Abstract
실험은 신경 자극 시스템의 응답에 대한 실시간에 의존인가 개발 및 신규 적용 종종 복잡한 폐쇄 - 루프 프로토콜에 대한 관심이 증가 목격된다. 최근 애플리케이션 optogenetics 3을 사용 피질 스트로크 다음 발작 제어 생쥐 1 및 지브라 피쉬 2 모두 모터 반응 연구를위한 가상 현실 시스템의 구현에 이르기까지 다양. 폐쇄 루프 기술의 주요 장점은 직접 액세스 할 수없는 또는 동시에 실험 처리량을 최대화하면서, 이러한 신경 흥분성 4 및 신뢰성 등 여러 변수에 의존하는 더 높은 차원의 특성을 프로빙하는 능력에있다. 이 기여 및 세포 전기 생리학의 맥락에서, 우리는 피라미드 대뇌 피질의 뉴런, REC의 응답 특성의 연구에 폐쇄 루프 다양한 프로토콜을 적용하는 방법에 대해 설명합니다청소년 쥐의 체 감각 피질에서 급성 뇌 조각에서 패치 클램프 기술로 세포 내 orded. 어떠한 시판 또는 개방 소스 소프트웨어를 효율적으로 여기에 설명 된 실험을 수행하는 데 필요한 모든 기능을 제공하지 같이, LCG 5라는 새로운 소프트웨어 도구는 그 모듈러 구조 컴퓨터 코드의 재사용을 극대화하고 새로운 실험 패러다임의 구현을 용이하게 개발되었다. 자극 파형은 컴팩트 한 메타 설명을 사용하여 지정하고 전체 실험 프로토콜은 텍스트 기반의 구성 파일에 설명되어 있습니다. 또한, LCG는 시험의 반복 실험 프로토콜의 자동화에 적합 명령 줄 인터페이스를 가지고 있습니다.
Introduction
최근, 셀룰러 전기 생리학 현대 폐쇄 루프 프로토콜 전압 및 전류 클램프 실험에 이용 전통적인 개방 루프 패러다임에서 진화했다. 가장 잘 알려진 폐 루프 기술은 아마도 신경 세포막 전압 (8)를 결정하기 위해 인공 전압 관문 이온 채널의 합성 주입 활성화 동적 클램프 6,7이며, 비 결정적가 플리커 효과 심층 연구 이온 신경 응답 역학 9 채널뿐만 아니라, 시냅스 백그라운드 작업 (10)와 같은 vivo-에서 실제의 체외에서 휴양.
제안 된 다른 폐쇄 루프 패러다임은 세포 메커니즘을 기본 신경 흥분을 조사하기 위해, 4,12 클램프 반응 클램프 (11), 생체 자기 유지 지속적인 활동의 세대에서 공부하고, 응답을 포함한다.
"ontent> 다음은 급성 뇌 조각 수행 전체 셀 패치 클램프 기록의 맥락에서 폐 루프 전기 생리 다양한 프로토콜을 적용 할 수있는 강력한 구조를 설명한다. 우리는 패치 클램프 기록을 이용하여 체세포 멤브레인 전압을 기록하는 방법을 보여 청소년 쥐의 체 감각 피질과에서 피라미드 뉴런에 LCG, 이론적 신경 생물학 및 Neuroengineering의 실험실에서 개발 된 명령 줄 기반 소프트웨어 도구를 사용하여 세 가지 다른 폐 루프 프로토콜을 적용 할 수 있습니다.간단히 설명 프로토콜은 능동 및 수동 막 특성의 큰 집합의 특성에 대한 관련 현재 클램프 자극 파형의 시리즈의 첫 번째 자동 주입입니다. 이러한 자극 파형의 정형화 된 일련의 응답 특성면에서 세포의 전기 생리 학적 표현형을 캡처하도록 제안되어왔다. 셀의 전자 코드로 알려진 (예를 들어, 참조 & #160; 13,14)는, 예컨대 전기 응답의 컬렉션 객관적 그들의 전기적 특성에 기초하여 신경 세포를 분류하기 위해 여러 실험실에서 사용된다. 이 비례 적분 미분 (PID) 제어기에 의하여 발화 속도의 폐 루프, 실시간 제어를 포함 혁신 기술에 의해 고정 된 입력 - 출력 전송 관계 (FI 곡선)의 분석을 포함 , 체외 준비 (10)과, 컴퓨터 시뮬레이션 가상의 GABA 성 interneuron의 수단으로이 동시에 기록 피라미드 뉴런의 실시간 세 번째 인공 관련하여 사실적인 생체 -like 배경 시냅스 활동의 두 번째 휴양.
또한, LCG는 단일 전극을 사용하여 동적 클램프 프로토콜을 구현 허용 전극 활성 보정 (AEC) (15)로 알려진 기술을 구현한다. 이 원하지 않는 효과를 보정 할 수 있습니다 (rtifacts) 세포가 자극을 전달하기 위해 사용될 때 발생하는 기록 전극. 방법은 기록 회로의 등가 전기 특성의 비모수 추정치에 기초한다.
