Introduction
Många neurodegenerativa sjukdomar, däribland Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), amyotrofisk lateralskleros (ALS), och transmissibla spongiforma encefalopatier (TSE), är förknippade med aggregering benägna proteiner och är därmed kollektivt kallas protein misfolding störningar (PMDs ). TSE eller prionsjukdomar utgör en unik klass av PMDs genom att de kan vara smitt hos både människor och djur en. På molekylär nivå, prioner replikera genom att rekrytera och konvertera mono α-helix-rika värd-kodad cellulär PrP (PrP C) i den patologiska β-sheet-rika PrP konforma 2,3. Självförökningsproteinaggregat har också identifierats i svampar, som delar viktiga egenskaper med däggdjurs prioner 4,5. Dessutom däggdjurs prioner kan röra sig från cell till cell och infektera naiva celler 6,7.
Medan PMDs other än TSE inte smittsam, de delar en gemensam patogena principen med prionsjukdomar 8,9. Även proteinerna knutna till var och en av PMDs inte är relaterade i struktur eller funktion, de alla formulär aggregat via en kristalliseliknande process som kallas kärn eller seedade polymerisation; Dessutom proteinhaltiga frön växa genom att rekrytera sina lösliga isoformer 2,10,11. Verkningsgraden att själv propagerar varierar in vivo, beroende på de inneboende egenskaperna hos proteinet, som tillsammans med ytterligare cellulära faktorer såsom molekylära chaperoner slutligen avgör andelen aggregerad kärnbildning, sådd, fragmentering och spridning 12-15. Därför måste det finnas en fin balans mellan dessa faktorer som gör att en effektiv spridning av proteinaggregering. Detta kan också förklara varför bara vissa amyloidogena aggregat hysa kännetecken på en prion, och därmed inte alla PMDs är smittsam. Prioner tycks representera "topp-artister" ofa brett spektrum av självreplikerande proteinaggregat, vilket gör dem till ett kraftfullt verktyg för att studera PMDs 8,13.
Fängslande, toxiciteten i samband med sjukdomsrelaterade aggregat har ofta en icke cell självständig komponent 16,17. Detta innebär att de påverkar angränsande celler som inte uttrycker motsvarande gen, i motsats till en strikt cell autonom verkan, vilket innebär att endast de celler som uttrycker genen uppvisar den specifika fenotypen. Detta compellingly framgår av vävnadsspecifika uttryck eller slå ner på de respektive proteiner i många modeller av neurodegenerativa sjukdomar 18-26. Olika mekanismer har föreslagits som grund för denna icke-cell självständig toxicitet i PMDs, inklusive minskad näringstillförsel, obalans i neuronal signalering, glutamatexcitotoxicitet och neuroinflammation 16,27,28. Dessutom, en prion-liknande rörelse av sjukdomsbundna aggregat mellan celler might bidra till denna aspekt 29,30. Ökande bevis tyder på att andra proteininneslutningar än prioner kan sända från cell-till-cell, vilket kan förklara den karakteristiska spridning av patologi observerats i många PMDs 30-36. Men det har ännu inte fastställts om det finns ett klart orsakssamband mellan intercellulära rörelse sjukdoms proteiner och toxisk effekt på angränsande celler. Därför är det nödvändigt och viktigt för utvecklingen av nya behandlingar en bättre förståelse av de cellulära vägar som ligger bakom cell till cell överföring och icke cell autonoma toxicitet. Men många aspekter av prion-liknande spridning och cellulära faktorer som påverkar cell-till-cell överföring av felveckade proteiner i metazoans inte förstått, i synnerhet på organismnivå.
Den nematod Caenorhabditis elegans har flera fördelar som ger potentialen att upptäcka nya aspekter av prion-liknande spreading i metazoans 17. Den är transparent, vilket möjliggör in vivo-spårning av fluorescerande märkta proteiner i den levande organismen. Dessutom är många cellulära och fysiologiska processer som påverkas av sjukdomen bevarad från maskar för människors, och C. elegans är också mottaglig för en mängd olika genetiska manipulationer och molekylära och biokemiska analyser 37-39. Exakt 959 somatiska celler utgör den vuxna hermafrodit med en enkel plan kropp som fortfarande har flera olika vävnadstyper, såsom muskel, neuroner och tarmen.
Att etablera en ny prionmodell i C. elegans, valde vi att exogent uttrycka väl karaktäriseras glutamin / asparagin (Q / N) -rika priondomän NM i cytosoliska jästprionprotein Sup35, eftersom det inte finns några kända endogena prionproteiner i maskar 4,40. Jäst prioner har varit ovärderliga för att belysa grundläggande mekanismer prionreplika 41-44. Dessutom är NM på granst cytosoliskt prion-liknande protein som har visat sig rekapitulera hela livscykel av en prion i däggdjurscellkultur 45,46. Likaledes, när den uttrycks i C. elegans, det Sup35 prion domänen antagits anmärkningsvärt väl till de olika kraven för förökning i metazoiska celler jämfört med jästceller och uppvisade viktigaste funktionerna i prionbiologi 40. NM aggregering associerades med en djup giftig fenotyp, inklusive störningar av mitokondrie integritet och utseende olika autophagy relaterade blåsor på cellnivå, samt embryonala och larvstillestånd, utvecklingsförsening och en utbredd störning av proteinveckmiljön på organismnivå. Påfallande, uppvisar priondomäncellen självständiga och icke cell autonoma toxicitet, påverkar grann vävnader där transgenen inte uttrycks. Vidare är den vesikulär transport av prion domän inom och mellan cellerna övervakas realtid <em> In vivo 40.
Här beskriver vi hur du undersöka prionliknande spridning i C. elegans. Vi kommer att förklara hur man övervaka intra- och intercellulära transport av vesiklar som innehåller prion domän med time-lapse fluorescensmikroskopi. Vi kommer att betona användningen av vävnadsspecifika fällbara sensorer och ubiquitously uttryckt spännings reportrar att utvärdera cell autonoma och icke cell autonoma effekter på cellulär kondition. Slutligen kommer vi att beskriva förfarandet för ett nyligen genomfört genomet bred RNA-interferens (RNAi) skärmen för att identifiera nya modifierare av prion-inducerad toxicitet. I kombination kan dessa metoder bidra till att retas isär genetiska vägar som är involverade i den intercellulära rörelsen av proteiner och deras icke cell autonoma toxicitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Övervakning transcellulär Spridning av Prion-liknande proteiner genom in vivo Time-lapse avbildning
OBS: Grow C. elegans vildtyp (WT) (N2) och transgena linjer enligt standardmetoder och noggrant reglera odlingstemperaturen 47.
