Abstract
Neuroscience experimental está a assistir um interesse crescente no desenvolvimento e aplicação de protocolos de novos e muitas vezes complexas, em circuito fechado, onde o estímulo aplicado depende em tempo real sobre a resposta do sistema. Aplicações recentes vão desde a implementação de sistemas de realidade virtual para o estudo de respostas motoras, tanto em camundongos e em um peixe-zebra 2, para controlar de convulsões seguintes acidente vascular cerebral cortical usando a optogenética 3. Uma das principais vantagens das técnicas de circuito fechado reside na capacidade de sondagem propriedades dimensionais mais altos que não estão directamente acessíveis ou que dependem de várias variáveis, tais como a excitabilidade neuronal 4 e fiabilidade, ao mesmo tempo maximizar a taxa de transferência experimental. Neste contribuição e no contexto de electrofisiologia celular, que descrevem como a aplicação de uma variedade de protocolos de circuito fechado para o estudo das propriedades de resposta de neurónios piramidais corticais, recorded intracelularmente com a técnica de patch clamp em fatias cerebrais agudas do córtex somatossensorial de ratos jovens. Como nenhum software de código aberto disponíveis comercialmente ou fornece todos os recursos necessários para desempenhar eficazmente as experiências descritas aqui, uma nova caixa de ferramentas de software chamado LCG 5 foi desenvolvido, cuja estrutura modular maximiza a reutilização de código de computador e facilita a implementação de novos paradigmas experimentais. Formas de onda de estimulação são especificados usando uma meta-descrição compacta e protocolos experimentais completos estão descritos nos arquivos de configuração baseados em texto. Além disso, LCG tem uma interface de linha de comando que é adequado para a repetição de ensaios e automação de protocolos experimentais.
Introduction
Nos últimos anos, electrofisiologia celular evoluiu a partir do paradigma de ciclo aberto tradicional utilizado em experiências de tensão e de corrente de fixação com os protocolos de circuito fechado modernos. A técnica de circuito fechado mais conhecido é talvez o grampo dinâmico 6,7, o que permitiu a injecção sintética de canais artificiais dependentes da voltagem de íons para determinar a voltagem da membrana neuronal 8, o estudo em profundidade dos efeitos da não-determinístico piscando em canais iônicos sobre a dinâmica de resposta neuronal 9, bem como a recriação in vitro de realista em vivo- como atividade fundo sináptica 10.
Outros paradigmas de circuito fechado que foram propostas incluem o grampo reactivo 11, para estudar in vitro a geração de actividade persistente auto-sustentado, e a resposta braçadeira 4,12, para investigar os mecanismos celulares excitabilidade neuronal subjacente.
ontent "> Descrevemos aqui um quadro poderosa que permite a aplicação de uma variedade de protocolos electrofisiológicas de circuito fechado no contexto de gravações de células inteiras patch clamp realizados em fatias cerebrais agudas. Mostramos como gravar tensão somática membrana por meio de gravações de patch clamp em neurônios piramidais do córtex somatossensorial de ratos jovens e aplicar três protocolos de circuito fechado diferentes usando LCG, uma caixa de ferramentas de software baseado em linha de comando desenvolvido no laboratório de Neurobiologia e teórico Neuroengineering.Resumidamente, os protocolos descritos são, em primeiro lugar a injecção automática de uma série de formas de onda de corrente de fixação de estímulo, relevantes para a caracterização de um grande conjunto de propriedades da membrana activas e passivas. Estes têm sido sugeridos para capturar o fenótipo electrofisiológico de uma célula em termos das suas propriedades de resposta a uma série de formas de onda de estímulo estereotipado. Conhecido como o e-code de uma célula (por exemplo, ver & #160; 13,14), como um conjunto de respostas eléctricas é utilizado por vários laboratórios para classificar objectivamente neurónios na base das suas propriedades eléctricas. Isto inclui a análise da relação de transferência de entrada-saída estacionária (curva FI), por uma técnica inovadora que envolve o circuito fechado, o controlo em tempo real da taxa de disparo por meio de um regulador proporcional-integral-derivativo (PID) , segundo a recriação da in vivo -como fundo atividade sináptica realista em preparações in vitro 10 e, em terceiro lugar a conexão artificial em tempo real de dois neurônios piramidais gravados simultaneamente por meio de um interneurônio GABAergic virtual, que é simulada pelo computador.
Além disso, LCG implementa a técnica conhecida como Ativo Eletrodo Compensação (AEC) 15, que permite a implementação de protocolos de fixação dinâmicos usando um único eletrodo. Isto permite compensar os efeitos indesejáveis (umrtifacts) do eléctrodo de registo que surgem quando é utilizado para a entrega de estímulos intracelulares. O método baseia-se numa estimativa não-paramétrico de as propriedades equivalentes eléctricos do circuito de gravação.