이 논문에서 설명 된 기술 및 실험 프로토콜 용이 종래 개방 루프 전압 및 전류 클램프 실험에 적용 할 수 있고, 생체 내에서 그러한 세포 외 17,18 4,16와 같은 다른 제제 또는 세포 내 레코딩로 확장 될 수있다. 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학에 대한 설정의주의 조립체 안정된 고품질 레코딩을위한 매우 중요한 단계이다. 다음에 우리는 실험 장치는 실험에 이미 사용할 수 있다고 가정하고, LCG의 사용을 설명하기에 우리의 관심을 집중한다. 독자는 최적화 및 디버깅에 대한 자세한 팁은 19-22로 지적되고있다.
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Protocol
여기에 설명 된 프로토콜은 추천 앤트워프 대학의 생명 과학학과의 윤리위원회의 가이드 라인을 준수합니다. 이 프로토콜은 승인 인도적 안락사 기술에 의해 수득 청소년의 Wistar 쥐의 뇌 외식로부터 비 감지 물질의 제조를 필요로한다.
1. 장비 준비
- 설치 및 데이터 수집 및 자극 시스템을 구성.
- 신호를 기록 및 전기 생리 학적 증폭기에 아날로그 제어 전압을 보낼 Comedi 지원 데이터 획득 (DAQ) 카드를 장착 한 퍼스널 컴퓨터 (PC)를 사용한다.
참고 : 자세한 내용은 http://www.comedi.org를 방문하십시오 Comedi 가장 일반적인 제조업체의 DAQ 카드의 다수를 지원하는 리눅스 모듈과 라이브러리입니다. - 컴퓨터 제어 패치 클램프 증폭기가 사용중인 경우, 상기 증폭기에 전용 한 외에 초 PC를 채용제어 할 수 있습니다.
주 : 후자는 통상적 인 운영 체제를 실행할 수 있지만, 별도의 PC는 특별한 운영 시스템을 이용하여 실시간으로 작동 될 것이다. 전용 PC에 원격 데스크톱 애플리케이션에 의해 연결하는 동안 이러한 조건 하에서는, 여분의 PC에 연결된 단일 모니터, 마우스 및 키보드를 사용하는 것이 편리하다. - http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso에서 LCG와 실시간 리눅스 운영 체제를 포함하는 라이브 CD의 ISO 이미지를 사전 설치 다운로드하여 빈 CD 또는 USB 스틱 "에 구워서 .
- 단순히 DAQ 카드를 포함하는 PC의 드라이브에 CD를 삽입하고 시작합니다. 또는 Linux 운영 체제 (예를 들어, 데비안이나 우분투)를 실행하는 PC에서 온라인 소스 저장소에서 LCG를 설치합니다. 설치 절차에 대한 자세한 내용은 온라인 설명서를 참조하십시오. 매뉴얼은 http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf에서 온라인으로 사용할 수 있습니다.
- 라이브 CD로 부팅 : 생S 자동으로 완벽하게 구성된 시스템을로드합니다. 이를 위해, 컴퓨터 CD-ROM 드라이브에 LCG 라이브 CD를 넣고 CD로부터 컴퓨터를 부팅; 부팅 메뉴가 나타나면 즉시 실시간 커널 (기본 옵션)을 선택하고 시스템이 초기화 될 때까지 기다립니다.
- 명령 프롬프트에 입력하여 DAQ 카드를 보정 :
sudo는 comedi_calibrate
또는
sudo는 comedi_soft_calibrate
데이터 수집 보드는 각각의 하드웨어 또는 소프트웨어 교정, (기판에 대한 정보를 획득하기 위해 명령 sudo는 comedi_board_info를 사용)를 지원하는지 여부에 따라. - 적절한 아날로그 - 디지털 및 디지털 - 아날로그 변환 계수를 설정 이것은 셀룰러 전기 생리 학적 증폭기의 사용 설명서를 갖는 액세스를 필요로하며, 특히 그 변환 계수에 미치는 사양.
- 환경 변수, 파일 /home/user/.lcg-env에 해당하는 숫자 값을 지정하는 텍스트 편집기를 사용하여 AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
주 : 이러한 증폭기에 의해 생성 된 입력 (AI) 및 전류 클램프 (CC)와 전압 클램프 (VC) 모드에 대한 출력 (AO) 이득, 및 컴퓨터에 의해 제공되는 전압 명령 및 전류 또는 전압 간의 변환 인자를 대표 각각. - 선택적으로, 자신의 시스템의 변환 계수를 찾는 (LCG 찾기 컨버전 팩터)가 제공 LCG 스크립트를 사용한다.
