KCI, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 25 glucose, 2 CaCl2, og 1 MgCl2. Forbered 10x stamopløsninger at reducereforberedelsestid på dagen for forsøget. Forbered 2 L, hvoraf en vil blive anvendt til fremstilling af skiver, og den anden til optagelse.
- Mætte ACSF med 95% O2 og 5% CO2 i mindst 30 minutter før begyndelsen af proceduren.
- For nuværende clamp optagelser, skal du bruge en intracellulær løsning (ICS), der indeholder (i mM) 115 K-gluconat, 20 KCI, 10 HEPES, 4 ATP-mg, 0,3 Na 2 GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Fremstilling af opløsningen i is, og filtrere det før begyndelsen af optagelserne at fjerne risikoen for tilstopning af pipetten.
- Hjerne ekstraktion.
- Bedøver dyret anbringe dyret i en induktion kammer med 4% isofluran og hurtigt halshugge det ved hjælp af en guillotine eller store saks.
- Skær huden langs midterlinjen, og skub det til ørerne.
- Ved hjælp af en fin saks klippe kraniet langs midterlinjen. Hold kniven så tæt som muligt til the overflade for at minimere skade på underliggende hjerne. Åbn kraniet med en pincet, så brug en spatel til at skille synsnerven og hjernestammen og forsigtigt slippe hjernen i iskoldt ACSF.
- Adskil cerebellum og de to halvdele med en skalpel (blad 24).
- Fjerne overskydende vand fra en af de to halvkugler og lim det på en hældende platform ved hjælp af en dråbe superlim. Hurtigt tilføje et par dråber ACSF over hjernen og overføre den til vibratome kammer.
BEMÆRK: Ved udarbejdelsen sagittale skiver, vinklen på platformen er vigtigt at undgå at beskadige dendritter af pyramideceller under udskæring procedure.
- Fremstilling af skiver.
- Placer bladet over hjernen og kassere den første 2,5-3 mm. Justere hastigheden og frekvens at skader på overfladen af den skive, mens på samme tid minimerer den tid, der kræves til udskæring procedure.
- Indstil tykkelse til 300 μm og begynde udskæring. Hvis kniven er gået forbi cortex, bruge et barberblad eller en bøjet nål til at skære over hippocampus og ved kanterne af den kortikale område af interesse.
- Læg skiverne i en multi-brønds inkubation kammer holdt ved 32-34 ° C.
- Træk kniven og gentag punkt 2.3.2 og 2.3.3, indtil 5-8 skiver skæres. De bedste skiver er som regel dem, hvor blodkarrene er parallelle med overfladen.
- Inkubér udsnit til 30 minutter efter den sidste skive er placeret i kammeret.
3. Patch-clamp Optagelser fra Lag 5 pyramideneuroner
- Placer en skive i optagelsen kammer og søge efter sunde celler. Disse celler normalt har lavere kontrast, et glat udseende og er ikke hævede.
- Inspicere skive under mikroskopet med 40X forstørrelse linse og søge efter celler i laget 5, placeret ca. 600 til 1.000 um fra overfladen af hjernen. Når en passende celle er fundet, belastning en tredjedel af mikropipette med ICS og placere den i hovedtrin.
- På den personlige computer, der kører live-cd eller forudkonfigureret Linux operativsystem, starte en kommando shell (f.eks bash), og ved sin hurtige type, kommandoen LCG-nul. Dette sikrer, at DAQ board ikke kører forstærkeren.
- Påfør 30-50 mbar af positivt tryk ved at trykke på stemplet af en fælles sprøjte, forbundet med slangen til pipetten holder og med hjælp af mikroskopet, placere pipetten ca. 100 um over udsnittet.
BEMÆRK: Placer pipette i en position, der giver mulighed for en direkte rute til målcellen, fortrinsvis efter det tilgang tilstanden af mikromanipulator. - Handler på kontrollerne i elektrofysiologi forstærker, justere pipetten offset og output en test puls (10 mV) i spænding clamp-mode.
