Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التحقيق في نشر وسمية البروتينات مثل بريون باستخدام Metazoan نموذج حي Published: January 8, 2015 doi: 10.3791/52321
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research, Northwestern University

Introduction

وترتبط العديد من الأمراض العصبية، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD)، ومرض باركنسون (PD)، الضموري العضلي التصلب الجانبي (ALS)، والاعتلال الإسفنجي المعدية (TSEs)، مع البروتينات المعرضة للتجميع، وبالتالي تعرف باسم البروتين misfolding اضطرابات (تطوير إدارة الأداء ). TSEs أو أمراض بريون تشكل فئة فريدة من تطوير إدارة الأداء في أنها يمكن أن تكون معدية في كل من البشر والحيوانات 1. على المستوى الجزيئي، والبريونات تكرار من خلال تجنيد وتحويل أحادى α-الحلزون الغنية المشفرة المضيف بي ار بي الخلوي (بي ار بي C) في المرضية ورقة β الغنية بي ار بي الشوري التشكل 2،3. وقد تم تحديد المجاميع البروتين نشر النفس أيضا في الفطريات، التي تشترك في الخصائص المهمة مع البريونات الثدييات 4،5. بالإضافة إلى ذلك، والبريونات الثدييات قادرة على الانتقال من خلية الى خلية وتصيب خلايا ساذجة 6،7.

في حين تطوير إدارة الأداء الغيرإيه من TSEs ليست معدية، إلا أنهما يشتركان مبدأ المسببة للأمراض مشتركة مع الأمراض بريون 8،9. على الرغم من أن البروتينات ترتبط كل من تطوير إدارة الأداء لا ترتبط في هيكل أو وظيفة، وأنهم جميعا المجاميع شكل من خلال عملية تشبه بلورة تسمى منوى أو المصنفة البلمرة. وعلاوة على ذلك البذور البروتينية تنمو من خلال تجنيد الإسوية القابلة للذوبان على 2،10،11. كفاءة لنشر الذاتي تختلف في الجسم الحي، وهذا يتوقف على الخصائص الجوهرية للبروتين، والتي جنبا إلى جنب مع العوامل الخلوية إضافية مثل المحرمين الجزيئي تحدد في نهاية المطاف معدلات التنوي الكلي، البذر، والتجزؤ ونشر 12-15. وبالتالي، يجب ان يكون هناك توازن دقيق بين هذه العوامل التي تسمح نشر كفاءة من البروتين التجميع. قد يفسر هذا أيضا لماذا فقط بعض المجاميع amyloidogenic تؤوي خصائص بريون، وبالتالي ليس كل تطوير إدارة الأداء والمعدية. ويبدو أن البريونات لتمثيل س 'أعلى فناني الأداءاتحاد كرة القدم طيف واسع من المجاميع البروتينية الذاتي تكرار، مما يجعلها أداة قوية لدراسة تطوير إدارة الأداء 8،13.

يثير الاهتمام والفضول، وسمية المرتبطة المجاميع المرتبطة المرض غالبا ما يكون غير خلية عنصر مستقل 16،17. وهذا يعني أنها تؤثر على الخلايا المجاورة التي لا تعبر عن الجين المقابل، على النقيض من تأثير مستقل الخلية بدقة، مما يعني أن فقط الخلايا معربا عن المعرض الجين النمط الظاهري محدد. وقد تجلى ذلك بشكل مقنع عن طريق التعبير الأنسجة محددة أو هدم البروتينات منها في نماذج عديدة من أمراض الاعصاب 18-26. وقد اقترحت آليات مختلفة كأساس لهذه الخلايا غير سمية الحكم الذاتي في تطوير إدارة الأداء، بما في ذلك إمدادات تقلص المواد الغذائية، وخلل في الإشارات العصبية، الغلوتامات التحفيز الزائدة، وneuroinflammation 16،27،28. وبالإضافة إلى ذلك، migh حركة تشبه بريون من المجاميع المرتبطة المرض بين الخلايار المساهمة في هذا الجانب 29،30. وتشير أدلة متزايدة على أن الادراج البروتين أخرى من البريونات يمكن أن تنقل من خلية الى خلية، وهو ما قد يفسر نشر سمة من الأمراض التي لوحظت في العديد تطوير إدارة الأداء 30-36. ومع ذلك، لم يتم بعد تحديد ما إذا كانت هناك علاقة سببية واضحة بين الحركة بين الخلايا البروتينات المرض وتأثير سام على الخلايا المجاورة. ولذلك، فهم أفضل للمسارات الخلوية التي تكمن وراء انتقال خلية الى خلية خلية وغير سمية الحكم الذاتي أمر ضروري وأساسي لتطوير علاجات جديدة. ومع ذلك، لا يفهم كثير من جوانب بريون مثل نشر والخلوية العوامل التي تؤثر على انتقال الخلية الى خلية من البروتينات تتجمع في metazoans جيدا، ولا سيما على مستوى العضوي.

الديدان الخيطية ايليجانس انواع معينة لديها العديد من المزايا التي توفر إمكانات ل اكتشاف جوانب جديدة من تشبه بريون SPREADIنانوغرام في metazoans 17. انها شفافة، والسماح لفي الجسم الحي تتبع البروتينات من الموسومة fluorescently في الكائن الحي. وعلاوة على ذلك، يتم الحفاظ العديد من العمليات الخلوية والفسيولوجية المتضررين من المرض من الديدان إلى الإنسان، وC. ايليجانس هي أيضا قابلة للطائفة واسعة من التلاعب الجيني والتحليلات الجزيئية والكيمياء الحيوية 37-39. بالضبط 959 الخلايا الجسدية تشكل خنثى الكبار مع خطة الهيئة البسيطة التي لا يزال لديها العديد من أنواع الأنسجة متميزة، بما في ذلك العضلات، والخلايا العصبية والأمعاء.

لوضع نموذج جديد في بريون C. ايليجانس، اخترنا للتعبير عن خارجيا وتتميز كذلك الجلوتامين / الأسباراجين (Q / N) الغنية بريون NM المجال من عصاري خلوي بروتين بريون Sup35 الخميرة، حيث لا توجد بروتينات بريون الذاتية المعروفة في الديدان 4،40. وقد البريونات الخميرة لا تقدر بثمن في توضيح الآليات الأساسية لتكرار بريون 41-44. وعلاوة على ذلك، NM هو التنوبالحادي وعصاري خلوي البروتين مثل بريون التي قد تظهر لتلخيص دورة الحياة الكاملة للبريون في الثقافة خلايا الثدييات 45،46. وبالمثل، عندما أعرب في C. ايليجانس، المجال بريون Sup35 اعتمدت بشكل جيد لمتطلبات مختلفة للنشر في الخلايا metazoan بالمقارنة مع خلايا الخميرة والملامح الرئيسية عرضت من بريون البيولوجيا ارتبط 40. NM التجميع مع النمط الظاهري السامة العميق، بما في ذلك تعطيل سلامة الميتوكوندريا ومظهر من مختلف الحويصلات الالتهام الذاتي ذات الصلة على المستوى الخلوي، فضلا عن اعتقال الجنينية واليرقات، تأخر في النمو، واضطراب واسع النطاق للبيئة طي البروتين على المستوى العضوي. لافت للنظر، يسلك المجال بريون خلية مستقلة وغير خلية سمية مستقلة، مما يؤثر على الأنسجة المجاورة التي لم أعرب التحوير. وعلاوة على ذلك، يتم مراقبة النقل حويصلي في مجال بريون داخل وبين خلايا في الوقت الحقيقي <em> في الجسم الحي 40.