참고에 의해 계산 된 값 LCG 찾기 컨버전 팩터는 일부 경우에 절단 된 수치 일 필요 또는 변환 계수의 정확한 값을 반영하도록 반올림 추측이다. - 사용하려면, LCG을-변환 요인을 찾아 종종 해당 headstage에 앰프 구입 '모델 세포'를 연결하여 시작합니다. 그런 다음, 라이브 CD를 실행하고 쉘 프롬프트에서 다음 명령을 입력하는 리눅스 시스템의 터미널을 엽니 다
LCg을 찾기 변환 요인을 -i의 $ HOME / .lcg-ENV -o $ 홈 / .lcg-ENV
참고 : 두 경우 모두 (즉, 수동 /home/user/.lcg-env 또는 LCG 찾기 변환 요인의 사용 수정), 가까이는 변경 사항을 적용하기 위해 터미널을 엽니 다. - 여러 headstages 사용하는 경우, 모든 채널에 동일한 값으로 환산 계수를 설정; 가능하지 않은 경우,보다 사용자의 요구에 맞게 구성 파일을 생성하기 위해 LCG 자극치 얼마나 여러 환산 계수를 사용하는 방법을 이해하기 위해 LCG 온라인 매뉴얼을 참조.
- 신호를 기록 및 전기 생리 학적 증폭기에 아날로그 제어 전압을 보낼 Comedi 지원 데이터 획득 (DAQ) 카드를 장착 한 퍼스널 컴퓨터 (PC)를 사용한다.
체성 감각 피질에서 급성 뇌 조각 2. 준비
- 전기 생리학을위한 솔루션의 준비.
- (125)의 NaCl, 2.5의 KCl (mm 단위)을 혼합하여 인공 세리 - 척수 (ACSF)를 준비 1.25의 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3를, 25 포도당, 2 염화칼슘 2, 1의 MgCl 2. 을 줄이기 위해 10 배 재고 솔루션을 준비실험 당일 준비 시간. 한 조각의 제조 및 다른 기록에 사용되는 어느 2 L를 준비한다.
- 절차의 시작에 앞서 적어도 30 분 동안 95 % O 2 및 5 % CO 2 ACSF 적신.
- 현재 클램프 녹음을 위해, (mm 단위)를 포함하는 세포 내 솔루션 (ICS)를 사용하여 115 K-글루코 네이트, (20)의 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-㎎, 0.3 나 2 -GTP, 10 2 -phosphocreatine 나. 얼음 용액을 준비하고 피펫 막힘의 위험을 제거하기 위해 녹화의 시작에 앞서이를 필터링.
- 뇌 추출.
- 4 % 이소 플루 란 유도 챔버에 동물을 배치 동물을 마취하고 신속 단두대 또는 대형 가위를 사용하여 참살.
- 중간 선을 따라 피부를 잘라 그것은 귀에 밀어 넣습니다.
- 가위의 벌금 쌍을 사용하여 중간 선을 따라 두개골을 잘라. 토륨 최대한 가까운 블레이드 유지E면은 하부 뇌 손상을 최소화하기 위해. , 핀셋 한 쌍의 두개골을 열고 시신경과 뇌간을 절단하고 부드럽게 얼음처럼 차가운 ACSF의 뇌를 드롭 주걱을 사용합니다.
- 소뇌와 메스 (블레이드 24)와 두 개의 반구를 분리합니다.
- 두 반구 중 하나에서 여분의 물을 제거하고 superglue 한 방울을 사용하여 경사 플랫폼에 접착제. 빨리 뇌 위에 ACSF 몇 방울을 추가하고 vibratome 챔버로 옮긴다.
주 : 시상 조각을 제조 할 때, 플랫폼의 각도 슬라이싱 절차 중에 피라미드 세포의 돌기의 손상을 방지하는 것이 중요하다.
- 조각의 준비.
- 뇌를 통해 블레이드를 배치 및 제 2.5 폐기 - 3mm를. 반면 슬라이싱 절차에 필요한 시간을 최소화하는 동시에 조각의 표면에 대한 손상을 제한하는 속도 및 주파수를 조정한다.
- 300 μ 두께로 설정M과 슬라이스를 시작합니다. 날이 피질을지나 간 후, 면도날 또는 해마 이상 관심의 대뇌 피질 영역의 가장자리에서 절단 할 수있는 구부러진 바늘을 사용합니다.
- 34 ° C - 멀티 웰 배양 챔버에서 슬라이스 (32)에서 유지 놓는다.
- 블레이드를 후퇴 5 점까지 2.3.2과 2.3.3를 반복 - 8 조각이 절단된다. 가장 일반적으로 슬라이스 혈관 표면에 평행 한 것들이다.
- 마지막 슬라이스 챔버에 배치 된 후 30 분 동안 인큐베이션 슬라이스.
레이어 5 피라미드 뉴런 3. 패치 클램프 녹음
- 녹화 실에서 조각을 놓고 건강한 세포를 검색합니다. 이 세포는 일반적으로 낮은 반면, 매끄러운 외관이 부어 없습니다.
- 뇌의 표면에서 약 600 μm의 1,000에 위치하고, 40X 배율 렌즈와 현미경 슬라이스를 검사하고 층 (5)에서 세포를 검색합니다. 적절한 세포가 발견되면, ICS와 마이크로 피펫의 부하 삼분하고 headstage에 넣습니다.
- 라이브 CD 또는 사전 구성된 리눅스 운영 체제를 실행하는 개인용 컴퓨터에서 명령 쉘 (예를 들어, bash는)이 실행되고 프롬프트에서 명령 LCG 제로. 이것은 DAQ 보드 증폭기를 구동되지 않는 것을 보장한다.
