Abstract
Neurosciences expérimentales est témoin d'un intérêt accru dans le développement et l'application de nouveaux protocoles et souvent complexes, en boucle fermée, où le stimulus appliqué dépend en temps réel sur la réponse du système. Les applications récentes vont de la mise en œuvre de systèmes de réalité virtuelle pour étudier les réponses motrices à la fois chez la souris et chez le poisson zèbre 1 2, pour contrôler des crises après un AVC corticale en utilisant l'optogénétique 3. Un des principaux avantages des techniques à boucle fermée réside dans la capacité de palpage caractéristiques dimensionnelles plus élevées qui ne sont pas directement accessibles ou qui dépendent de plusieurs variables, telles que l'excitabilité neuronale 4 et la fiabilité, tout en maximisant le débit expérimentale. Dans cette contribution, et dans le contexte de l'électrophysiologie cellulaire, nous décrivons comment appliquer une variété de protocoles en boucle fermée à l'étude des propriétés des pyramidale neurones corticaux, rec réponseorded intracellulaire avec la technique de patch-clamp en tranches de cerveau aiguë du cortex somatosensoriel de jeunes rats. Comme aucun logiciel à code source disponible dans le commerce ou ouverte offre toutes les fonctionnalités nécessaires pour effectuer efficacement les expériences décrites ici, une nouvelle boîte à outils logicielle appelée LCG 5 a été développé, dont la structure modulaire optimise la réutilisation de code informatique et facilite la mise en œuvre de nouveaux paradigmes expérimentaux. formes d'onde de stimulation sont spécifiées en utilisant une méta-description compacte et protocoles expérimentaux complets sont décrits dans les fichiers de configuration à base de texte. En outre, LCG dispose d'une interface de ligne de commande qui est adapté à la répétition des essais et de l'automatisation des protocoles expérimentaux.
Introduction
Au cours des dernières années, l'électrophysiologie cellulaire a évolué à partir du paradigme en boucle ouverte traditionnelle utilisée dans les expériences de tension et de serrage courant des protocoles en boucle fermée modernes. La technique en boucle fermée le plus connu est peut-être la pince dynamique 6,7, qui a permis l'injection synthétique de canaux voltage-dépendants artificiels ion pour déterminer la tension de la membrane neuronale 8, l'étude approfondie des effets de la non-déterministe vacillante sur canaux ioniques sur la dynamique de réponse neuronale 9, ainsi que la récréation in vitro de réaliste dans vivo- comme activité de fond synaptique 10.
D'autres paradigmes en boucle fermée qui ont été proposées comprennent la pince réactive 11, pour étudier in vitro la génération de l'activité persistante auto-entretenue, et la réponse serrer 4,12, pour enquêter sur les mécanismes cellulaires de l'excitabilité neuronale sous-jacente.
ontenu "> Ici, nous décrivons un cadre puissant qui permet l'application d'une variété de boucle fermée protocoles électrophysiologiques dans le cadre d'enregistrements patch clamp de cellules entières effectuées dans des tranches de cerveau aigus. Nous montrons comment enregistrer la tension de la membrane somatique au moyen d'enregistrements de patch-clamp dans les neurones pyramidaux du cortex somatosensoriel de rats juvéniles et appliquer trois protocoles en boucle fermée à l'aide de différents LCG, une boîte à outils de logiciels basés sur la ligne de commande développé dans le laboratoire de neurobiologie théorique et Neuroengineering.En bref, les protocoles décrits sont, d'abord l'injection automatique d'une série de formes d'onde pince de relance actuelles, pertinentes pour la caractérisation d'un grand ensemble de propriétés des membranes actives et passives. Ceux-ci ont été suggérées pour capturer le phénotype électrophysiologique d'une cellule en termes de ses propriétés de réponse à une série stéréotypée de formes d'onde de relance. Connu comme le e-code d'une cellule (par exemple, voir & #160; 13,14), une telle collection de réponses électriques est utilisé par plusieurs laboratoires de classer objectivement neurones sur la base de leurs propriétés électriques. Cela comprend l'analyse de la relation de transfert d'entrée-sortie fixe (courbe FI), par une technique innovante qui consiste à boucle fermée, le contrôle en temps réel de la vitesse de mise à feu au moyen d'un dispositif de commande (PID) proportionnel-intégral-dérivé , deuxième de la récréation vivo -comme activité réaliste de fond synaptique dans les préparations in vitro et 10, troisième la connexion artificielle en temps réel de deux neurones pyramidaux enregistrées simultanément au moyen d'un interneurone GABAergique virtuel, qui est simulé par l'ordinateur.
En outre, LCG met en œuvre la technique dite électrode active rémunération (AEC) 15, qui permet la mise en œuvre des protocoles de serrage dynamiques en utilisant une seule électrode. Ceci permet de compenser les effets indésirables (artifacts) de l'électrode d'enregistrement qui se pose lorsqu'il est utilisé pour délivrer des stimuli intracellulaires. La méthode est basée sur une estimation non paramétrique des caractéristiques électriques équivalentes du circuit d'enregistrement.