نحن هنا وصف كيفية فحص نشر مثل بريون في C. ايليجانس. سوف نشرح كيفية مراقبة النقل داخل الأقاليم وفيما بين الخلايا من الحويصلات التي تحتوي على المجال بريون باستخدام الوقت الفاصل بين مضان المجهري. سوف نؤكد على أن استخدام أجهزة الاستشعار الأنسجة محددة قابلة للطي وأعرب بتواجد مطلق للصحفيين الإجهاد لتقييم آثار خلية خلية مستقلة تتمتع بالحكم الذاتي وغير على اللياقة البدنية الخلوية. وأخيرا، فإننا سوف تصف الإجراء من الجينوم واسعة تدخل الحمض النووي الريبي (رني) شاشة أجريت مؤخرا لتحديد معدلات جديدة من سمية التي يسببها بريون. في الجمع، ويمكن لهذه الأساليب تساعد على ندف بصرف النظر مسارات الجينية التي تساهم في الحركة بين الخلايا البروتينات وغير خلية سميتها مستقلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. رصد العابر للنشر من البروتينات مثل بريون بواسطة فيفو في الوقت الفاصل بين التصوير

ملاحظة: تنمو C. ايليجانس البرية من نوع (WT) (N2) وخطوط المعدلة وراثيا وفقا للأساليب القياسية ومراقبة بعناية درجة حرارة زراعة 47.

  1. توليد خطوط المعدلة وراثيا من C. ايليجانس معربا عن البروتين مثل بريون، الموسومة ب أحادى البروتين الفلوري الأحمر (mRFP). مشاهدة هذا الفيديو الذي يوضح كيفية استخدام حقن مكروي 48. لمزيد من التفاصيل والأساليب التي تصف كيفية دمج هذه السطور خارج الصبغي، انظر 49.
  2. إعداد السكان متزامنة عبر وضع البيض او تبيض وفقا للأساليب القياسية 50.
    1. المزامنة وضع البيض
      1. نقل 10-20 البالغين حامل على طبق من ذهب والسماح لهم وضع البيض ل1 - 2 ساعة. إزالة البالغين من لوحة وترك ذرية تنمو حتى سن المرجوة.
      2. <لى> التزامن التي كتبها تبيض
      1. جمع السكان غير المتزامنة من البالغين حامل وتبييض لهم محلول قلوي هيبوكلوريت (250 ملي هيدروكسيد الصوديوم و 1: 4 (ت / ت) التخفيف من التبييض التجاري في H 2 O). غسل البيض مرتين (218 x ج لمدة 1 دقيقة) مع M9 عازلة 47 (21 mMNa 2 HPO 4 · 7H 2 O، 22 mMKH 2 PO 4، 86 mMNaCl، 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O، إضافة درهم 2 O ما يصل الى 1 L).
      2. تسمح لهم ليفقس في المخزن M9 مع طيف الانفعالات O / N عند 20 درجة مئوية. وتطوير دودة اعتقال في مرحلة L1 في حالة عدم وجود مصدر الغذاء، وترك السكان متزامنة. نقل L1s على نيماتودا جديدة نمو وسائل الإعلام (NGM) لوحات مع المصنف OP50 E. البكتيريا القولونية، والسماح للذرية تتطور حتى سن 47 المرجوة.
  3. إعداد 2٪ منصات الاغاروز (في H 2 O) على شريحة المجهر كما هو موضح 50.
    1. إعداد اثنين ميلالشرائح croscope مع الشريط وضع العلامات وضعت على طولها كامل لاستخدامها الفواصل. ضع شريحة المجهر الثالثة بينهما.
    2. حل 2٪ الاغاروز في H 2 O وماصة قطرة واحدة على شريحة نظيفة.
    3. ضع الشريحة الرابعة عمودي على الشرائح الثلاث الأخرى على الجزء العلوي من انخفاض أجار. اضغط برفق إلى أسفل لشد سادة لسمك نفس الشريط وضع العلامات.
    4. اتركها لتجف لمدة 1 دقيقة قبل إزالة الفواصل وسحب بلطف الشرائح عن بعضها البعض. سوف لوحة أجار التمسك واحد منهم.
  4. ماصة ~ 10 ميكرولتر مخدر (2 مم الليفاميزول في المخزن M9) إلى لوحة ونقل ~ 10 الحيوانات باستخدام معول سلك البلاتين. مع تغطية زلة غطاء (~ 22 × 22 ملم) والتقاط صور في حدود 1 ساعة.
  5. بدلا من ذلك، للحصول على الأفلام على مدى فترة طويلة من الزمن أو لزيادة خفض إمكانية أي حركة الحيوانات، واستخدام مزيج من مخدر وحبة تجميد 51.
    1. إعداد 10٪ الآغاارتفع منصات (في المخزن M9) كما هو موضح 51 وإضافة الديدان إلى 3 ميكرولتر حل معايير حجم nanosphere (الخرز البوليسترين، 100 نانومتر)، بالإضافة إلى 3 ميكرولتر مخدر (4 ملي الليفاميزول في المخزن M9). تغطية بلطف مع انزلاق الغطاء. لتجنب جفاف، وختم زلة تغطية مع VALAP (مزيج من كميات متساوية من الفازلين، اللانولين، وشمع البارافين).
  6. صورة من الحراك الديدان باستخدام مجهر متحد البؤر.
    ويتم الحصول على نتائج باستخدام غزل القرص AF متحد البؤر المجهر مجهزة الكاميرا EM-CCD والميكروسكوب الأتمتة وتحليل الصور برامج مثل MetaMorph والخطوط العريضة لتفاصيل أدناه، ولكن يمكن أيضا أن نظم التصوير متحد البؤر مقارنة أخرى أن تستخدم: ملاحظة.
    1. استخدام الهدف النفط 63X أو 100X / 1.4NA ووضع شريحة المجهر تحتوي على ديدان في حامل شريحة المجهر.
    2. فتح البرنامج. ضبط قوة الليزر والمرشحات لmRFP التصوير. استخدام الليزر 561 نانومتر في 10٪ من الطاقة والانبعاثات مرشح> 600 نانومتر.
    3. تحت "إنقاذ" علامة التبويب تحديد أو إنشاء مجلد الدليل حيث يجب حفظ الملفات. تعيين اسم إلى الملف.
    4. تحت عنوان "طول الموجة" علامة التبويب اختيار الإضاءة المناسبة وضبط التعرض وكسب. استخدام "YokoQuad الأحمر" (أو وضع الإضاءة يعادل لmRFP التصوير) مع التعرض ما بين 100 و 300 ميللي ثانية، وكسب الكاميرا ما بين 100 و 300، وهذا يتوقف على عينة فردية (تقييم باستخدام صورة حية).
    5. تحت "Timelapse" علامة التبويب حدد "عدد من النقاط الزمنية" = 301، "مدة" = 5 دقائق و"الوقت / الفاصل" = 1 ثانية.
    6. تحت عنوان "المجلات" علامة التبويب اختيار مجلة: "AFC SET Z HOLD" و "AFC العودة للZ HOLD"، النوع: &# 8220؛ الخاصة "(مرتين)، نقطة الأولية:" بداية التوقيت نقطة "و" نهاية نقطة زمنية ". هذا الخيار ضبط تلقائي للصورة هو المهم الصورة نفس القسم على مدى فترة أطول من الزمن.
    7. عندما يتم الإعداد، اضغط على "اكتساب". وصفد الفيديو timelapse كملفات TIFF منفصلة.
    8. فتح جميع ملفات .tiff من سلسلة زمنية معينة في يماغيج. انتقل إلى "صورة" → "الأكوام" → "صور لالأكوام". اختياريا، وضبط السطوع والتباين، إضافة شريط الحجم، الخ تصدير الفيلم تحت عنوان "ملف" → "حفظ باسم" → "AVI ..." (للحصول على مثال، انظر الفيديو 1 و 2 الموافق الشكل 1).

2. عن طريق الطي مجسات ومراسلون الإجهاد المعنية بالتحقيق في خلية مستقلة وغير خلية ذاتية الحكم يؤثر على استتباب بروتيني وسمية

  1. توليد خطوط المعدلة وراثيا التي coexpress جهاز استشعار للطي أو الإجهاد أوردتهص جنبا إلى جنب مع البروتين مثل بريون. للحصول على طرق حول كيفية إنشاء الصلبان أو توليد خطوط المعدلة وراثيا، انظر 48،49،52. انظر الجدول رقم 1 للحصول على قائمة C. سلالات ايليجانس التي يمكن استخدامها.
  2. إعداد السكان متزامنة من الحيوانات المعدلة وراثيا وزراعتها حتى سن المطلوب كما هو موضح أعلاه (القسم 1.2) 50.
  3. باستخدام stereomicroscope، ودراسة النمط الظاهري المعنيين من أجهزة الاستشعار للطي أو مراسل الإجهاد.
    1. لاستشعار للطي، وتحديد عدد الحيوانات إيواء المجاميع في كل يوم بعد التزامن (للحصول على مثال، انظر الشكل 2E وF).
    2. لمراسل والإجهاد، واختبار إذا coexpression نتائج البروتين مثل بريون في مضان زيادة لمراسل (للحصول على مثال، انظر الشكل 3).