- Generera transgena linjer av C. elegans uttrycker prionliknande protein, märkt med mono röd fluorescerande protein (mRFP). Titta på denna video som visar hur man använder mikroinjektion 48. För ytterligare information och metoder som beskriver hur man kan integrera dessa extrakromosomala linjer, se 49.
- Förbered synkroniserade populationer av äggläggning eller blekning enligt standardmetoder 50.
- Synkronisering av äggläggning
- Överför 10 - 20 gravida vuxna på en plåt och låt dem lägga ägg för 1 - 2 tim. Ta vuxna från plattan och låt avkomman växa tills önskad ålder.
<li> Synkronisering av blekning - Samla en osynkroniserad population av gravida vuxna och bleka dem med alkalisk hypokloritlösning (250 mM NaOH och 1: 4 (v / v) utspädning av kommersiella blekmedel i H2O). Tvätta äggen två gånger (218 xg i 1 min) med M9 buffert 47 (21 mMNa 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O, lägg dH 2 O upp till 1 L).
- Tillåt dem att kläckas i M9-buffert med försiktig omrörning O / N vid 20 ° C. Worm utveckling griper vid L1 skede i frånvaro av en näringskälla, som lämnar en synkroniserad population. Överför L1s på färska nematoder Growth Media (NGM) plattor ympats med OP50 E. coli-bakterier och låt avkomman utvecklas tills önskad ålder 47.
- Synkronisering av äggläggning
- Förbered två kmmikroskop diabilder med märkband placeras över hela sin längd för att användas som distanser. Placera en tredje objektglas mellan dem.
- Lös 2% agaros i H2O och pipetten ett släpp på rent objektglas.
- Placera en fjärde slide vinkelrätt mot de tre andra glider ovanpå agar droppe. Tryck försiktigt ner för att platta till kudden till samma tjocklek som märkband.
- Låt torka i 1 minut innan du tar bort distanserna och försiktigt dra bilderna isär. Den agar pad fastnar en av dem.
- Bered 10% agarose pads (i M9 buffert) som beskrivs 51 och lägga maskar till lösning Nanosphere storleksstandarder 3 pl (polystyren pärlor, 100 nm) plus 3 pl narkos (4 mM levamisol i M9 buffert). Täck försiktigt med ett täckglas. För att undvika uttorkning, täta täckglas med valap (blandning av lika mängder vaselin, lanolin, och paraffinvax).
OBS: Resultat erhålls med hjälp av en roterande skiva AF konfokalmikroskop utrustad med en EM-CCD-kamera och en Mikroskopi Automation & bildanalys programvara som metamorfa och beskriva detaljerna nedan, men andra jämförbara konfokala bildsystem kan också användas.
- Använd 63X eller 100X / 1.4NA olje mål och placera objektglas innehåller maskar i objektglas hållaren.
- Öppna programmet. Justera lasereffekt och filter för mRFP avbildning. Använd 561 nm laser vid 10% effekt och utsläpp filter> 600 nm.
- Under "Saving" -fliken välja eller skapa mappen katalog där filerna ska sparas. Tilldela ett namn på filen.
- Under "Wave Length" -fliken välja lämplig belysning och justera exponering och vinning. Använd "YokoQuad Red" (eller motsvarande belysningsinställning för mRFP imaging) med en exponering mellan 100 och 300 ms och en kamera vinst mellan 100 och 300, beroende på den enskilda prov (bedöms med hjälp av live-bilden).
- Under "Timelapse" fliken välj "Antal tidpunkter" = 301, "Duration" = 5 min och "Tid / Intervall" = 1 sek.
- Under "Tidskrifter" fliken välj Journal: "AFC SET Z HOLD" och "AFC Återgå till Z HOLD", typ: &# 8220; Special "(två gånger), Initial Point:" Start av tidspunkt "och" Slut på tidspunkt ". Denna autofokus alternativet är viktigt att bilden samma avsnitt under en längre tid.
- När installationen är klar, tryck på "Hämta". Den timelapse video Safed som separata TIFF-filer.
- Öppna alla TIFF-filer i en viss tidsserie i ImageJ. Gå till "Image" → "Stacks" → "bilder till Stacks". Eventuellt justera ljusstyrka och kontrast, lägga storlek bar, etc. Exportera filmen under "Arkiv" → "Om inte" → "AVI ..." (för ett exempel, se Video 1 och 2 motsvarar fig 1).
2. Använda Folding Sensorer och Stress Reportrar att undersöka Cell autonoma och icke cell autonoma Påverkar på Proteostas och toxicitet
- Generera transgena linjer som samuttrycker en hopfällbar sensor eller stress reporter tillsammans med prionliknande protein. För metoder för att etablera kors eller generera transgena linjer, se 48,49,52. Se tabell 1 för en lista över C. elegans-stammar som kan användas.
- Förbered synkroniserade populationer av transgena djur och odla dem tills önskad ålder som beskrivits ovan (avsnitt 1.2) 50.
- Med hjälp av ett stereomikroskop, undersöka respektive fenotyp av fällbara sensorn eller stress reporter.
- För fällbara sensorn, fastställa antalet djur hyser aggregat på varje dag efter synkronisering (för ett exempel, se figur 2E och F).
- För stress reportern, provningen om samuttryck av prionliknande protein resulterar i en ökad fluorescens av reporter (för ett exempel, se figur 3).
3. Genomvid Screen för bekämpande av Prion-inducerad toxicitet i C. elegans
Figur 4. Schematisk representation av RNAi screening-protokollet. Se protokollet avsnitt 3 för en detaljerad beskrivning av de enskilda stegen.
- Synkronisering av C. elegans maskar och dubbel RNAi-biblioteket
- För RNAi skärmen använder Ahringer RNAi-biblioteket (eller Vidal RNAi-biblioteket) 53,54. Rearray RNAi-biblioteket från den ursprungliga 384-brunnsformat i 96-brunnsplattor genom att fylla plattorna med 100 | il LB-amp-media (50 ng / ml ampicillin i LB) supplementerad med 10% glycerol och inokulera med användning av en 96-stifts replikatorn. Odla vid 37 ° CO / N med omröring och förvara vid -80 ° C.
- Upprätt C. elegans WT och transgena linjer vid 20 ° C på NGM plattor ympats med OP50 E. coli-bakterier enligt standardmetoder 47.
- Synkronisera priondomäntransgena och WT (kontroll) nematoder genom blekning (se avsnitt 1.2).
- På samma dag som maskarna bleks, förbereda LB medium kompletterat med 50 | ig / ml ampicillin. Använd en automatiserad reagensutmatare att utmata (eller pipett manuellt) 65 | il av de LB-amp i material i varje brunn i en 96 brunnars platta.
