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Chemistry

Preparação e Caracterização de SDF-1α-Quitosana As nanopartículas de sulfato de dextrano

Published: January 22, 2015 doi: 10.3791/52323

Introduction

O sulfato de dextrano (DS) e quitosana (CS) são polissacarídeos com múltiplas substituídos grupos sulfato carregados negativamente (em DS), ou grupos amina carregados positivamente (desacetilados CS). Quando misturado numa solução aquosa, os dois polissacáridos formar complexos de polielectrólitos através de interacções electrostáticas. Os complexos resultantes podem formar grandes agregados que irá ser progressivamente-separado da solução aquosa (ou precipitados), pequenas partículas que são dispersíveis em água (colóides). As condições específicas que contribuem para esses resultados têm sido extensivamente estudada, e foram resumidos e ilustrado em pormenor numa publicação recente 1. Entre essas condições, dois requisitos básicos para a produção de partículas dispersíveis em água são os polímeros de carga oposta deve 1) têm massa molar significativamente diferente; e 2) ser misturado numa relação não estequiométrica. Estas condições permitirão que os segmentos poliméricos complexados carga neutra gerados pela carganeutralização para segregar e formar o núcleo da partícula, e o excesso de polímero para formar o invólucro exterior 1. As partículas de glicanos descritos neste protocolo são destinados para a administração pulmonar, e são projetados para serem net carregado negativamente, e de dimensões nanométricas. A carga de superfície negativa reduz a probabilidade de absorção celular das partículas de 2,3. Partículas de dimensão nanométrica facilitar a passagem através das vias aéreas distais. Para atingir este objectivo, a quantidade de DS utilizado nesta preparação é em excesso de CS (proporção em peso de 3: 1); e alta massa molecular DS (peso-médio MW 500.000) e de baixo peso molecular, CS (MW gama 50-190 kDa, 75-85% desacetilada) são usadas.

SDF-1α é um factor homing células estaminais, que exerce a função de homing através da sua actividade quimiotáctica. SDF-1α desempenha um papel importante no retorno e manutenção de células estaminais hematopoiéticas na medula óssea e no recrutamento de ProgeNitor células no tecido periférico para a reparação de lesão 4,5. SDF-1α tem um local de ligação à heparina na sequência da proteína, o que permite que a proteína se liga à heparina / sulfato de heparano, formam dímeros, ser protegido contra a protease (CD26 / DPPIV) inactivação, e interagem com células alvo através dos receptores de superfície celular 6-8. DS tem propriedades estruturais semelhantes às da heparina / sulfato de heparano; assim, a ligação de SDF-1α para DS seria semelhante à dos seus ligantes poliméricos naturais.

No protocolo seguinte, descreve-se a preparação de nanopartículas de SDF-1α-DS-CS. Os procedimentos representam uma das formulações que foram previamente estudadas 9. O protocolo é originalmente adaptado de uma investigação do VEGF-DS-CS nanopartículas 10. Uma preparação em pequena escala é descrito, o qual pode ser facilmente dimensionado para cima com as mesmas soluções de reserva e as condições de preparação. Após a preparação, as partículas são caracterizadas by examinar seu tamanho, potencial zeta, a extensão da incorporação SDF-1α, in vitro tempo de liberação e atividade do incorporada SDF-1α.

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Protocol

1. Preparação de SDF-1α Glicano Nanopartículas

Devido ao efeito da administração in vivo, esterilizar todos os recipientes, pipetas, e pontas usadas na preparação.