3. شاشة الجينوم على نطاق لقمع سمية التي يسببها بريون في C. ايليجانس

الشكل (4)
الرقم 4. تمثيل تخطيطي للبروتوكول فحص رني. انظر القسم بروتوكول 3 للحصول على وصف مفصل للخطوات الفردية.

  1. تزامن C. الديدان ايليجانس والازدواجية في مكتبة رني
    1. للشاشة رني، استخدام المكتبة Ahringer رني (أو المكتبة فيدال رني) 53،54. Rearray المكتبة رني من 384 شكل البئر الأصلي إلى 96 لوحات جيدة عن طريق ملء لوحات مع 100 ميكرولتر وسائل الاعلام LB-أمبير (50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين في LB) تستكمل مع 10٪ الجلسرين وتطعيم باستخدام المكرر 96-دبوس. ينمو بمعدل 37 درجة CO / N مع الإثارة وتخزينها في -80 ° C.
    2. الحفاظ على C. ايليجانس WT وخطوط المعدلة وراثيا في 20 ° C على لوحات NGM المصنف مع OP50 E. البكتيريا القولونية وفقا للأساليب القياسية 47.
    3. مزامنة المعدلة وراثيا مجال بريون وWT (مراقبة) الديدان الخيطية التي تبيض (انظر القسم 1.2).
    4. في نفس اليوم الذي الديدان والمبيضة، وإعداد وسائل الاعلام LB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. استخدام موزع كاشف الآلي للاستغناء (أو ماصة يدويا) 65 ميكرولتر من وسائل الإعلام LB-أمبير في كل بئر من 96 لوحة جيدا.
    5. إزالة 96 جيدا لوحات مكتبة Ahringer رني من -80 ° C وتقديمهم للغطاء العقيمة اصطف مع المناشف الورقية. على الفور إزالة ختم الشريط من خلال عقد لوحة رأسا على عقب حين لوحات لا تزال مجمدة، والحرص على تجنب التلوث من الجليد على السطح الخارجي لللوحات. Reinvert لوحات والسماح لهم ذوبان الجليد لمدة 30 دقيقة.
    6. تراجع واحد معقمة 96 دبوس المكرر إلى واحد رني لوحة المكتبة، ومن ثم إلى واحدة جديدة لوحة LB-AMP. استخدام المكرر معقمة جديدة لكل لوحة. اغلاق جميع لوحات مع شريط لاصق احباط والعودة لوحات مكتبة ل-80 ° C. على نسخ متماثلة يمكن أن تكون غارقة في التبييض، وتشطف،وتعقيمها لاستخدامها مرة أخرى.
    7. السماح لوحات رني المكررة أن ينمو O / N في حاضنة المقرر ان 37 ° C و 300 دورة في الدقيقة. لاستخدام HT115 E. القولونية بكتيريا إيواء ناقلات الفارغة (L4440) كعنصر تحكم، وتنمو بشكل منفصل في أنبوب الثقافة وثم ماصة 65 ميكرولتر من الثقافة مع ماصة الأقنية إلى ربع اثنين من 96 لوحات جيدة.
  2. تحريض البكتيرية إنتاج الرنا المزدوج الجديلة وإضافة الديدان
    1. تمييع الآيزوبروبيل-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) إلى تركيز 5 مم في DDH 2 O. استخدام محطة العمل الآلي مع رئيس متعددة للاستغناء (أو الماصة يدويا) 10 ميكرولتر من المخفف IPTG في كل بئر من البكتيريا ورني لوحات السيطرة. ختم ووضع لوحات العودة إلى الحاضنة. دعهم يهز لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية.
    2. في حين البكتيريا تهز، وإعداد الديدان. خلط M9 / دودة تعليق جيدا، وماصة عينة صغيرة (~ 5-10 ميكرولتر) إلى شريحة المجهر والزجاج. عدعدد الديدان تحت stereomicroscope وحساب عدد الديدان في ميكرولتر.
    3. باستخدام تقنية معقمة، وإعداد محلول تستكمل M9 (M9 +) مع تركيزات النهائية التالية: 0.20 ملغ / مل IPTG، 8.0 ميكروغرام / مل نسبة الكولسترول في الدم، 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين و 9.6 ميكروغرام / مل التتراسيكلين، 0.0835 ميكروغرام / مل Fungizone، و 15 الديدان في 50 ميكرولتر.
      1. جعل حلول منفصلة لالمعدلة وراثيا مجال بريون والديدان WT. الحجم النهائي من الحل الدودة M9 + اللازمة سيعتمد على عدد من لوحات رني نسخ (انظر أدناه)، بالإضافة إلى ~ 30 مل من حجم القتلى التي ستبقى في الخزان، إذا تم استخدام موزع الآلي.
    4. بعد تحريض 3 ساعة من إنتاج الرنا المزدوج الجديلة البكتيرية، واتخاذ لوحات من الحاضنة والسماح لهم تبرد لRT (~ 30 دقيقة) لتجنب الحرارة مشددا على الحيوانات.
    5. الاستغناء 50 ميكرولتر M9 + نطاق بريون حل دودة المعدلة وراثيا إلى كل بئر من لوحات رني واحدة من لوحات فارغة مكافحة ناقلات الأمراض. جعلتأكد من خلط حل دودة قبل كل خطوة كما تميل الحيوانات إلى الرواسب في قاع الخزان.
    6. الاستغناء الديدان WT في لوحة التحكم الثاني. ترك لوحات تفض للسماح للتهوية. للحفاظ على ثقافة السائل من التبخر، كومة 4-5 لوحات معا والتفاف مع منشفة ورقية رطبة ورقائق الألومنيوم. احتضان عند 200 دورة في الدقيقة عند 20 درجة مئوية لمدة 4 أيام.
  3. النقاط
    ملاحظة: بعد 4 أيام في الحاضنة، والديدان يكون في اليوم الثاني من مرحلة البلوغ ونحن على استعداد للكشف. السماح للحيوانات التكيف مع الظروف غير الهز لمدة 30 دقيقة قبل الفحص لضمان سحق دون عائق.
    1. باستخدام كاميرا الصقر 4M60 متصلة بجهاز كمبيوتر مع الشاشة، شاشة بصريا لزيادة سحق بالمقارنة مع مراقبة تعامل مجال بريون الحيوانات المعدلة وراثيا.
    2. تجميع قائمة من المشاهدات الأولية لتأكيد استخدام wrMTrck (انظر القسم التالي).