Les techniques et les protocoles expérimentaux décrits dans le présent document peuvent être facilement appliquées dans la tension en boucle ouverte conventionnelle et expériences de serrage actuels et peuvent être étendus à d'autres préparations, comme extracellulaire 4,16 ou enregistrements intracellulaires in vivo 17,18. L'assemblée attentive de la configuration pour le patch de cellules entières pince électrophysiologie est une étape très importante pour la stabilité, des enregistrements de haute qualité. Dans ce qui suit, nous supposons qu'un tel dispositif expérimental est déjà disponible à l'expérimentateur, et concentrons notre attention sur la description de l'utilisation du LCG. Le lecteur est pointé à 19-22 pour obtenir des conseils supplémentaires sur l'optimisation et le débogage.
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Protocol
Le protocole décrit ici est conforme aux recommandations et directives du Comité d'éthique du département de sciences biomédicales de l'Université d'Anvers. Ce protocole nécessite la préparation d'un matériau non-sensible du cerveau de rats Wistar explantée mineurs, obtenu par des techniques d'euthanasie approuvées.
1. Préparation Equipement
- Installer et configurer l'acquisition de données et système de stimulation.
- Utilisation d'un ordinateur personnel (PC) équipé d'une carte d'acquisition de données (DAQ) supporté par Comedi pour enregistrer et envoyer les signaux des tensions de commande analogiques à l'amplificateur électrophysiologique.
NOTE: Comedi est un module Linux et la bibliothèque qui prend en charge une multitude de cartes DAQ de fabricants les plus communs: visiter http://www.comedi.org pour plus d'informations. - Dans le cas où un amplificateur patch clamp contrôlé par ordinateur est en cours d'utilisation, employer un deuxième PC en plus de celle dédiée à l'amplificateurcontrôle.
REMARQUE: Alors que ce dernier peut exécuter un système d'exploitation classique, le PC supplémentaire sera d'exploitation en temps réel au moyen d'un système d'exploitation particulier. Dans ces conditions, il est commode d'utiliser un seul moniteur, une souris et clavier connecté au PC supplémentaire, lors de la connexion par une application de bureau à distance à l'ordinateur dédié. - Télécharger l'image ISO du Live CD contenant un système d'exploitation Linux en temps réel avec LCG préinstallés par http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso et le graver sur un CD ou USB vierge bâton " .
- Il suffit d'insérer le CD dans le lecteur de l'ordinateur contenant la carte DAQ et démarrer. Autrement, installez LCG de son référentiel de source en ligne sur un PC exécutant le système d'exploitation Linux (par exemple, Debian ou Ubuntu). Consultez le manuel en ligne pour plus de détails sur la procédure d'installation. Le manuel est disponible en ligne à http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf.
- Amorçage à partir du CD live: this chargera automatiquement un système entièrement configuré. Pour ce faire, placez le LCG Live CD dans le lecteur de CD-ROM de votre ordinateur et de démarrer l'ordinateur à partir du CD; sélectionnez le noyau temps réel (option par défaut) dès que le menu de démarrage apparaît et attendez que le système pour initialiser.
- Calibrer la carte DAQ en tapant à l'invite de commande:
sudo comedi_calibrate
ou
sudo comedi_soft_calibrate
selon que le conseil d'acquisition de données prend en charge matériel ou logiciel d'étalonnage, respectivement (utiliser la commande sudo comedi_board_info pour obtenir des informations sur la carte). - Réglez le convertisseur analogique-numérique et numérique-analogique facteurs de conversion approprié: cela nécessite d'avoir accès au manuel de l'amplificateur électrophysiologique cellulaire, et en particulier à ses caractéristiques sur ses facteurs de conversion.
- Utilisez un éditeur de texte pour spécifier les valeurs numériques appropriées dans le fichier /home/user/.lcg-env, pour les variables d'environnement AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
NOTE: Ils représentent l'entrée (AI) et de sortie (AO) des gains pour pince de courant (CC) et la pince de tension (VC) des modes, et les facteurs de conversion entre les commandes de tension fournies par l'ordinateur et le courant ou des tensions générées par l'amplificateur respectivement. - Vous pouvez également utiliser le script fourni (LCG-find-conversion-facteurs LCG), de trouver les facteurs de conversion de son système.