- Reducere trykket til 10-30 mbar (afhængig af pipette størrelse) ved at trækkestempel af sprøjten; forsigtigt nærmer cellen og tjekke for dannelsen af en smilehul ved at observere billedet på videokameraet skærm. Overvåg testen puls for en stigning i resistens på alle tidspunkter, ved at se strømbølge vises på oscilloskopet forbundet til elektrofysiologi forstærkeren (alternativt kan bruge kommandoen LCG-seal-test til kontrol pipette resistens).
- Slip trykket og om nødvendigt forsigtigt undertryk til pipetten til at hjælpe segl dannelse, når du bemærker en forøgelse i pipette modstand og dannelsen af en "smilehul" på cellen.
- Mens tætningselementerne former, gradvist at reducere den holdepotentiale til -70 mV.
- Når først en gigaohm forsegling er opnået, at den bedrift nuværende er mellem 0-30 pA. Anvende korte pulser af undertryk (sugning) for at bryde membranen og etablere helcelle-konfiguration. Alternativt kan du injicere stærke og korte pulser af spænding (
- Skift til strømtang tilstand og kontroller, at potentialet den hvilende membran er typisk for en sund celle. For kortikale pyramideneuroner ved hjælp af en kalium-gluconat-baseret løsning, denne værdi er normalt mellem -65 og -75 mV.
4. Halvautomatisk karakterisering af en neuron elektriske egenskaber Respons
- Opret en mappe til at gemme brugerens data. For at gøre dette ansættelse et script inkluderet i LCG live-cd, der skaber mapper baseret på den dato. For at bruge den, skriv ved kommandoprompten
cd ~ / eksperimenter
LCG-oprette-eksperiment-mappe -s psp, in_vivo_like
Dette vil oprette en mappe, hvor data for denne celle vil blive gemt (og en "psp" og "in_vivo_like" undermapper), og det vil udskrive navn til terminalenVinduet; er det også muligt at lagre yderligere oplysninger, såsom pipette modstand og celletype ved hjælp af denne script. - Skift bibliotek til den nyoprettede mappe ved hjælp af kommandoen
cd ~ / <mappenavn>
Mappenavnet er den ene, der vises af kommandoen LCG-oprette-eksperiment-mappe og vil have tidsstemplet for den aktuelle dag (dvs. år-måneder-dag), som i 20140331A01. - Sørg for, at forstærkeren er indstillet til at fungere i strømtang tilstand, at kablerne er tilsluttet, og den eksterne spænding kommandoen af forstærkeren, hvis den findes, er aktiveret.
- Indtast kommandoen LCG-ecodeat kommandoprompten. Dette kræver en række kommandoer (nemlig LCG-ap, LCG-vi, LCG-rampe, LCG-tau og LCG-trin), der anvendes til at karakterisere grundlæggende respons egenskaber af cellen. LCG-ecode kræver, at brugeren angive to parametre: amplituden af 1 ms lange impuls af strøm anvendes til at fremkalde en enkelt spike i cellen, og den maksimale amplitude af den nuværende ramp injiceret ind i cellen for at finde sin rheobase.
Brug følgende kommando syntaks:
LCG-ecode --pulse-amplitude X --ramp-amplitude Y
med et udvalg af de værdier X og Y (i Pa), der er tilstrækkeligt til at gøre cellen brand i respons på en 1 ms lang puls og en vedvarende tilførsel af strøm, hhv.
BEMÆRK: Disse protokoller kræver udfører den numeriske skøn over "elektrode kerne" for at bruge den aktive elektrode Compensation (AEC) 15. En larmende strøm injektion bruges til at estimere kernen og brugeren bliver bedt om at bekræfte antallet af prøver, der udgør kernen. Se 15 for nærmere oplysninger om betydningen af elektroden kerne og hvordan du vælger antallet af kerne prøver.