  1. Prepare as seguintes soluções de em água ultrapura: 1% de sulfato de dextrano; NaOH 1 M (esterilizado por filtração com uma membrana PES); Quitosano a 0,1% em 0,2% de ácido acético glacial (0,8 e filtra-se através de filtros de 0,22 um, consecutivamente e ajustar o pH para 5,5 com NaOH depois); 0,1 M ZnSO4; 15% de manitol; e 0,92 mg / ml de SDF-1α (armazenado em alíquotas a 80 ° C, e mantida a 4 ° C uma vez descongelado).
  2. Esteriliza-se através de soluções de estoque 0,22 mM membranas de filtro. Avaliar os níveis de endotoxina na solução preparada com ensaio limulus amebócito lisado (LAL) coágulo de gel. Certifique-se que os níveis são <0,06 EU / ml.
  3. Adicionar 0,18 ml de água ultrapura para um frasco de vidro de 1,5 ml contendo uma barra de agitação magnética. Defina a velocidade de agitação a 800 rpm. Adicionar 0,1 ml de 1%sulfato de dextrano e agita-se durante 2 min. Adicionar 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml de 0,92 mg / ml de SDF-1α solução) e agitar durante 20 min.
  4. Adicionar 0,33 ml de 0,1% de quitosano, gota a gota e agita-se durante 5 min. Alterar a velocidade de agitação para o máximo e adicionar 0,1 ml de 0,1 M ZnSO4 lentamente com uma seringa de 0,1 mL (ao longo de 1 min).
  5. Retorno velocidade de agitação para 800 rpm e mexa por 30 min. Adicionar 0,4 ml de 15% de manitol e agita-se durante 5 min. Transferir a mistura reaccional para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 16.000 xg, a 4 ° C durante 10 min.
    Nota: A presença de manitol facilita a ressuspensão das partículas após centrifugação. Dependendo da compactação do sedimento, a concentração de manitol pode variar de 0% a 5%. Ressuspensão completa das partículas após cada centrifugação é crítico para evitar agregados na suspensão final.
  6. Aspirar o sobrenadante e utilizar uma pipeta para remover a última gota do líquido lentamente. Adicionar 0,2 ml de 5% de manitol. Suspender o pellet com 0,5 ml, 29 G needle seringa. Adicionar 1 ml de 5% de manitol. Centrifuga-se a 16000 xg durante 15 min.
  7. Repita o passo 1.6.
  8. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 0,2 ml de 5% de manitol. Armazenar a suspensão de partículas a 4 ° C.
    Nota: A suspensão de partículas também pode ser armazenado congelado a -80 ° C ou liofilizado. Incluindo 5% de manitol em suspensão é essencial para evitar a agregação das partículas após congelação e descongelação ou após liofilização e re-hidratação. O manitol pode ser removido por centrifugação da suspensão, após o armazenamento.

2. A medição do tamanho de partícula e Potencial Zeta

O tamanho de partícula e potencial zeta são analisados ​​por dispersão de luz dinâmica e electroforético da dispersão de luz, respectivamente, com um analisador de partículas indicada na lista de materiais.

  1. Configure os seguintes parâmetros para medição do tamanho de partícula: tempos de Capitalização: 70; Repita vezes: 4; Temperatura: 25 ° C;Diluente: água; Ajuste de intensidade: auto.
  2. Dilui-se a amostra SDF-1α-DS-CS com água (diluição de 10 vezes). Carregar 100 ul da amostra a uma cuvete descartável de UV, tais como numa cuvete de Eppendorf. Coloque a célula no suporte da célula. Aguarde até que o ajuste de intensidade para chegar a "Optimum" (~ 10.000 cps). Iniciar a aquisição de dados.
  3. Após a medição está completa, gravar os resultados cumulantes de diâmetro (nm) e índice de polidispersão. Calcular a média dos resultados obtidos a partir de cada uma das quatro leituras repetidas e calcular o desvio padrão.
  4. Carga de 500 ul de 10 vezes a amostra diluída partícula a uma célula de fluxo para medição do potencial zeta. Configure os seguintes parâmetros para a medição: tempos de Capitalização: 10; Repita vezes: 5; Temperatura: 25 ° C; Diluente: água; Ajuste de intensidade: auto. Registam-se os resultados do potencial zeta (mV). Média, o resultado de cada um dos 5 leituras repetidas, e calcular o deviatio padrãon.