REMARQUE: Les valeurs calculées par lcg-trouver-conversion-facteurs sont des suppositions, qui dans certains cas sont nécessaires pour être numériquement tronqués ou arrondis pour refléter les valeurs exactes des facteurs de conversion. - Pour utiliser lcg-trouver-conversion-facteurs, de commencer par connecter la "cellule modèle» qui est souvent achetée avec l'amplificateur à la headstage correspondante. Ensuite, ouvrez un terminal sur la machine Linux sur lequel vous exécutez le Live CD et entrez la commande suivante à l'invite du shell:
lcconversion facteurs g-trouver--i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env
NOTE: Dans les deux cas (ie, modification manuelle de /home/user/.lcg-env ou l'utilisation de LCG-trouver-conversion-facteurs), fermer et ouvrir le terminal pour que les modifications prennent effet. - Si plusieurs headstages sont utilisés, définir les facteurs de conversion aux mêmes valeurs dans tous les canaux; si cela est impossible, consultez le manuel en ligne LCG à comprendre comment utiliser de multiples facteurs de conversion dans lcg-relance ou comment produire des fichiers de configuration qui mieux adaptés aux besoins de l'utilisateur.
- Utilisation d'un ordinateur personnel (PC) équipé d'une carte d'acquisition de données (DAQ) supporté par Comedi pour enregistrer et envoyer les signaux des tensions de commande analogiques à l'amplificateur électrophysiologique.
2. Préparation des tranches aiguë du cerveau cortex somatosensoriel
- Préparation des solutions pour l'électrophysiologie.
- Préparation liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) en mélangeant (en mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, NaHCO 3 26, glucose 25, CaCl2 2, MgCl2 et 1. Préparer 10x actions des solutions pour réduire lale temps de préparation, le jour de l'expérience. Préparer 2 L, dont une sera utilisé pour la préparation des tranches et l'autre pour l'enregistrement.
- Saturer la ACSF avec 95% O 2 et 5% de CO 2 pendant au moins 30 min avant le début de la procédure.
- Pour les enregistrements en cours de serrage, utiliser une solution intracellulaire (ICS) contenant (en mM) 115 K-gluconate, 20 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0,3 Na 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Préparer la solution dans de la glace et le filtrer avant le début des enregistrements pour éliminer le risque de colmatage de la pipette.
- l'extraction du cerveau.
- Anesthésier l'animal placer l'animal dans une chambre d'induction avec 4% d'isoflurane et décapite rapidement à l'aide d'une guillotine ou grands ciseaux.
- Couper la peau le long de la ligne médiane et faites-le glisser à l'oreille.
- Utilisation d'une belle paire de ciseaux couper le crâne le long de la ligne médiane. Gardez la lame aussi près que possible de the surface de manière à minimiser les dommages au cerveau sous-jacent. Ouvrez le crâne avec une paire de pinces, utiliser une spatule pour couper le nerf optique et le tronc cérébral et doucement tomber le cerveau glacée ACSF.
- Séparer le cervelet et les deux demi-sphères avec un scalpel (lame 24).
- Retirer l'excès d'eau de l'un des deux hémisphères et le coller sur une plate-forme inclinée en utilisant une goutte de colle. Rapidement ajouter quelques gouttes de l'ACSF sur le cerveau et le transférer à la chambre de vibratome.
NOTE: Lors de la préparation des tranches sagittal, l'angle de la plate-forme est important pour éviter d'endommager les dendrites des cellules pyramidales pendant la procédure de tranchage.
- Préparation des tranches.
- Placez la lame sur le cerveau et jeter les premiers 2,5 - 3 mm. Régler la vitesse et la fréquence de limiter les dommages à la surface de la tranche, tout en minimisant en même temps le temps nécessaire à la procédure de coupe.
- Réglez l'épaisseur de 300 μm et commencer à trancher. Une fois que la lame a dépassé le cortex, utiliser une lame de rasoir ou une aiguille recourbée à couper au-dessus de l'hippocampe et sur les bords de la zone corticale d'intérêt.
- Placez les tranches dans une chambre d'incubation multi-puits maintenus à 32-34 ° C.
- Rétracter la lame et répétez les points 2.3.2 et 2.3.3 jusqu'à 5 - 8 tranches sont coupées. Les meilleures tranches sont généralement ceux où les vaisseaux sanguins sont parallèles à la surface.
- Incuber les tranches de 30 minutes après la dernière tranche est placée dans la chambre.
3. patch-clamp enregistrements à partir de la couche 5 pyramidaux Neurones
- Placer une tranche dans la chambre d'enregistrement et de recherche pour les cellules saines. Ces cellules ont généralement un contraste plus faible, un aspect lisse et ne sont pas gonflées.
- Vérifier la tranche au microscope avec un grossissement de la lentille de 40X et recherche de cellules dans la couche 5, située à environ 600 à 1 000 um de la surface du cerveau. Une fois qu'une cellule est trouvée, la charge d'un tiers de la micropipette avec ICS et placez-le dans le headstage.
- Sur l'ordinateur personnel utilisant le live CD ou le système pré-configuré exploitation Linux, lancer un shell de commande (par exemple, bash) et à son invite, tapez la commande lcg-zéro. Cela garantit que la carte DAQ ne conduit pas l'amplificateur.
- Appliquer 30 - 50 mbar de pression positive en appuyant sur le piston d'une seringue commun, connecté par un tube sur le porte-pipette et, avec l'aide du microscope, placer la pipette au-dessus d'environ 100 um de la tranche.