- Ta bort 96 brunnar Ahringer RNAi biblioteksplattor från -80 ° C och föra dem till en steril huva fodrad med hushållspapper. Omedelbart ta bort tätningsbandet genom att hålla plattan upp och ner medan plattor är fortfarande frysta, var noga med att undvika kontamination från is på utsidan av plattorna. Reinvert plattorna och låt dem tina i ca 30 min.
- Doppa en steril 96 stift replicator i en RNAi bibliotek plattan, och sedan i en färsk LB-amp-platta. Använd en ny steril portreplikator för varje platta. Täta alla plattor med klisterfolie tejp och returnera biblioteket plattorna till -80 ° C. De replikatorer kan den läggas i blekmedel, sköljs,och autoklaverades för att användas på nytt.
- Tillåt duplicerade RNAi plattor att växa O / N i en inkubator inställd på 37 ° C och 300 rpm. För att använda HT115 E. coli bakterier som härbärgerar den tomma vektorn (L4440) som en kontroll, växer det separat i ett odlingsrör och sedan pipettera 65 ul av kulturen med en multikanalpipett i en fjärdedel av två 96-brunnsplattor.
- Induktion av bakteriell dsRNA produktion och tillägg av maskar
- Späd Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) till en 5 mM koncentration i DDH 2 O. Använd en automatiserad arbetsstation med en flerkanalig huvud att dosera (eller pipett manuellt) 10 pl utspätt IPTG till varje brunn av RNAi bakterier och kontrollplattorna. Återförslut och placera plattorna tillbaka i inkubatorn. Låt dem skaka under 3 timmar vid 37 ° C.
- Medan bakterier skakar, förbereda maskar. Blanda M9 / masken fjädring väl, och pipettera ett litet prov (~ 5-10 l) till ett objektglas. Räknaantalet maskar under ett stereomikroskop och beräkna antalet maskar per il.
- Använd steril teknik och förbereda en lösning av kompletterad M9 (M9 +) med följande slutliga koncentrationer: 0,20 mg / ml IPTG, 8,0 mikrogram / ml kolesterol, 50 ug / ml ampicillin, 9,6 mikrogram / ml tetracyklin, 0,0835 ng / ml Fungizone, och 15 maskar per 50 | il.
- Gör separata lösningar för priondomäntransgena och WT maskar. Den slutliga volymen av M9 + mask lösning som krävs kommer att bero på antalet RNAi plattor kopierats (se nedan), plus ~ 30 ml dödvolym som kommer att finnas kvar i behållaren, om en automatiserad dispenser används.
- Efter 3 h induktion av bakteriell dsRNA produktion, ta plåtarna ur kuvösen och låt dem svalna till RT (~ 30 min) för att undvika värme betonar djuren.
- Fördela 50 pl M9 + prion domän transgen mask lösning till varje brunn av RNAi-plattor och en av de tomma vektorkontrollplattor. GöraSe till att blanda masken lösning före varje steg eftersom djuren tenderar att sedimentera till botten av reservoaren.
- Dispensera WT maskar in i den andra styrplattan. Lämna plattorna oförseglade att tillåta luftning. För att hålla den flytande kulturen från att avdunsta, stapla 4-5 plattor tillsammans och wrap med en fuktig pappershandduk och aluminiumfolie. Inkubera vid 200 rpm vid 20 ° C under 4 dagar.
- Scoring
OBS: Efter fyra dagar i inkubatorn kommer maskarna vara den andra dagen av vuxenlivet och är redo att screena. Låt djuren anpassa sig till icke skakar förutsättningar för 30 min före screening för att säkerställa ostörd stryk.- Med hjälp av en Falcon 4M60 kamera ansluten till en dator med en skärm, skärm visuellt för ökad stryk jämfört med kontrollbehandlade priondomäntransgena djur.
- Sammanställa en lista över preliminära träffar för att bekräfta att använda wrMTrck (se nästa avsnitt).
4. Bekräftelse av PreliminärSkärm Hits
- Motilitet analys på solida plattor
- Förbered plattor med NGM kompletterat med 100 ug / ml ampicillin, 12,5 | ig / ml tetracyklin och 1 mM IPTG, enligt standardmetoder 47. Om möjligt, använd en platt hälla maskin att försäkra alla plattor har samma höjd media, vilket kommer att möjliggöra en mer strömlinjeformad videoförvärvsprocess.
- Väx de olika RNAi kloner i ~ 1 ml LB + 50 ug / ml ampicillin, O / N vid 37 ° C och 250 rpm.
- Nästa dag, inducerar uttrycket av dsRNA med 1 mM IPTG under 3 h. Seed plattorna med 150 fil av varje RNAi bakterieklon, spridda i ett tunt lager. Låt bakterierna torrt för 2 dagar vid RT i mörker. Förbered tre plattor per RNAi klon.
- Synkronisera masken befolkningen genom blekning enligt standardmetoder 50 (se avsnitt 1.2), och låt äggen kläcks O / N i M9 media.
- Ta ett prov av snäck suspensionen och bestämma mängden nematodes per il vid stereomikroskop. Sedan, pipett rätt volym M9 plus maskar i varje experimentell platta så att den innehåller 25-30 L1 maskar. Odla nematoderna vid 20 ° C under 4 dagar tills maskarna når dag 2 i vuxen ålder.
- Kvantitativ analys av masken motilitet med wrMTrck plugin för ImageJ
OBS: Filmerna spelades in med hjälp av en stereo vid 10X förstoring med en Hamamatsu Orca-R2 digitalkamera C10600-10B och Hamamatsu Enkel PCI bildbehandlingsprogram.- Slå på kameran och Simple PCI bildprogram. Klicka på "Live" för att möjliggöra justering av bildförhållanden.
- Ställ in videoförhållanden enligt följande: Förstärkning = 0; Ljusläge = Hög; Hastighetsindex = 1; Binning = 2. Klicka på "Auto Expose" och sedan justera ljusförhållanden, flytta mikroskop speglar och ljusstyrka och kontrast urtavlor.
OBS! Videon måste ha en hög kontrast utan att vara OVEREXPSTÄNGD, så att djuren sig som svarta former på en ljus bakgrund. - Klicka på "Time Scan" och välj en mapp och ett filnamn. Ställ "Field Delay" till 20 msek och "Stanna vid Time" till 30 sek. Tryck på "Live Review" för att välja det område av plattan för att spela in (där de flesta maskar är). Tryck plattan 3 eller 4 gånger på scenen, snabbt bekräfta sin position i synfältet och tryck på "Start".
- Efter filmen är slut inspelning, högerklicka på bilden och välj "Exportera Montage Sequence" för att exportera filmen från en .cxd format till en .avi.
- Analysera motilitet videor
- Öppna ImageJ programvara, gå till "Plugins" fliken, sedan "wrmtrck" och välj "wrMTrck Batch". Välj den katalog som innehåller alla filer som ska analyseras.
- I huvudinmatningsfönster wrMTrck_Batch, ladda ingångsvärden som beskrivs i Figure 5C. Förklaring för varje parameter finns i instruktionerna som medföljer plugin. Klicka på "OK" och låt rörelseanalys körningen.
- Att kyrkoherden resultaten och bekräfta att alla upptäckta spår är från faktiska C. elegans och eliminera artefakter, öppna varje .txt-filer skapas för varje film och kopiera informationen till en dataanalys programvara fil. Öppna "* _labels.zip" filer som skapas och köra den resulterande "* _labels.tif" för att manuellt kontrollera och eliminera falska mask spår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Övervakning intercellulär spridning av prionliknande proteiner genom in vivo time-lapse avbildning
Transgen C. elegans linjer som uttrycker prion domänen är särskilt väl lämpade för analys av vissa aspekter av prionliknande proteiner, t.ex., cell till cell överföring och icke cell autonoma toxicitet. Öppenheten i djuren möjliggör spårning av fluorescerande taggade proteiner inifrån den levande organismen i varje skede av livet. Med utnyttjande av detta, är förflyttning av prionliknande proteiner över celler och vävnader med hjälp av ett fluorescensmikroskop visualiseras. En olje mål 63X eller 100X / 1.4NA är nödvändig för att lösa de vesikulära strukturer. Viktigt har prion domänen märkas med mRFP, för att förbli fluorescerande synlig inom dessa förmodligen sura vesiklar 40. Gul fluorescerande protein (YFP), som ofta används som en etikett, jagär inte lämpligt eftersom det kyls i en miljö med lågt pH 40,55. Stam AM815 uttrycker RFP-tagged R2E2 (ett höggradigt aggregering benägen och toxiska formen av prion domän NM) som ackumuleras i rörformiga vesiklar, medan RFP taggen ensam förblir löslig (Figur 1A och B). Använda in vivo tidsförlopp avbildning, kan det konstateras att dessa rörformiga blåsor transporteras inom och mellan celler 40 (Figur 1C och D, Video 1 och 2) [placera länkar till Video 1 och 2 här].
Använda fällbara sensorer och stress reportrar att undersöka cell autonoma och icke-cell autonoma effekter på Proteostas och toxicitet
Prioner kan passera utsäde besläktade proteiner och störa den cellulära proteinveckmiljö. Detta kan avslöjas genom samuttryck av lämplig fällbara sensors. Folding sensorer är icke väsentliga metastabila proteiner som är beroende av en fungerande Proteostas nätverk för att lägga sig på rätt sätt. Några exempel är den välkända eldflugeluciferas och proteiner som härbärgerar temperaturkänsliga (ts) mutationer 56-66. En störning av Proteostas leder till felveckning av reportern, som kan detekteras genom visuell undersökning av aggregat eller genom exponering av respektive ts mutantfenotypen vid tillåt temperaturer. Sträckor av polyglutamine (polyQ) med en längd på tröskeln till sammanläggning (cirka 40 rester) är också ofta används eftersom de uppvisar en åldersberoende aggregering 67-69. Börjar tidigare aggregering avslöjar en komprometterad hopfällbar miljö. Här använde vi en prion mutant RΔ2-5 som förblir lösligt när den uttrycks i C. elegans kroppen väggen muskel (BWM) celler och tarm 40 (Figur 2A och C). Vid samtidig uttryck med R2E2 i BWM celler, RΔ2-5 reaDily aggregat (Figur 2B), avslöjar en cell autonom verkan R2E2 på proteinveck miljön. Den utbredda effekten på Proteostas och induktion av felveckning tvärs vävnader kan utvärderas genom expression av det fällbara sensorn i en distinkt vävnad som inte uttrycker den mycket aggregering benägna formen av prion domänen. R2E2 uttrycktes under BWM cellspecifik promotor (myo-3p), medan RΔ2-5 uttrycktes under en tarm specifik promotor (VHA-6p). Sammanläggning av intestinal RΔ2-5 visar att R2E2 påverkar proteinveck på ett icke-cell självständigt sätt 40 (figur 2D). Istället för att använda RΔ2-5, där aggregat endast kan upptäckas med hög upplösning, användning av polyQ44 uttryckt i tarmen (Q44i) möjliggör visualisering av aggregat med låg upplösning under ett stereomikroskop (Figur 2E och F). Dessutom möjliggör detta en kvantifiering av animaLS med aggregat, såväl som en kvantifiering av antalet aggregat.
För att undersöka icke cell autonom toxicitet av prion domän, som tidigare har vi granskat angränsande vävnader som inte uttrycker R2E2 genom elektronmikroskopi och fann att uttryck av prion domän i muskelceller leder till ett icke-cell autonom störning av mitokondriell integritet i angränsande vävnader, såsom som tarmen 40. Mitokondriell dysfunktion resulterar i ökade reaktiva syreradikaler (ROS) produktion och oxidativ stress. En icke-invasiv sätt att visualisera induktion av den oxidativa stress är att använda en oxidativ stress inducerbart reporter 70. Stammen CF1553 uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under oxidativ stress inducerbara promotorn sod-3 70. När korsade till djur som uttrycker prion domänen R2E2 i BWM celler, var reportern signifikant uppregleras i BWM celler såväl som i många icke-BWM vävnader (
Genome-wide screen för undertryckande av prion-inducerad toxicitet i C. elegans
Den komplexa toxiciteten fenotyp av prion domänen uttryckt i C. elegans är särskilt intressant på grund av bristen på skönjbar toxicitet observerats i de flesta in vitro prionmodeller 71. Denna modell kan avslöja nya vägar som kan påverka toxiciteten förknippad med prioner i metazoans. För att lösa detta har vi screenas för gener som, när RNAi-utarmat, skulle förbättra motilitet defekt R2E2 transgena djur. Kontroll behandlad WT maskar kan användas som ett positivt samarbetentrol, kommer även om de flesta kandidatgener inte ge en fullständig rörelse fenotyp räddning, på grund av den variabla RNAi penetrans och den höga toxiciteten av transgen. Djuren behandlades under 4 dagar med RNAi, från det första larvtillståndet L1 till dag 2 i vuxen ålder. Vid det laget är stryk av obehandlade R2E2 djur betydligt långsammare än stryk av WT djur, vilket är viktigt eftersom vi screening för en förbättring av rörlighet. F1 avkomma kommer att vara närvarande (~ L1s), men är lätt att skilja från P0 generation. Endast den P0 generationen har gjorts. Denna initiala skärmen är visuella och icke kvantitativ och därför var en låg tröskel för att identifiera preliminära hits, vilket innebär att varje bakteriell RNAi klon som tycktes öka stryk av prion-uttryck djuren testas i en kvantitativ krypande analys. Figur 4 skisserar huvudsakliga stegen i inställningsskärmen. Den höga upplösningen på Falcon 4M60 kameran möjlig en visuell screening av ett quarter av plattan i taget på en datorskärm, vilket tillät skärmen ska fyllas mer effektivt. Medan användbara, är detta inte nödvändigt. Den visuella undersökningen av snäck stryk kan också utföras genom att använda ett stereoskop vid låg förstoring (10X).
Bekräftelse av preliminära skärm träffar
Högkapacitetsscreeningar utförs som ett förhållningssätt som gör att analysera genomet breda effekter för att få en primär lista över kandidatgener som kan förädlas genom kompletterande metoder. Validering av resultaten skärmen är därför viktigt att undanröja eventuella falska positiva, som kan följa av att utföra en skärm med endast en experimentell prov per RNAi. R2E2 transgena djur matades med RNAi kloner av primära hits och mätte hastigheten på NGM plattor på den andra dagen av vuxenlivet, som en kvantifierbar avläsning av motilitet och minskad toxicitet. Vi använde wrMTrck plugin för ImageJ, som utvecklats i vårtlaboratorium, som noggrant identifierar C. elegans i filmer och följer deras rörelse. Den wrMTrck plugin och skript för automatiserad analys är öppen källkod och allmänt tillgängliga på http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html, tillsammans med detaljerade instruktioner om hur man använder det. Efter nedladdning, kopiera hela wrMTrck mappen till Plugins mappen i ImageJ. Detta protokoll beskriver wrMTrck_Batch metoden att föredra för att analysera ett stort antal filmer åt gången, men instruktioner för en manuell, film genom film, analys finns också med plugin nedladdning. WrMTrck_Batch omvandlar en originalvideo (figur 5A) till ett binärt format med bakgrundssubtraktion och varje mask har ett spår. Var och en av de bearbetade videoklipp kan senare ses med dessa spår lagrade, för att manuellt ta bort några artefakter som felaktigt identifierats som maskar (e. G., Spår 1 i figur 5B). Ett effektivt sätt att eliminera bakgrundsteknik iFACTS (indikerade med en pil på figur 5B) är att noggrant välja de minsta och största storlek av föremålen som skall identifieras (figur 5C). Från de olika utgångarna på wrMTrck plugin, använder vi kroppslängder per sekund (BLPS) parameter som mäter genomsnittshastigheten för varje djur, företrädd av längden på varje spår dividerat med kroppslängden i varje objekt, vilket normaliserar för potentiella skillnader i storlek nematoder (Figur 5D). Med denna metod, identifierade vi 35 dämpare av prion-inducerad toxicitet (sopt) att ökad motilitet fenotypen i R2E2 uttrycker C. elegans till minst 133% och upp till 256% jämfört med tomma vektorbehandlade maskar (Figur 6). Dessa sopt gener representerar den sista bekräftade hits som resulte från våra hög kapacitet insatser.
21fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Priondomän sprider mellan celler och vävnader i C. elegans av vesikulär transport. (A) Kollapsade konfokala z-stackar av nematoder som uttrycker RFP i kroppen väggen muskler (BWM) celler (RFPm). (B) Kollapsade konfokala z-stackar av nematoder som uttrycker den mycket giftiga och aggregering benägna NM variant, R2E2 , i BWM celler (R2E2m). Pilar indikerar rörformiga blåsor, indikerar pilspets aggregat. (C + D) Time-lapse-serien av djur som uttrycker RFPm (C) och R2E2m (D). Pilar anger områden av vesikulär rörelse. RFPm uppvisar mestadels en diffus färgning. Även när RFPm finns i vesikler, dessa knappt röra. R2E2m lokaliserar till många blåsor som transporteras inom och mellan celler. Skalstrecken: 10 ^ M. De medföljande Videor 1 och 2 [placera länkar till Video 1 och 2 här] motsvara figurerna 1C och D,respektive.
Figur 2. Folding sensorer avslöjar den utbredda effekten av prion domänen på Proteostas. (A + B) Samuttryck av R2E2m främjar RΔ2-5m aggregering. Konfokala bilder av (A) RΔ2-5m kontroll och (B) RΔ2-5m samuttrycks med R2E2m i BWM celler. (C + D) Muskel uttryckt R2E2m främjar intestinal RΔ2-5i aggregering. (C) Confocal bilden av kontrolldjur som uttrycker RΔ2- 5i i tarmceller. (D) Confocal bild av djur som uttrycker R2E2m i BWM celler och RΔ2-5i i tarmen. Skala barer: 10 pm (E + F) R2E2m inducerar icke cell självständig aggregering av Q44i (E) Representativa fluorescerande bilder av Q44i och Q44i; R2E2m djur fyra dagar efter att överföra synkroniserade L1 lar..vae på färska OP50-seeded NGM plattor. Uttrycket av R2E2 i BWM celler leder till en tidigare debut av Q44i aggregation i tarmen. (F) Kvantifiering av djur med aggregat (i%) på angivna dagar efter synkronisering. Felstaplar representerar SD Denna siffra har ändrats från 40.
Figur 3. sod-3p :: GFP transkriptions stressen reporter avslöjar att prion domänen orsakar cellsjälvständiga och icke cell autonoma induktion av oxidativ stress. (A + B) Representativa fluorescerande bilder (som använder samma exponeringstid) av sod-3p :: GFP uttrycka kontrolldjur (A) och sod-3p :: GFP;. R2E2m djur (B) på dag 2 i vuxen ålder (C) Uttrycket av R2E2 i BWM celler leder till en induktion av reportern inte bara i BWM-cells (I), men även i tarmen (II), nervkabel (III), i svalg och huvud neuroner (IV).
Figur 5. Analys av snäck rörelse med wrMTrck plugin till ImageJ. (A) Exempel på en ingångs film alstras genom användning av en lämplig förstoring (~ 10X) för att övervaka flera djur i taget. (B) "* _labels.tif" filer är en utsignal från wrMTrck_Batch och möjliggöra manuell datasäkring av analysresultat. Pilen indikerar ett objekt som var korrekt inte i analysen på grund av ett lämpligt val av lägsta och högsta storleksparametrar. (C) Ingångs fönster wrMTrck_Batch, visar parametrar som används för detta protokoll. Dessa parametrar måste anpassas efter de individuella mikroskop och filminställningar. (D) Utgångs resultat från movement analys av (B), med BLPS kolumnen gulmarkerade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. R2E2 maskar som behandlats med RNAi kloner som är supressors av prion-inducerad toxicitet (sopt) visar förbättrad motilitet. Motilitet visas som relativa BLPS vid jämförelse med den negativa kontrollen (tom vektor). Visas är alla statistiskt signifikanta (elev t-test) RNAi kloner som identifierats i HTP-skärmen. 
representerar träffen visas som ett exempel i figur 5. Resultaten är från 3 filmer, med 17 <n <53 spår per tillstånd. Felstaplar representerar SEM. </ P>
Tabell 1. C. elegans stammar uttrycker fällbara sensorer och stress reportrar.
| Stam namn | genotyp | Kommentarer | Stam källa | ||||
| Vikbara sensorer | |||||||
| transgener | |||||||
| AM140 | UNC-54p :: polyQ35 :: YFP | muskelspecifikt uttryck av polyQ35, åldersberoende aggregering | CGC eller Morimoto lab | ||||
| AM141 | UNC-54p :: polyQ40 :: YFP | muskelspecifikt uttryck av polyQ40, age beroende aggregering | CGC eller Morimoto lab | ||||
| AM801 | unc-54p :: RΔ2-5 :: YFP | muskel-specifikt uttryck för kärnbildning inkompetent prion domän | Morimoto lab | ||||
| OG412 | VHA-6p :: polyQ44 :: YFP | tarm-specifikt uttryck för polyQ44, åldersberoende aggregering | CGC | ||||
| AM809 | VHA-6p :: RΔ2-5 :: gfp; myo-2p :: mCherry | tarm-specifikt uttryck för kärnbildning inkompetent prion domän | Morimoto lab | ||||
| AM47 | F25B3.3p :: polyQ40 :: GFP | neuron-specifikt uttryck för polyQ40, celltyp specifik aggregering | Morimoto lab | ||||
| AM982 | unc54p :: luciferas :: YFP | muskelspecifikt uttryck av WT eldflugeluciferas | Morimoto lab | myo-3p :: luciferas :: gfp; rol-6 | muskelspecifikt uttryck av WT eldflugeluciferas | Behl lab | |
| SNG-1p :: luciferas :: gfp; rol-6 | muskelspecifikt uttryck av WT eldflugeluciferas | Behl lab | |||||
| FUH55 | unc54p :: Fluc :: EGFP; rol-6 | muskelspecifikt uttryck av WT eldflugeluciferas | Hartl lab | ||||
| FUH134 | unc54p :: FLUCSM :: EGFP; rol-6 | muskelspecifikt uttryck av R188Q mutant eldflugeluciferas | Hartl lab | ||||
| FUH135 | unc54p :: FLUCDM :: EGFP; rol-6 | muskelspecifikt uttryck av R188Q + R261Q dubbelmutanten eldflugeluciferas | Hartl lab | ||||
| FUH48 | F25B3.3p :: Fluc :: EGFP; rol-6 | neuron-specifikt uttryck för WT firefly LuciferaSE | Hartl lab | ||||
| FUH136 | F25B3.3p :: FLUCSM :: EGFP; rol-6 | neuron-specifikt uttryck för R188Q mutant eldflugeluciferas | Hartl lab | ||||
| FUH137 | F25B3.3p :: FLUCDM :: EGFP; rol-6 | neuron-specifikt uttryck för R188Q + R261Q dubbelmutanten eldflugeluciferas | Hartl lab | ||||
| ts mutanter | |||||||
| CB1402 | unc-15 (e1402) Jag | Paramyosin (ts), temperaturkänslig Unc-förlamad, låt | CGC | ||||
| CB1157 | unc-54 (E1157) Jag | Myosin (ts), temperaturkänsligt Unc | CGC | ||||
| CB1301 | unc-54 (E1301) Jag | Myosin (ts), temperaturkänsligt Unc | CGC | ||||
| CB286 | unc-45 (E286) III | Unc-45 (ts), temperaturkänsligt, långsamma Unc, Egl | CGC | ||||
| HE250 | unc-52 (e669su250) II | Perlecan (ts), temperaturkänsligt Unc, styv förlamning | CGC | ||||
| SD551 | låt-60 (ga89) IV | Ras (ts), temperaturkänsligt Muv, Ste, låt, Lva, Osm | CGC | ||||
| CX51 | dyn-1 (ky51) X | Dynamin (ts), temperaturkänsligt Unc | CGC | ||||
| CW152 | gas-1 (fc21) X | Gas-1 (ts), temperaturkänsligt EtOH känslighet | CGC | ||||
| ZZ26 | unc-63 (x26) I | Acetylkolinreceptorn (ts), temperaturkänslig levamisol motstånd | CGC | ||||
| påfrestning reportrar | |||||||
| CL2070 | hsp-16.2p :: gfp; rol-6 | termisk stress; UPR cyto | CGC | ||||
| TJ375 | hsp-16.2p :: gfp | termisk stress; UPR cyto | CGC | ||||
| TJ3000, TJ3001 | hsp-16.2p :: gfp; Cbr-UNC-119 (+) | termisk stress; UPR cyto | CGC | ||||
| AM446 | hsp70p :: gfp, rol-6 | termisk stress; UPR cyto | Morimoto lab | ||||
| AM722 | hsp70p :: mCherry; myo-2p :: CFP | termisk stress; UPR cyto | Morimoto lab | ||||
| AM799 | hsp90p :: gfp | termisk stress; UPR cyto | Morimoto lab | ||||
| OG497 | HSF-1p :: HSF-1 :: gfp; Cbr-UNC-119 (+) | termisk stress; UPR cyto | CGC | ||||
| CF1553 | sod-3p :: gfp, rol-6 | oxidativ stress | CGC | ||||
| KN259 | sod-3p :: gfp, rol-6 | oxidativ stress | CGC | ||||
| CL2166 | gst-4p :: GFP :: nls | oxidativ stress | CGC | ||||
| LD1171 | GCS-1p :: gfp, rol-6 | oxidativ stress | CGC | ||||
| LD1 | SKN-1p :: SKN-1 :: gfp, rol-6 | oxidativ stress | CGC | ||||
| IG274 | NLP-29P :: gfp | osmotisk påfrestning | CGC | ||||
| BC20309 | mtl-1p :: gfp | metallspänning | Baillie lab | ||||
| BC20342 | mtl-2p :: gfp | metall stress | Baillie lab | ||||
| BC20314 | ELT-2p :: gfp | metallspänning | Baillie lab | ||||
| SJ4005 | hsp-4p :: gfp | UPR ER | CGC | ||||
| SJ4100 | hsp-6p :: gfp | UPR mito | CGC | ||||
| SJ4058 | hsp-60p :: gfp | UPR mito | CGC |
CGC: Caenorhabditis Genetics Center; ts = temperaturkänsligt; UPR = ovikt protein svar; CYTO = cytosoliskt; Mito = mitokondriell; ER = endoplasmatiska retiklet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som beskrivs här hjälper till att illustrera att sprida och komplexa cellsjälvständiga och icke cell autonoma toxicitet prionliknande proteiner. Vi upptäckte nyligen att en aggregation-prone cytosoliskt prion domän tas upp i membranbundna vesiklar i en autophagy relaterad process. En specifik delmängd av dessa vesiklar transporterar prion domän inom och mellan celler och vävnader 40. Nyckeln för att övervaka deras rörelse i det levande djuret är att proteinet måste vara taggade med mRFP, eftersom endast mRFP-märkta proteiner var synliga i dessa förmodligen sura vesiklar. Med samma tillvägagångssätt, vi undersöker för närvarande möjligheterna prion-liknande beteende av vissa sjukdomsrelaterade proteiner, såsom superoxiddismutas 1 (SOD1) (kopplat till ALS), alfa-synuklein (länkad till PD) eller TAR DNA-bindande protein 43 (TDP-43) (kopplat till ALS). Även om denna intercellulära transport inom vesiklar verkar användas av flera andra proteiner, kan det finnas enTTERLIGARE vägar som tillåter spridning.