As técnicas e protocolos experimentais descritos no presente documento podem ser facilmente aplicadas na tensão de circuito aberto convencional e experiências de fixação de corrente e pode ser alargado a outras preparações, tais como extracelular 4,16 ou gravações intracelulares, in vivo 17,18. A montagem cuidadosa da configuração para fixação de membranas de células inteiras eletrofisiologia é um passo muito importante para, gravações de alta qualidade estáveis. A seguir vamos supor que uma configuração tal experimental já está disponível para o experimentador, e concentrar a nossa atenção na descrição do uso de LCG. O leitor é apontado 19-22 por mais dicas sobre otimização e depuração.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O protocolo aqui descrito está em conformidade com as recomendações e orientações do Comitê do Departamento de Ciências Biomédicas da Universidade de Antuérpia Ética. Este protocolo requer a preparação de um material não-sensível a partir do cérebro de ratos Wistar explantado juvenis, obtido por técnicas de eutanásia humanas aprovados.
1. Equipamentos Preparação
- Instalar e configurar a aquisição de dados e sistema de estimulação.
- Usar um computador pessoal (PC) equipado com uma placa de aquisição de dados (DAQ) suportado por Comedi para gravar sinais e enviar voltagens analógicas de controlo para o amplificador electrofisiológico.
NOTA: Comedi é um módulo de Linux e biblioteca que suporta uma grande variedade de cartões de aquisição de dados dos fabricantes mais comuns: visitar http://www.comedi.org para mais informações. - No caso de um amplificador de patch clamp controlado por computador está em uso, empregar um segundo PC além do uma dedicada ao amplificadorao controle.
NOTA: Enquanto o último pode executar um sistema operativo convencional, o PC extra será operar em tempo real por meio de um sistema especial de funcionamento. Nestas condições, é conveniente usar um único monitor, mouse e teclado conectado ao PC extra, durante a conexão por um aplicativo de desktop remoto para o PC dedicado. - Baixe a imagem ISO do Live CD que contém um sistema operacional em tempo real com Linux pré-instalado da LCG http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso e queimá-lo em um CD ou USB vara em branco " .
- Basta inserir o CD no drive do PC que contém o cartão DAQ e iniciá-lo. Como alternativa, instale LCG do seu repositório fonte on-line em um PC rodando o sistema operacional Linux (por exemplo, Debian ou Ubuntu). Consulte o manual online para obter detalhes sobre o procedimento de instalação. O manual está disponível online em http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf.
- Arrancar a partir do CD ao vivo: this carregará automaticamente um sistema totalmente configurado. Para fazer isso, coloque o Live CD do LCG no computador unidade de CD-ROM e inicialize o computador a partir do CD; selecionar o kernel de tempo real (opção padrão), logo que o menu de inicialização aparecer e aguarde o sistema para inicializar.
- Calibrar o cartão DAQ, digitando no prompt de comando:
sudo comedi_calibrate
ou
sudo comedi_soft_calibrate
dependendo se a placa de aquisição de dados suporta calibração de hardware ou software, respectivamente (use o comando sudo comedi_board_info para obter informações sobre a bordo). - Defina o conversor analógico-digital adequada e de digital para analógico factores de conversão: este exige ter acesso ao manual do amplificador eletrofisiológico celular e, particularmente, com as respectivas especificações nos seus factores de conversão.
- Use um editor de texto para especificar os valores numéricos apropriados no /home/user/.lcg-env arquivo, para as variáveis de ambiente AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
NOTA: Estes representam a entrada (AI) e de saída (AO) ganhos para alicate de corrente (CC) ea braçadeira de tensão (VC) modos, e os fatores de conversão entre os comandos de tensão fornecidas pelo computador e que o actual ou tensões geradas pelo amplificador , respectivamente. - Como alternativa, use o script LCG fornecida (LCG-achado-conversão-factores), para encontrar os fatores de conversão de seu sistema.
NOTA: Os valores calculados pela LCG-encontrar-conversão-fatores são suposições, que em alguns casos são necessários para ser numericamente truncado ou arredondados para refletir os valores exatos dos factores de conversão. - Para usar lcg encontrar-conversão-fatores, comece conectando a "célula modelo", que muitas vezes é comprado com o amplificador para o headstage correspondente. Em seguida, abra um terminal na máquina Linux onde você está executando o Live CD e digite o seguinte comando no prompt shell:
lcg-encontrar-conversão-fatores -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env
NOTA: Em ambos os casos (ou seja, modificação manual de /home/user/.lcg-env ou uso de LCG-achado-conversão-factores), fechar e abrir o terminal para que as alterações tenham efeito. - Se forem usadas várias headstages, defina os fatores de conversão para os mesmos valores em todos os canais; se isso não for possível, consulte o manual online LCG para entender como usar vários factores de conversão em LCG-estímulo ou como produzir arquivos de configuração que melhor se adequam às necessidades do usuário.