NOTE: Placez la pipette dans une position qui permet un accès direct à la cellule cible, de préférence en utilisant le mode de la micromanipulateur d'approche. - Agissant sur les commandes de l'amplificateur d'électrophysiologie, ajuster le décalage de pipette et la sortie une impulsion de test (10 mV) en mode tension de serrage.
- Réduire la pression de 10 - 30 mbar (en fonction de la taille de la pipette) en retirant lepiston de la seringue; approcher doucement la cellule et vérifier pour la formation d'une fossette en observant l'image sur l'écran de la caméra vidéo. Surveiller l'impulsion de test pour une augmentation de la résistance en tout temps, en regardant la forme du courant affiché sur l'oscilloscope relié à l'amplificateur d'électrophysiologie (vous pouvez aussi utiliser le lcg-joint-test de commande pour contrôler la résistance de la pipette).
- Relâchez la pression et si nécessaire, appliquer une pression négative douce à la pipette pour aider à la formation de joint lorsque vous remarquez une augmentation de la résistance à la pipette et la formation d'une «fossette» sur la cellule.
- Alors que les formes de phoques, de diminuer progressivement le potentiel de maintien de -70 mV.
- Une fois que le joint d'gigaohm a été obtenue, en sorte que le courant de maintien est compris entre 0 à 30 pA. Appliquer de courtes impulsions de pression négative (aspiration) pour rompre la membrane et établir la configuration de cellule entière. Alternativement, vous pouvez injecter des impulsions fortes et brèves de tension (
- Passer en mode pince de courant et vérifiez que le potentiel de membrane de repos est typique d'une cellule saine. Pour les neurones pyramidaux du cortex utilisant une solution à base de gluconate de potassium, cette valeur est généralement comprise entre -65 et -75 mV.
4. Caractérisation semi-automatique des propriétés de réponse électrique d'un neurone
- Créez un répertoire pour stocker les données de l'utilisateur. Pour ce faire, l'emploi d'un script inclus dans le LCG CD live qui crée des dossiers basés sur la date. Pour l'utiliser, tapez à l'invite de commande
cd ~ / expériences
lcg-créer-expérience-dossier -s psp, in_vivo_like
Cela va créer un dossier où les données de cette cellule seront sauvegardés (et un «psp» et «in_vivo_like 'sous-dossiers) et il va imprimer son nom à la bornela fenêtre; il est également possible de stocker des informations supplémentaires telles que la résistance à la pipette et le type de cellule à l'aide de ce script. - Changer répertoire pour le dossier nouvellement créé en utilisant la commande
cd ~ / <nom_dossier>
Le nom du dossier est celui affiché par la commande lcg-créer-expérience-dossier et aura l'horodatage de la journée en cours (ie, l'année-mois-jour), comme dans 20140331A01. - Assurez-vous que l'amplificateur est réglé pour fonctionner en mode pince de courant, que les câbles sont connectés et la commande de tension externe de l'amplificateur, si elle est présente, est activée.
- Entrez la commande lcg-ecodeat l'invite de commande. Cela appelle une série de commandes (à savoir lcg-ap, lcg-vi, lcg-rampe, lcg-tau et LCG-étapes), utilisé pour caractériser les propriétés de réponse de base de la cellule. lcg-ecode exige que l'utilisateur de spécifier deux paramètres: l'amplitude du 1 ms long impulsion de courant utilisé pour susciter un seul pic dans la cellule, et l'amplitude maximale de la RAM actuellep injecté dans la cellule à trouver son rhéobase.
Utilisez la syntaxe de commande suivante:
lcg-ecode --pulse amplitude X --ramp amplitude Y
avec un choix des valeurs X et Y (en Pa) qui sont suffisantes pour rendre le feu de la cellule en réponse à une ms-1 et une longue impulsion d'injection de courant continu, respectivement.
NOTE: Ces protocoles nécessitent d'effectuer l'estimation numérique de le «noyau de l'électrode» afin d'utiliser la rémunération électrode active (AEC) 15. Une injection de courant bruyante est utilisée pour estimer le noyau et l'utilisateur est invité à confirmer le nombre d'échantillons qui composent le noyau. Voir 15 pour des informations détaillées sur la signification du noyau de l'électrode et la façon de choisir le nombre d'échantillons du noyau.
5. Injection de la conductance à travers simulées Synapses et Simulation de In Vivo -comme l'activité de fond
- Injection des potentiels post-synaptiques excitateurs simulées
- Passez dans le répertoire où vous allez économiser l'expérience suivante, en tapant la commande suivante à l'invite de commande de la coque:
cd psp / 01 - Copier un fichier de configuration LCG dans le répertoire courant et l'ouvrir avec un éditeur de texte (Nano dans cet exemple) en tapant les commandes suivantes à l'invite de commande de la coquille (ce fichier de configuration exemple est inclus dans le code source et le live cd) :
cp ~ / / src / lcg / configurations / epsp.xml locale
nano epsp.xml
NOTE: Ceci est tout simplement un fichier texte avec différentes entités connectées les unes aux autres. Pour plus de détails, voir la section des résultats représentatifs. - Si nécessaire modifier l'inputChannel, outputChannel, l'inputConversionFactor et outputConversionFactor dans ce fichier pour correspondre à la configuration de l'utilisateur.