4. تأكيد الأوليةالشاشة الزيارات

  1. الحركة الفحص على لوحات الصلبة
    1. إعداد لوحات مع NGM تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين، 12.5 ميكروغرام / مل التتراسيكلين و1 ملم IPTG، وفقا لأساليب القياسية 47. إذا كان ذلك ممكنا، واستخدام آلة صب لوحة أن أؤكد لجميع لوحات لديها نفس الارتفاع من وسائل الإعلام، والتي سوف تسمح لعملية الاستحواذ الفيديو أكثر بساطة.
    2. تنمو الحيوانات المستنسخة رني مختلفة في ~ 1 مل LB + 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين، O / N عند 37 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة.
    3. في اليوم التالي، حمل التعبير عن الرنا المزدوج الجديلة مع IPTG 1 ملم لمدة 3 ساعة. البذور لوحات مع 150 ميكرولتر من كل استنساخ رني البكتيرية، وتنتشر في طبقة رقيقة. السماح للبكتيريا الجافة لمدة 2 أيام في RT في الظلام. إعداد 3 لوحات في رني استنساخ.
    4. مزامنة السكان دودة من قبل تبيض وفقا للأساليب القياسية 50 (انظر القسم 1.2)، والسماح لليا يفقس البيض / N في M9 وسائل الإعلام.
    5. أخذ عينة من تعليق دودة وتحديد مقدار نواعمatodes في ميكرولتر في stereomicroscope. ثم، ماصة الحجم المناسب للM9 بالإضافة إلى الديدان في كل لوحة التجريبية بحيث يحتوي على 25 - 30 الديدان L1. تنمو الديدان الخيطية عند 20 درجة مئوية لمدة 4 أيام حتى تصل إلى الديدان يوم 2 من مرحلة البلوغ.
  2. التحليل الكمي للدودة الحركة مع البرنامج المساعد wrMTrck ليماغيج
    ملاحظة: تم تسجيل أشرطة الفيديو باستخدام stereomicroscope في 10X التكبير مع هاماماتسو أرك-R2 كاميرا رقمية C10600-10B وهاماماتسو برامج التصوير PCI بسيط.
    1. بدوره على الكاميرا وبسيط برامج التصوير PCI. انقر على "لايف" للسماح لتعديل أوضاع التصوير.
    2. إعداد الشروط الفيديو على النحو التالي: كسب = 0؛ ضوء الوضع = السامية. مؤشر السرعة = 1؛ Binning = 2. انقر فوق "تلقائي فضح" ومن ثم ضبط ظروف الإضاءة، والانتقال المرايا المجهر والسطوع والتباين بطلب.
      ملاحظة: الفيديو تحتاج إلى وجود تباين عالية دون أن overexposed، بحيث تظهر الحيوانات الأشكال السوداء كما على خلفية مشرقة.
    3. انقر على "الوقت المسح الضوئي" واختيار مجلد واسم ملف. مجموعة "تأخير الميدان" إلى 20 ميللي ثانية و "أوقفوا في وقت" إلى 30 ثانية. اضغط على "مراجعة لايف" من أجل اختيار منطقة من لوحة لتسجيل (حيث معظم الديدان هي). اضغط على لوحة 3 أو 4 مرات على المسرح، بسرعة تأكيد مكانتها في مجال الرؤية واضغط على "ابدأ".
    4. بعد انتهاء تسجيل الفيلم، انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة واختر "تصدير المونتاج تسلسل" لتصدير الفيلم من شكل .cxd لافي.
  3. تحليل أشرطة الفيديو الحركة
    1. فتح برنامج يماغيج، انتقل إلى "الإضافات" علامة التبويب، ثم "wrmtrck" وحدد "دفعة wrMTrck". حدد الدليل الذي يحتوي على كافة الملفات ليتم تحليلها.
    2. في إطار الإدخال الرئيسي للwrMTrck_Batch، تحميل قيم الإدخال على النحو المفصل في شملت رقمالبريد 5C. شرح لكل من المعلمات ويمكن العثور عليها في التعليمات التي تصاحب البرنامج المساعد. انقر على "موافق" والسماح للتشغيل تحليل الحركة.
    3. إلى الإشراف النتائج والتأكد من أن جميع المسارات الكشف هي من C. الفعلي ايليجانس والقضاء على القطع الأثرية، وفتح كل من ملفات .txt إنشاء كل فيلم ونسخ المعلومات إلى ملف برنامج تحليل البيانات. فتح ملفات "* _labels.zip" خلق وتشغيل الناتجة "* _labels.tif" للتحقق يدويا والقضاء على المسارات دودة كاذبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مراقبة بيخلوي نشر من البروتينات مثل بريون من قبل في الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير

المعدلة وراثيا C. خطوط ايليجانس معربا عن المجال بريون بشكل خاص مناسبة تماما لتحليل جوانب معينة من مثل بريون البروتينات، على سبيل المثال، نقل خلية الى خلية خلية وغير سمية مستقلة. شفافية الحيوانات تمكن من تتبع الموسومة fluorescently البروتينات من داخل الكائن الحي في كل مرحلة من مراحل الحياة. الاستفادة من هذا، وتصور الحركة من البروتينات مثل بريون عبر الخلايا والأنسجة باستخدام المجهر مضان. والهدف النفط 63X أو 100X / 1.4NA ضروري لحل الهياكل حويصلي. الأهم من ذلك، يحتوي المجال بريون أن الكلمات الدلالية مع mRFP، من أجل أن تبقى مرئية fluorescently داخل هذه الحويصلات الحمضية يفترض 40. الأصفر البروتين الفلوري (YFP)، والتي غالبا ما يتم استخدام العلامة، طليست مناسبة لأنها تطفئ في بيئة منخفضة الحموضة 40،55. سلالة AM815 عن الموسومة RFP R2E2 (شكل عرضة تجميع-للغاية وسام من المجال بريون NM) التي تتراكم في الحويصلات أنبوبي، في حين أن العلامة RFP وحده لا تزال قابلة للذوبان (1A الشكل وباء). استخدام في الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير، ويمكن ملاحظة أن يتم نقل هذه الحويصلات أنبوبي داخل وبين خلايا 40 (الشكل 1C وD، فيديو 1 و 2) [الروابط مكان للفيديو 1 و 2 هنا].

باستخدام أجهزة استشعار للطي وصحفيين الإجهاد للتحقيق في خلية آثار الحكم الذاتي مستقلة وغير الخلية على استتباب بروتيني وسمية

البريونات هي قادرة على عبور البروتينات المرتبطة البذور وتعطيل الخلوية البيئة البروتين للطي. ويمكن كشف ذلك من خلال coexpression من الحرفي المناسب للطيروبية. أجهزة الاستشعار للطي هي بروتينات متبدل الاستقرار غير الضرورية التي تعتمد على شبكة استتباب بروتيني وظيفية لأضعاف بشكل صحيح. بعض الأمثلة هي يراعة luciferase معروفة والبروتينات إيواء حساسة للحرارة (TS) الطفرات 56-66. وتعطل استتباب بروتيني يؤدي إلى misfolding لمراسل، والتي يمكن الكشف عنها بواسطة الفحص البصري من المجاميع أو عن طريق التعرض لالنمط الظاهري متحولة TS منها في درجات حرارة الإباحية. وغالبا ما تستخدم أيضا تمتد من polyglutamine (polyQ) بطول على عتبة التجميع (حوالي 40 بقايا) لأنها تظهر خاصية التجميع التي تعتمد على سن 67-69. في وقت سابق من بداية التجميع يكشف بيئة قابلة للطي للخطر. هنا، قمنا بتوظيف متحولة بريون RΔ2-5 التي لا تزال قابلة للذوبان عندما أعرب في C. ايليجانس جدار الجسم العضلات (BWM) الخلايا والأمعاء 40 (الشكل 2A و C). على التعبير المتزامن مع R2E2 في الخلايا BWM، RΔ2-5 الجرميةالمجاميع dily (الشكل 2B)، وكشف عن تأثير الحكم الذاتي خلية من R2E2 على البيئة البروتين للطي. تأثير واسع النطاق على استتباب بروتيني وتحريض misfolding عبر الأنسجة يمكن تقييمها من قبل التعبير من أجهزة الاستشعار للطي في نسيج المتميزة التي لا تعبر عن شكل عالية عرضة تجميع المجال بريون. وأعرب عن R2E2 تحت المروج معين خلية BWM (ميو-3P)، في حين أعرب RΔ2-5 تحت المروج الأمعاء محددة (VHA-6P). تجميع المعوية RΔ2-5 يوضح أن R2E2 يؤثر على طي البروتين في الخلايا بطريقة غير المستقلة 40 (الشكل 2D). بدلا من استخدام RΔ2-5، حيث يمكن الكشف عن المجاميع فقط في ارتفاع القرار، وأعرب استخدام polyQ44 في الأمعاء (Q44i) يسمح التصور من الركام في دقة منخفضة تحت stereomicroscope (الشكل 2E وF). وعلاوة على ذلك، وهذا يمكن القياس الكمي للأنيماليرة سورية مع المجاميع، وكذلك القياس الكمي لعدد من المجاميع.