3. Quantificação de SDF-1α nas Partículas

  1. Dilui-se em forma livre SDF-1α a concentrações de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, e 0,05 mg / ml em tampão de amostra de Laemmli 1,3x. Diluir 6 ul amostras SDF-1α-DS-CS com tampão de amostra de 40 ul 1,3x Laemmli. (Preparar tampão de Laemmli 4x estoque contendo 0,25 M de Tris-HCl, pH 7,5, 8% SDS, 40% glicerol, 0,05 mg / ml de azul de bromofenol, e 8% de 2-mercaptoetanol. Dividir a solução estoque em pequenas alíquotas a -20 e manter ° C para uso individual.)
  2. Aquecer as amostras a 100 ° C durante 10 min. Agitar as amostras duas vezes (cada uma de 10 segundos à velocidade máxima) durante o tempo de aquecimento de 10 min de modo a dissociar as partículas completamente. Arrefecer as amostras até à TA durante 2 min. Centrífuga a 10.000 xg por 0,5-1 min para derrubar o condensado de água. Vortex novamente para misturar bem.
    Nota: Neste ponto, a solução da amostra deve ser límpida sem precipitados visíveis presentes.
  3. Carga 10 &# 181; l sample / bem a um gel SDS 4-20%. Executar electroforese a 200 V durante 20 min. Manchar o gel com Coomassie mancha azul proteína.
  4. Examinar a densidade de banda de proteína de SDF-1α usando um gerador de imagens e análise de densitometria software molecular. Calcular a quantidade de SDF-1α nas partículas contra uma curva padrão construída com padrões SDF-1α livres.

4. Ensaio de Libertação In Vitro

  1. Misturar partículas de glicano SDF-1α com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem cálcio e magnésio (D-PBS) a uma proporção de 1: 1 (v / v).
  2. Dividir a suspensão de partículas em 0,05 ml de partes alíquotas em tubos de 1,5 ml. Coloque as amostras para o fundo dos tubos. Evitar a introdução de bolhas de ar ou perturbar a superfície do líquido. Selar o topo dos tubos com parafilme.
    NOTA: Ao fazer isso, o líquido irá permanecer na parte inferior durante a rotação de cima para baixo subsequente sobre o misturador tubo.
  3. Gire os tubos a 37 &# 176; C em um giro Micro-Tube Mixer. Retirar as alíquotas de nos tempos designados, e imediatamente centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  4. Separa-se os sobrenadantes e peletes, e reconstituir o sedimento com 0,05 ml de D-PBS. Armazenar as amostras a -20 ° C. Depois de todas as amostras são recolhidas, examinar-se os sobrenadantes e peletes sobre um gel de SDS como descrito acima.

5. Migration Assay

Este ensaio mede a actividade quimiotáctica de SDF-1α. Interacção de SDF-1α com o seu receptor (CXCR4) na superfície da célula causa a migração da célula no sentido do gradiente de SDF-1α. Neste ensaio, as células são carregadas para um bem superior (separados por uma membrana semi-permeável, a partir de um poço inferior) e SDF-1α solução em um tubo inferior.

  1. Diluir SDF-1α (forma livre ou ligado a partículas) com tampão de migração (meio RPMI-1640 contendo 0,5% de albumina de soro de bovino) na proporção de 3-FOld diluição em série para as concentrações finais de 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14, e 0,05 ng / ml.
  2. Adicionar 0,6 ml de solução a SDF-1α diluída ou tampão de migração apenas (controlo negativo) a uma cavidade da placa de 24 poços. Adicionar tampão migração 0,57 ml a um bem (controle de célula de entrada). Incubar a 37 ° C durante 30 min. Coloque uma inserção de cultura de célula Transwell permeável tal como (tamanho de poro de 5 um, 6,5 mm de diâmetro) na parte superior do poço inferior. Carregar 0,1 ml de células de Jurkat (5 x 10 5) para inserir o Transwell. Coloque 0,03 ml de células directamente para a célula de entrada de controlo bem. Incubar a placa a 37 ° C durante 2 horas numa atmosfera de 5% de CO2.
  3. Remova as inserções Transwell. Transferem-se as células que migraram para os poços inferiores a um tubo de poliestireno de 4 ml. Contar as células migraram com um citômetro de fluxo.
  4. Calcular a migração como uma percentagem do número de células de entrada (o número de células no controlo de célula de entrada bem x 100/30) após subtracção dos números em negative controles (células migraram para os poços contendo tampão migração só).