- Calculer le noyau de l'électrode nécessaire pour effectuer la compensation de l'électrode active »la méthode utilisée par LCG pour effectuer seule électrode pince dynamique» en lançant la command
lcg-kernel
Cela incitera pour le nombre de points dans le noyau. Encore une fois, sélectionnez un nombre pour que le noyau de l'électrode couvre la fin de la décroissance exponentielle queue. - Effectuer l'expérience de serrage dynamique en utilisant la commande
lcg-expérimenter epsp.xml -c - Dressez la liste des fichiers et de visualiser les résultats en utilisant la commande
ls -l
lcg-plot--f fichier dernière
- Passez dans le répertoire où vous allez économiser l'expérience suivante, en tapant la commande suivante à l'invite de commande de la coque:
- Injection des potentiels post-synaptiques inhibitrices simulées
- Créez un dossier et copiez le fichier de epsp.xml à elle en tapant les commandes suivantes à l'invite de commande de la coque:
mkdir ../02
cp epsp.xml ../02/ipsp.xml
cd ../02 - Editez le fichier de configuration en utilisant un éditeur de texte: changer le potentiel d'inversion synaptique et temps de montée et de déclin des constantes de la Exp2Synapse modèle de synapse à ce qui suit:
paramètres>
<E> -80 </ E>
<TauRise> 0.8E-3 </ tauRise>
<TauDecay> 10e-3 </ tauDecay>
<paramètres>
Quittez l'éditeur de texte. - Calculer le noyau de l'électrode et réaliser l'expérience comme dans 5.1, en tapant les commandes suivantes à l'invite de commande de la coque:
lcg-kernel
lcg-expérimenter ipsp.xml -c - Dressez la liste des fichiers et de visualiser les résultats, en tapant les commandes suivantes à l'invite de commande de la coque:
ls -l
lcg-plot-fichier -f <filename.h5>
- Créez un dossier et copiez le fichier de epsp.xml à elle en tapant les commandes suivantes à l'invite de commande de la coque:
- Simulation d'vivo -comme activité de fond:
- Passez dans le répertoire où vous souhaitez enregistrer l'expérience suivante, comme précédemment indiqué, en tapant les commandes suivantes à l'invite de commande de la coque:
cd ../../in_vivo_like/01 - Copiez le fichier de configuration du répertoire source LCG, en tapant les commandes suivantes à l'invite de commande de la coque:
cp ~ / / src / lcg / configurations / in_vivo_like.xml locale
nano in_vivo_like.xml - Ajustez les paramètres de configuration DAQ pour la configuration de l'utilisateur, comme décrit au paragraphe 5.1.3 et quittez l'éditeur.
- Calculer le noyau de l'électrode et réaliser l'expérience comme dans 5.1, en tapant les commandes suivantes à l'invite de commande de la coque:
lcg-kernel
lcg-expérimenter in_vivo_like.xml -c -n 10 -i 3
Les interrupteurs «-n 10» et «-i 3» indiquent que la stimulation doit être répété 10 fois à des intervalles de trois secondes. - Visualisez les traces premières à l'aide de la commande suivante à l'invite de commande de la coque:
lcg-plot--f fichier tout
- Passez dans le répertoire où vous souhaitez enregistrer l'expérience suivante, comme précédemment indiqué, en tapant les commandes suivantes à l'invite de commande de la coque:
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Representative Results
Dans les sections précédentes, nous avons décrit comment utiliser le LCG de boîte à outils logiciels pour caractériser les propriétés électrophysiologiques des cellules pyramidales L5 et de recréer vivo -comme l'activité synaptique dans une préparation de tranches. L'utilisation d'une interface de ligne de commande et le protocole semi-automatisé favoriser la reproductibilité et l'efficacité de l'expérience, ce qui peut avoir un grand impact sur le rendement et la qualité des données produites. En outre, puisque les données sont enregistrées de manière cohérente, il est facile d'étendre l'analyse à un objectif particulier. La figure 1 montre le résultat typique d'une expérience dans laquelle des propriétés électrophysiologiques de base d'une cellule à l'aide de six protocoles distincts ont été caractérisés.
Mesure d'action forme potentiel et le seuil (figure 1A): une brève et forte impulsion de courant de dépolarisation est injecté pour mesurer la forme moyenne potentiel d'action. Le seuil de pic estcalculé comme étant le premier pic de la dérivée troisième de potentiel d'action 24. Mesure de la courbe tension-courant (Figure 1B): sous-seuil des impulsions de courant sont injectés dans la cellule, ce qui permet la mesure des propriétés de réponse passive telles que la résistance d'entrée et la caractérisation des courants ioniques sous-seuil.