5. Injektion af Ledningsevne gennem Simulerede Synapser og Simulering af In Vivo -lignende Baggrund Activity
- Injektion af simulerede excitatoriske postsynaptiske potentialer
- Skift til det bibliotek, hvor du vil spare den næste eksperiment, ved at skrive følgende kommando i kommandoprompten af skallen:
cd psp / 01 - Kopiere en LCG konfigurationsfil til den aktuelle mappe og åbne den med en teksteditor (Nano i dette eksempel) ved at skrive følgende kommandoer ved kommandoprompten af skallen (dette eksempel konfigurationsfil er inkluderet i kildekoden og live cd) :
cp ~ / local / src / LCG / konfigurationer / epsp.xml
nano epsp.xml
BEMÆRK: Denne er simpelthen en tekstfil med forskellige enheder er forbundet med hinanden. For flere detaljer se repræsentant afsnittet Resultater. - Hvis det er nødvendigt redigere til inputChannel, outputChannel den inputConversionFactor og outputConversionFactor i denne fil matcher brugerens opsætning.
- Beregn elektroden kerne er nødvendig for at udføre den aktive elektrode kompensation «den metode, som LCG at udføre enkelt elektrode dynamisk klemme" ved udstedelse af command
LCG-kernel
Dette vil bede for antallet af punkter i kernen. Igen, vælge et nummer, således at elektroden kerne dækker enden af den eksponentielle henfald hale. - Udfør den dynamiske clamp eksperiment ved hjælp af kommandoen
LCG-eksperimentere -c epsp.xml - Liste filerne og visualisere resultaterne ved hjælp af kommandoen
ls -l
LCG-plot-fil -f sidste
- Skift til det bibliotek, hvor du vil spare den næste eksperiment, ved at skrive følgende kommando i kommandoprompten af skallen:
- Injektion af simulerede inhibitoriske postsynaptiske potentialer
- Opret en mappe og kopiere epsp.xml filen til den ved at skrive følgende kommandoer ved kommandoprompten af skallen:
mkdir ../02
cp epsp.xml ../02/ipsp.xml
cd ../02 - Redigere konfigurationsfilen ved hjælp af en teksteditor: ændre den synaptiske vending potentiale og stige og forfald tid konstanter i modellen synapse Exp2Synapse til følgende:
parametre>
<E> -80 </ E>
<TauRise> 0.8e-3 </ tauRise>
<TauDecay> 10e-3 </ tauDecay>
<parametre>
Afslut teksteditor. - Beregn elektroden kerne og udføre eksperimentet som i 5.1, ved at skrive følgende kommandoer ved kommandoprompten af skallen:
LCG-kernel
LCG-eksperimentere -c ipsp.xml - Liste filerne og visualisere resultaterne, ved at skrive følgende kommandoer ved kommandoprompten af skallen:
ls -l
LCG-plot-fil -f <filename.h5>
- Opret en mappe og kopiere epsp.xml filen til den ved at skrive følgende kommandoer ved kommandoprompten af skallen:
- Simulering af in vivo-lignende baggrund aktivitet:
- Skift til det bibliotek, hvor du vil gemme det følgende eksperiment, som tidligere vist, ved at skrive følgende kommandoer ved kommandoprompten af skallen:
cd ../../in_vivo_like/01 - Kopier konfigurationsfilen fra LCG kilde mappe, ved at skrive følgende kommandoer ved kommandoprompten af skallen:
cp ~ / local / src / LCG / konfigurationer / in_vivo_like.xml
nano in_vivo_like.xml - Juster DAQ konfigurationsparametre for brugerens opsætning, som beskrevet i 5.1.3 og forlade editoren.