التحقيق في خلية غير سمية الحكم الذاتي في المجال بريون، درسنا سابقا الأنسجة التي لا تعبر عن R2E2 بواسطة المجهر الإلكتروني المجاورة ووجدت أن التعبير عن المجال بريون في خلايا العضلات يؤدي إلى خلية تعطيل غير مستقلة للنزاهة الميتوكوندريا في الأنسجة المجاورة، مثل كما الأمعاء 40. النتائج ضعف الميتوكوندريا في زيادة أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) الإنتاج والاكسدة. وهناك طريقة موسع لتصور تحريض الاستجابة الاكسدة هو استخدام الاكسدة مراسل محرض 70. سلالة CF1553 يعبر عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت الإجهاد التأكسدي المروج محرض الاحمق-3 70. عندما عبرت للحيوانات معربا عن المجال بريون R2E2 في الخلايا BWM، تم upregulated مراسل بشكل كبير في الخلايا BWM وكذلك في العديد من الأنسجة غير BWM ( الجدول 1 قائمة C. ايليجانس سلالات التعبير للطي وأجهزة الاستشعار وصحفيين التوتر التي يمكن استخدامها بالقياس.

شاشة الجينوم على نطاق لقمع سمية التي يسببها بريون في C. ايليجانس

النمط الظاهري سمية معقدة من المجال بريون أعرب في C. ايليجانس المثير للاهتمام بشكل خاص بسبب عدم وجود سمية ملحوظة لوحظ في معظم نماذج بريون في المختبر 71. هذا النموذج قد تكشف مسارات الجديدة التي يمكن أن تؤثر على السمية المرتبطة البريونات في metazoans. ولمعالجة ذلك، قمنا بترتيب لالجينات التي، عندما رني المنضب، من شأنه أن يحسن خلل الحركة من R2E2 الحيوانات المعدلة وراثيا. السيطرة تعامل WT الديدان يمكن استخدامها بوصفه مشاركا إيجابياntrol، وعلى الرغم من أن معظم الجينات المرشحة لا يوفر الإنقاذ حركة النمط الظاهري الكامل، وذلك بسبب انتفاذ رني المتغير وسمية عالية من التحوير. تم علاج الحيوانات لمدة 4 أيام مع رني، من أول L1 الدولة اليرقات إلى يوم 2 من مرحلة البلوغ. وبحلول ذلك الوقت، وسحق الحيوانات R2E2 غير المعالجة أبطأ بكثير من سحق الحيوانات WT، وهو أمر مهم لأننا الكشف عن حدوث تحسن في القدرة على الحركة. سوف F1 ذرية تكون موجودة (~ L1s)، ولكن من السهل أن نميز من الجيل P0. وسجل فقط الجيل P0. هذه الشاشة الأولية المرئية وغير الكمية، وبالتالي، تم استخدام عتبة منخفضة لتحديد الزيارات الأولية، وهذا يعني أن كل استنساخ رني البكتيرية التي بدا لزيادة سحق الحيوانات، معربا عن بريون تم اختبارها في الزحف الفحص الكمي الشكل 4 يحدد الخطوات الرئيسية لإعداد الشاشة. عالية الدقة من الكاميرا فالكون 4M60 تمكين لفحص البصري من quarثالثا من لوحة في نفس الوقت على شاشة الكمبيوتر، والذي سمح الشاشة ليتم الانتهاء بشكل أكثر كفاءة. بينما مفيدة، وهذا ليس ضروريا. ويمكن أيضا أن الفحص البصري للدودة سحق أن يؤديها باستخدام المجسام في التكبير المنخفض (10X).

تأكيد الشاشة الزيارات الأولية

يتم تنفيذ شاشات إنتاجية عالية كنهج التي تسمح آثار واسعة تحليل جينوم للحصول على قائمة أولية من الجينات المرشحة التي يمكن صقلها من قبل وسائل تكميلية. المصادقة على نتائج الشاشة هو ذلك، من الضروري للقضاء على ايجابيات كاذبة المحتملة، والتي قد تنجم عن أداء الشاشة مع العينة التجريبية واحد فقط لكل رني. تم تغذية R2E2 الحيوانات المعدلة وراثيا مع الحيوانات المستنسخة رني الزيارات الأولية وقياس سرعتهم على لوحات NGM في اليوم الثاني من مرحلة البلوغ، وقراءات قابلة للقياس الكمي من الحركة وانخفض سمية. استخدمنا المساعد wrMTrck ليماغيج، وضعت في موقعناالمختبر، الذي يحدد بدقة C. ايليجانس في أشرطة الفيديو ويتبع حركتها. البرنامج المساعد wrMTrck والكتابات للتحليل الآلي مفتوحة المصدر ومتاحة للجمهور في http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html، جنبا إلى جنب مع تعليمات مفصلة حول كيفية استخدامها. بعد التحميل، نسخ المجلد wrMTrck كله إلى مجلد الإضافات من يماغيج. يصف هذا البروتوكول طريقة wrMTrck_Batch، فضل لتحليل عدد كبير من أشرطة الفيديو في وقت واحد، ولكن تعليمات عن دليل، الفيلم من الفيلم، وتحليل متوفرة مع البرنامج المساعد تحميل أيضا. WrMTrck_Batch يحول على الفيديو الأصلي (الشكل 5A) في شكل ثنائي مع الطرح الخلفية ويتم تعيين كل دودة المسار. كل من أشرطة الفيديو معالجتها يمكن أن ينظر إليها في وقت لاحق مع هذه المسارات فرضه، من أجل القضاء على أي القطع الأثرية التي تم تحديدها زورا والديدان (ه. ز.، المسار رقم 1 في الشكل 5B) يدويا. طريقة واحدة فعالة للقضاء على الفن الخلفية ifacts (المشار إليها مع سهم على الشكل 5B) هو ان تختار بعناية الحد الأدنى والحد الأقصى لحجم الكائنات لتحديدها (الشكل 5C). من نواتج مختلفة من المساعد wrMTrck، ونحن نستخدم أطوال الجسم في الثانية (BLPS) معلمة والذي يقيس متوسط ​​سرعة كل حيوان، ممثلة طول كل مسار مقسوما على طول الجسم من كل كائن، وبالتالي تطبيع الاختلافات المحتملة في حجم الديدان الخيطية (الشكل 5D). باستخدام هذه الطريقة، حددنا 35 المكثفات من سمية التي يسببها بريون (sopt) أن زيادة النمط الظاهري الحركة في R2E2 معربا عن C. ايليجانس إلى 133٪ على الأقل وتصل إلى 256٪ بالمقارنة مع الديدان المعالجة ناقلات الفارغة (الشكل 6). وتمثل هذه الجينات sopt أكد نهائي الزيارات التي نتجت عن جهودنا فحص إنتاجية عالية.

21fig1highres.jpg "/>
الشكل 1. المجال بريون ينتشر بين الخلايا والأنسجة في C. ايليجانس بواسطة وسائل النقل الحويصلي. (A) انهارت مبائر ض أكوام من الديدان الخيطية معربا عن RFP في عضلة جدار الجسم (BWM) خلايا (RFPm). (ب) انهارت مبائر ض أكوام من الديدان الخيطية معربا عن البديل شديدة السمية وتجميع NM عرضة، R2E2 ، في الخلايا BWM (R2E2m). السهام تشير إلى الحويصلات أنبوبي، رأس السهم يشير مجموع المباراتين. (C + D) الوقت الفاصل بين سلسلة من الحيوانات معربا عن RFPm (C) وR2E2m (D). السهام تشير إلى مجالات الحركة حويصلي. RFPm يسلك في الغالب تلطيخ منتشر. حتى عندما يتم العثور RFPm في الحويصلات، وهذه بالكاد تتحرك. R2E2m يموضع إلى العديد من الحويصلات التي يتم نقلها داخل وبين الخلايا. الحانات النطاق: 10 ميكرون. أشرطة الفيديو المرفقة من 1 و 2 [الروابط مكان لفيديو 1 و 2 هنا] تتوافق مع 1C أرقام وD،على التوالي.