La mesure du courant minimal suffisant pour provoquer la cuisson prolongée (Figure 1C). La rampe injecté du courant permet la caractérisation de la cellule comme un type I ou de type II oscillateur 25. Mesure de la courbe (figure 1D) fréquence-courant (FI): le courant injecté est une fonction de la fréquence de mise à feu instantanée et est mise à jour chaque fois que les pointes de cellules, en utilisant le protocole en boucle fermée décrit dans 5. En utilisant cette technique, une estimation fiable de la courbe de fI peut être obtenu en moins de 30 sec. Mesure de la Membrane constante de temps (figure 1E): une impulsion de courant à court hyperpolarisant est livré pour mesurer les propriétés de relaxation passives de la membrane. Cette impulsion est alors apte à une double exponentielle pour calculer la constante de temps membranaire (44 ms dans ce cas).
Et coefficient de réponse de courant de dépolarisation (figure 1F) Adaptation: deux valeurs supra-seuil de courant sont injectés à mesurer le coefficient d'adaptation (rapport entre les premier et dernier intervalles inter-pic). L'application automatique d'une série de protocoles tels que ceux décrits permet de caractériser chaque cellule enregistrée en termes de ses propriétés électrophysiologiques clés et constitue l'étape de base de tout effort visant à comparer les types de neurones différents et leur rôle, à la fois en matière de santé et de la maladie.
Bien que LCG contient plusieurs scripts qui implémentent des protocoles spécialisés, la plupart de la puissance et la flexibilité de la boîte à outils résidents à la capacité d'décrivent des expériences au moyen de fichiers de configuration. Dans Sec. 5, il est décrit comment effectuer serrage dynamique à injecter activité de fond simulé dans le neurone. Voici le concept de fichiers et entités configuration est introduit. Un fichier de configuration est un simple fichier texte contenant les noms et les interconnexions de tous les blocs de construction de base (appelées entités) qui sont nécessaires pour réaliser une expérience donnée; pour cette raison, la conception de nouveaux paradigmes par des entités de raccordement est une tâche relativement facile, tout comme le partage et la réutilisation des paradigmes expérimentaux. Dans l'expérience représentée sur la figure 2, cinq entités sont utilisés:
H5Recorder: enregistre les entités connectées à un fichier compressé. Le format de fichier de HDF5 a été choisi car il est soutenu par la plupart des langages de programmation tels que Python et MATLAB.
RealNeuron: fournit une couche d'abstraction de l'aspect technique de l'en temps réel reCording et d'injection. Il contient les informations sur la carte d'acquisition de données et effectue la compensation de l'électrode active en ligne. Quand un potentiel d'action est détectée par le franchissement du seuil, le Real Neuron émet également un pic dans la forme d'un événement: cela peut être utilisé par exemple pour surveiller le taux de mise à feu au cours de l'expérience ou à l'interface avec les synapses artificiels.
Poisson: génère trains de potentiels suivant une distribution exponentielle avec un taux particulier. La graine de ce processus peut être fixé de manière que les essais peuvent être reproduits de manière cohérente.
SynapticConnection: reçoit les pointes de la génératrice et les relaie à la synapse approprié après un délai donné.
Exp2Synapse: modèle d'une synapse exponentielle double. Il contient le potentiel d'inversion et les constantes de temps de montée et de décroissance.
Comme mentionné précédemment, chaque entité est reliée à une ou plusieurs autres to composer une expérience. Dans l'exemple de la simulation d'un courant post-synaptique excitatrice décrit dans l'art. 5,1, à la fois la RealNeuron et la Exp2Synapse sont reliés à la H5Recorder, à enregistrer dans un fichier tension de membrane synaptique et de courant, respectivement. L'entité Poisson délivre pointes générées à une fréquence de 2 Hz à la SynapticConnection, qui à son tour offre les événements à la Exp2Synapse après 1 ms. Enfin, l'entité Exp2Synapse est reliée à la RealNeuron. En utilisant de petites variations de ce fichier de configuration, comme le montre la Sec. 5.2 et 5.3, on peut simuler les courants inhibitrices et recréer vivo -comme activité.
Sur la figure 2 on montre comment, à l'aide d'une configuration dynamique de serrage, on peut étudier l'intégration synaptique de manière contrôlée en simulant le courant induit dans un neurone par des synapses artificiels. La figure 2A (en haut) montre des potentiels post-synaptiques individuels (en haut ) avec le injéchies courants. (Bleus) des traces rouges désignent excitateurs événements (inhibiteurs). Notez que le courant injecté est une fonction de la tension de la membrane et de la variation de conductance associé à l'activation de la synapse virtuelle.