Användningen av väl karakteriserade fällbara sensorer är ett kraftfullt verktyg för att övervaka effekterna på cellulärt protein fällbara miljö C. elegans 63-66. Här har vi visat hur man använder åldersberoende ansamling av fluorescerande taggade aggregering benägna proteiner uttrycks under vävnadsspecifika promotorer för att visuellt övervaka fällbara kapacitet distinkta vävnader samtidigt. Andra möjligheter att studera organism Proteostas nätet innefattar användningen av endogena ts muterade proteiner. Dessa metastabila proteiner fungerar normalt vid den tillåtna temperaturen (15 ° C), men misfold och blir icke-funktionell vid den restriktiva temperaturen (25 ° C), som uppvisar deras karakteristiska mutantfenotypen. I närvaro av en aggregering benägen protein eller under åldring, de ts mutantfenotypen blir exponerade även vid permissiva betingelser 63-66. Några av dessa ts mutanter uttrycks i oNLY en delmängd av vävnader eller uppvisar vävnadsspecifika fenotyper, vilket gör dessa särskilt användbart för att testa för cellsjälvständiga och icke cell autonoma proteotoxic effekter. Till exempel, en ts mutant av LET-60, en medlem av GTP-bindande RAS protoonkogen familj, Ras (ts), ubiquitously uttrycks, men visar vävnadsspecifik mutant fenotyper 63,66. Genom att använda denna ts mutant, var effekten av polyQ expansioner på cellulär Proteostas visat sig vara cell autonoma 63. Expression av polyQ i den genetiska bakgrunden till ras (ts) avslöjade endast den mutanta fenotypen specifik för den vävnad i vilken proteinet uttrycks. Exponeringen av flera muterade fenotyper skulle indikera att ett protein har icke-cell autonoma proteotoxic effekter.
Dessutom, för att testa effekterna på cellstressvägar, det finns ett stort urval av in vivo fluorescerande spännings reportrar i C. elegans 72. Dessa är vanligtvis transkriptional reportrar som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under en stress-promotor, såsom hsp-16.2p eller sod-3p, som rapporterar på termisk eller oxidativ stress, respektive 72. Genom att använda lämpliga reportrar i kombination med prionliknande proteiner, kan man övervaka en potentiell induktion av stressreaktioner i andra än den som uttrycker respektive transgen vävnader. En varning är dock att dessa stress reportrar är ofta inte tillräckligt känsliga för att avslöja subtila uppreglering av en given väg (opublicerade observationer).
På vår strävan att undersöka om gener som påverkar icke-cellen autonoma toxicitet också påverkar protein sprider, vi började med att screening för gener som, när knockad, skulle lindra defekter rörelse. Använda visuell utvärdering av bass skattesatser som en utläsning, kunde vi bekvämt analys ~ 25 plåtar per session och utföra två omgångar av detta protokoll per vecka, vilket resulterade i slutförav den initiala skärmen inom 6 veckor. Bekräftelsen av träffar, genom kvantitativ analys av masken rörelse på solida plattor, i tre exemplar, med hjälp wrMTrck utfördes i ytterligare 3 veckor. En varning är dock att genom att använda krypa i plattor i stället för att simma i flytande medier som en utläsning man kan förlora vissa kandidatgener, som simning och krypa är inte identiska motioner och kan påverkas av olika vägar 73. Således, om vissa kandidatgener inte kan bekräftas på fasta plattor, de bör testas på nytt i flytande medier, där simning kan kvantifieras genom att räkna stryk frekvensen inom en viss tid.
Screeningen protokoll som beskrivs här använder automatiserad hantering arbetsstationer flytande, vilket kraftigt minskar variabilitet. Nackdelen är att det behövs ett överskott av fluider för reservoaren av robotarna, som kanske inte alltid är genomförbart. Denna screening inställning kan lätt anpassas för andra skärmar i C. elegans </ Em> att använda stryk som en skriv out.This skärmen var inte utformade för att direkt identifiera gener som påverkar spridning eller icke cell självständig toxicitet prion domänen, som genomet breda skärmar ska vara enkel i designen, så att den kan utföras i tid. Motilitet defekter kan härröra inte bara från muskulös, men också från neuronal skada och från ett antal andra gendefekter 53. Genom att använda denna avläsning, kanske vi hittar inte bara modifierare av muskelspecifik toxicitet. Vi testar för närvarande kandidatgener för deras effekter på priondomän sprider och icke cell autonoma toxicitet med hjälp av de metoder som beskrivs ovan. Dessa experiment kommer så småningom avslöja om transcellulär spridning av proteinaggregat är direkt kopplad till toxiciteten observerats i andra vävnader eller om cell till cell överföring och icke cell autonoma toxicitet kan kopplas bort.