الشكل 2
الشكل 2. أجهزة الاستشعار للطي تكشف عن تأثير واسع المجال بريون على استتباب بروتيني. (A + B) Coexpression من R2E2m يعزز تجميع RΔ2-5m. صور مبائر من (A) مراقبة RΔ2-5m و (ب) RΔ2-5m coexpressed مع R2E2m في الخلايا BWM. وأعرب (C + D) العضلات R2E2m يعزز تجميع RΔ2-5i الأمعاء. (C) متحد البؤر صورة مراقبة الحيوانات معربا عن RΔ2- 5I في الخلايا المعوية. (D) صورة متحد البؤر الحيوانات معربا عن R2E2m في الخلايا BWM وRΔ2-5i في الأمعاء. الحانات النطاق: 10 ميكرون (E + F) R2E2m يدفع الخلايا غير التجميع الذاتي من Q44i (E) وصور الفلورسنت التمثيلية للQ44i وQ44i؛ حيوانات R2E2m 4 أيام بعد نقل متزامنة لار L1.الدرهم على-OP50 المصنف لوحات NGM الطازجة. التعبير عن R2E2 في الخلايا BWM يؤدي إلى ظهور سابق من Q44i التجميع في الأمعاء. (F) الكمي للحيوانات مع المجاميع (في المائة) في الأيام المشار إليها بعد التزامن. تم تعديل أشرطة الخطأ تمثل SD هذا الرقم من 40.

الشكل (3)
الشكل 3.-3P الاحمق :: GFP مراسل الإجهاد النسخي يكشف أن المجال بريون يسبب خلية مستقلة وغير مستقلة خلية تحريض الاكسدة. (A + B) صور الممثل الفلورسنت (باستخدام نفس وقت التعرض) من الاحمق-3P :: GFP معربا عن الحيوانات السيطرة (A) والاحمق-3P :: GFP؛ الحيوانات R2E2m (B) في يوم 2 من سن البلوغ (C) التعبير عن R2E2 في الخلايا BWM يؤدي إلى تحريض مراسل ليس فقط في الخلية BWMالصورة (I)، ولكن أيضا في الأمعاء (II)، والحبل العصبي (III) والبلعوم ورئيس الخلايا العصبية (IV).

الرقم 5
الشكل 5. تحليل حركة دودة مع البرنامج المساعد wrMTrck ليماغيج. (A) مثال لفيلم المدخلات الناتجة عن استخدام التكبير المناسب (~ 10X) لمراقبة العديد من الحيوانات في وقت واحد. (ب) "* _labels.tif" ملفات ويبلغ حجم انتاجها من wrMTrck_Batch والسماح للكرأيشن اليدوي لنتائج التحليل. السهم يشير إلى الكائن الذي تم استبعاده بشكل صحيح من التحليل بسبب الاختيار المناسب من المعلمات الحد الأدنى والحد الأقصى للحجم. (C) نافذة الإدخال من wrMTrck_Batch، والتي تبين المعايير المستخدمة لهذا البروتوكول. وتحتاج هذه المعلمات ليتم تعديلها وفقا للإعدادات المجهر وفيلم الفردية. (D) النتائج الإخراج من movemeأبرز تحليل الإقليم الشمالي من (B)، مع العمود BLPS باللون الأصفر. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (1)
الشكل 6. الديدان R2E2 تعامل مع الحيوانات المستنسخة رني التي هي supressors التي يسببها بريون سمية (sopt) تظهر تحسن القدرة على الحركة. يظهر على الحركة كما BLPS قريب بالمقارنة مع سيطرة سلبية (ناقلات الفارغة). أظهرت كلها (طالب اختبار t) استنساخ رني ذات دلالة إحصائية المحددة في الشاشة بالمشاركه. نجوم السوداء يمثل ضربة كما هو موضح في المثال في الشكل 5. نتائج هي من 3 أفلام، مع 17 <ن <53 المسارات في الشرط. أشرطة الخطأ تمثل SEM. </ P>

الجدول 1. C. ايليجانس سلالات التعبير للطي وأجهزة الاستشعار وصحفيين الإجهاد.

اسم السلالة النمط الجيني تعليقات مصدر السلالة
أجهزة الاستشعار للطي
الجينات المحورة
AM140 UNC-54p :: :: polyQ35 YFP العضلات محددة التعبير عن polyQ35 والعمر التجميع تعتمد CGC أو موريموتو المختبر
AM141 UNC-54p :: :: polyQ40 YFP التعبير عضلة معينة من polyQ40، AGالبريد تجميع يعتمد CGC أو موريموتو المختبر
AM801 UNC-54p :: :: RΔ2-5 YFP التعبير عضلة معينة من التنوي غير كفء مجال بريون موريموتو المختبر
OG412 VHA-6P :: :: polyQ44 YFP الأمعاء محددة التعبير عن polyQ44 والعمر التجميع تعتمد CGC
AM809 VHA-6P :: :: RΔ2-5 GFP. ميو-2P :: mcherry التعبير الأمعاء محددة من التنوي غير كفء مجال بريون موريموتو المختبر
AM47 F25B3.3p :: :: polyQ40 الحراجية التعبير الخلايا العصبية محددة من polyQ40، نوع من الخلايا تجميع محدد موريموتو المختبر
AM982 unc54p :: :: luciferase المراسل YFP التعبير عضلة معينة من WT يراعة luciferase موريموتو المختبر ميو-3P :: :: luciferase المراسل GFP. رول-6 التعبير عضلة معينة من WT يراعة luciferase بيهل المختبر
SNG-1P :: :: luciferase المراسل GFP. رول-6 التعبير عضلة معينة من WT يراعة luciferase بيهل المختبر
FUH55 unc54p :: :: FLUC EGFP. رول-6 التعبير عضلة معينة من WT يراعة luciferase هارتل المختبر
FUH134 unc54p :: :: FLUCSM EGFP. رول-6 التعبير عضلة معينة من R188Q متحولة يراعة luciferase المراسل هارتل المختبر
FUH135 unc54p :: :: FLUCDM EGFP. رول-6 التعبير عضلة معينة من R188Q + R261Q متحولة مزدوج يراعة luciferase المراسل هارتل المختبر
FUH48 F25B3.3p :: :: FLUC EGFP. رول-6 التعبير الخلايا العصبية محددة من WT lucifera اليراعحد ذاتها هارتل المختبر
FUH136 F25B3.3p :: :: FLUCSM EGFP. رول-6 التعبير الخلايا العصبية محددة من R188Q متحولة يراعة luciferase المراسل هارتل المختبر
FUH137 F25B3.3p :: :: FLUCDM EGFP. رول-6 التعبير الخلايا العصبية محددة من R188Q + R261Q متحولة مزدوج يراعة luciferase المراسل هارتل المختبر
نهاية الخبر المسوخ
CB1402 UNC-15 (e1402) I نظير الميوزين (TS)، ودرجة الحرارة حساسة UNC بالشلل، واسمحوا CGC
CB1157 UNC-54 (e1157) I الميوسين (TS)، ودرجة الحرارة UNC حساسة CGC
CB1301 UNC-54 (e1301) I الميوسين (TS)، ودرجة الحرارة UNC حساسة CGC
CB286 UNC-45 (e286) III UNC-45 (TS)، ودرجة الحرارة الحساسة، وبطء التحرك UNC، EGL CGC
HE250 UNC-52 (e669su250) II Perlecan (TS)، ودرجة الحرارة حساسة UNC، والشلل قاسية CGC
SD551 دعونا-60 (ga89) IV رأس (TS)، ودرجة الحرارة حساسة MUV، سانت، اسمحوا، LVA، OSM CGC
CX51 داين-1 (ky51) X Dynamin (TS)، ودرجة الحرارة UNC حساسة CGC
CW152 الغاز-1 (fc21) X الغاز-1 (TS)، ودرجة الحرارة حساسة حساسية ETOH CGC
ZZ26 UNC-63 (X26) I أستيل مستقبلات (TS)، ودرجة الحرارة حساسة المقاومة الليفاميزول CGC
للصحفيين الإجهاد
CL2070 HSP-16.2p :: فرنك غينيع؛ رول-6 الإجهاد الحراري. خلوي الاستعراض الدوري الشامل CGC
TJ375 HSP-16.2p :: GFP الإجهاد الحراري. خلوي الاستعراض الدوري الشامل CGC
TJ3000، TJ3001 HSP-16.2p :: GFP. CBR-UNC-119 (+) الإجهاد الحراري. خلوي الاستعراض الدوري الشامل CGC
AM446 hsp70p :: GFP، رول-6 الإجهاد الحراري. خلوي الاستعراض الدوري الشامل موريموتو المختبر
AM722 hsp70p :: mcherry. ميو-2P :: الحراجية الإجهاد الحراري. خلوي الاستعراض الدوري الشامل موريموتو المختبر
AM799 hsp90p :: GFP الإجهاد الحراري. خلوي الاستعراض الدوري الشامل موريموتو المختبر
OG497 HSF-1P :: HSF-1 :: فرنك غينيع؛ CBR-UNC-119 (+) الإجهاد الحراري. خلوي الاستعراض الدوري الشامل CGC
CF1553 أبله-3P :: GFP، رول-6 الاكسدة CGC
KN259 أبله-3P :: GFP، رول-6 الاكسدة CGC
CL2166 GST-4P :: :: GFP NLS الاكسدة CGC
LD1171 GCS-1P :: GFP، رول-6 الاكسدة CGC
LD1 SKN-1P :: ŜĶŅ-1 :: GFP، رول-6 الاكسدة CGC
IG274 البرمجة اللغوية العصبية-29P :: GFP التوتر الاسموزي CGC
BC20309 MTL-1P :: GFP الإجهاد المعادن بيلي المختبر
BC20342 MTL-2P :: GFP شارع المعادنلاحقة معناها أنثى بيلي المختبر
BC20314 ELT-2P :: GFP الإجهاد المعادن بيلي المختبر
SJ4005 HSP-4P :: GFP UPR ER CGC
SJ4100 HSP-6P :: GFP UPR ميتو CGC
SJ4058 HSP-60P :: GFP UPR ميتو CGC