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Representative Results

O tamanho e potencial zeta das partículas preparadas SDF-1α-DS-CS são determinadas com um analisador de partículas. A Figura 1 mostra a análise da medição do tamanho. A partir dos resultados obtidos a partir de quatro cumulantes medições repetidas, o diâmetro hidrodinâmico médio das partículas SDF-1α-DS-CS é 661 ± 8,2 (nm) e a polidispersidade é de 0,23 ± 0,02. O resultado da medição do potencial zeta é mostrado na Figura 2. A partir das cinco medições repetidas, o potencial zeta das partículas SDF-1α-DS-CS é -24,8 ± 0,5 mV. Como mencionado acima, a presença de 5% de manitol à suspensão de partículas de SDF-1α-DS-CS é essencial para a prevenção de agregação das partículas durante um processo de congelação e descongelação. A Figura 3 mostra a medição do tamanho das partículas em suspensão na água e congeladas a -80 ° C. Um pico agregação distinta é visível após o descongelamento.

O amount de SDF-1α nas partículas SDF-1α-DS-CS é estimado por eletroforese em gel de SDS. Figura 4A mostra um azul manchado de gel SDS Coomassie com as normas de SDF-1α, DS-CS nanopartículas (partículas de controle sem incorporação SDF-1α , Ctrl NP) e SDF-1α-DS-CS nanopartícula (amostras carregadas SDF-1α NP). Uma curva padrão é construída a partir da análise da densidade das bandas padrão SDF-1α (Figura 4B). Cálculo a partir da curva padrão indica que a concentração de SDF-1α na amostra NP SDF-1α é de 0,03 mg / ml (média de duplicados). Uma vez que a diluição da amostra com o tampão da amostra é (6 + 40) / 6, a concentração original da amostra é de 0,23 mg / ml. Como o volume final da preparação de partículas é de 0,2 ml, total de SDF-1α na suspensão final é 0,046 mg. Considerando-se a massa de entrada do SDF-1α na mistura reaccional é de 0,08 mg, a eficácia de encapsulação de SDF-1α nas partículas DS-CS é de 57%. Piveteosan foi previamente relatado para manchar com azul de Coomassie. A coloração, no entanto, não é significativa no gel mostrado na Figura 4A. É, talvez, relacionada com a quantidade de quitosano (matriz da partícula) carregado no gel. Em qualquer caso, uma dissociação completa e a separação da SDF-1α a partir da matriz da partícula é necessário para avaliar com precisão a quantidade de proteína incorporada. Este gel também mostra que o SDF-1α não é detectável degradada por aquecimento a 100 ° C durante 10 min ou por o processo de vórtice, como não há bandas encontram-se entre a banda de proteína SDF-1α e a frente de corante.

A taxa de libertação in vitro de SDF-1α das nanopartículas é determinada por incubação das partículas em 50% de D-PBS a 37 ° C durante 7 dias. Em 0 horas, 3 horas, 8 horas, 24 horas, 48 ​​horas e 7 dias, a alíquotas das amostras são retiradas e imediatamente centrifugado. A SDF-1α libertado (no sobrenadante) é separado do SD ligados a partículaF-1α (pellet). As amostras são corridas num gel de SDS, e a quantidade de SDF-1α nos sobrenadantes e peletes são determinadas por coloração com Coomassie e análise de densitometria. Um gel típico de SDS da análise é mostrado na Figura 5. Como demonstrado, a partícula ligada SDF-1α é minimamente libertado após uma incubação de 7 dias.