En fournissant des trains Poisson pic à des fréquences plus élevées pour les synapses, vivo -comme activité de fond peut être simulé (figure 2B et 2D). Même pendant dopage lors de grands courants sont injectés (trace noire dans le bas de la figure 2B), les actifs des garanties de compensation de l'électrode que la forme des pointes est pas affectée (figure 2C), même si une seule électrode est utilisée pour injecter simultanément actuelle et enregistrer la tension de la membrane. Répétition de multiples essais avec les mêmes formes d'onde de conductance permet d'étendre le travail de 23 à un cadre plus réaliste, ce qui permet de séparer les contributions des différents synaptic courants à la fiabilité et la précision de la synchronisation de pointe.
La figure 3 montre un exemple simple de réseau hybride, obtenue par l'enregistrement simultané de deux cellules pyramidales non connectées et en utilisant un interneurones GABAergiques virtuel pour simuler une forme d'inhibition disynaptique, un mécanisme généralisé que dans le cortex cérébral implique l'activation des cellules Martinotti. 26, 27 La figure 3A montre un schéma du dispositif expérimental: une paire de vrais, cellules pyramidales non connectées (triangles noir et rouge) est connectée artificiellement par un interneurone GABAergique simulé, modélisée comme une fuite neurone intégrer et-le-feu. La synapse qui relie la cellule pyramidale présynaptique aux affichages des interneurones homosynaptique facilitation à court terme mis en œuvre selon le modèle Tsodyks-Markram 28, tandis que la synapse reliant la interneurone et la cellule post-synaptique pyramidale est une synapse biexponentielle avec la montée et la décadence time constantes de 1 et 10 ms, respectivement.
Les coefficients de pondération des deux connexions ont été ajustées pour avoir une déviation dans le potentiel de membrane post-synaptique de l'ordre de 2 mV. La figure 3B et 3C montrent la réponse du pyramidal neurone présynaptique à un train d'impulsions intracellulaires livrés à 90 Hz et les EPSP correspondants dans la simulation interneurone:. les paramètres de la connexion synaptique ont été ajustés afin d'avoir le neurone artificiel émettent un pic après une rafale présynaptique de 3 - 4 pics à haute fréquence, tel que rapporté expérimentalement 26,29 Figure 3D montre l'effet de l'inhibition sur disynaptique la vraie cellule postsynaptique pyramidale. 10 essais sont superposées, dans lequel le neurone est stimulé avec l'activité in vivo -comme congelé dans de fond similaire à celui décrit à la figure 2 Remarque l'augmentation de la fiabilité en réponse aux trois inhibiteurs IPSP,reflété dans la pointe gigue inférieure après l'activation de la cellule d'inhibition, comme indiqué par les tirets rouges ci-dessous les traces de tension.
Figure 1. Caractérisation électrophysiologique d'un patchée L5 neurone pyramidal chiffre de sortie du protocole e-code pour une cellule pyramidale typique. quantifications sont effectuées automatiquement et aucune nouvelle édition est nécessaire. (A) Calcul d'action potentiel de seuil (ligne pointillée -50,5 mV). La ligne rouge est la forme moyenne potentiel d'action. (B) Mesure de la réponse passive (en haut) à des courants hyperpolarisants (en bas). (C) Réponse à une augmentation de dépolarisation de courant pour mesurer le courant de rhéobase (123 pA). (D) la fréquence de tir en fonction du courant injecté, mesurée en utilisant une approche en boucle fermée. Chaque point gris est située à la paire(Courant injecté, inverse de l'intervalle de interspike). La courbe rouge est l'ajustement linéaire des points de données et la ligne pointillée indique l'rhéobase mesurée dans le panneau (C). (E) Mesure de la constante de temps membranaire (43,8 ms). (F) Identification des propriétés actives de base de la cellule révèle que la cellule est un neurone de dopage régulier et qu'il ya un minimum d'adaptation. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Reconstitution d'en vivo- comme activité en utilisant pince dynamique. (A) Simulation d'excitateur (rouge, Sec. 5.1) et inhibitrice (bleu, Sec. 5.2) synapses, des traces grises sont d'autres réalisations de la même expérience. (B ) (C) Formes des pointes lors de l'expérience en (B). (D) parcelle Raster des pointes générés dans 20 essais montre que le neurone peut être extrêmement fiable et précis en réponse à la même entrée comme on le voit en 23. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Simulation d'inhibition disynaptique via un interneurone inhibitrice simulé (A) Schéma de la configuration de l'enregistrement:. Les pyramides noires et rouges représentent une paire de cellules pyramidales réel enregistrées simultanément. Noir et rouge indiquent neurone présynaptique et postsynaptique, respectivement. Le cercle bleu représente un interneurone GABAergique virtuelle, contacté par la cellule pyramidale noir, qui à son tour inhibe la cellule pyramidale rouge. (B) Réponse du réel présynaptique neurone pyramidal à un train d'impulsions délivrées à une fréquence de 90 Hz, indiquée par les tirets orange au-dessus de la trace de tension. Les tirets noirs en dessous de la trace de tension indiquent les fois des potentiels d'action ont été émises par la cellule présynaptique. (C) Réponse du interneurone simulé à la gare de pointes émis par la cellule présynaptique. (D)Superposition des 10 traces enregistrées de tension réelle de la cellule post-synaptique pyramidale en réponse à l'activation de l'interneurone simulé. La cellule post-synaptique a été stimulé avec vivo -comme activité congelé dans de fond, pour obtenir la dynamique de tension fiables. Les tirets rouges ci-dessous les traces de tension indiquent les moments où, au cours des essais successifs, les neurones post-synaptiques émis un potentiel d'action. Notez la précision accrue après l'activation de la interneurone, indiqué par une gigue inférieure pic entre les essais.