- Usar um computador pessoal (PC) equipado com uma placa de aquisição de dados (DAQ) suportado por Comedi para gravar sinais e enviar voltagens analógicas de controlo para o amplificador electrofisiológico.
2. Preparação de fatias do cérebro do aguda do córtex somatossensorial
- Preparação de soluções para eletrofisiologia.
- Preparar fluido cerebrospinal artificial (ACSF) através da mistura de (em mM) 125 de NaCl, 2,5 de KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 25 de glucose, 2 CaCl2, 1 MgCl2 e. Prepare 10x soluções estoque para reduzir oo tempo de preparação, no dia da experiência. Preparar 2 L, dos quais um será usado para a preparação das fatias e a outra para a gravação.
- Saturar o ACSF com 95% de O2 e 5% de CO 2 durante pelo menos 30 minutos antes do início do procedimento.
- Para gravações de controle de corrente, usar uma solução intracelular (ICS) contendo (em mM) 115 de K-gluconato, KCl 20, 10 de HEPES, 4 de ATP-Mg, 0,3 Na 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Preparar a solução em gelo e filtrá-la antes do início das gravações para eliminar o risco de entupimento da pipeta.
- Extracção do cérebro.
- Anestesiar o animal colocando o animal em uma câmara de indução com 4% de isoflurano e rapidamente decapitar-lo usando uma guilhotina ou tesouras grandes.
- Corte a pele ao longo da linha média e deslize-o para os ouvidos.
- Usando um belo par de tesouras cortou o crânio ao longo da linha média. Mantenha a lâmina mais perto possível para poe a superfície de modo a minimizar os danos no cérebro subjacente. Abra o crânio com um par de pinças, utilizar uma espátula para separar o nervo óptico e do tronco cerebral e do cérebro cair suavemente em ACSF gelado.
- Separa-se o cerebelo e os dois hemisférios com um bisturi (lâmina 24).
- Remover o excesso de água a partir de um dos dois hemisférios e colá-la sobre uma plataforma inclinada utilizando uma gota de supercola. Rapidamente adicionar algumas gotas de ACSF sobre o cérebro e transferi-lo para a câmara de vibratome.
NOTA: Ao preparar fatias sagital, o ângulo da plataforma é importante para evitar danificar os dendritos das células piramidais durante o procedimento de corte.
- Preparação das fatias.
- Posicione a lâmina sobre o cérebro e descartar o primeiro 2,5-3 mm. Ajustar a velocidade e frequência para limitar os danos à superfície da fatia e, ao mesmo tempo, minimizando o tempo necessário para o procedimento de corte.
- Defina a espessura de 300 μm e começar a cortar. Uma vez que a lâmina foi passado o córtex, utilizar uma lâmina de barbear ou de uma agulha dobrada para cortar acima do hipocampo e nas bordas da área cortical de interesse.
- Coloque as fatias numa câmara de incubação de poços múltiplos mantida a 32-34 ° C.
- Retrair a lâmina e repita pontos 2.3.2 e 2.3.3 até 5-8 fatias são cortadas. Os melhores fatias são normalmente aqueles em que os vasos sanguíneos são paralelas à superfície.
- Incubam-se as fatias durante 30 min após a última fatia é colocado na câmara.
3. Gravações patch-clamp de Camada 5 piramidais neurônios
- Coloque uma fatia na câmara de gravação e procurar células saudáveis. Estas células normalmente têm menos contraste, uma aparência suave e não estão inchados.
- Inspeccionar a fatia sob o microscópio com a lente de ampliação de 40X e procurar as células em 5 camada, localiza-se, aproximadamente, 600 a 1000 um a partir da superfície do cérebro. Uma vez que uma célula adequada, a carga de um terço da micropipeta com o ICS e colocá-lo no andar de entrada.
- No computador pessoal executando o CD ao vivo ou o sistema operacional Linux pré-configurado, abra um shell de comando (por exemplo, bash) e pelo seu tipo prompt de comando LCG-zero. Isso garante que a placa DAQ não está dirigindo o amplificador.
- Aplicar 30 - 50 mbar de pressão positiva, pressionando o pistão de uma seringa comum, ligada por tubagem para o suporte da pipeta e, com a ajuda de um microscópio, colocar a pipeta de aproximadamente 100 mm acima da fatia.
NOTA: Coloque a pipeta numa posição que permite uma via directa para a célula alvo, de preferência usando o modo de abordagem do micromanipulador. - Agindo sobre os controles do amplificador eletrofisiologia, ajustar o deslocamento pipeta e saída de um pulso de teste (10 mV) no modo braçadeira de tensão.
- Reduzir a pressão para 10 - 30 mbar (dependendo do tamanho da pipeta), retirando oêmbolo da seringa; aproximar suavemente a célula e verificar a formação de uma ondulação, observando a imagem no monitor da câmara de vídeo. Monitore o pulso de teste para um aumento da resistência em todos os momentos, observando a forma de onda atual exibida no osciloscópio ligado ao amplificador eletrofisiologia (alternativamente, você pode usar o LCG-seal-teste de comando para monitorar a resistência pipeta).
- Libertar a pressão e, se necessário aplicar pressão negativa suave para a pipeta para ajudar a formação de selo quando se detectar um aumento na resistência da pipeta e a formação de uma "ondulação" na célula.
- Enquanto as formas de vedação, gradualmente, diminuir o potencial de realização de -70 mV.
- Uma vez que um selo gigaohm tenha sido obtida, garantir que a corrente de retenção é entre 0-30 pA. Aplicar pulsos curtos de pressão negativa (sucção) para quebrar a membrana e estabelecer a configuração de célula inteira. Alternativamente, você pode injetar pulsos fortes e breves de tensão (
- Alternar para o modo pinça de corrente e verificar se o potencial de repouso da membrana é típica de uma célula saudável. Para neurônios piramidais corticais usando uma solução baseada em potássio-gluconato, este valor é geralmente entre -65 e -75 mV.
4. Caracterização semi-automática de Imóveis resposta elétrica do neurônio
- Crie um diretório para armazenar os dados do usuário. A fim de fazer isso a empregar um script incluído no LCG vivo CD que cria pastas com base na data. Para usá-lo, digite no prompt de comando
cd ~ / experiências
LCG-criar-experimento-pasta-s psp, in_vivo_like
Isto irá criar uma pasta onde os dados para essa célula será salvo (e um 'psp' e 'in_vivo_like' subpastas) e ele irá imprimir o seu nome para o terminaljanela; também é possível armazenar informações adicionais, tais como a resistência da pipeta e tipo de célula usando este script. - Altere o diretório para a pasta recém criada usando o comando
cd ~ / <foldername>
O nome da pasta é a que é exibida pelo comando LCG-criar-experimento de pasta e terão o carimbo de hora do dia atual (ou seja, ano-mês-dia), como em 20140331A01. - Certifique-se de que o amplificador é configurado para operar no modo de alicate de corrente, de que os cabos estão conectados e de comando externo de tensão do amplificador, se presente, está habilitado.
- Digite o comando LCG-ecodeat prompt de comando. Isso exige uma série de comandos (ou seja LCG-ap, lcg-vi, lcg-ramp, lcg-tau e LCG-passos), utilizado para caracterizar as propriedades básicas de resposta da célula. LCG-ecode requer que o utilizador especificar dois parâmetros: a amplitude do 1 ms de duração de impulso de corrente usada para induzir um único pico na célula, e a amplitude máxima da corrente de carneirop injectado para dentro da célula para encontrar a sua reobase.
Use a seguinte sintaxe de comando:
LCG-ecode --pulse-amplitude X---ramp amplitude Y
com uma escolha dos valores de x e Y (em Pa) que são suficientes para tornar o fogo de células em resposta a um 1 ms de duração de pulso e uma injecção de corrente contínua, respectivamente.
NOTA: Estes protocolos exigem a execução da estimativa numérica do 'kernel do eléctrodo ", a fim de usar o eletrodo de Compensação Ativa (AEC) 15. A injeção de corrente ruidosa é usado para estimar o kernel eo usuário é solicitado a confirmar o número de amostras que compõem o kernel. Veja 15 para obter informações detalhadas sobre o significado do kernel do eletrodo e como escolher o número de amostras do kernel.
5. Injeção de condutância através simulados Sinapses e Simulação de In Vivo -como Atividade Fundo
- A injeção de potenciais pós-sinápticos excitatórios simulados
- Mude para o diretório onde você irá salvar o próximo experimento, digitando o seguinte comando no prompt de comando do shell:
psp cd / 01 - Copiar um arquivo de configuração de LCG para o diretório atual e abri-lo com um editor de texto (Nano neste exemplo), digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell (este arquivo de configuração exemplo está incluído no código fonte eo cd ao vivo) :
cp ~ / local / src / lcg / configurações / epsp.xml
nano epsp.xml
NOTA: Este é simplesmente um ficheiro de texto com diferentes entidades ligadas uma à outra. Para mais detalhes veja a seção Resultados Representante. - Se necessário editar o inputChannel, outputChannel, o inputConversionFactor eo outputConversionFactor neste arquivo para coincidir com a configuração do usuário.
- Calcule o kernel eletrodo necessário para executar a compensação eletrodo ativo 'o método utilizado pela LCG para executar eletrodo único grampo dinâmico ", emitindo o command
LCG-kernel
Isto irá pedir para o número de pontos do kernel. Novamente, seleccionar um número de modo a que o núcleo de eléctrodo cobre a extremidade da cauda de decaimento exponencial. - Realizar o experimento braçadeira dinâmica usando o comando
LCG-experimentar epsp.xml -c - Listar os arquivos e visualizar os resultados usando o comando
ls -l
LCG-plot--f arquivo último
- Mude para o diretório onde você irá salvar o próximo experimento, digitando o seguinte comando no prompt de comando do shell:
- Injeção de potenciais pós-sinápticos inibitórios simulados
- Crie uma pasta e copiar o arquivo para epsp.xml-lo digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell:
mkdir ../02
cp epsp.xml ../02/ipsp.xml
cd ../02 - Edite o arquivo de configuração usando um editor de texto: mudar o potencial reversão sináptica e subir e tempo de decaimento constantes do Exp2Synapse modelo sinapse para o seguinte:
parâmetros>
<E> -80 </ E>
<TauRise> 0.8e-3 </ tauRise>
<TauDecay> 10e-3 </ tauDecay>
<parâmetros>
Saia do editor de texto. - Calcule o kernel do eléctrodo e realizar o experimento como em 5.1, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell:
LCG-kernel
LCG-experimentar ipsp.xml -c - Listar os arquivos e visualizar os resultados, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell:
ls -l
LCG-plot-arquivo -f <filename.h5>
- Crie uma pasta e copiar o arquivo para epsp.xml-lo digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell:
- Simulação de in vivo -como atividade de fundo:
- Mude para o diretório onde você deseja salvar o seguinte experimento, conforme demonstrado anteriormente, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell:
cd ../../in_vivo_like/01 - Copie o arquivo de configuração do directório de origem LCG, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell:
cp ~ / local / src / lcg / configurações / in_vivo_like.xml
nano in_vivo_like.xml - Ajustar os parâmetros de configuração DAQ para a configuração do usuário, conforme descrito no ponto 5.1.3 e saia do editor.
- Calcule o kernel do eléctrodo e realizar o experimento como em 5.1, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell:
LCG-kernel
LCG-experimentar in_vivo_like.xml -c -n -i 10 3
Os interruptores '-n 10' e '-i' 3 indicam que a estimulação deve ser repetida 10 vezes em intervalos de três segundos. - Visualize os traços matérias por usando o seguinte comando no prompt de comando do shell:
LCG-plot-arquivo -f tudo
- Mude para o diretório onde você deseja salvar o seguinte experimento, conforme demonstrado anteriormente, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nas seções anteriores, descrevemos como usar a caixa de ferramentas de software LCG para caracterizar as propriedades eletrofisiológicas de células piramidais L5 e recriar in vivo -como atividade sináptica em uma preparação fatia. O uso de uma interface de linha de comando e protocolo semi-automatizado favorecer a reprodutibilidade e a eficiência da experiência, o que pode ter um grande impacto sobre a produção e a qualidade dos dados produzidos. Além disso, uma vez que os dados são guardados de uma forma consistente, é fácil estender a análise a um determinado objetivo. A Figura 1 mostra o resultado típico de um experimento no qual as propriedades eletrofisiológicas básicas de um celular usando seis protocolos distintos foram caracterizados.
Medição da acção forma e potencial limiar (Figura 1A): uma breve e forte impulso de corrente de despolarização é injectado para medir o potencial de acção forma média. O limiar é picocalculada como o primeiro pico da terceira derivação do potencial de acção 24. Medição da curva de corrente-tensão (Figura 1B): sub-limiar de impulsos de corrente são injectados para dentro da célula, permitindo a medição de propriedades de resposta passiva, tais como a resistência de entrada e a caracterização de sub-limiar correntes iónicas.
