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Biology

Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo Published: January 8, 2015 doi: 10.3791/52321
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research, Northwestern University

Introduction

Muitas doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP), a esclerose lateral amiotrófica (ELA), e encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET), estão associados a proteínas de agregação propensas e são, portanto, conhecidos coletivamente como proteína misfolding transtornos (EPM ). EET ou doenças provocadas por priões constituem uma classe única de EPM em que eles podem ser infecciosas em seres humanos e animais 1. A nível molecular, prions replicar recrutando e convertendo monomérica α-hélice-rico codificado-host PrP celular (PrP C) para o patológico β-folha-rico conformação PrP Sc 2,3. Agregados de proteína auto-propagação também foram identificados em fungos, que partilham características importantes de mamíferos com priões 4,5. Além disso, os priões mamíferos são capazes de mover a partir de célula-a-célula e infectar células naive 6,7.

Enquanto EPM other do TSE não são infecciosos, eles compartilham um princípio patogênico comum com doenças de príon 8,9. Embora as proteínas ligadas a cada um dos EPM não estão relacionados em termos de estrutura ou função, eles todos formam agregados por meio de um processo de cristalização, chamado nucleada ou semeada de polimerização; Além disso sementes proteicos crescer através do recrutamento de suas isoformas solúveis 2,10,11. A eficiência para a auto-propagam in vivo varia, dependendo das propriedades intrínsecas da proteína, que, em conjunto com factores celulares adicionais, tais como as chaperonas moleculares, em última análise determinam as taxas de nucleação agregado, a sementeira, a fragmentação e espalhamento 12-15. Por isso, deve haver um bom equilíbrio entre esses fatores que permite a propagação eficiente de agregação de proteínas. Isso também pode explicar por que apenas alguns agregados amiloidogénicas abrigar as características de um prião, e, assim, nem todos os EPM são infecciosas. Os príons parecem representar o 'top-performers'fa amplo espectro de agregados proteicos de auto-replicação, o que os torna uma ferramenta poderosa para estudar EPM 8,13.

Curiosamente, a toxicidade associada com agregados relacionados com a doença muitas vezes tem um componente autônomo não célula 16,17. Isto significa que eles afectam as células vizinhas que não expressam o gene correspondente, em contraste com um efeito estritamente autónoma célula, o que implica que apenas as células que expressam o gene exibem o fenótipo específico. Este foi convincentemente demonstrada pela expressão específica de tecido ou derrubar das respectivas proteínas em vários modelos de doenças neurodegenerativas 18-26. Vários mecanismos têm sido sugeridos como uma base para esta não-toxicidade celular autônomo na EPM, incluindo o fornecimento de nutrientes diminuído, o desequilíbrio na sinalização neuronal, excitotoxicidade do glutamato, e neuroinflammation 16,27,28. Além disso, um movimento de prião semelhante de agregados ligados de doenças entre as células might contribuir para este aspecto 29,30. Uma evidência crescente sugere que outras inclusões de proteína que pode transmitir priões a partir de célula-para-célula, o que pode explicar a característica de difusão na patologia observada em muitos EPM 30-36. No entanto, ele ainda não foi determinado se há um claro nexo de causalidade entre o movimento intercelular de proteínas doença eo efeito tóxico sobre as células vizinhas. Por conseguinte, um melhor entendimento das vias celulares que estão subjacentes a transmissão célula-a-célula e célula não autónomo toxicidade é necessária e essencial para o desenvolvimento de novas terapias. No entanto, muitos aspectos do prião como espalhando-celulares e factores que influenciam a transmissão célula a célula de proteínas mal enroladas em metazoários não são bem compreendidos, em particular ao nível dos organismos.

O nemátodo Caenorhabditis elegans tem várias vantagens que oferecem o potencial de descobrir novas facetas de spreadi prion-likeng em metazoans 17. É transparente, permitindo a rastrear in vivo de proteínas marcadas fluorescentemente no organismo vivo. Além disso, muitos processos celulares e fisiológicas afectadas pela doença são conservados de vermes para a saúde humana, e C. elegans é também susceptível a uma grande variedade de manipulações genéticas e análises moleculares e bioquímicos 37-39. Exatamente 959 células somáticas compõem o hermafrodita adulto com um plano corporal simples, que ainda tem vários tipos de tecidos diferentes, incluindo músculos, neurônios e intestino.

Para estabelecer um novo modelo de príon em C. elegans, que escolheu para expressar exogenamente a glutamina bem caracterizada / asparagina (Q / N) rico em prião NM domínio do cytosolic proteína de levedura prion Sup35, já que não há proteínas príon endógenas conhecidas em vermes 4,40. Prions levedura foram inestimáveis ​​para elucidar os mecanismos básicos de prion replicação 41-44. Além disso, NM é o abetoproteína prião como citosólica-r que tem sido mostrado para recapitular o ciclo de vida completo de um prião em cultura de células de mamífero 45,46. Da mesma forma, quando expresso em C. elegans, o domínio prion Sup35 adotado muito bem com as diferentes necessidades para propagação em células metazoários em comparação com células de levedura e principais características expostas da biologia prion agregação 40. NM foi associada com um fenótipo tóxico profunda, incluindo a ruptura da integridade mitocondrial e aparecimento de várias vesículas autofagia relacionados sobre o nível celular, bem como prisão embrionário e larval, atraso do desenvolvimento, e uma perturbação generalizada do ambiente dobramento de proteínas ao nível do organismo. Surpreendentemente, o domínio príon celular apresenta toxicidade autônoma e não autônomos celular, afetando tecidos vizinhos em que o transgene não foi expressa. Além disso, o transporte vesicular do domínio prião dentro e entre as células é monitorado em tempo real <em> in vivo 40.

Aqui nós descrevemos como examinar divulgação prion-like em C. elegans. Vamos explicar como monitorar o transporte intra e intercelular de vesículas contendo o domínio prion usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Vamos enfatizar o uso de sensores de dobradura de tecidos específicos e universalmente expressa repórteres de estresse para avaliar Cell efeitos autônomos autónomos e não sobre fitness celular. Finalmente, vamos descrever o procedimento de uma grande tela recentemente realizada genoma RNA de interferência (RNAi) para identificar novos modificadores de toxicidade induzida por prion. Em conjunto, estes métodos podem ajudar a provocar uma separação de caminhos genéticos envolvidos no movimento intercelular de proteínas e sua toxicidade autónoma non celular.

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Protocol

1. Monitoramento transcelular Espalhando de proteínas príon-like por In Vivo tempo-lapso

NOTA: Crescer C. elegans do tipo selvagem (WT) (N2) e linhas transgénicas de acordo com métodos padrão e controlar cuidadosamente a temperatura de cultivo 47.

  1. Gerar linhagens transgênicas de C. elegans que expressa a proteína prion-like, marcado com proteína fluorescente vermelha monomérica (MRFP). Assista a este vídeo que demonstra como usar a microinjeção 48. Para mais detalhes e métodos que descrevem como integrar estas linhas extracromossómicos, consulte 49.
  2. Prepare populações sincronizadas por colocação de ovo ou branqueamento de acordo com métodos padronizados 50.
    1. Sincronização de postura de ovos
      1. Transferência de 10-20 adultos grávidas em um prato e deixe que eles põem ovos por 1-2 horas. Remover adultos a partir da placa e deixar a crescer até a progenitura idade desejada.
      2. <li> Sincronização por branqueamento
      1. Recolha uma população de adultos grávidos não sincronizado e branquear com uma solução de hipoclorito alcalino (NaOH a 250 mM e 1: 4 (v / v) diluição da lixívia comercial em H 2 O). Lavar os ovos duas vezes (218 xg durante 1 min) com tampão M9 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO · 4 7H 2 O, adicionar dH2O até 1 L).
      2. Permita-lhes a eclodir em tampão M9 com suave agitação O / N a 20 ° C. Desenvolvimento verme vai prender na fase L1 na ausência de uma fonte de alimento, deixando uma população sincronizada. Transfira para L1s fresco nematóides Crescimento Media (NGM) placas semeadas com OP50 E. coli bactérias e deixar a prole se desenvolver até a idade desejada 47.
  3. Prepare 2% almofadas de agarose (em H 2 O) em uma lâmina de microscópio como descrito 50.
    1. Prepare dois microscope com lâminas de fita de rotulagem colocados ao longo de todo o seu comprimento para ser usado como espaçadores. Colocar uma terceira lâmina de microscópio entre eles.
    2. Dissolve-se 2% de agarose em H 2 O e uma pipeta de queda sobre a lâmina limpa.
    3. Coloque uma quarta corrediça perpendicular aos outros três lâminas sobre o topo da gota de agar. Pressione levemente para baixo para achatar a almofada para a mesma espessura que a fita de rotulagem.
    4. Deixe secar por 1 min antes de retirar os espaçadores e puxando os slides separados. A almofada de agar vai ficar com um deles.
  4. Pipeta ~ 10 ul anestésico (2 levamisol mM em tampão M9) para a almofada de transferência e ~ 10 animais utilizando-se uma escolha de fio de platina. Cubra com uma lamela (~ 22 x 22 mm) e tirar fotos dentro de 1 hora.
  5. Alternativamente, para adquirir os filmes ao longo de um longo período de tempo ou para reduzir ainda mais a possibilidade de uma deslocação dos animais, usar uma combinação de anestésico e talão de imobilização 51.
    1. Prepare 10% agaalmofadas aumentou (em tampão M9), conforme descrito 51 e adicionar minhocas a 3 ul solução padrões de tamanho nanosphere (esferas de poliestireno, 100 nm), mais 3 anestésicos ul (4 levamisol mM em tampão M9). Cubra delicadamente com uma lamela. Para evitar a desidratação, selar a lamínula com valap (mistura de quantidades iguais de vaselina, lanolina e cera de parafina).
  6. Imagem vermes imobilizada utilizando um microscópio confocal.
    Nota: Os resultados são obtidos utilizando um disco giratório AF confocal microscópio equipado com uma câmera de EM-CCD e um Software Microscopia Automação e Análise de Imagem, como MetaMorph e delinear os detalhes abaixo, mas outros sistemas de imagem confocal comparável também pode ser usado.
    1. Use o objetivo de óleo 63X ou 100X / 1.4NA e coloque a lâmina de microscópio contendo vermes no suporte da lâmina de microscópio.
    2. Abra o software. Ajuste de potência do laser e filtros para MRFP imagem. Use o laser 561 nm a 10% de energia e emissão de filtro> 600 nm.
    3. Sob a guia "Saving" selecionar ou criar a pasta do diretório onde os arquivos devem ser salvos. Atribua um nome para o arquivo.
    4. No separador "Comprimento de onda", selecione a iluminação adequada e ajustar a exposição e ganho. Use "YokoQuad Red" (ou uma configuração de iluminação equivalente para MRFP de imagem) com uma exposição de entre 100 e 300 ms e um ganho da câmera entre 100 e 300, dependendo da amostra individual (avaliada usando a imagem ao vivo).
    5. No separador "Timelapse" selecionar "Número de pontos de tempo" = 301, "Duração" = 5 min e "Time / Interval" = 1 seg.
    6. Sob a "Journals" tab selecione Journal: "AFC SET Z HOLD" e "AFC Return to Z HOLD", Tipo: &# 8220; Special "(duas vezes), Ponto inicial:" Inicio do horário de ponto "e" Fim do ponto de tempo ". Esta opção de focagem automática é importante para a imagem da mesma secção ao longo de um período mais longo de tempo.
    7. Quando a instalação for concluída, pressione "Adquirir". O vídeo timelapse é safed como arquivos TIFF separados.
    8. Abra todas ficheiros.tiff de uma determinada série tempo em ImageJ. Vá em "Imagem" → "Stacks" → "Imagens para Stacks". Opcionalmente, ajustar brilho e contraste, adicionar bar tamanho, etc. Exportar o filme em "File" → "salvar como" → "AVI ..." (por exemplo, ver vídeo 1 e 2 correspondente à Figura 1).

2. Usando dobráveis ​​Sensores e Repórteres de estresse para Investigar celular autónomos e não celular Autónoma afeta em Proteostase e Toxicidade

  1. Gerar linhagens transgênicas que co-expressar um sensor de dobragem ou estresse reporter em conjunto com a proteína prião semelhante. Para os métodos sobre como estabelecer cruzes ou gerar linhagens transgênicas, ver 48,49,52. Ver Tabela 1 para uma lista de C. elegans estirpes que podem ser utilizadas.
  2. Prepare populações sincronizados de animais transgênicos e cultivá-las até a idade desejada, conforme descrito acima (seção 1.2) 50.
  3. Usando um microscópio estereoscópico, examinar o respectivo fenótipo do sensor de dobragem ou estresse repórter.
    1. Para o sensor de dobragem, determina o número de animais que albergam agregados em cada dia depois da sincronização (por exemplo, ver Figura 2E e F).
    2. Para o repórter tensão, se o ensaio de co-expressão dos resultados priões do tipo de proteína em uma fluorescência aumentada do repórter (para um exemplo, ver Figura 3).

3. Tela Genome-wide para Repressão de toxicidade induzida por Prion em C. elegans

Figura 4
Figura 4. Representação esquemática do protocolo de triagem RNAi. Consulte a seção de protocolo 3 para uma descrição detalhada das etapas individuais.

  1. Sincronização de C. vermes elegans e duplicação de biblioteca RNAi
    1. Para a tela de RNAi, usar a biblioteca Ahringer RNAi (ou a biblioteca Vidal RNAi) 53,54. Rearray a biblioteca de RNAi do original 384 formato bem em placas de 96 poços, preenchendo as placas com 100 ul meio LB-amp (50 ug / ml de ampicilina em LB) suplementado com 10% de glicerol e inocular utilizando um replicador de 96 pinos. Crescer a 37 ° CO / N com agitação e armazenar a -80 ° C.
    2. Manter C. linhagens transgênicas em 20 ° C em placas NGM elegans WT e semeado com OP50 E. bactérias coli de acordo com métodos padrão 47.
    3. Sincronize transgênico domínio prion e WT (controle) nematóides pelo branqueamento (ver secção 1.2).
    4. No mesmo dia em que os vermes são branqueados, preparar meio LB suplementado com 50 ug / ml de ampicilina. Usar um dispensador automático para distribuir o reagente (ou pipeta manualmente) 65 ul dos meios LB-amp em cada poço de uma placa de 96 poços.
    5. Retirar 96 poços placas biblioteca Ahringer RNAi de -80 ° C e trazê-los para um capuz estéril forrado com papel toalha. Remover imediatamente o selo-tape, segurando a placa de cabeça para baixo, enquanto as placas ainda estão congelados, tendo o cuidado para evitar a contaminação de gelo do lado de fora das placas. Reinverter as placas e deixá-los descongelar por cerca de 30 min.
    6. Mergulhe uma estéril 96 pin replicador em uma placa de RNAi biblioteca, e, em seguida, em uma placa de LB-amp fresco. Use um replicador estéril nova para cada prato. Vede todas as placas com fita adesiva e papel alumínio retornar as placas da biblioteca para -80 ° C. Os replicadores pode ser embebido em água sanitária, enxaguado,e autoclavado para ser usado novamente.
    7. Permitir placas duplicadas de ARNi para crescer O / N em uma incubadora ajustada a 37 ° C e 300 rpm. Para usar HT115 E. coli bactérias que albergam o vector vazio (L4440) como um controlo, crescem-lo separadamente num tubo de cultura e, em seguida, pipeta 65 ul da cultura com uma pipeta de canais múltiplos dentro de um quarto de duas placas de 96 poços.
  2. A indução da produção bacteriana ARNcd e adição de vermes
    1. Dilui-Isopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) para uma concentração de 5 mM em ddH 2 O. Utilize uma estação de trabalho automatizada com uma cabeça para dispensar múltiplos canais (ou pipeta manualmente) 10 ul de IPTG diluída em todos os poços das bactérias RNAi e as placas de controlo. Voltar a vedar e colocar as placas de novo na incubadora. Deixá-los agitar durante 3 horas a 37 ° C.
    2. Enquanto as bactérias estão tremendo, preparar os vermes. Misture a suspensão M9 / verme bem, e pipetar uma pequena amostra (~ 5 - 10 ul) para uma lâmina de microscópio de vidro. Contaro número de vermes sob microscópio estereoscópico e calcular o número de vermes por ul.
    3. Utilizando uma técnica estéril, preparar uma solução de M9 suplementado (M9 +) com as seguintes concentrações finais: 0,20 mg / ml de IPTG, 8,0 ug / ml de colesterol, 50 ug / ml de ampicilina, 9,6 ug / ml de tetraciclina, 0,0835 ug / ml de Fungizone, e 15 vermes por 50 ul.
      1. Faça soluções separadas para transgênica domínio prion e vermes WT. O volume final da solução verme M9 + necessária irá depender do número de placas de ARNi copiados (ver abaixo), além de ~ 30 ml de volume morto que vai permanecer no reservatório, se um distribuidor automático é usado.
    4. Após a indução de 3 horas de produção dsRNA bacteriana, tirar as placas fora da incubadora e deixe-os arrefecer à RT (~ 30 min) para evitar calor perturbar os animais.
    5. Dispensar 50 ul de domínio de prião solução verme transgénico M9 + para cada poço das placas de ARNi e uma das placas de controlo do vector vazio. FazerCertifique-se de misturar a solução verme antes de cada passo como os animais tendem a sedimentar para o fundo do reservatório.
    6. Dispensar vermes WT para a segunda placa de controle. Deixar as placas não vedadas para permitir o arejamento. Para manter a cultura líquido evapore, empilhe 4-5 placas juntos e enrole com uma toalha de papel úmido e papel alumínio. Incubar a 200 rpm a 20 ° C durante 4 dias.
  3. Scoring
    NOTA: Após 4 dias na incubadora, os vermes estará no segundo dia de vida adulta e estão prontos para o rastreio. Deixe os animais se adaptar às condições não agitam durante 30 minutos antes de triagem para garantir surra sem serem incomodados.
    1. Usando uma câmara Falcon 4M60 ligado a um computador com um monitor, para o aumento da tela visualmente debulha, em comparação com o domínio de prião animais transgénicos de controlo tratados.
    2. Compilar uma lista de visitas preliminares para confirmar usando wrMTrck (veja a próxima seção).

4. Confirmação da PreliminarBatida de tela

  1. Ensaio de motilidade em placas sólidas
    1. Preparar placas com NGM suplementadas com 100 ug / ml de ampicilina, 12,5 ug / ml de tetraciclina e 1 mM de IPTG, de acordo com métodos padrão 47. Se possível, use uma máquina de despejar placa para assegurar todas as placas têm a mesma altura dos meios de comunicação, o que permitirá um processo de aquisição de vídeo mais simplificado.
    2. Crescer as diferentes clones de ARNi em ~ 1 ml de LB + 50 ug / ml de ampicilina, O / N a 37 ° C e 250 rpm.
    3. No dia seguinte, induzir a expressão do ARNcd com IPTG 1 mM durante 3 h. Semente as placas com 150 mL de cada clone bacteriano RNAi, distribuídos em uma camada fina. Deixe as bactérias secas durante 2 dias à TA no escuro. Prepare 3 placas por RNAi clone.
    4. Sincronize a população sem-fim por branqueamento de acordo com métodos padronizados 50 (ver secção 1.2), e deixe os ovos eclodem O / N em M9 mídia.
    5. Tomar uma amostra da suspensão verme e determinar a quantidade de NEMatodes por ul no microscópio estereoscópico. Em seguida, pipetar o volume adequado de meio M9 mais vermes em cada placa experimental de modo que contenha 25 - 30 vermes L1. Crescer as nemátodos a 20 ° C durante 4 dias até que os vermes atingir dia 2 da fase adulta.
  2. A análise quantitativa da motilidade verme com o plugin wrMTrck para ImageJ
    NOTA: Os vídeos foram gravados usando um microscópio estereoscópico com aumento de 10x com um Hamamatsu Orca-R2 câmera digital C10600-10B eo software PCI imaging Simples Hamamatsu.
    1. Ligue a câmera eo software PCI imagem simples. Clique em "Live" para permitir o ajuste das condições de imagem.
    2. Configurar as condições de vídeo como se segue: Ganho = 0; Modo Luz = alta; Índice de Velocidade = 1; Binning = 2. Clique em "Auto Exposé" e, em seguida, ajustar as condições de iluminação, movendo-se os espelhos microscópio e do brilho e contraste mostradores.
      NOTA: O vídeo precisa ter um alto contraste sem ser OVEREXPosed, de modo que os animais aparecem como formas pretas em um fundo brilhante.
    3. Clique em "Scan Time" e escolha uma pasta e um nome de arquivo. Defina "Campo Delay" para 20 ms e "Pare no Time" a 30 seg. Pressione "Review Live", a fim de escolher a área da chapa para gravar (onde a maioria dos worms são). Toque na placa 3 ou 4 vezes no palco, rapidamente confirmar a sua posição no campo de visão e pressione "Start".
    4. Depois que o filme termina de gravar, clique direito sobre a imagem e escolha "Exportar Montage Sequence" para exportar o filme a partir de um formato .cxd a um .avi.
  3. Analisando os vídeos de motilidade
    1. Abra o software ImageJ, vá para a aba "Plugins" e depois em "wrmtrck" e selecione "Batch wrMTrck". Selecione o diretório que contém todos os arquivos a serem analisados.
    2. Na janela de entrada principal do wrMTrck_Batch, carregar os valores de entrada, conforme detalhado na Figure 5C. Explicação para cada um dos parâmetros podem ser encontradas no manual de instruções que acompanham o plugin. Clique em "OK" e deixar a análise do movimento de execução.
    3. Para a curadoria os resultados e confirmar que todas as faixas detectadas são de real C. elegans e eliminar artefatos, abra cada um dos arquivos .txt criados para cada filme e copiar as informações em um arquivo de software de análise de dados. Abra o "* _labels.zip" arquivos criados e executar o que resulta "* _labels.tif" para verificar e eliminar faixas vermes falsos manualmente.

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Representative Results

Monitoramento intercelular difusão de proteínas príon-like in vivo por time-lapse imaging

Transgênicos C. linhas elegans que expressam o domínio prião são particularmente bem adaptados para a análise de certos aspectos de proteínas priões do tipo, por exemplo, transmissão de célula para célula e a toxicidade celular não autónomo. A transparência dos animais permite o acompanhamento de fluorescente etiquetado proteínas de dentro do organismo vivo em todas as fases da vida. Aproveitando-se disso, o movimento de proteínas príon-como em todo células e tecidos, utilizando um microscópio de fluorescência são visualizados. Um objectivo óleo 63X ou 100X / 1.4NA é necessária para resolver as estruturas vesiculares. É importante notar que o domínio de prião tem que ser marcado com MRFP, a fim de permanecer com fluorescência visível dentro destas vesículas ácidas presumivelmente 40. Proteína fluorescente amarela (YFP), que é muitas vezes usado como uma tag, is não é adequado porque ele é resfriado em um ambiente de baixo pH 40,55. Estirpe AM815 expressa marcaram-RFP R2E2 (uma forma altamente propensos a agregação e tóxica do domínio prião NM) que se acumula em vesículas tubulares, enquanto por si só a marcação RFP permanece solúvel (Figura 1A e B). Usando a imagem in vivo de lapso de tempo, pode-se observar que essas vesículas tubulares são transportados dentro e entre as células 40 (Figura 1C e D, Video 1 e 2) [colocar links para vídeo 1 e 2 aqui].

Utilizando sensores de fole e repórteres de estresse para investigar celulares efeitos autônomos autónomos e não celulares sobre Proteostase e toxicidade

Os príons são capazes de atravessar proteínas relacionadas sementes e perturbar o ambiente de dobramento de proteínas celulares. Isso pode ser revelada através da co-expressão de senso dobrável adequadors. Sensores dobráveis ​​são proteínas metastáveis ​​não essenciais que dependem de uma rede Proteostase funcional para dobrar corretamente. Alguns exemplos são a luciferase do pirilampo bem conhecido e abrigando proteínas sensíveis à temperatura (ts) mutações 56-66. Uma interrupção de Proteostase leva para o enrolamento incorrecto do repórter, o qual pode ser detectada por meio de exame visual dos agregados ou por exposição do respectivo fenótipo mutante ts a temperaturas permissivas. Trechos de polyglutamine (polyQ) com um comprimento no limiar de agregação (cerca de 40 resíduos) também são usados ​​muitas vezes porque eles apresentam uma agregação dependente da idade 67-69. Início mais precoce da agregação revela um ambiente de dobradura comprometida. Aqui, nós empregamos um mutante prion RΔ2-5 que permanece solúvel quando expressos em C. elegans músculo da parede do corpo (BWM) e células do intestino 40 (Figura 2A e C). Na altura da expressão simultânea com R2E2 em células BWM, RΔ2-5 readíly agregados (Figura 2B), revelando uma célula autônoma de R2E2 efeito sobre o meio ambiente dobramento de proteínas. O efeito generalizado sobre Proteostase e indução de enrolamento incorrecto através dos tecidos pode ser avaliada pela expressão do sensor de dobragem num tecido distinto que não expressam a forma altamente propensa à agregação-do domínio do prião. R2E2 foi expressa sob um promotor específico de células BWM (mio-3p), ao passo que RΔ2-5 foi expressa sob um promotor específico do intestino (vha-6p). Agregação de RΔ2-5 intestinal demonstra que R2E2 afecta o enrolamento de proteínas de um modo autónomo não célula 40 (Figura 2D). Em vez de usar RΔ2-5, em que os agregados só pode ser detectado em alta resolução, o uso de polyQ44 expresso no intestino (Q44i) permite a visualização de agregados em baixa resolução sob um estereomicroscópio (Figura 2E e F). Além disso, isto permite uma quantificação de animasl com agregados, bem como a quantificação do número de agregados.

Para investigar a toxicidade de células não autónomo do domínio do prião, que anteriormente examinados tecidos que não expressam R2E2 por microscopia electrónica vizinho e descobriu que a expressão do domínio do prião em células musculares leva a um rompimento de células não autónomo de integridade mitocondrial em tecidos adjacentes, tal como o intestino 40. Disfunção mitocondrial em resultados o aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS) produção e estresse oxidativo. A forma não invasiva para visualizar a indução da resposta ao estresse oxidativo é a utilização de um estresse oxidativo repórter indutível 70. A cepa CF1553 expressa a proteína fluorescente verde (GFP), sob o estresse oxidativo promotor induzido sod-3 70. Quando cruzado para animais que expressam o domínio prião R2E2 em células BWM, o repórter foi significativamente regulada positivamente em células BWM, bem como em vários tecidos não-BWM ( A Tabela 1 apresenta uma lista de C. elegans estirpes expressando sensores dobráveis ​​e repórteres de stress que podem ser usados ​​de forma análoga.

Tela de todo o genoma para a supressão de toxicidade induzida por prion em C. elegans

O fenótipo toxicidade complexo do domínio prião expresso em C. elegans é particularmente interessante por causa da falta de toxicidade observados em mais perceptível em modelos in vitro de priões 71. Este modelo pode revelar novos caminhos que podem influenciar a toxicidade associada com príons no metazoans. Para resolver isso, temos examinado para genes que, quando RNAi-empobrecido, irá melhorar a motilidade defeito de animais transgênicos R2E2. Controlo tratados vermes WT pode ser usado como um co positivantrol, embora a maioria dos genes candidatos não irá fornecer um resgate fenótipo movimento completo, devido à penetrância variável RNAi e a elevada toxicidade do transgene. Os animais foram tratados durante 4 dias com RNAi, a partir do primeiro estado de larvas L1 de 2 dias de idade adulta. Por esse tempo, a goleada de animais não tratados R2E2 é significativamente mais lenta do que a goleada de animais WT, que é importante, porque estamos a triagem para a melhoria da mobilidade. F1 descendência estará presente (~ L1), mas é fácil distinguir a partir da geração P0. Somente a geração P0 é marcado. Este ecrã inicial é visual e não quantitativo e, portanto, um baixo limiar foi usado para identificar acertos preliminares, o que significa que cada clone de RNAi bacteriana que pareceu aumentar a debulha de animais que expressam priões foi re-testada num ensaio de rastreamento quantitativa. A Figura 4 descreve o principais etapas do configuração de tela. A alta resolução da câmera Falcon 4M60 permitiu uma triagem visual de um quarter da placa de cada vez na tela do computador, o que permitiu a tela para ser concluída de forma mais eficiente. Embora útil, esta não é necessária. O exame visual do verme debulha também pode ser realizada utilizando-se um estereoscópio com baixa ampliação (10x).

Confirmação de visitas de rastreio preliminar

Rastreios de elevada capacidade são executadas como uma abordagem que permite a análise do genoma efeitos largos para obter uma lista principal de genes candidatos que podem ser refinados por métodos complementares. A validação dos resultados de tela é, portanto, essencial para eliminar possíveis falsos positivos, que possam resultar da realização de uma tela com apenas uma amostra experimental por RNAi. R2E2 animais transgénicos foram alimentados com os clones de ARNi de acessos primários e medida a sua velocidade em placas NGM no segundo dia de idade adulta, como uma leitura quantificável de motilidade e toxicidade diminuída. Nós usamos o plugin wrMTrck para ImageJ, desenvolvido em nossolaboratório, que identifica com precisão C. elegans em vídeos e segue seu movimento. O plugin e scripts para análise automatizada wrMTrck são de código aberto e acessível ao público em http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html, junto com instruções detalhadas sobre como usá-lo. Após o download, copiar a pasta inteira wrMTrck para a pasta Plugins do ImageJ. Este protocolo descreve o método wrMTrck_Batch, preferido para a análise de um grande número de vídeos em um momento, mas as instruções de um manual, filme por filme, análise também estão disponíveis com o download do plugin. WrMTrck_Batch converte um vídeo original (Figura 5A) em um formato binário com subtração de fundo e cada verme é atribuída uma faixa. Cada um dos vídeos processados ​​podem ser visualizadas mais tarde com estas faixas sobrepostas, de modo a eliminar quaisquer artefactos manualmente que foram falsamente identificados como vermes (e. G., Pista 1 na Figura 5B). Uma maneira eficaz de eliminar arte de fundo iFacts (indicado com uma seta na Figura 5B) é escolher cuidadosamente o tamanho mínimo e máximo dos objectos a ser identificados (Figura 5C). A partir das diferentes saídas do encaixe wrMTrck, usamos os comprimentos de corpo por segundo (BLPS) parâmetro que mede a velocidade média de cada animal, representada pelo comprimento de cada faixa dividida pelo comprimento do corpo de cada objecto, portanto, para normalizar as diferenças potenciais no tamanho dos nemátodos (Figura 5D). Utilizando este método, foram identificados 35 supressores de toxicidade induzida por prião (sopt) que aumentou o fenótipo motilidade em R2E2 expressando C. elegans para pelo menos 133% e até 256% quando comparado com vermes tratados com vector vazio (Figura 6). Estes genes sopt representam confirmou a final visitas que resultaram de nossos esforços rastreio de alto rendimento.

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Figura 1. O domínio prião diferenciais entre células e tecidos em C. elegans por transporte vesicular. (A) Reduzir confocal z-pilhas de nematóides que expressam RFP no músculo parede do corpo (BWM) células (RFPm). (B) Reduzir confocal z-pilhas de nematóides expressando a variante altamente tóxico e agregação NM propenso, R2E2 , em células BWM (R2E2m). As setas indicam vesículas tubulares, seta indica agregada. (C + D) série Time-lapse de animais expressando RFPm (C) e R2E2m (D). As setas indicam as áreas de movimento vesicular. RFPm apresenta principalmente uma coloração difusa. Mesmo quando RFPm é encontrado em vesículas, estes apenas mover. R2E2m localiza a numerosas vesículas, que são transportados dentro e entre as células. Barras de escala: 10 um. Os vídeos de acompanhamento 1 e 2 [colocar links para Video 1 e 2 aqui] corresponde à 1C e D Figuras,respectivamente.

Figura 2
Figura 2. sensores dobráveis ​​revelar o efeito generalizado do domínio prião na Proteostase. (A + B) A co-expressão de R2E2m promove a agregação RΔ2-5m. Imagens confocal de (A) controle RΔ2-5m e (B) RΔ2-5m co-expressas com R2E2m em células BWM. (C + D) Muscle expressa R2E2m promove agregação RΔ2-5i intestinal. (C) confocal imagem de controle de animais expressando RΔ2- 5i em células intestinais. (D) imagem confocal de animais que expressam R2E2m em células e BWM RΔ2-5i no intestino. Barras de escala: 10 mm (E + F) R2E2m induz não célula agregação autónoma de Q44i (E) imagens fluorescentes representativos de Q44i e Q44i; animais R2E2m 4 dias após a transferência lar L1 sincronizado..vae em placas NGM frescos OP50-semeado. A expressão em células de R2E2 BWM leva a um precoce de agregação Q44i no intestino. (F) Quantificação de animais com agregados (em%) em dias indicados após a sincronização. As barras de erro representam SD Este valor foi modificado a partir do 40.

Figura 3
Figura 3. O sod-3p :: GFP estresse transcrição repórter revela que o domínio prion provoca célula a célula indução autônoma autônomo e não de estresse oxidativo. (A + B) Imagens representativas fluorescentes (usando o mesmo tempo de exposição) de sod-3p :: GFP expressando animais de controlo (A) e sod-3p :: GFP;. R2E2m animais (B) no dia 2 da fase adulta (C) A expressão em células de R2E2 BWM leva a uma indução da repórter não apenas na célula BWMs (I), mas também no intestino (II), cordão nervoso (III), na faringe e na cabeça neurónios (IV).

Figura 5
Figura 5. Análise de movimento sem-fim com o plug-in para o ImageJ wrMTrck. (A) Exemplo de um filme de entrada gerado usando uma ampliação apropriada (~ 10X) para monitorizar vários animais de cada vez. (B) "*" _labels.tif arquivos são uma saída do wrMTrck_Batch e permitir curation manual dos resultados da análise. A seta indica um objeto que foi corretamente excluídos da análise devido a uma escolha adequada dos parâmetros mínimos e máximos de tamanho. (C) a janela de entrada de wrMTrck_Batch, mostrando parâmetros utilizados para este protocolo. Esses parâmetros devem ser ajustados de acordo com as configurações de microscópio e filmes individuais. (D) os resultados de saída de movemeanálise nt de (B), com a coluna BLPS destacada em amarelo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 1
Figura 6. vermes R2E2 tratados com clones de ARNi que são supressores de toxicidade induzida por prião (sopt) mostram a melhoria da motilidade. Motilidade é mostrado como BLPS relativos quando comparadas com o controlo negativo (vector vazio). São mostrados todos (t de Student) clones estatisticamente significativas RNAi identificados na tela de HTP. estrela preta representa a batida mostrado como um exemplo na Figura 5. Os resultados são de três filmes, com 17 <n <53 faixas por condição. As barras de erro representam SEM. </ P>

Tabela 1. C. elegans estirpes expressando sensores dobráveis ​​e repórteres de estresse.

Nome Strain genótipo Comentários Fonte Strain
Sensores de dobramento
transgenes
AM140 unc-54p :: :: polyQ35 YFP músculo-expressão específica de polyQ35, idade agregação dependente CGC ou Morimoto laboratório
AM141 unc-54p :: :: polyQ40 YFP a expressão específica de músculo de polyQ40, age agregação dependente CGC ou Morimoto laboratório
AM801 unc-54p :: :: RΔ2-5 YFP expressão específica do músculo da nucleação de domínio prion incompetente Morimoto laboratório
OG412 vha-6p :: :: polyQ44 YFP intestino específica expressão de polyQ44, idade agregação dependente CGC
AM809 vha-6p :: RΔ2-5 :: GFP; mio-2p :: mCherry expressão específica do intestino de nucleação domínio prion incompetente Morimoto laboratório
AM47 F25B3.3p :: polyQ40 :: PCP expressão específica do neurônio de polyQ40, agregação específico tipo de célula Morimoto laboratório
AM982 unc54p :: :: luciferase YFP a expressão específica de músculo do WT luciferase do pirilampo Morimoto laboratório mio-3p :: luciferase :: GFP; rol-6 a expressão específica de músculo do WT luciferase do pirilampo Behl laboratório
SNG-1p :: luciferase :: GFP; rol-6 a expressão específica de músculo do WT luciferase do pirilampo Behl laboratório
FUH55 unc54p :: :: FLUC egfp; rol-6 a expressão específica de músculo do WT luciferase do pirilampo Hartl laboratório
FUH134 unc54p :: :: FLUCSM egfp; rol-6 a expressão específica de músculo de R188Q mutante luciferase do pirilampo Hartl laboratório
FUH135 unc54p :: :: FLUCDM egfp; rol-6 a expressão específica de músculo de R188Q + R261Q mutante duplo da luciferase do pirilampo Hartl laboratório
FUH48 F25B3.3p :: :: FLUC egfp; rol-6 expressão específica do neurônio de WT Lucifera vagalumese Hartl laboratório
FUH136 F25B3.3p :: :: FLUCSM egfp; rol-6 expressão específica do neurônio de R188Q mutante luciferase do pirilampo Hartl laboratório
FUH137 F25B3.3p :: :: FLUCDM egfp; rol-6 expressão específica do neurônio de R188Q + R261Q mutante duplo da luciferase do pirilampo Hartl laboratório
mutantes ts
CB1402 UNC-15 (e1402) I Paramiosina (TS), sensível à temperatura Unc-paralisado, Deixe- CGC
CB1157 unc-54 (E1157) I Miosina (ts), sensível à temperatura Unc CGC
CB1301 unc-54 (e1301) I Miosina (ts), sensível à temperatura Unc CGC
CB286 UNC-45 (e286) III Unc-45 (TS), sensível à temperatura, lento Unc movimento, Egl CGC
HE250 UNC-52 (e669su250) II Perlecan (ts), sensível à temperatura Unc, paralisia stiff CGC
SD551 deixe-60 (ga89) IV Ras (ts), sensível à temperatura Muv, Ste, Let, Lva, Osm CGC
CX51 dyn-1 (ky51) X Dynamin (ts), sensível à temperatura Unc CGC
CW152 gás-1 (fc21) X Gás-1 (ts), sensibilidade à temperatura EtOH sensível CGC
ZZ26 UNC-63 (x26) I Receptor de acetilcolina (TS), a temperatura resistência levamisol sensível CGC
repórteres de estresse
CL2070 HSP-16.2p :: gfp; rol-6 estresse térmico; Cito UPR CGC
TJ375 hsp-16.2p :: GFP estresse térmico; Cito UPR CGC
TJ3000, TJ3001 hsp-16.2p :: GFP; CBR-unc-119 (+) estresse térmico; Cito UPR CGC
AM446 hsp70p :: GFP; rol-6 estresse térmico; Cito UPR Morimoto laboratório
AM722 hsp70p :: mCherry; mio-2p :: PCP estresse térmico; Cito UPR Morimoto laboratório
AM799 hsp90p :: GFP estresse térmico; Cito UPR Morimoto laboratório
OG497 HSF-1p :: HSF-1 :: gfp; CBR-unc-119 (+) estresse térmico; Cito UPR CGC
CF1553 sod-3p :: GFP; rol-6 estresse oxidativo CGC
KN259 sod-3p :: GFP; rol-6 estresse oxidativo CGC
CL2166 gst-4p :: GFP :: nls estresse oxidativo CGC
LD1171 gcs-1p :: GFP; rol-6 estresse oxidativo CGC
LD1 skn-1p :: SKN-1 :: GFP; rol-6 estresse oxidativo CGC
IG274 PNL-29p :: GFP estresse osmótico CGC
BC20309 MTL-1p :: GFP estresse de metal Baillie laboratório
BC20342 MTL-2p :: GFP metais stress Baillie laboratório
BC20314 elt-2p :: GFP estresse de metal Baillie laboratório
SJ4005 hsp-4p :: GFP UPR ER CGC
SJ4100 HSP-6p :: GFP UPR mito CGC
SJ4058 HSP-60p :: GFP UPR mito CGC

CGC: Caenorhabditis Genetics Center; ts = sensível à temperatura; UPR resposta = proteína desdobrada; cito = cytosolic; mito = mitocondrial; ER = retículo endoplasmático.

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Discussion

Os métodos descritos aqui ajudam a ilustrar espalhando e celular toxicidade autônoma da célula complexo autônomo e não de proteínas príon-like. Descobrimos recentemente que um domínio de prion cytosolic agregação propensas é retomado em vesículas ligadas à membrana em um processo de autofagia relacionados. Um subconjunto específico dessas vesículas transporta o domínio de prião dentro e entre as células e tecidos 40. A chave para controlar o seu movimento no animal vivo é que a proteína tem de ser marcado com MRFP, porque apenas proteínas MRFP-marcados eram visíveis nestes presumivelmente vesículas ácidas. Usando a mesma abordagem, estamos neste momento a investigar o comportamento prion-like potencial de certas proteínas relacionadas com a doença, tais como superóxido dismutase 1 (SOD1) (ligado à ALS), alfa-sinucleína (ligada ao PD) ou proteína de ligação ao DNA TAR 43 (TDP-43) (ligado à ALS). Embora este tipo de transporte intercelular dentro de vesículas parece ser usada por várias outras proteínas, pode haver umdicional vias que permitam espalhar.

O uso de sensores dobráveis ​​bem caracterizada é uma ferramenta poderosa para monitorizar os efeitos sobre o ambiente proteína celular dobragem em C. elegans 63-66. Aqui temos mostrado como utilizar a idade acumulação dependente de proteínas marcadas fluorescentemente propensas à agregação expresso sob promotores específicos de tecidos para monitorizar visualmente a capacidade de dobragem de tecidos distintas simultaneamente. Outras possibilidades para o estudo da rede Proteostase do organismo incluem a utilização de mutantes ts proteínas endógenas. Estas proteínas metaestáveis ​​funcionará normalmente a uma temperatura permissiva (15 ° C), mas misfold e tornam-se não funcionais na temperatura restritiva (25 ° C), apresentando a sua característica fenótipo mutante. Na presença de uma proteína ou propensos a agregação durante o envelhecimento, as ts fenótipo mutante fica exposta, mesmo em condições permissivas 63-66. Alguns destes mutantes ts são expressas em oomente um subconjunto de tecidos ou apresentam fenótipos específicos do tecido, tornando estes particularmente útil para testar a célula a célula autônoma e não efeitos proteotoxic autônomos. Por exemplo, um mutante ts de LET-60, um membro da família do oncogene RAS de ligação a GTP, Ras (ts), é expressa ubiquamente, mas mostra mutante específica de tecido fenótipos 63,66. Ao utilizar este mutante ts, o efeito de expansões de poliQ no Proteostase celular foi mostrado para ser autónomo célula 63. Expressão de poliQ no fundo genético de ras (ts) revelou apenas o fenótipo mutante específica para o tecido no qual a proteína foi expressa. A exposição de diversos fenótipos mutantes iria indicar que uma proteína não possui efeitos celulares proteotoxic autónomas.

Além disso, para testar os efeitos sobre as vias de estresse celular, há uma grande variedade de in vivo repórteres estresse fluorescentes em C. elegans 72. Estes são geralmente transcriçãorepórteres al que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) sob um promotor de stress-inducible, como HSP-16.2p ou sod-3p, que informam sobre estresse térmico ou oxidativo, respectivamente 72. Ao utilizar repórteres adequados em combinação com proteínas priões do tipo, pode-se monitorar a indução potencial de uma resposta de stress-se senão a uma expressando o transgene respectivos tecidos. Uma ressalva, no entanto, é que esses muitas vezes repórteres de stress não são suficientemente sensíveis para revelar a regulação positiva subtil de um dado percurso (observações não publicadas).

Em nossa busca para examinar se os genes que influenciam a toxicidade autônomo não-celular também afetam a proteína se espalhando, começámos por triagem para genes que, quando derrubado, seria amenizar defeitos do movimento. Usando a avaliação visual das taxas de natação como um-out ler, fomos capazes de confortavelmente ensaio ~ 25 placas por sessão e realizar duas rodadas de este protocolo por semana, resultando na conclusãoda tela inicial no prazo de 6 semanas. A confirmação dos hits, através da análise quantitativa do movimento sem-fim em placas sólidas, em triplicata, utilizando wrMTrck foi realizada em um adicional de 3 semanas. Uma ressalva, no entanto, é que usando o rastreamento em placas em vez de nadar em meio líquido como uma leitura pode-se perder certos genes candidatos, como natação e rastejando não são movimentos idênticos e pode ser influenciada por vias distintas 73. Deste modo, se alguns genes candidatos não pode ser confirmada em placas de sólidos, eles devem ser re-testadas em meio líquido, onde a natação podem ser quantificados por contagem do debulha frequência dentro de um determinado tempo.

O protocolo de triagem descrito aqui usa automatizado estações de trabalho de manipulação de líquidos, o que reduz a variabilidade. A desvantagem é que um excesso de fluidos para o reservatório dos robôs é necessária, o que pode não ser sempre possível. Esta configuração de rastreio pode ser facilmente adaptado para outras telas em C. elegans </ Em> que sova utilização como uma tela-out.This leitura não foi concebida para identificar os genes que influenciam directamente a toxicidade celular não autónomo ou espalhamento do domínio do prião, como telas de largura genoma deve ser simples na sua concepção, de modo a ser realizada em tempo hábil. Motilidade defeitos podem originar-se, a partir de apenas muscular, mas também a partir de lesões neuronais e de um número de outros defeitos do gene 53. Assim, usando esta leitura, podemos encontrar não só modificadores de toxicidade específica do músculo. Estamos actualmente a testar os genes candidatos para os seus efeitos no domínio prião espalhamento e não toxicidade autónoma de célula utilizando os métodos descritos acima. Essas experiências irão eventualmente revelar se espalhando transcelular de agregados de proteína está directamente relacionada com a toxicidade observada em outros tecidos ou se a transmissão célula-a-célula e célula toxicidade autónomo não pode ser desacoplado.

Tomados em conjunto, os métodos descritos podem ser utilizados para examinar o potencial prcomportamento ion-like de proteínas a nível celular e organismal usando C. elegans.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains

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References

  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie. Cell. 73 (6), 1055-1058 (1993).
  3. Caughey, B., Kocisko, D. A., Raymond, G. J., Lansbury, P. T. Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem Biol. 2 (12), 807-817 (1995).
  4. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
  5. Chien, P., Weissman, J. S., DePace, A. H. Emerging principles of conformation-based prion inheritance. Annu Rev Biochem. 73, 617-656 (2004).
  6. Kimberlin, R. H., Walker, C. A. Pathogenesis of mouse scrapie: patterns of agent replication in different parts of the CNS following intraperitoneal infection. J R Soc Med. 75 (8), 618-624 (1982).
  7. Beekes, M., McBride, P. A., Baldauf, E. Cerebral targeting indicates vagal spread of infection in hamsters fed with scrapie. J Gen Virol. 79 (3), 601-607 (1998).
  8. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).
  9. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
  10. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  11. Wood, S. J., et al. alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease. J Biol Chem. 274 (28), 19509-19512 (1999).
  12. Wang, Y. Q., et al. Relationship between prion propensity and the rates of individual molecular steps of fibril assembly. J Biol Chem. 286 (14), 12101-12107 (2011).
  13. Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 123 (8), 1191-1201 (2010).
  14. Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442 (7102), 585-589 (2006).
  15. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J Struct Biol. 179 (2), 152-160 (2012).
  16. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).
  17. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cell-autonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. Dis Model Mech. 7 (1), 31-39 (2014).
  18. Lino, M. M., Schneider, C., Caroni, P. Accumulation of SOD1 mutants in postnatal motoneurons does not cause motoneuron pathology or motoneuron disease. J Neurosci. 22 (12), 4825-4832 (2002).
  19. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  20. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 13010-13015 (2009).
  21. Clement, A. M., et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science. 302 (5642), 113-117 (2003).
  22. Gu, X., et al. Pathological cell-cell interactions elicited by a neuropathogenic form of mutant Huntingtin contribute to cortical pathogenesis in HD mice. Neuron. 46 (3), 433-444 (2005).
  23. Yamanaka, K., et al. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7594-7599 (2008).
  24. Garden, G. A., et al. Polyglutamine-expanded ataxin-7 promotes non-cell-autonomous purkinje cell degeneration and displays proteolytic cleavage in ataxic transgenic mice. J Neurosci. 22 (12), 4897-4905 (2002).
  25. Raeber, A. J., et al. Astrocyte-specific expression of hamster prion protein (PrP) renders PrP knockout mice susceptible to hamster scrapie. EMBO J. 16 (20), 6057-6065 (1997).
  26. Yazawa, I., et al. Mouse model of multiple system atrophy alpha-synuclein expression in oligodendrocytes causes glial and neuronal degeneration. Neuron. 45 (6), 847-859 (2005).
  27. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
  28. Sambataro, F., Pennuto, M. Cell-autonomous and non-cell-autonomous toxicity in polyglutamine diseases. Prog Neurobiol. 97 (2), 152-172 (2012).
  29. Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Prion-like spread of protein aggregates in neurodegeneration. J Exp Med. 209 (5), 889-893 (2012).
  30. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).
  31. Braak, H., Braak, E., Bohl, J. Staging of Alzheimer-related cortical destruction. Eur Neurol. 33 (6), 403-408 (1993).
  32. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).
  33. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  34. Clavaguera, F., et al. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat Cell Biol. 11 (7), 909-913 (2009).
  35. Nonaka, T., et al. Prion-like Properties of Pathological TDP-43 Aggregates from Diseased Brains. Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).
  36. Lundmark, K., et al. Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6979-6984 (2002).
  37. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10 (5), 703-713 (2000).
  38. Xu, X., Kim, S. K. The early bird catches the worm: new technologies for the Caenorhabditis elegans toolkit. Nat Rev Genet. 12 (11), 793-801 (2011).
  39. Boulin, T., Hobert, O. From genes to function: the C. elegans genetic toolbox. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (1), 114-137 (2012).
  40. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 9 (3), e1003351 (2013).
  41. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
  42. Liu, J. J., Lindquist, S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast. Nature. 400 (6744), 573-576 (1999).
  43. Halfmann, R., et al. Prions are a common mechanism for phenotypic inheritance in wild yeasts. Nature. 482 (7385), 363-368 (2012).
  44. Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6 (11), e294 (2008).
  45. Krammer, C., et al. The yeast Sup35NM domain propagates as a prion in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 462-467 (2009).
  46. Hofmann, J. P., et al. Cell-to-cell propagation of infectious cytosolic protein aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (15), 5951-5956 (2013).
  47. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  48. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
  49. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , (2006).
  50. Methods in cell biology. Wormbooks. Shaham, S. , (2006).
  51. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization). PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
  52. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. , (2006).
  53. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  54. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  56. Kern, A., Ackermann, B., Clement, A. M., Duerk, H., Behl, C. HSF1-controlled and age-associated chaperone capacity in neurons and muscle cells of C. elegans. PLoS One. 5 (1), e8568 (2010).
  57. Becker, J., Walter, W., Yan, W., Craig, E. A. Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydj1p, in protein translocation in vivo. Mol Cell Biol. 16 (8), 4378-4386 (1996).
  58. Salvaterra, P. M., McCaman, R. E. Choline acetyltransferase and acetylcholine levels in Drosophila melanogaster: a study using two temperature-sensitive mutants. J Neurosci. 5 (4), 903-910 (1985).
  59. Goloubinoff, P., Mogk, A., Zvi, A. P., Tomoyasu, T., Bukau, B. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (24), 13732-13737 (1999).
  60. Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. D. naK. DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J. 12 (11), 4137-4144 (1993).
  61. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31 (21), 4221-4235 (2012).
  62. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
  63. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  64. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  65. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. J Vis Exp. (82), e50840 (2013).
  66. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5 (3), e1000399 (2009).
  67. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  68. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. J Neurosci. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  69. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. J Biol Chem. 283 (1), 194-201 (2008).
  70. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  71. Schatzl, H. M., et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J Virol. 71 (11), 8821-8831 (1997).
  72. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. , (2014).
  73. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).

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Biologia Celular Edição 95, doenças neurodegenerativas doenças de prião misfolding proteína-como o espalhamento a transmissão célula para célula a agregação de proteína a toxicidade celular não autónomo Proteostase
Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo<em&gt; C. elegans</em
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Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M.… More

Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).

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