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Discussion
Dans ce texte, un protocole complet pour la mise en œuvre en temps réel, en boucle fermée monocellulaires expériences électrophysiologiques ont été décrits, en utilisant la technique du patch clamp et une boîte à outils du logiciel développé récemment appelé LCG. Pour optimiser la qualité des enregistrements, il est crucial que la configuration de l'enregistrement soit correctement mise à la terre, à l'abri et sans vibration: ce qui garantit l'accès à cellules entières stable et durable à la cellule, qui, avec la possibilité d'automatiser des sections entières des protocoles de stimulation , permet une maximisation du débit de l'expérience.
Deux cas dans lesquels LCG peut être appliquée ont été présentés, à savoir la caractérisation d'une cellule en termes de ses propriétés électrophysiologiques (Figure 1), y compris le calcul rapide de la relation entrée-sortie active d'un neurone, et la récréation de in vivo -comme activité dans une tranche de cerveau (Figure 2). Sucapplications h ont montré comment construire des protocoles distincts et mis en évidence quelques-uns des traits les plus saillants de LCG: son interface de ligne de commande, il est adapté pour les scripts, ce qui permet à l'application automatique d'une série de protocoles. En outre, comme cela a été fait sur la figure 1, les valeurs extraites d'un protocole peuvent être utilisés à des paramètres de mesure de protocoles suivants.
Il est possible de suivre en temps réel plus élevé des caractéristiques de commande de la réponse de la cellule en cours d'analyse (par exemple, le taux de mise à feu instantanée, comme représenté sur la figure 1D) et modifier la stimulation en conséquence, par exemple en utilisant un régulateur PID pour calculer le courant nécessaire pour maintenir un taux d'allumage constante ou variable dans le temps.
La mise en œuvre des protocoles de conductance et pince dynamique avec LCG est simple et ne nécessite l'écriture d'un fichier de configuration de texte, une procédure qui peut être automatisé par l'utilisation de sson œuvre. LCG comprend plus de 30 entités qui peuvent être interconnectés pour concevoir de nouveaux protocoles expérimentaux. Nous avons décrit comment utiliser LCG aide d'une interface de ligne de commande, mais une expérience lanceur graphique a été conçu pour faciliter le démarrage des expériences et de modifier les paramètres en permettant aux utilisateurs non expérimentés combiner LCG commandes pour créer leurs propres interfaces graphiques.
Deux boîtes à outils existantes offrent des fonctionnalités similaires à LCG: RELACS et RTXI. La première est à la fois une plate-forme pour effectuer des expériences électrophysiologiques et d'analyse et d'annoter les données enregistrées. La principale différence entre LCG et solutions existantes est son interface utilisateur basée sur une ligne de commande. Les avantages de cette approche sont multiples: tout d'abord, une interface de ligne de commande permet d'automatiser des tâches standardisées et répétitives au moyen de scripts éventuellement complexes et d'autre part, il permet d'intégrer des essais expérimentaux dans les workflows les plus complexes mis en œuvredans le langage de script de haut niveau, comme Matlab ou Python.
En résumé, la nature modulaire de LCG permet d'accroître le nombre de protocoles expérimentaux disponibles de deux façons: la première et la plus simple est l'un par l'écriture de fichiers ad hoc de configuration qui utilisent les objets existants pour effectuer de nouveaux protocoles. Le second est la mise en œuvre par - en utilisant C ++ - nouveaux objets élémentaires qui peuvent être utilisés pour étendre les capacités et les caractéristiques de LCG. Les exemples présentés dans ce protocole concernent l'étude des cellules individuelles dans des tranches de cerveau. Cependant, des protocoles similaires peuvent également être utilisés avec succès dans les préparations in vivo, pour enregistrer deux signaux intracellulaires et extracellulaires, et ex vivo des préparations telles que des cultures de neurones, pour enregistrer, par exemple, par le biais potentiels extracellulaires tableaux multi-électrodes tout en stimulant dans fermées 4 boucle.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
References
- Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
- Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
- Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
- Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
- Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
- Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
- White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
- Destexhe, a, Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
- Fellous, J. -M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
- Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
- Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
- Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
- Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
- Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
- Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
- Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , (1995).
- Molleman, A. Patch Clamping. , John Wile., & Sons, Ltd. Chichester, UK. (2002).
- Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
- Gold, R. The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
- Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).
- Koch, C., Segev, I. Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , MIT Press. Cambridge, MA, USA. (1988).
- Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
- Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
- Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).