- (30) 적용 - 현미경의 도움으로, 피펫 홀더에 튜브에 의해 연결되어있는 일반적인 주사기의 피스톤을 눌러 긍정적 인 압력의 50 밀리바을, 슬라이스 위의 피펫을 약 100 ㎛를 놓습니다.
참고 : 바람직하게는 미세 조작기의 접근 모드를 사용하여, 표적 세포에 직접 경로를 할 수있는 위치에 피펫을 놓습니다. - 컨트롤에 전기 생리학 증폭기 연기, 오프셋 피펫 및 출력 전압 클램프 모드에서 테스트 펄스 (10 MV)를 조정한다.
- 철수 30 밀리바 (피펫의 크기에 따라) - (10)에 압력을 감소주사기의 피스톤; 부드럽게 세포 접근과 비디오 카메라 모니터에 화상을 관찰함으로써 딤플의 형성을 확인. 항상 저항의 증가에 대한 테스트 펄스 모니터, 전기 생리학 증폭기에 연결된 오실로스코프에 표시 전류 파형을 보면서 (또는 당신 피펫 저항을 모니터링하는 명령 LCG 밀봉 테스트를 사용할 수있다).
- 압력을 해제하고 피펫 저항의 증가 및 셀에 "딤플"의 형성을 확인할 때 필요하다면 밀봉 형성을 돕기 위해 부드럽게 피펫에 부압을 적용한다.
- 씰 형태이지만, 점차 MV를 -70 유지 가능성을 줄입니다.
- 30 pA를 - 기가 옴 밀봉을 얻을되면, 홀딩 전류가 0 사이에 있는지 확인하십시오. 멤브레인을 깰 전체 셀 구성을 설정하는 부압 (흡입)의 짧은 펄스를 적용합니다. 또는, (전압의 강하고 짧은 펄스를 삽입 할 수
- 현재 클램프 모드로 전환하고 휴식 막 잠재력이 건강한 세포의 전형적인 있는지 확인합니다. 글루 콘산 칼륨 계 용액을 사용하여 피라미드 피질 뉴런의 경우,이 값은 일반적으로 사이 -65 -75 MV이다.
신경 세포의 전기 응답 특성의 4. 반자동 특성
- 사용자의 데이터를 저장할 디렉토리를 작성하십시오. 스크립트가 날짜를 기준으로 폴더를 생성 라이브 LCG CD에 포함이 고용을하기 위해. 명령 프롬프트에서 그것을 사용하려면
CD ~ / 실험
LCG가 작성-실험 폴더는 PSP, in_vivo_like을 -s
이것은 그 셀에 대한 데이터가 저장 될 폴더 (및 하위 폴더 'in_vivo_like' 'PSP'등) 생성하고이 단말기에 자사의 이름을 인쇄합니다창문; 그러한 피펫 저항이 스크립트를 사용하는 세포의 종류에 따라 추가 정보를 저장하는 것도 가능하다. - 명령을 사용하여 새로 만든 폴더로 디렉토리를 변경
CD ~ / <폴더 이름>
폴더 이름은 20140331A01에서와 같이 명령의 LCG-- 실험 - 폴더를 생성하고 현재 날짜의 타임 스탬프를해야합니다 (즉, 년 - 월 - 일)에 의해 표시되는 것입니다. - 증폭기는 클램프 전류 모드로 동작하도록 설정되어 케이블이 연결되고, 상기 증폭기의 외부 전압 명령이 존재하는 경우, 활성화되어 있는지 확인.
- 명령 LCG-ecodeat에게 명령 프롬프트를 입력합니다. 이 셀의 기본 응답 특성을 특성화하는 데 사용되는 일련의 명령 (즉 LCG-AP, LCG-VI, LCG-램프, LCG 타우와 LCG-단계)를 호출합니다. LCG-ecode는 사용자가 두 개의 매개 변수를 지정하는 것이 필요하다 : 단일 셀에서 스파이크를 유발하기 위해 사용되는 전류의 MS-1 긴 펄스의 진폭 및 RAM 전류의 최대 진폭을P는 rheobase을 찾는 셀에 주입.
다음 명령 구문을 사용합니다 :
LCG-ecode --pulse 진폭 X --ramp 진폭 Y
각각 한 MS-긴 펄스 전류의 지속적인 주입에 응답하여 셀 불을하기에 충분한 값 X와 (PA)에서의 Y와 선택.
주 :이 프로토콜은 전극 활성 보정 (AEC) (15)를 사용하기 위해 '전극 커널'의 수치 추정을 수행 필요. 노이즈 전류 주입은 커널을 추정하는데 사용되며, 사용자는 커널을 이루는 샘플 개수를 확인하는 메시지가 표시된다. 전극 커널의 의미와 방법 커널 샘플의 수를 선택하는 방법에 대한 자세한 정보는 15을 참조하십시오.
시뮬레이션 시냅스 및 생체 -like 배경 작업의 시뮬레이션을 통해 컨덕턴스 5. 주입
- 시뮬레이션 흥분성 시냅스 후 전위의 주입
- 당신은 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여 다음 실험을 절약 할 디렉토리로 변경
CD의 PSP / 01 - 현재 디렉토리에 LCG 구성 파일을 복사하고 (이 예제 구성 파일이 소스 코드와 라이브 CD에 포함되어 있습니다) 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여 (이 예에서는 나노) 텍스트 편집기에서 엽니 다 :
CP ~ / 지역 / SRC / LCG / 구성 / epsp.xml
나노 epsp.xml
주 :이 단순히 서로 연결 다른 기관과 텍스트 파일이다. 자세한 내용은 대표 결과 섹션을 참조하십시오. - 필요한 편집 inputChannel, outputChannel, inputConversionFactor이 파일의 outputConversionFactor는 사용자의 설정과 일치하도록합니다.
- COM을 실행하여 '단일 전극 동적 클램프를 수행하기 위해 LCG에 의해 사용 된 방법'전극 활성 보정을 수행하기 위해 필요한 전극 커널을 계산MAND
LCG 커널
이 커널에서 점의 수를 입력하라는 메시지가 표시됩니다. 전극 커널 지수 감쇠 꼬리의 끝 부분을 덮도록 다시 번호를 선택한다. - 명령을 사용하여 동적 클램프 실험을 수행
-c epsp.xml을 LCG는-실험 - 파일리스트 및 명령을 사용하여 결과를 시각화
LS -l
마지막 -f LCG-플롯 파일
- 당신은 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여 다음 실험을 절약 할 디렉토리로 변경
- 시뮬레이션 억제 시냅스 후 전위의 주입
- 폴더를 생성하고 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여에 epsp.xml 파일을 복사 :
MKDIR ../02
CP epsp.xml ../02/ipsp.xml
CD ../02 - 텍스트 편집기를 이용하여 구성 파일을 편집 반전 시냅스 전위를 변경하고 다음에 모델 시냅스 Exp2Synapse 상수의 상승 및 감쇠 시간 :
매개 변수>
<E> -80 </ E>
<tauRise> 0.8e-3 </ tauRise>
<TauDecay> 10E-3 </ tauDecay>
<매개 변수>
텍스트 편집기를 종료합니다. - 전극 커널을 계산하고 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여, 5.1에서와 같이 실험을 수행 :
LCG 커널
-c ipsp.xml을 LCG는-실험 - 파일을 나열하고 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여, 그 결과를 시각화 :
LS -l
LCG-플롯 파일 -f <filename.h5>
- 폴더를 생성하고 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여에 epsp.xml 파일을 복사 :
- 생체 -like 배경 활성의 시뮬레이션 :
- 이전 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여 그림과 같이, 다음과 같은 실험을 저장할 디렉토리로 변경
CD ../../in_vivo_like/01 - LCG 소스 디렉토리에서, 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여 구성 파일을 복사합니다
CP ~ / 지역 / SRC / LCG / 구성 / in_vivo_like.xml
나노 in_vivo_like.xml - 5.1.3에 기술 된 바와 같이, 사용자의 설정에 DAQ 구성 매개 변수를 조정하고 편집기를 종료합니다.
- 전극 커널을 계산하고 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여, 5.1에서와 같이 실험을 수행 :
LCG 커널
10 -i 3 -n -c in_vivo_like.xml을 LCG는-실험
-N '10'및 '-i 3'스위치 자극 세 초 간격으로 10 회 반복되어야한다는 것을 나타낸다. - 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 사용하여 원시 흔적을 시각화 :
LCG-플롯 파일 -f 모든
- 이전 쉘의 명령 프롬프트에서 다음 명령을 입력하여 그림과 같이, 다음과 같은 실험을 저장할 디렉토리로 변경
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Representative Results
이전 섹션에서, 우리는 L5 피라미드 세포의 전기 생리 학적 특성을 특성화하는 소프트웨어 툴박스 LCG를 사용하고, 슬라이스 조제에서 생체 -like 시냅스 활성을 다시하는 방법을 설명 하였다. 명령 라인 인터페이스 및 반자동 프로토콜의 사용은 생성 된 데이터의 출력과 품질에 큰 영향을 미칠 수 실험의 재현성과 효율을 선호. 데이터가 일관된 방식으로 저장이기 때문에, 실제로는 특정 목표에 대한 분석을 확장하기 용이하다. (1)는 여섯 별개의 프로토콜을 이용하여 셀의 기본 전기 생리 학적 특성을 특징으로되어있는 실험의 전형적인 결과를 나타낸다.
활동 전위 모양 및 임계치 (도 1a)의 측정 : 짧은 전류 탈분극의 강한 펄스는 평균 활동 전위 모양을 측정하기 위해 주입된다. 스파이크는 임계활동 전위 (24)의 세 번째 도함수의 제 1 피크로 계산. 전압 - 전류 곡선 (도 1b)의 측정은 : 서브 임계치 전류 펄스는 이러한 입력 저항과 하위 임계 이온 전류의 특성 등의 수동 응답 특성의 측정을 허용하는, 세포 내로 주입된다.
지속적인 발사 (그림 1C)를 도출하기위한 최소한의 충분한 전류의 측정. 현재의 주입 램프는 유형 I 또는 II 형 발진기 (25)와 셀의 특성 수 있습니다. 주파수 전류 (FI) 곡선 (도 1D)의 측정 : 주입 전류 순시 소성 주파수의 함수이며,도 5에서 설명한 폐쇄 루프 프로토콜을 사용 때마다 셀 스파이크를 갱신한다. 이 기술을 사용하여, 인터넷 곡선의 신뢰성 추정이 30 초 미만으로 얻을 수있다. membran의 측정즉 시간 (도 1E) 전율 : hyperpolarizing 짧은 전류 펄스는 멤브레인의 패시브 완화 특성을 측정하기 위해 제공된다. 이 펄스는 일정한 막 시간 (이 경우 44 MS)를 계산하는 이중 지수에 적합합니다.
적응 계수 및 탈분극 전류 (도 1F)에 대한 응답은 : 현재의 두 문헌 임계 값 (첫번째와 마지막 간 스파이크 간격 간의 비율) 적응 계수를 측정하기 위해 주입된다. 설명 된 것과 같은 프로토콜의 일련의 자동화 된 애플리케이션은 건강과 질병 모두에서 주요 전기 생리 학적 특성의 관점에서 각각의 기록 셀의 특성을 허용하고 다른 신경 세포의 종류와 역할을 비교 대상으로 어떤 노력을위한 기본적인 단계를 구성한다.
LCG 전문 프로토콜을 구현하는 여러 스크립트가 포함되어 있지만, 전력 및 도구 상자의 유연성의 대부분은 거주능력의 설정 파일을 이용하여 실험을 설명한다. 초합니다. 5 이는 뉴런으로 시뮬레이션 배경 활성을 주입하는 동적 클램프를 수행하는 방법을 설명한다. 여기서 구성 파일 및 엔티티들의 개념이 도입된다. 구성 파일은 단순히 주어진 실험을 수행하기 위해 필요한 모든 기본 빌딩 블록 (불리는 엔티티들)의 이름 및 배선을 포함하는 텍스트 파일이고; 공유하고 실험 패러다임을 재사용 같이 이러한 이유로, 연결 실체에 의해 새로운 패러다임을 설계하는 것은 상대적으로 쉬운 작업입니다. 도 2에 도시 된 실험에서, 다섯 엔티티가 사용된다 :
H5Recorder은 : 압축 파일에 연결된 개체를 기록합니다. 그러한 파이썬 MATLAB과 같은 대부분의 프로그래밍 언어에 의해지지되기 때문에 HDF5 파일 포맷이 선택되었다.
RealNeuron는 : 실시간 재의 기술적 측면에 추상화 계층을 제공한다cording 및 사출. 그것은 데이터 수집 보드에 대한 정보를 포함하고 온라인 전극 활성 보정을 수행한다. 활동 전위가 임계 값 초과에 의해 검출 될 때, 리얼 뉴런은 또한 이벤트의 형태로 스파이크를 출력한다 :이 실험 중에 연소율을 모니터링 또는 인공 시냅스와 인터페이스 인스턴스에 대해 이용 될 수있다.
푸 아송 : 특정 속도 지수 분포 다음 스파이크 열차를 생성합니다. 시험 일관 재생 될 수 있도록이 프로세스의 시드가 수정 될 수있다.
SynapticConnection은 : 발전기에서 스파이크를 받아 지정된 지연 시간 후 적절한 시냅스로 중계한다.
Exp2Synapse : 이중 지수 시냅스의 모델. 그것은 반전 잠재력과 상승과 부패 시간 상수가 포함되어 있습니다.
앞서 언급 한 바와 같이, 각각의 엔티티는 하나 이상의 기타 t에 접속되고O 실험을 구성한다. 장에서 설명 흥분성 시냅스 후 전류의 시뮬레이션 예에서. 5.1, RealNeuron과 Exp2Synapse 모두 각각 막 전압과 시냅스 전류를 파일로 저장, H5Recorder에 연결되어 있습니다. 포아송 엔티티는 차례대로 한 후 MS Exp2Synapse에 이벤트를 전달한다 SynapticConnection, 2 Hz의 주파수에서 발생하는 스파이크를 제공한다. 마지막 Exp2Synapse 엔티티 RealNeuron에 접속된다. 초 후 도시 된 바와 같이,이 구성 파일의 작은 변화를 사용. 5.2 및 5.3, 하나는 억제 전류를 시뮬레이션하고 생체 -like 활동을 다시 만들 수 있습니다.
도 2에서이 동적 클램프 구성에 의하면, 하나의 인공 시냅스가 뉴런으로 유도 전류를 시뮬레이션에 의해 제어되는 방식으로 시냅스 통합을 연구하는 방법을 도시한다.도 2a (상단)은 개별 시냅스 후 전위를 나타낸다 (상부 ) 함께 INJ와반사된다 전류. 레드 (블루) 흔적은 흥분성 (억제) 이벤트를 나타낸다. 주입 된 전류는 막 전압의 가상 시냅스의 활성화에 관련된 전도도의 변화의 함수임을 유의.
시냅스에 높은 주파수에서 포아송 스파이크 열차 전달함으로써, 생체 -like 배경 활성은 (도 2B 및 2D) 시뮬레이션 될 수있다. 비록 큰 전류가 하나의 전극을 동시에 전류 주입하기 위해 사용되는 경우에도 (도 2B의 하부에 검은 트레이스) 스파이크 형상 (도 2C)의 영향을받지되는 전극 활성 보상 보증을 주입 할 때 급상승 중 멤브레인 전압을 기록한다. 같은 전도 파형 여러 실험을 반복하는 것이 가능 다른 synapti의 기여를 분리하고,보다 현실적인 프레임 워크 (23)의 일을 연장 할 수 있습니다신뢰성과 스파이크 타이밍의 정밀도 C 전류.
도 3은 두 개의 연결되지 않은 피라미드 세포로부터 동시에 기록 disynaptic 억제의 형태를 시뮬레이션하는 가상 GABA 성의 interneuron를 사용하여 얻어지는 하이브리드 네트워크의 간단한 예를 도시하고, 광범위기구는 대뇌 피질 Martinotti 세포의 활성화를 포함하는. 26 27도 3a는 실험 장치의 개략도를 보여줍니다 실제, 연결되지 않은 피라미드 세포 (검은 색과 빨간색 삼각형) 한 쌍의 인위적 새는 통합 및 화재 신경 세포로 모델링, 시뮬레이션 GABA 성을 interneuron를 통해 연결되어있다. 시냅스는 interneuron과 시냅스 피라미드 셀을 연결하는 동안, homosynaptic 단기 촉진이 Tsodyks-Markram 모델 (28)에 따라 구현 interneuron 디스플레이에 연접 피라미드 세포를 연결하는 시냅스는 상승과 붕괴 TI와 biexponential 시냅스입니다날은 각각 1 내지 10 밀리 상수.
두 연결 가중치 MV.도 3b 및도 3c는 90 Hz에서 전달 세포 펄스 트레인에 연접 피라미드 신경 세포의 응답을 보여 약 2 시냅스 막 전위의 편향과 시뮬레이션에 대응 EPSPS를 갖도록 조정 하였다 interneuron :. 시냅스 연결의 파라미터 인공 뉴런 3 연접 버스트 후에 스파이크를 방출 갖기 위해 조절 된 - 실험적으로보고, 고주파에서 4 스파이크 26,29도 3d는에 disynaptic 억제 효과를 나타낸다 실제 시냅스 피라미드 세포 :. 10 시도가 중첩, 신경 세포가도 2에 기술 된 것과 유사한 동결 생체 -like 배경 활성을 자극하는이 세 억제 IPSPs에 응답 신뢰성 증가를 참고전압 트레이스 아래 적색 파선으로 나타낸 바와 같이, 억제 세포의 활성화 후에 작은 스파이크 지터에 반영.
그림 1. 전형적인 피라미드 세포의 전자 코드 프로토콜의 패치 L5 피라미드 뉴런 출력 그림의 전기 생리 특성.; 정량화이 자동으로 수행되고 더 이상 편집 할 필요가 없습니다. 활동 전위 임계 값 (점선 -50.5 MV)의 (A) 계산. rheobase 전류 (123 연평균)을 측정하는 현재의 탈분극 증가. (D) 발사 주파수에 레드 라인이 평균 활동 전위 모양입니다. hyperpolarizing 전류 (아래)에 수동 응답 (위)의 (B)를 측정. (C) 응답 주입 된 전류의 함수로서, 폐 루프 방법을 사용하여 측정. 각각의 회색 점은 한 쌍에 위치(현재는 interspike 간격의 역수를 주입). 셀의 기본 활성 특성의 적색 곡선 데이터 포인트에 선형 피팅이며 점선은 패널 (C)에서 측정 rheobase를 나타낸다. 일정한 막 시간 (43.8 MS)의 (E)를 측정한다. (F) 식별 셀이 일반 급상승 신경 세포가 있음을 밝혀 최소한의 적응이 있음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동적 클램프를 사용하여 활동 등에 vivo- 그림 2. 레크리에이션. (A) 흥분성의 시뮬레이션 (빨강, 초. 5.1)과 억제 (파란색, 초. 5.2) 시냅스, 회색 흔적은 같은 실험의 다른 실현이다. (B ) (C) 도형의 실험 (B) 중에. 20 시험 양단에 발생 스파이크 (D) 래스터 플롯 신경 세포는 23에서와 같이 동일한 입력에 응답하여 매우 안정적이고 정확한 될 수 있음을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시뮬레이션 억제 interneuron 통해 disynaptic 억제 그림 3. 시뮬레이션 녹화 설정의 (A) 도식은 :. 검은 색과 빨간색 피라미드 동시에 기록 된 실제 피라미드 세포의 쌍을 나타냅니다. 검은 색과 빨간색은 각각 시냅스와 시냅스 후 뉴런을 나타냅니다. 파란색 원 차례로 적색 피라미드 세포를 억제하는 것이, 흑색 피라미드 세포 접촉 가상 GABA 성의 interneuron을 나타낸다. (B)는 90 Hz의 주파수에서 제공 펄스 트레인 실제 연접 피라미드 신경의 반응에 의해 지시 전압 추적 위의 오렌지 대시. 전압 추적 아래의 검은 색 대시는 시간의 활동 전위가 시냅스 세포에 의해 방출 된 나타냅니다. 시냅스 세포에 의해 방출 스파이크의 기차 시뮬레이션 interneuron의 (C) 응답. (D)모의 interneuron의 활성화에 응답하여 실시간 시냅스 피라미드 세포로부터 기록 열 전압 트레이스 중첩. 시냅스 후 세포는 안정적인 전압 역학을 얻기 위해, 냉동 생체 -like 배경 활성을 자극했다. 전압 흔적 아래 빨간색 대시 연속 시험 동안의 시간, 활동 전위를 방출 시냅스 후 뉴런을 나타냅니다. 시험에서 낮은 스파이크 지터로 표시 interneuron의 활성화 후 증가 된 정밀도를 참고.
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Discussion
이 텍스트 실시간 구현에 대한 전체 프로토콜에서, 폐쇄 루프 단일 세포 전기 생리 실험은 패치 클램프 기술과 LCG라는 최근에 개발 된 소프트웨어 도구를 사용하여, 기술되었다. 레코딩의 품질을 최적화하기 위해 그 녹화 설정이 적절하게 접지 된 프리 실드 진동 인 것이 중요하다 :이 셀, 안정적이고 지속적인 전체 세포 접근을 보장 함께 자극 프로토콜의 전체 부분을 자동화 가능성있는 실험의 처리량을 극대화 할 수 있습니다.
LCG가 제시되어 적용될 수있는 두 가지 경우, 즉 신경 세포의 활성의 입력 - 출력 관계의 빠른 계산을 포함하여 전기 생리 학적 특성 (도 1)의 측면에서 전지의 특성 및 생체 -like의 레크리에이션 뇌 슬라이스 활동 (그림 2). SUCH 응용 프로그램은 어떻게 서로 다른 프로토콜을 구성하는 방법 보여 LCG의 가장 눈에 띄는 기능 중 일부를 강조 : 그 명령 줄 인터페이스 프로토콜의 일련의 자동화 된 애플리케이션을 가능하게 스크립팅 것이 적합하다. 도 1에서 수행 된 바와 같이 또한, 하나의 프로토콜로부터 추출 된 값은 후속 프로토콜 맞춤 매개하는데 사용될 수있다.
그것은 (예를 들어,도 1d에 도시 된 바와 같이 그 순간 소성 율)을 실시간으로 분석중인 셀의 응답의 고차 기능을 모니터링하고 전류를 계산하기 위해 PID 컨트롤러를 사용하여, 예를 들어, 따라서 자극을 수정하는 것이 가능하다 일정 또는 시변 연소율을 유지해야.
LCG와 컨덕턴스 및 동적 클램프 프로토콜의 구현은 간단하며 단지 텍스트 구성 파일을 작성하는 (S)의 사용에 의해 자동화 될 수있는 절차를 필요imple 스크립트. LCG는 새로운 실험 프로토콜을 고안하는 상호 연결될 수 30 개 이상의 요소를 포함한다. 그러나 우리는 그래픽 실험 실행이 실험을 시작하고 비 숙련 된 사용자를 시켜서 매개 변수를 변경 용이하도록 설계되었습니다 명령 줄 인터페이스를 사용하여 LCG를 사용 LCG가 자신의 그래픽 인터페이스를 만들 명령을 결합하는 방법을 설명했다.
RELACS 및 RTXI : 기존의 두 도구 상자는 LCG와 유사한 기능을 제공합니다. 전자는 전기 생리 학적 실험을 수행하고, 기록 된 데이터를 분석하여 어노테이션을위한 플랫폼 모두이다. LCG와 기존 솔루션의 주요 차이점은 커맨드 라인에 기초하여 사용자 인터페이스이다. 이 방법의 장점은 여러 가지이다 : 첫째로, 명령 라인 인터페이스는 아마도 복잡한 스크립트에 의해 표준화되고 반복적 인 작업을 자동화 할 수 있으며, 둘째, 구현 된 좀 더 복잡한 워크 플로우에 실험적 시험 매립 허용파이썬 Matlab과 같은 높은 수준의 스크립트 언어에.
요약하면, LCG의 모듈 특성은 두 가지 방법으로 실험 프로토콜을 사용할 수 있도록 확장 : 제 가장 간단한 하나는 새로운 프로토콜을 수행하는 기존의 개체를 사용하는 애드혹 구성 파일을 작성하는 것이다. C ++를 사용하여 - - 상기 LCG의 능력 및 기능을 확장하는데 사용될 수있는 새로운 기본 객체 번째는 구현된다. 예는이 프로토콜 우려에 뇌 조각에서 개별 세포의 연구를 발표했다. 그러나 유사한 프로토콜은 성공적으로 모두 세포 내와 세포 외 신호를 기록하기 위해, 생체 준비에 사용하고, 예를 들면 기록하는 등의 연결을 문화와 같은 생체 준비, 다중 전극 배열을 통한 세포 외 잠재력에 폐쇄에 자극하면서 할 수있다 루프 4.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
References
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