Taget tillsammans, kan de beskrivna metoder användas för att undersöka den potentiella prjon-liknande beteende av proteiner på cell och organismnivå med hjälp C. elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Nanosphere size standards 100 nm | ThermoScientific | 3100A | |
| Levamisole | Sigma | L-9756 | |
| IPTG | Sigma | 15502-10G | |
| Ahringer RNAi library | Source BioScience LifeSciences | http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/ |
|
| Equipment | |||
| Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC | ThermoScientific | 75004521 | http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60 |
| 96 pin replicator | Scionomix | http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/ | |
| HiGro high-capacity, incubating shaker | Digilab | http://www.digilabglobal.com/higro | |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Titertrek | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm | |
| Biomek FX AP96 Automated Workstation | Beckman Coulter | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm | |
| Innova44 shaker | New Brunswick | http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04&action=products&contentid=1& catalognode=83389 |
|
| M205 FA | Leica | http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/ | |
| ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera | Hamamatsu | http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html | |
| Spinning Disc AF Confocal Microscope | Leica | http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/ | |
| Falcon 4M60 camera | Teledyne Dalsa | http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/ | |
| Software | |||
| MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html | |
| Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software | Meyer Instruments | http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm | |
| ImageJ | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| wrMTrck plugin for ImageJ | http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html | ||
| C. elegans strains | |||
| N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570 | |
| AM815 rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] | Morimoto lab | available from our laboratory | |
| See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains |
References
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie. Cell. 73 (6), 1055-1058 (1993).
- Caughey, B., Kocisko, D. A., Raymond, G. J., Lansbury, P. T. Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem Biol. 2 (12), 807-817 (1995).
- Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
- Chien, P., Weissman, J. S., DePace, A. H. Emerging principles of conformation-based prion inheritance. Annu Rev Biochem. 73, 617-656 (2004).
- Kimberlin, R. H., Walker, C. A. Pathogenesis of mouse scrapie: patterns of agent replication in different parts of the CNS following intraperitoneal infection. J R Soc Med. 75 (8), 618-624 (1982).
- Beekes, M., McBride, P. A., Baldauf, E. Cerebral targeting indicates vagal spread of infection in hamsters fed with scrapie. J Gen Virol. 79 (3), 601-607 (1998).
- Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
- Wood, S. J., et al. alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease. J Biol Chem. 274 (28), 19509-19512 (1999).
- Wang, Y. Q., et al. Relationship between prion propensity and the rates of individual molecular steps of fibril assembly. J Biol Chem. 286 (14), 12101-12107 (2011).
- Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 123 (8), 1191-1201 (2010).
- Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442 (7102), 585-589 (2006).
- Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J Struct Biol. 179 (2), 152-160 (2012).
- Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cell-autonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. Dis Model Mech. 7 (1), 31-39 (2014).
- Lino, M. M., Schneider, C., Caroni, P. Accumulation of SOD1 mutants in postnatal motoneurons does not cause motoneuron pathology or motoneuron disease. J Neurosci. 22 (12), 4825-4832 (2002).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
- Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 13010-13015 (2009).
- Clement, A. M., et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science. 302 (5642), 113-117 (2003).
- Gu, X., et al. Pathological cell-cell interactions elicited by a neuropathogenic form of mutant Huntingtin contribute to cortical pathogenesis in HD mice. Neuron. 46 (3), 433-444 (2005).
- Yamanaka, K., et al. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7594-7599 (2008).
- Garden, G. A., et al. Polyglutamine-expanded ataxin-7 promotes non-cell-autonomous purkinje cell degeneration and displays proteolytic cleavage in ataxic transgenic mice. J Neurosci. 22 (12), 4897-4905 (2002).
- Raeber, A. J., et al. Astrocyte-specific expression of hamster prion protein (PrP) renders PrP knockout mice susceptible to hamster scrapie. EMBO J. 16 (20), 6057-6065 (1997).
- Yazawa, I., et al. Mouse model of multiple system atrophy alpha-synuclein expression in oligodendrocytes causes glial and neuronal degeneration. Neuron. 45 (6), 847-859 (2005).
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Sambataro, F., Pennuto, M. Cell-autonomous and non-cell-autonomous toxicity in polyglutamine diseases. Prog Neurobiol. 97 (2), 152-172 (2012).
- Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Prion-like spread of protein aggregates in neurodegeneration. J Exp Med. 209 (5), 889-893 (2012).
- Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).
- Braak, H., Braak, E., Bohl, J. Staging of Alzheimer-related cortical destruction. Eur Neurol. 33 (6), 403-408 (1993).
- Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Clavaguera, F., et al. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat Cell Biol. 11 (7), 909-913 (2009).
- Nonaka, T., et al. Prion-like Properties of Pathological TDP-43 Aggregates from Diseased Brains. Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).
- Lundmark, K., et al. Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6979-6984 (2002).
- Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10 (5), 703-713 (2000).
- Xu, X., Kim, S. K. The early bird catches the worm: new technologies for the Caenorhabditis elegans toolkit. Nat Rev Genet. 12 (11), 793-801 (2011).
- Boulin, T., Hobert, O. From genes to function: the C. elegans genetic toolbox. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (1), 114-137 (2012).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 9 (3), e1003351 (2013).
- Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
- Liu, J. J., Lindquist, S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast. Nature. 400 (6744), 573-576 (1999).
- Halfmann, R., et al. Prions are a common mechanism for phenotypic inheritance in wild yeasts. Nature. 482 (7385), 363-368 (2012).
- Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6 (11), e294 (2008).
- Krammer, C., et al. The yeast Sup35NM domain propagates as a prion in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 462-467 (2009).
- Hofmann, J. P., et al. Cell-to-cell propagation of infectious cytosolic protein aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (15), 5951-5956 (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
- Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , (2006).
- Methods in cell biology. Wormbooks. Shaham, S. , (2006).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization). PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. , (2006).
- Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
- Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Kern, A., Ackermann, B., Clement, A. M., Duerk, H., Behl, C. HSF1-controlled and age-associated chaperone capacity in neurons and muscle cells of C. elegans. PLoS One. 5 (1), e8568 (2010).
- Becker, J., Walter, W., Yan, W., Craig, E. A. Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydj1p, in protein translocation in vivo. Mol Cell Biol. 16 (8), 4378-4386 (1996).
- Salvaterra, P. M., McCaman, R. E. Choline acetyltransferase and acetylcholine levels in Drosophila melanogaster: a study using two temperature-sensitive mutants. J Neurosci. 5 (4), 903-910 (1985).
- Goloubinoff, P., Mogk, A., Zvi, A. P., Tomoyasu, T., Bukau, B. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (24), 13732-13737 (1999).
- Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. D. naK. DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J. 12 (11), 4137-4144 (1993).
- Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31 (21), 4221-4235 (2012).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14914-14919 (2009).
- Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. J Vis Exp. (82), e50840 (2013).
- Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5 (3), e1000399 (2009).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. J Neurosci. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. J Biol Chem. 283 (1), 194-201 (2008).
- Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
- Schatzl, H. M., et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J Virol. 71 (11), 8821-8831 (1997).
- Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. , (2014).
- Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