A medição da corrente mínima suficiente para provocar queima prolongada (Figura 1C). A rampa da corrente injectada permite a caracterização da célula como um tipo I ou tipo II oscilador 25. Medição da curva (Figura 1D) de frequência de corrente (FI): a corrente injectada é uma função da frequência de disparo instantâneo e é actualizada sempre que os picos de células, utilizando o protocolo de circuito fechado descrito no 5. Usando esta técnica, uma estimativa fiável da curva Fi podem ser obtidas em menos de 30 seg. Medição da Membrane constante de tempo (Figura 1E): um impulso de corrente curto hiperpolarizante é entregue para medir as propriedades de relaxação passiva da membrana. Este pulso é então caber a uma dupla exponencial para calcular o tempo de membrana constante (44 ms, neste caso).
Coeficiente de adaptação e resposta a despolarização corrente (Figura 1F): dois valores supra-limiar de corrente são injectados para medir o coeficiente de adaptação (razão entre os primeiros e últimos intervalos inter-pico). A aplicação automática de uma série de protocolos como os descritos permite caracterizar cada célula registados em termos de suas propriedades eletrofisiológicas-chave e constitui o passo fundamental para qualquer esforço teve como objetivo comparar diferentes tipos de neurônios e seu papel, tanto na saúde e na doença.
Embora LCG contém vários scripts que implementam protocolos especializados, a maioria do poder e flexibilidade da caixa de ferramentas residems na capacidade de descrever as experiências por meio de arquivos de configuração. Em Sec. 5 é descrito como executar grampo dinâmico para injetar atividade fundo simulado no neurônio. Aqui o conceito de arquivos de configuração e entidades é introduzido. Um arquivo de configuração é simplesmente um arquivo de texto contendo os nomes e as interconexões de todos os blocos de construção básicos (chamados de entidades) que são necessários para a realização de um determinado experimento; por esta razão, projetando novos paradigmas por entidades de ligação é uma tarefa relativamente fácil, como é compartilhar e reutilizar paradigmas experimentais. Na experiência apresentada na Figura 2, são utilizadas cinco entidades:
H5Recorder: registra as entidades conectadas a um arquivo compactado. O formato de arquivo HDF5 foi escolhida uma vez que é suportado pela maioria dos linguagens de programação como Python e MATLAB.
RealNeuron: fornece uma camada de abstração para o aspecto técnico do tempo real recordões e injecção. Ele contém as informações sobre a placa de aquisição de dados e executa a compensação eletrodo ativo online. Quando um potencial de acção é detectada por cruzamento de limiar, Neuron real também produz um pico em forma de um evento: este pode ser utilizado por exemplo, para monitorizar a taxa de disparo durante a experiência ou a interface com sinapses artificiais.
Poisson: gera trens de pico na sequência de uma distribuição exponencial com uma taxa específica. A semente deste processo pode ser fixado de modo que os ensaios podem ser reproduzidos de forma consistente.
SynapticConnection: recebe os picos a partir do gerador e retransmite-os para a sinapse apropriado após um determinado atraso.
Exp2Synapse: Modelo de uma sinapse exponencial dupla. Ele contém o potencial de inversão ea ascensão e decadência constantes de tempo.
Como mencionado anteriormente, cada entidade é ligado a um ou mais outro to compor um experimento. No exemplo da simulação de uma corrente pós-sináptica excitatória descrito no cap. 5.1, tanto o RealNeuron eo Exp2Synapse estão ligados ao H5Recorder, para salvar em arquivo de tensão e corrente de membrana sináptica, respectivamente. A entidade Poisson proporciona picos gerados com uma frequência de 2 Hz para a SynapticConnection, que por sua vez fornece os eventos para o Exp2Synapse depois de 1 ms. Finalmente, a entidade Exp2Synapse está ligado ao RealNeuron. Usando pequenas variações deste ficheiro de configuração, como mostrado na segundos. 5.2 e 5.3, pode-se simular correntes inibitórias e recriar in vivo -como atividade.
Na Figura 2 mostra-se como, por meio de uma braçadeira de configuração dinâmica, pode-se estudar a integração sináptica de uma forma controlada através da simulação da corrente induzida em um neurónio por sinapses artificiais. A Figura 2A (topo) mostra potenciais pós-sinápticos individuais (topo ) em conjunto com o injected correntes. (Azul) traços vermelhos indicam excitatórios eventos (inibitórios). Note-se que a corrente injectada é uma função da tensão da membrana e da alteração na condutância associada à activação da sinapse virtual.
Ao entregar trens Poisson pico em freqüências mais altas para as sinapses, in vivo -como atividade fundo pode ser simulada (Figura 2B e 2D). Mesmo durante a cravação quando grandes correntes são injectadas (traço negro na parte inferior da Figura 2B), o eléctrodo de Compensação Activo garantias de que a forma dos picos não é afectada (Figura 2C), embora um único eléctrodo é usado simultaneamente para injectar corrente e registar a voltagem da membrana. Repetindo múltiplos ensaios com as mesmas formas de onda permite que se estende a condutância de trabalho 23 a um quadro mais realista, tornando-se possível separar as contribuições de diferentes synaptic correntes a confiabilidade ea precisão do tempo de pico.