- Beregn elektroden kerne og udføre eksperimentet som i 5.1, ved at skrive følgende kommandoer ved kommandoprompten af skallen:
LCG-kernel
LCG-eksperimentere -c in_vivo_like.xml -n 10 -i 3
De "-n 10" og "-i 3'switches viser, at stimuleringen bør gentages 10 gange med intervaller på tre sek. - Visualiser de rå spor ved at bruge følgende kommando ved kommandoprompten af skallen:
LCG-plot-fil -f alle
- Skift til det bibliotek, hvor du vil gemme det følgende eksperiment, som tidligere vist, ved at skrive følgende kommandoer ved kommandoprompten af skallen:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I de foregående afsnit har vi beskrevet, hvordan at bruge softwaren værktøjskassen LCG at karakterisere de elektrofysiologiske egenskaber af L5 pyramideformede celler og til at genskabe in vivo-lignende synaptisk aktivitet i en skive forberedelse. Brugen af en kommando-line interface og semi-automatiske protokol favoriserer reproducerbarhed og effektivitet af forsøget, som kan have en stor indflydelse på produktionen og kvaliteten af de producerede data. Derudover, da dataene er gemt på en ensartet måde, er det let at udvide analysen til et bestemt mål. Figur 1 viser den typiske resultat af et eksperiment, hvor grundlæggende elektrofysiologiske egenskaber for en celle ved hjælp af seks forskellige protokoller er blevet karakteriseret.
Måling af aktionspotentialet form og tærskel (figur 1A): en kort og stærk puls af depolariserende strøm injiceres at måle den gennemsnitlige aktionspotentiale form. Piggen tærskel erberegnet som den første top af den tredje derivat af aktionspotentialet 24. Måling af spænding-strøm kurve (figur 1 B): sub-tærskel strømimpulser injiceres ind i cellen, således at målingen af passive respons egenskaber såsom input modstand og karakterisering af sub-tærskel ionstrømme.
Måling af den minimale strøm tilstrækkelig til at fremkalde langvarig fyring (figur 1C). Den injicerede rampe af strøm giver mulighed for karakterisering af cellen som en type I eller type II oscillator 25. Måling af frekvens-strøm (FI) kurve (figur 1 D): den injicerede strøm er en funktion af den øjeblikkelige fyring frekvens og opdateres hver gang cellen pigge, ved hjælp af den lukkede kredsløb protokollen beskrevet i 5. Med denne teknik, kan en pålidelig estimering af FO-kurven opnås i mindre end 30 sek. Måling af membrane tidskonstant (figur 1E): en kort hyperpolarisering strømimpuls leveres til måling af de passive afslapning egenskaber af membranen. Denne puls er derefter egnet til en dobbelt eksponentialfunktion at beregne membranens tidskonstant (44 ms i dette tilfælde).
Tilpasning koefficient og reaktion på depolariserende strøm (figur 1F): to overnationale tærskelværdier for strøm injiceres at måle tilpasningen koefficient (forholdet mellem første og sidste inter-spike intervaller). Den automatiserede anvendelse af en række protokoller som dem, der er beskrevet tillader karakteriserer hver indspillet celle i form af sine vigtigste elektrofysiologiske egenskaber og udgør det grundlæggende skridt for enhver indsats rettet mod at sammenligne forskellige neuron typer og deres rolle, både i sundhed og sygdom.
Selvom LCG indeholder flere scripts, der gennemfører specialiserede protokoller, det meste af styrken og fleksibiliteten i værktøjskassen bosats i evnen til at beskrive eksperimenter ved hjælp af konfigurationsfiler. I Sec. 5 er det beskrevet, hvordan du udfører dynamisk klemme at injicere simuleret baggrund aktivitet ind i neuron. Her introduceres begrebet konfigurationsfiler og enheder. En konfigurationsfil er simpelthen en tekstfil med navne og sammenkoblinger på alle de grundlæggende byggesten (kaldet enheder), der er nødvendige for at udføre en given eksperiment; af denne grund, at designe nye paradigmer ved at forbinde enheder er en forholdsvis nem opgave, som er at dele og genbruge eksperimentelle paradigmer. I eksperimentet vist i figur 2, er fem enheder anvendes:
H5Recorder: registrerer de tilsluttede enheder til en komprimeret fil. Den HDF5 filformat er valgt, da det er støttet af de fleste programmeringssprog såsom Python og MATLAB.
RealNeuron: giver en abstraktion lag til det tekniske aspekt af real-time reCording og injektion. Den indeholder oplysninger om datafangst bord og udfører den aktive elektrode kompensation online. Når et aktionspotentiale detekteres af tærskelkrydsningshøjde, Fast Neuron udsender også en stigning i form af en begivenhed: dette kan bruges for eksempel til at overvåge afbrændingstakten under eksperimentet eller at interface med kunstige synapser.