A actividade da SDF-1α ligado a partículas é medido por um ensaio de migração (ensaio quimiotáctico), e comparada com a de livre SDF-1α. Neste ensaio, SDF-1α nas nanopartículas DS-CS é diluída em série com um tampão de migração, e incubado com células Jurkat durante 2 horas. As células que migraram são contadas com um citómetro de fluxo. Os dados (com concentrações de SDF-1α de 0,05-11 ng ​​/ ml) são representados por meio de regressão não-linear apropriado, e da CE 50 é calculado. Como mostrado na Figura 6, o SDF-1α ligado a partículas induzida a mesma extensão da migração como a de livre SDF-1 ^5; em todas as concentrações medidas. Os valores de EC50 de formas livres e ligados a partículas de SDF-1α são 0,55 e 0,45 ng / ml, respectivamente.

Figura 1
Tela Análise Figura 1. tiro mostrando medição espalhamento dinâmico de luz do tamanho das partículas. Os dois primeiros painéis mostram os gráficos da função de autocorrelação, G2 (τ) e logaritmo [G2 (τ) -1] ao longo do tempo. O processador de sinal digital do instrumento (correlacionador) expressa a intensidade da luz detectada como uma função do tempo de atraso (τ). O gráfico mostra que as partículas de SDF-1α-DS-CS causou um decaimento exponencial da intensidade entre 0,2-2 mseg. Para obter a constante de decaimento médio <Γ> , Um programa analisa a Ln [G2 (τ) -1] lote com cumulantes montagem. O primeiro coeficiente de ordem do deequação polinomial rived é atribuído a <Γ> , Que é proporcional à inclinação da curva. O segundo coeficiente de ordem dividido pelo quadrado da <Γ> é o índice de polidispersibilidade, o qual descreve a largura da distribuição de intensidade. De <Γ> o coeficiente médio de difusão (<D> ) E diâmetro da partícula (d) são calculados como: Γ = D · q e D = k B T / 3πη 0 d (equação Stoke-Einstein). As médias de dois painéis mostram a variação do tamanho da leitura durante as medições de acumulação 70, e a distribuição do tamanho calculado em relação com a intensidade, a medição. O diâmetro cumulantes e índice de polidispersão são apresentados na parte inferior da tela.

Figura 2
Figura 2. Análise tela tiro mostrando eletroforética espalhamento de luzmedição do potencial zeta de partículas. O painel superior mostra um G2 (τ) sobre enredo tempo. A função oscilante em decomposição progressiva que se observa tipicamente em partículas carregadas que são submetidos a electroforese e espalhamento de luz. A função reflete a mudança de freqüência (efeito Doppler) causado pelas partículas que se deslocam no campo elétrico. A transformação de Fourier do G2 (τ) mostra o espectro de energia (intensidade vs. frequência) mostrado no painel do meio. O centro do pico de deslocamento de frequência define a mobilidade das partículas, a partir do qual o potencial zeta é calculada. O potencial zeta calculado é mostrado na parte inferior da tela.

Figura 3
Figura 3. Partícula de medição de tamanho de partículas de SDF-1 α-DS-CS após congelamento e descongelamento em água. Na ausência de manitol, as partículas formam aggregates após congelamento e descongelamento. Note-se a formação de uma intensidade / pico do tamanho adicional e o aumento em diâmetro e cumulantes polidispersidade comparada com a da Figura 1.

Figura 4
Figura 4. Quantificação da SDF-1 α incorporação em nanopartículas DS-CS. (A) Fotografia de gel SDS corado com Coomassie carregado com gratuitas normas SDF-1α, DS-CS nanopartícula (Ctrl NP) e SDF-1α-DS- CS nanopartículas amostras (SDF-1α NP) como indicado. As bandas de proteínas SDF-1α e gel correndo corante frente estão marcados. As amostras Ctrl NP não são coradas com azul de Coomassie e as bandas de quitosana (largura) são vagamente visível. (B) As bandas são analisadas com um densitómetro, a partir do qual a curva padrão foi construída com os padrões de SDF-1α livres (média de duplicate). A quantidade de SDF-1α nas nanopartículas é calculada por comparação com a curva padrão, o que dá um valor médio de 0,3 ug / poço (10 uL).

Figura 5
Figura 5. gel SDS mostra SDF-1 α in vitro curso de tempo de libertação. Corada com Coomassie de gel SDS mostra a quantidade libertada de SDF-1α (em sobrenadantes) e ligado SDF-1α (em pastilhas) após incubação de SDF-1α-DS nanopartículas -CS a 37 ° C para vários períodos de tempo. Re-impresso com a permissão de 9.

Figura 6
Figura 6. Curvas de dose-resposta de SDF-1 α (círculos) e SDF-1α nanopartículas (NP) (quadrados) em um ensaio de migração de células de Jurkat. SDF-1α em ambos livres e ligados para nanopartículasms exibiu a mesma actividade com valores de EC50 de 0,55 e 0,45 ng / ml, respectivamente. Re-impresso com a permissão de 9.

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Discussion

Como mencionado acima, as nanopartículas DS-CS são formados através de neutralização de cargas entre polianião (DS) e policatião (CS) moléculas. Uma vez que a interacção de cargas ocorre prontamente durante a colisão molecular, a concentração das soluções de polímero e a velocidade de agitação durante a mistura é crítica para o tamanho das partículas resultantes. A tendência geral é que DS e CS 15 soluções e maior resultado velocidade de agitação em partículas menores mais diluído.

A formulação de nanopartículas de glicano SDF-1α pode ser variada. Por exemplo, os valores e as proporções de SDF-1α / DS / CS utilizados neste protocolo são 0,08 / 0,33 / 1 (mg / mg / mg), respectivamente. Dependendo do uso pretendido das nanopartículas SDF-1α, estas relações podem mudar. Se a quantidade de SDF-1α adicionada à mistura é de 0,04 mg (0,04 / 0,33 / 1, mg / mg / mg) em vez de 0,08 mg, as partículas será menor, ~ 650 nm, e a eficácia de encapsulação SDF-1α ligeiramente greater, 70-80% 9. No entanto, quando entregues in vivo, uma maior quantidade da matriz de glicanos estará presente por SDF-1α. Se um tamanho de partícula menor for desejado, a formulação de nanopartículas de glicano SDF-1α pode ser ainda modificado. Uma alternativa é a utilização de um quitosano menor peso molecular, tal como demonstrado em Ref 15. Deve notar-se, no entanto, que o quitosano tem uma elevada afinidade para a endotoxina (lipopolissacáridos carregado negativamente); assim, um teste de nível de endotoxina ou potencialmente uma purificação é necessária para a utilização de quaisquer produtos de quitosano antes da administração in vivo. A segunda alternativa é a de carregar SDF-1α em pequenas nanopartículas DS-CS pré-formados. Uma vez que este último pode ser manipulado mais facilmente no tamanho de partícula e SDF-1α tem uma elevada afinidade para DS, o carregamento de uma pequena quantidade de SDF-1α para o invólucro exterior das partículas DS-CS pode resultar em partículas menores.

Em comparação com outros tipos denanopartículas (por exemplo, PLGA 11, 12 polianidrido, ou nanopartículas de gelatina 13), as nanopartículas DS-CS tem particulares vantagens e limitações. As principais vantagens das nanopartículas DS-CS são: 1) a preparação de partículas não envolvem solventes orgânicos ou sonicação vigorosa. É, portanto, adequado para o factor de proteína de incorporação, como preparação suave reduz a probabilidade de inactivação de proteínas; 2) a matriz das partículas tem uma propriedade estrutural semelhante ao da matriz extracelular, o que faz com que as partículas de tecido compatíveis com o ambiente e é menos tóxico e inflamatória; e 3) imita SDF-1α ligados a partículas de glicano uma relação de ligação natural entre a proteína e a matriz extracelular, o que explica a actividade quimiotáctica cheio de SDF-1α depois de ser incorporado nas partículas de glicano. A SDF-1α totalmente activo na forma ligada à partícula permite que a servir como um factor homing estacionária no tecido environment. As limitações das nanopartículas DS-CS são: 1) os diâmetros das partículas são geralmente maiores do que as partículas acima mencionadas; e 2) facilmente entrar em colapso em soluções salinas, que podem não ser adequados para injecção directa para a circulação sanguínea.

A SDF-1α ligado a partículas é encontrado para ser minimamente libertado a partir das nanopartículas depois de uma incubação de sete dias. Este fenómeno está relacionado com a elevada afinidade da SDF-1α para a heparina, o que também contribui para a sua função in vivo. Desde que as proteínas com domínios de ligação à heparina terão geralmente diferentes afinidades para heparina, as suas taxas de lançamentos provavelmente diferem. Por exemplo, em um VEGF 165 -DS-CS nanopartículas preparadas numa formulação semelhante, 44% do VEGF 165 incorporada foi libertada na primeira hora e de 29% foi lançado no próximo 47 horas durante a incubação a 37 ° C 14. Por conseguinte, o padrão de libertação in vitro para um prot específicoein precisa ser testado individualmente.

O objectivo da preparação de nanopartículas de SDF-1α-DS-CS é entregar SDF-1α para o pulmão e estabelecer um sinal homing células-tronco no tecido. As partículas também podem ser entregues a outros tecidos para o mesmo fim, embora o formato específico de nanopartículas não é necessário para a injecção de tecido sólido. O facto de SDF-1α é estabilizada por DS na matriz de nanopartículas e é minimamente libertado a partir das partículas de suporte de recrutamento de células estaminais princípios, e a partícula deverá ser benéfico para a regeneração do tecido.

Uma vez que as nanopartículas de proteína-glicanos tem uma matriz semelhante à de glicosaminoglicanos da superfície celular e da matriz extracelular, é possível que as proteínas incorporadas-partículas podem ser trocados por essas matrizes (As moléculas da matriz extracelular carregadas negativamente podem competir com a ligação do positivamente proteína carregado) in vivo caracterização in vitro.

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Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH subvenções: HL671795, HL048743 e HL108630.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran sulfate Fisher BP1585-100
Chitosan, low molecular weight  Sigma 448869
Zinc sulfate heptahydrate Sigma 204986
D-Mannitol Sigma M9546
UltraPure water  Invitrogen  10977-023
SDF-1α Prepared according to reference 8.
Syringe filter, PES membrane 0.22 μm Millipore SLGP033RS
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) Fisher  14-513-63
Glass vial Kit; SUN-SRi Fisher  14-823-182
Delsa Nano C Particle Analyzer  Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets Eppendorf 952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel Bio-Rad 456-1096
GelCode Blue Safe Protein Stain Fisher  PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System BioRad 170-8640
Corning Transwell Permeable Supports Corning 3421
Accuri C6 Flow Cytometer BD Biosciences
Dulbecco’s phosphate buffered saline  Sigma D8537
Pyrogent plus kit Fisher NC9753738

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Chemistry Edição 95 sulfato de dextrano o quitosano glicano SDF-1α nanopartículas complexo polielectrólito
Preparação e Caracterização de SDF-1α-Quitosana As nanopartículas de sulfato de dextrano
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Bader, A. R., Li, T., Wang, W.,More

Bader, A. R., Li, T., Wang, W., Kohane, D. S., Loscalzo, J., Zhang, Y. Y. Preparation and Characterization of SDF-1α-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles. J. Vis. Exp. (95), e52323, doi:10.3791/52323 (2015).

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