A Figura 3 mostra um exemplo simples de rede híbrida, obtido por gravar, simultaneamente, a partir de duas células piramidais não ligados e usando um interneurônio GABAérgica virtual para simular uma forma de inibição disynaptic, um mecanismo generalizado de que no córtex cerebral envolve a activação de células Martinotti 26., 27 A Figura 3A mostra uma vista esquemática do sistema experimental: um par de células piramidais, desconectados reais (triângulos pretos) e vermelho é artificialmente ligado através de um interneurônio GABAérgica simulado, modelada como um neurónio gotejante integrar-e-fogo. A sinapse que se conecta a célula piramidal pré-sináptico para os interneurônio exibe facilitação homossináptica significa curto prazo implementadas de acordo com o modelo Tsodyks-Markram 28, enquanto a sinapse conectando o interneurônio ea célula pós-sináptica piramidal é uma sinapse biexponencial com a ascensão e decadência time constantes de 1 e 10 ms, respectivamente.
Os pesos de ambas as ligações foram ajustados para ter um desvio no potencial da membrana pós-sináptica de aproximadamente duas mV. A Figura 3B e 3C mostram a resposta do neurónio pré-sináptico piramidal para um trem de pulsos entregues intracelulares a 90 Hz e os EPSPs correspondentes no simulado interneurônio:. os parâmetros da conexão sináptica foram ajustados a fim de ter o neurónio artificial emitem um pico após uma explosão pré-sináptica de 3-4 picos em alta frequência, como relatado experimentalmente 26,29 Figura 3D mostra o efeito de inibição sobre disynaptic o real célula pós-sináptica piramidal:. 10 ensaios são sobrepostas, em que o neurónio é estimulado com actividade in vivo -like fundo congelado semelhante ao descrito na Figura 2 Notar o aumento em termos de fiabilidade, em resposta às três IPSPs inibitórios,reflectido no pico menor instabilidade após a activação da célula inibidora, como indicado pelos traços vermelho sob os vestígios de tensão.
Figura 1. Caracterização eletrofisiológica de um L5 piramidal neurônio figura de saída corrigida do protocolo de e-código para uma célula piramidal típica.; quantificações são executados automaticamente e sem edição adicional é necessária. (A) Cálculo da ação de limite de potencial (linha tracejada -50,5 mV). Linha vermelha é a ação forma potencial média. (B) Medição da resposta passiva (superior) a correntes hiperpolarizantes (em baixo). (C) Resposta a uma crescente corrente de despolarização para medir a corrente reobase (123 Pa). (D) Freqüência Firing como uma função da corrente injectada, medida utilizando uma abordagem de ciclo fechado. Cada ponto cinzento está localizado no par(Corrente injectada, inverso do intervalo interspike). A curva a vermelho é o ajuste linear para os pontos de dados e a linha a tracejado indica a reobase medido no painel (C). (E) medida do tempo de membrana constante (43,8 ms). (F) A identificação de propriedades básicas activos da célula revela que a célula é um neurônio spiking regular e que não há adaptação mínima. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Recreação em vivo- como atividade usando braçadeira dinâmica. (A) Simulação de excitatória (vermelho, Sec. 5.1) e inibitória (azul, Sec. 5.2) sinapses, os traços cinzentos são outras realizações do mesmo experimento. (B ) (C) Formas de os picos durante o experimento em (B). (D) trama Raster dos picos gerados através de 20 ensaios mostra que o neurônio pode ser extremamente confiável e preciso em resposta à mesma entrada como visto em 23. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Simulação de inibição disynaptic através de um interneurônio inibitória simulada (A) esquemático da configuração de gravação:. As pirâmides pretas e vermelhas representam um par de células piramidais reais gravados simultaneamente. Preto e vermelho indicam neurônio pré-sináptico e pós-sináptico, respectivamente. O círculo azul representa uma interneurônio virtual GABAergic, contactado pela célula piramidal preto, que por sua vez inibe a célula piramidal vermelho. (B) Resposta do real neurônio pré-sináptico piramidal para um trem de pulsos entregues a uma frequência de 90 Hz, indicado por os traços de laranja acima do traço de tensão. Os traços pretos abaixo do traço de tensão indicam as vezes potenciais de ação foram emitidas pela célula pré-sináptica. (C) Resposta da interneurônio simulado para o trem de pontos emitidos pela célula pré-sináptica. (D)Sobreposição de 10 vestígios de tensão registadas entre a célula pós-sináptica verdadeira piramidal, em resposta à activação do interneurônio simulada. A célula pós-sináptica foi estimulado com in vivo -como atividade fundo congelado, para obter a dinâmica de confiança de tensão. Os traços vermelhos abaixo os traços de tensão indicam as vezes em que, durante os ensaios sucessivos, os neurônios pós-sinápticos emitidos um potencial de ação. Note-se a maior precisão depois da activação do interneurônio, indicado por um jitter pico inferior em todos os ensaios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste texto um protocolo completo para a aplicação em tempo real, em circuito fechado célula única experimentos eletrofisiológicos foi descrito, utilizando a técnica de patch-clamp e uma caixa de ferramentas de software recentemente desenvolvido chamado LCG. Para otimizar a qualidade das gravações é crucial que a configuração de gravação ser devidamente fundamentada, blindado e vibração livre: Isso garante o acesso de células inteiras estável e duradoura para o celular, que, juntamente com a possibilidade de automatizar seções inteiras dos protocolos de estimulação , permite a maximização do rendimento do experimento.
Dois casos em que podem ser aplicadas LCG foram apresentadas, nomeadamente a caracterização de uma célula em termos de suas propriedades eletrofisiológicas (Figura 1), incluindo o cálculo rápido de relação de entrada-saída de um neurônio ativo, ea recriação de in vivo -como actividade em uma fatia do cérebro (Figura 2). Such aplicações mostrou como construir protocolos distintos e destacou algumas das características mais proeminentes da LCG: sua interface de linha de comando faz com que seja adequado para execução de scripts, que permite a aplicação automática de uma série de protocolos. Além disso, como foi feito na Figura 1, os valores extraídos a partir de um protocolo pode ser utilizado para parâmetros de medida protocolos subsequentes.
É possível monitorizar em tempo real características de ordem mais alta da resposta da célula sob análise (por exemplo, a sua taxa de disparo instantâneo, como mostrado na Figura 1D) e modificar a estimulação em conformidade, por exemplo usando um controlador PID para calcular o actual necessária para manter uma taxa de queima constante ou variável no tempo.
A implementação de protocolos de condutância e braçadeira dinâmica com LCG é simples e requer apenas escrever um arquivo de configuração de texto, um procedimento que pode ser automatizado pelo uso de sos scripts imple. LCG inclui mais de 30 entidades que podem ser interligados para criar novos protocolos experimentais. Nós descrevemos como usar LCG usando uma interface de linha de comando, no entanto, um lançador de experiência gráfica foi projetado para facilitar o arranque experiências e alterações de parâmetros, permitindo que os usuários inexperientes combinar comandos LCG para criar suas próprias interfaces gráficas.
Duas caixas de ferramentas existentes oferecem funcionalidades semelhantes a LCG: RELACS e RTXI. O primeiro é tanto uma plataforma para a realização de experimentos eletrofisiológicos e para analisar e anotar os dados gravados. A principal diferença entre LCG e soluções existentes é a sua interface de usuário com base em uma linha de comando. As vantagens desta abordagem são várias: em primeiro lugar, uma interface de linha de comando permite automatizar tarefas padronizadas e repetitivas por meio de scripts de possivelmente complexos e, por outro, permite a incorporação de ensaios experimentais em fluxos de trabalho mais complicados implementadasem linguagem de script de alto nível, tais como Matlab ou Python.
Em resumo, a natureza modular de LCG permite expandir o número de protocolos experimentais disponíveis de duas formas: a primeira e mais simples é por escrever arquivos de configuração ad hoc que usam os objetos existentes para realizar novos protocolos. A segunda é através da implementação - usando C ++ - novos objetos elementares que podem ser usados para expandir ainda mais as capacidades e características de LCG. Os exemplos apresentados nesta preocupação protocolo do estudo de células individuais em fatias de cérebro. No entanto, os protocolos semelhantes também pode ser empregada com sucesso em preparações in vivo, para gravar ambos os sinais intracelulares e extracelulares, e em preparações ex vivo tais como culturas neuronais, para gravar, por exemplo, potenciais extracelulares através de matrizes multi-eletrodo, estimulando simultaneamente em closed- loop de 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
References
- Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
- Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
- Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
- Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
- Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
- Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
- White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
- Destexhe, a, Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
- Fellous, J. -M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
- Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
- Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
- Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
- Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
- Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
- Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
- Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , (1995).
- Molleman, A. Patch Clamping. , John Wile., & Sons, Ltd. Chichester, UK. (2002).
- Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
- Gold, R. The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
- Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).
- Koch, C., Segev, I. Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , MIT Press. Cambridge, MA, USA. (1988).
- Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
- Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
- Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).