Poisson: genererer spike tog efter en eksponentiel fordeling med en bestemt hastighed. Frøet af denne proces kan fastsættes således, at forsøg kan reproduceres konsekvent.
SynapticConnection: modtager spidserne fra generatoren og relæer dem til den relevante synapse efter en given forsinkelse.
Exp2Synapse: model af en dobbelt eksponentiel synapse. Den indeholder tilbageførsel potentiale og stigningen og henfald tidskonstanter.
Som tidligere nævnt, er hver enhed forbundet til en eller flere andre to komponere et eksperiment. I eksemplet med simulering af en excitatorisk postsynaptisk strøm beskrevet i kap. 5.1, både RealNeuron og Exp2Synapse er forbundet til H5Recorder, for at spare at indgive membran spænding og synaptisk strøm hhv. Poisson enhed leverer pigge genereret ved en frekvens på 2 Hz til SynapticConnection, som igen leverer begivenheder til Exp2Synapse efter 1 ms. Endelig er Exp2Synapse enhed forbundet til RealNeuron. Ved hjælp af små variationer af denne konfigurationsfil, som vist i Sek. 5.2 og 5.3, kan man simulere hæmmende strømninger og genskabe in vivo-lignende aktivitet.
I figur 2 er det vist, hvordan man ved hjælp af en dynamisk klemme konfiguration kan man studere synaptisk integration på en kontrolleret måde ved at simulere den inducerede strøm i en neuron med kunstige synapser. Figur 2A (øverst) viser individuelle postsynaptiske potentialer (top ) sammen med det injected strømninger. Rød (blå) spor betegne excitatoriske (hæmmende) hændelser. Bemærk, at den injicerede strøm er en funktion af membranens spænding og af ændringen i ledningsevne associeret med aktiveringen af den virtuelle synapse.
Ved at levere Poisson spike tog ved højere frekvenser til de synapser, kan in vivo-lignende baggrund aktivitet simuleres (figur 2B og 2D). Selv under spiking når store strømme injiceret (sorte spor i bunden af figur 2B), den aktive elektrode Compensation garanterer, at formen af piggene ikke påvirkes (figur 2C), selv om en enkelt elektrode anvendes til samtidigt at injicere strøm og optage membranen spænding. Gentagelse af flere forsøg med de samme konduktans waveforms tillader at udvide arbejdet i 23 til en mere realistisk ramme, der gør det muligt at adskille bidragene fra forskellige synaptic strømme til pålidelighed og præcision af spike timing.
Figur 3 viser et simpelt eksempel på hybrid netværk, ved at registrere samtidig fra to uforbundne pyramideformede celler og ved hjælp af en virtuel GABAerg interneuron at simulere en form for disynaptic inhibering, en udbredt mekanisme, i hjernebarken involverer aktiveringen af Martinotti celler. 26, 27 Figur 3A viser en skematisk af forsøgsopstillingen: et par virkelige, usammenhængende pyramideformede celler (sorte og røde trekanter) er kunstigt forbundet gennem en simuleret GABAerge interneuron, modelleret som en utæt integrere-og-brand neuron. Synapsen, der forbinder præsynaptiske pyramideformede celle til interneuron displays homosynaptic kortsigtet lettelse gennemføres i henhold til den Tsodyks-Markram model 28, mens synapsen forbinder interneuron og den postsynaptiske pyramideformede celle er en bieksponentiel synapse med stige og forfald timig konstanter af 1 og 10 ms, hhv.
Vægten af begge forbindelser blev justeret til at have en afbøjning i den postsynaptiske potentiale på ca. 2 membran mV. Figur 3B og 3C viser responset af den præsynaptiske neuron pyramideformede til et tog af intracellulære afgivne pulser ved 90 Hz, og de tilsvarende EPSP'er i den simulerede interneuron:. parametrene for den synaptiske forbindelse blev justeret for at få den kunstige neuron udsender et spyd efter en præsynaptisk burst af 3 - 4 spikes ved høj frekvens, som rapporteret eksperimentelt 26,29 figur 3D viser virkningen af den disynaptic inhibering på den virkelige postsynaptiske pyramideformede celle:. 10 forsøg overlejres, hvori neuron stimuleres med frossen in vivo-lignende baggrund aktivitet svarende til den, der er beskrevet i figur 2 Bemærk stigningen i pålidelighed som svar på de tre inhibitoriske IPSPs,afspejlet i den mindre spike jitter efter aktiveringen af den inhiberende celle, som angivet ved de røde streger nedenfor spændingen spor.
Figur 1. Elektrofysiologiske karakterisering af en patched L5 Pyramidal neuron Output figur af e-koden protokol for en typisk pyramideformet celle.; kvantificeringer udføres automatisk, og ingen yderligere redigering er påkrævet. (A) Beregning af handling potentiale tærskel (stiplet linie -50,5 mV). Røde linje er den gennemsnitlige aktionspotentiale form. (B) Måling af passiv respons (øverst) til hyperpolarisering strømme (nederst). (C) Reaktion i stigende depolariserende strøm til at måle rheobase strøm (123 Pa). (D) Firing frekvens som en funktion af det injicerede strøm, målt ved anvendelse af et lukket kredsløb tilgang. Hvert gråpunktet er placeret på parret(Nuværende injiceres, inverse af interspike interval). Den røde kurve er lineær tilpasning til datapunkterne, og den stiplede linje indikerer rheobase målt i panel (C). (E) Foranstaltning af membranen tidskonstant (43,8 ms). (F) Identifikation af basiske aktive egenskaber af cellen afslører, at cellen er en regelmæssig spiking neuron, og at der er minimal tilpasning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Genskabelse af i vivo- lignende aktivitet under anvendelse af dynamisk klemme. (A) Simulering af excitatoriske (rød, Sec. 5.1) og inhiberende (blå, Sec. 5.2) synapser, grå spor er andre realiseringer af det samme forsøg. (B ) (C) Former af piggene under eksperimentet i (B). (D) Raster plot af piggene genereret tværs 20 forsøg viser, at neuron kan være ekstremt pålidelige og præcise svar på det samme input som ses i 23. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Simulering af disynaptic hæmning via en simuleret hæmmende interneuron (A) Skematisk af opsætningen optagelse:. De sorte og røde pyramider repræsenterer et par ægte pyramideceller registreres samtidigt. Sort og rød indikerer præsynaptiske og postsynaptiske neuron hhv. Den blå cirkel repræsenterer en virtuel GABAerg interneuron, kontaktes af sorte pyramideformet celle, som igen hæmmer røde pyramideformede celle. (B) Reaktion af den reelle præsynaptiske neuron pyramideformede til et tog af impulser afgivet ved en frekvens på 90 Hz, angivet ved de orange streger over spænding spor. De sorte streger nedenfor spændingen trace angiver gange aktionspotentialer blev udsendt af den præsynaptiske celle. (C) Respons af den simulerede interneuron til toget af pigge, der udsendes af den præsynaptiske celle. (D)Overlejring af 10 spænding spor optaget fra den virkelige postsynaptiske pyramideformet celle som respons på aktiveringen af den simulerede interneuron. Den postsynaptiske celle blev stimuleret med frosne in vivo-lignende baggrund aktivitet, for at opnå pålidelige spænding dynamik. De røde streger nedenfor spændingen spor angiver de tidspunkter, hvor, under successive forsøg, de postsynaptiske neuroner udsendes en handling potentiale. Bemærk den forøgede præcision efter aktiveringen af den interneuron, angivet ved en lavere spike jitter tværs forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne tekst en fuld protokol for gennemførelse af real-time, blev lukket kredsløb enkelt celle elektrofysiologiske eksperimenter beskrives ved hjælp af patch clamp-teknik og en nylig udviklet software værktøjskasse kaldet LCG. For at optimere kvaliteten af optagelserne er det afgørende, at opsætningen optagelsen være korrekt jordforbindelse, skærmet og vibrationsfri: dette sikrer stabil og varig hel-celle adgang til cellen, der sammen med mulighed for at automatisere hele sektioner af stimulation protokoller , giver mulighed for maksimering af gennemløbet af forsøget.
To sager, hvor LCG kan anvendes er blevet præsenteret, nemlig karakteriseringen af en celle med hensyn til dets elektrofysiologiske egenskaber (figur 1), herunder den hurtige beregning af en neuron aktive input-output forhold, og genskabelse af in vivo-lignende aktivitet i en hjerne skive (figur 2). Such applikationer viste, hvordan at konstruere forskellige protokoller og fremhævet nogle af de mest fremtrædende træk ved LCG: dens kommando-line interface gør det velegnet til scripting, som gør det muligt automatisk anvendelse af en række protokoller. Derudover, som blev gjort i figur 1, værdier ekstraheret fra én protokol kan anvendes til at skræddersy parametrene for efterfølgende protokoller.
Det er muligt at overvåge i realtid højere ordens funktioner i respons af cellen under analysen (fx dens øjeblikkelige skudhastighed, som vist i figur 1 D) og ændre stimulation i overensstemmelse hermed, for eksempel ved hjælp af en PID-regulator til at beregne den aktuelle nødvendig for at opretholde en konstant eller tidsvarierende skudhastighed.
Gennemførelsen af konduktans og dynamisk clamp-protokoller med LCG er ligetil og kræver kun at skrive en tekst konfigurationsfil, en procedure, der kan automatiseres ved brugen af sgennemførelsesbeføjelser scripts. LCG omfatter over 30 enheder, der kan indbyrdes forbundet til at udtænke nye forsøgsprotokoller. Vi beskrev, hvordan man bruger LCG hjælp af en kommandolinje-grænseflade, men en grafisk eksperiment løfteraket er designet til at gøre det lettere at starte eksperimenter og ændre parametre ved at lade ikke-erfarne brugere kombinere kommandoer LCG at skabe deres egne grafiske interfaces.
To eksisterende værktøjskasser tilbyde funktionaliteter ligner LCG: RELACS og RTXI. Førstnævnte er både en platform til at udføre elektrofysiologiske eksperimenter og til at analysere og udfyldelse af de registrerede data. Den væsentligste forskel mellem LCG og eksisterende løsninger er dens brugergrænseflade baseret på en kommando-linje. Fordelene ved denne fremgangsmåde er flere: for det første, en kommando-line interface giver automatisere standardiserede og gentagne opgaver ved hjælp af evt komplekse scripts, og for det andet, det giver mulighed for indlejring eksperimentelle forsøg i mere komplicerede arbejdsgange implementereti højt niveau scriptsprog, såsom Matlab eller Python.
Sammenfattende modulære natur LCG tillader at udvide antallet af tilgængelige forsøgsprotokoller på to måder: Den første og mest ligetil en er ved at skrive ad hoc konfigurationsfiler, der bruger de eksisterende objekter til at udføre nye protokoller. Den anden er ved at gennemføre - ved hjælp af C ++ - nye elementære genstande, der kan bruges til yderligere at udvide funktionaliteten og funktioner i LCG. Eksemplerne i denne protokol forbindelse med undersøgelse af individuelle celler i hjernen skiver. Men lignende protokoller kan også med held anvendes i in vivo præparater, for at optage både intracellulære og ekstracellulære signaler, og ex vivo præparater såsom neuronale kulturer, til at optage, f.eks, ekstracellulære potentialer gennem multi-elektrode arrays og samtidig stimulere i med lukket loop 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
References
- Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
- Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
- Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
- Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
- Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
- Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
- White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
- Destexhe, a, Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
- Fellous, J. -M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
- Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
- Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
- Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
- Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
- Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
- Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
- Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , (1995).
- Molleman, A. Patch Clamping. , John Wile., & Sons, Ltd. Chichester, UK. (2002).
- Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
- Gold, R. The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
- Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).
- Koch, C., Segev, I. Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , MIT Press. Cambridge, MA, USA. (1988).
- Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
- Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
- Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).