CGC: مركز علم الوراثة انواع معينة. TS = درجة الحرارة حساسة. UPR استجابة = تكشفت البروتين. خلوي = عصاري خلوي. ميتو = الميتوكوندريا. ER = الشبكة الإندوبلازمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأساليب المذكورة هنا تساعد على توضيح نشر والخلية معقدة المستقلة وغير المستقلة سمية الخلايا من البروتينات مثل بريون. اكتشفنا مؤخرا أن يؤخذ على عصاري خلوي مجال بريون المعرضة للتجميع ما يصل إلى الحويصلات بغشاء في عملية الالتهام الذاتي ذات الصلة. مجموعة فرعية معينة من هذه الحويصلات تنقل المجال بريون داخل وبين الخلايا والأنسجة 40. المفتاح لمراقبة حركتهم في الحيوان يعيش هو أن البروتين يجب أن يكون ذات الكلمات الدلالية مع mRFP، فقط لأن البروتينات mRFP الموسومة كانت واضحة في هذه الحويصلات الحمضية المفترض. باستخدام نفس النهج، نحن نحقق حاليا مثل السلوك بريون المحتمل لبعض البروتينات المرتبطة المرض، مثل ديسموتاز الفائق 1 (SOD1) (المرتبطة ALS)، ألفا synuclein (المرتبطة PD) أو TAR بروتين ملزمة DNA 43 (TDP-43) (المرتبطة ALS). ورغم أن هذا النقل بين الخلايا داخل الحويصلات يبدو لاستخدامها من قبل عدة بروتينات أخرى، قد يكون هناكمسارات dditional التي تسمح الانتشار.

استخدام أجهزة الاستشعار للطي تتميز كذلك هو أداة قوية لمراقبة الآثار على البروتين الخلوي للطي البيئة في C. ايليجانس 63-66. نحن هنا أظهرت كيفية استخدام تراكم تعتمد سن الموسومة fluorescently البروتينات تجميع عرضة أعرب تحت المروجين الأنسجة محددة لمراقبة بصريا القدرة للطي من أنسجة متميزة في وقت واحد. وتشمل الاحتمالات الأخرى لدراسة شبكة استتباب بروتيني عضوي استخدام الذاتية البروتينات متحولة TS. وهذه البروتينات متبدل الاستقرار بشكل طبيعي في درجة الحرارة المسموح بها (15 ° C)، ولكن misfold وتصبح غير وظيفي في درجة الحرارة المقيدة (25 ° C)، واظهار النمط الظاهري متحولة مميزة لهم. في وجود تجميع عرضة البروتين أو أثناء الشيخوخة، ونهاية الخبر يتعرض النمط الظاهري متحولة حتى في الظروف متساهلة 63-66. يتم التعبير عن بعض هذه نهاية الخبر المسوخ في سنلي مجموعة فرعية من الأنسجة أو الظواهر الأنسجة محددة المعرض، مما يجعل هذه مفيدة بشكل خاص لاختبار خلية خلية مستقلة وغير الآثار proteotoxic مستقلة. على سبيل المثال، متحولة TS من LET-60، وهو عضو في الأسرة RAS protooncogene ملزم GTP، رأس (TS)، وأعرب عن بتواجد مطلق، ولكن يظهر متحولة الأنسجة محددة الظواهر 63،66. باستخدام هذه نهاية الخبر متحولة، وقد تبين تأثير التوسعات polyQ على استتباب بروتيني الخلوية لتكون خلية مستقلة 63. التعبير عن polyQ في الخلفية الوراثية للرأس (TS) كشف فقط النمط الظاهري متحولة محددة لالأنسجة التي أعرب عن البروتين. ان التعرض من الظواهر متحولة متعددة تشير إلى أن بروتين له غير خلية آثار proteotoxic مستقلة.

بالإضافة إلى ذلك، لاختبار آثار على مسارات الإجهاد الخلوية، وهناك مجموعة كبيرة من الإجهاد في الجسم الحي للصحفيين الفلورسنت في C. ايليجانس 72. هذه عادة ما تكون النسخللصحفيين القاعدة، والتي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت مروج من الإجهاد محرض، مثل HSP-16.2p أو أبله-3P، والذي يقدم تقريرا عن الإجهاد الحراري أو الأكسدة، على التوالي 72. باستخدام صحفيين المناسب في تركيبة مع البروتينات مثل بريون، يمكن للمرء مراقبة الحث المحتمل لاستجابات التوتر في الأنسجة الأخرى من واحد معربا عن التحوير المعنيين. التحذير واحدة، ومع ذلك، هو أن هذه صحفيين الإجهاد غالبا ما تكون غير حساسة بما يكفي للكشف عن upregulation خفية من مسار معين (الملاحظات غير منشورة).

على سعينا لدراسة ما إذا كانت الجينات التي تؤثر على الخلايا غير سمية مستقلة أيضا تؤثر على البروتين نشر، بدأنا قبل الكشف عن الجينات التي، عندما ترسيتها، فإن تحسين عيوب الحركة. استخدام التقييم البصري للمعدلات السباحة باعتبارها التدريجي قراءة، كنا قادرين على فحص مريح ~ 25 لوحات في كل دورة وتنفيذ جولتين من هذا البروتوكول في الأسبوع، مما أدى إلى الانتهاءمن الشاشة الأولية في غضون 6 أسابيع. تأكيد الضربات، من خلال التحليل الكمي للحركة الدودة على لوحات الصلبة، في يثلث، تم تنفيذها باستخدام wrMTrck في 3 أسابيع إضافية. التحذير واحدة، ومع ذلك، هو أنه باستخدام الزحف في لوحات بدلا من السباحة في وسائل الإعلام السائلة كما للقراءة من أصل واحد قد تفقد بعض الجينات مرشح، والسباحة والزحف ليست متطابقة الاقتراحات ويمكن أن تتأثر مسارات مميزة 73. وهكذا، إذا لا يمكن تأكيد بعض الجينات المرشحة على لوحات الصلبة، ينبغي إعادة اختبار في وسائل الإعلام السائلة، حيث يمكن كميا السباحة عن طريق عد تردد سحق في غضون فترة زمنية معينة.

بروتوكول الفحص الموصوفة هنا يستخدم الآلي محطات معالجة السائل، مما يقلل كثيرا تقلب. والعيب هو أن هناك حاجة إلى وجود فائض من السوائل للخزان من الروبوتات، التي قد لا تكون دائما ممكنا. هذا الإعداد الفحص يمكن تكييفها بسهولة للشاشات أخرى في C. ايليجانس </ م> أن استخدام سحق بمثابة-out.This قراءة الشاشة لم تكن مصممة لتحديد الجينات التي تؤثر مباشرة في نشر أو عدم خلية سمية الحكم الذاتي في المجال بريون، كما ينبغي أن يكون الجينوم شاشات واسعة بسيط في التصميم، وذلك ليتم تنفيذها في الوقت المناسب. يمكن أن تنشأ عيوب الحركة ليس فقط من العضلات، ولكن أيضا من التلف العصبية وعدد من عيوب جينية أخرى 53. وهكذا، وذلك باستخدام هذا قراءات، فإننا قد نجد معدلات ليس فقط من سمية العضلات محددة. ونحن حاليا اختبار الجينات مرشح لآثارها على نطاق بريون نشر وغير سمية خلية مستقلة باستخدام الأساليب المذكورة أعلاه. وهذه التجارب تكشف في نهاية المطاف ما إذا كانت العابر للانتشار المجاميع بروتين يرتبط مباشرة إلى سمية لوحظت في الأنسجة الأخرى أو إذا نقل خلية الى خلية خلية وغير سمية مستقلة يمكن أن يكون وفكت.

أخذت معا، الأساليب المذكورة يمكن استخدامها لدراسة العلاقات العامة المحتملةالسلوك مثل أيون من البروتينات على المستوى الخلوي والعضوي باستخدام C. ايليجانس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie. Cell. 73 (6), 1055-1058 (1993).
  3. Caughey, B., Kocisko, D. A., Raymond, G. J., Lansbury, P. T. Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem Biol. 2 (12), 807-817 (1995).
  4. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
  5. Chien, P., Weissman, J. S., DePace, A. H. Emerging principles of conformation-based prion inheritance. Annu Rev Biochem. 73, 617-656 (2004).
  6. Kimberlin, R. H., Walker, C. A. Pathogenesis of mouse scrapie: patterns of agent replication in different parts of the CNS following intraperitoneal infection. J R Soc Med. 75 (8), 618-624 (1982).
  7. Beekes, M., McBride, P. A., Baldauf, E. Cerebral targeting indicates vagal spread of infection in hamsters fed with scrapie. J Gen Virol. 79 (3), 601-607 (1998).
  8. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).
  9. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
  10. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  11. Wood, S. J., et al. alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease. J Biol Chem. 274 (28), 19509-19512 (1999).
  12. Wang, Y. Q., et al. Relationship between prion propensity and the rates of individual molecular steps of fibril assembly. J Biol Chem. 286 (14), 12101-12107 (2011).
  13. Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 123 (8), 1191-1201 (2010).
  14. Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442 (7102), 585-589 (2006).
  15. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J Struct Biol. 179 (2), 152-160 (2012).
  16. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).
  17. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cell-autonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. Dis Model Mech. 7 (1), 31-39 (2014).
  18. Lino, M. M., Schneider, C., Caroni, P. Accumulation of SOD1 mutants in postnatal motoneurons does not cause motoneuron pathology or motoneuron disease. J Neurosci. 22 (12), 4825-4832 (2002).
  19. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  20. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 13010-13015 (2009).
  21. Clement, A. M., et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science. 302 (5642), 113-117 (2003).
  22. Gu, X., et al. Pathological cell-cell interactions elicited by a neuropathogenic form of mutant Huntingtin contribute to cortical pathogenesis in HD mice. Neuron. 46 (3), 433-444 (2005).
  23. Yamanaka, K., et al. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7594-7599 (2008).
  24. Garden, G. A., et al. Polyglutamine-expanded ataxin-7 promotes non-cell-autonomous purkinje cell degeneration and displays proteolytic cleavage in ataxic transgenic mice. J Neurosci. 22 (12), 4897-4905 (2002).
  25. Raeber, A. J., et al. Astrocyte-specific expression of hamster prion protein (PrP) renders PrP knockout mice susceptible to hamster scrapie. EMBO J. 16 (20), 6057-6065 (1997).
  26. Yazawa, I., et al. Mouse model of multiple system atrophy alpha-synuclein expression in oligodendrocytes causes glial and neuronal degeneration. Neuron. 45 (6), 847-859 (2005).
  27. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
  28. Sambataro, F., Pennuto, M. Cell-autonomous and non-cell-autonomous toxicity in polyglutamine diseases. Prog Neurobiol. 97 (2), 152-172 (2012).
  29. Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Prion-like spread of protein aggregates in neurodegeneration. J Exp Med. 209 (5), 889-893 (2012).
  30. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).
  31. Braak, H., Braak, E., Bohl, J. Staging of Alzheimer-related cortical destruction. Eur Neurol. 33 (6), 403-408 (1993).
  32. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).
  33. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  34. Clavaguera, F., et al. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat Cell Biol. 11 (7), 909-913 (2009).
  35. Nonaka, T., et al. Prion-like Properties of Pathological TDP-43 Aggregates from Diseased Brains. Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).
  36. Lundmark, K., et al. Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6979-6984 (2002).
  37. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10 (5), 703-713 (2000).
  38. Xu, X., Kim, S. K. The early bird catches the worm: new technologies for the Caenorhabditis elegans toolkit. Nat Rev Genet. 12 (11), 793-801 (2011).
  39. Boulin, T., Hobert, O. From genes to function: the C. elegans genetic toolbox. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (1), 114-137 (2012).
  40. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 9 (3), e1003351 (2013).
  41. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
  42. Liu, J. J., Lindquist, S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast. Nature. 400 (6744), 573-576 (1999).
  43. Halfmann, R., et al. Prions are a common mechanism for phenotypic inheritance in wild yeasts. Nature. 482 (7385), 363-368 (2012).
  44. Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6 (11), e294 (2008).
  45. Krammer, C., et al. The yeast Sup35NM domain propagates as a prion in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 462-467 (2009).
  46. Hofmann, J. P., et al. Cell-to-cell propagation of infectious cytosolic protein aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (15), 5951-5956 (2013).
  47. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  48. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
  49. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , (2006).
  50. Methods in cell biology. Wormbooks. Shaham, S. , (2006).
  51. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization). PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
  52. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. , (2006).
  53. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  54. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  56. Kern, A., Ackermann, B., Clement, A. M., Duerk, H., Behl, C. HSF1-controlled and age-associated chaperone capacity in neurons and muscle cells of C. elegans. PLoS One. 5 (1), e8568 (2010).
  57. Becker, J., Walter, W., Yan, W., Craig, E. A. Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydj1p, in protein translocation in vivo. Mol Cell Biol. 16 (8), 4378-4386 (1996).
  58. Salvaterra, P. M., McCaman, R. E. Choline acetyltransferase and acetylcholine levels in Drosophila melanogaster: a study using two temperature-sensitive mutants. J Neurosci. 5 (4), 903-910 (1985).
  59. Goloubinoff, P., Mogk, A., Zvi, A. P., Tomoyasu, T., Bukau, B. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (24), 13732-13737 (1999).
  60. Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. D. naK. DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J. 12 (11), 4137-4144 (1993).
  61. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31 (21), 4221-4235 (2012).
  62. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
  63. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  64. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  65. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. J Vis Exp. (82), e50840 (2013).
  66. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5 (3), e1000399 (2009).
  67. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  68. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. J Neurosci. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  69. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. J Biol Chem. 283 (1), 194-201 (2008).
  70. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  71. Schatzl, H. M., et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J Virol. 71 (11), 8821-8831 (1997).
  72. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. , (2014).
  73. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 95،
التحقيق في نشر وسمية البروتينات مثل بريون باستخدام Metazoan نموذج حي<em&gt; C. ايليجانس</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M.… More

Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter