Introduction
硫酸葡聚糖（DS）和脱乙酰壳多糖（CS）与多个取代带负电荷的硫酸基（在DS）的多糖，或带正电荷的胺基（脱乙酰CS）。当在水溶液中混合时，两种多糖形成通过静电相互作用的聚电解质复合物。所得复合物可以形成大的聚集体将相分离的水溶液（沉淀），或小颗粒是水可分散的（胶体）。有助于这些成果的具体条件已被广泛研究，并进行了总结，并详细示出在最近的评论1。在这些条件下，用于生产水可分散的颗粒的两个基本要求是相反电荷的聚合物必须1）有显著不同摩尔质量;和2）被混合在一个非化学计量比。这些条件将允许由电荷产生的电荷中性络合聚合物链段中和，以分隔并形成颗粒的核，和过量的聚合物，以形成外壳1。在这个协议中所描述的聚糖颗粒旨在用于肺部递送，并且被设计成净负电荷，和纳米尺寸。的负的表面电荷降低了蜂窝颗粒2,3的吸收的可能性。纳米尺寸的颗粒有利于通过远端气道的通道。为了实现这一目标，DS在这一制备中所用的量是过量的CS（重量比3：1）;和高分子量的DS（重均分子量50万）和低分子量的CS（分子量范围50-190 kDa的，75-85％脱乙酰化）被使用。
SDF-1α是干细胞归巢因子，其发挥通过其趋化活性的归巢功能。 SDF-1α起着寻和维护的造血干细胞在骨髓中的重要作用，并在招募PROGE的NITOR细胞的损伤修复4,5外围组织。 SDF-1α具有肝素结合位点在其蛋白序列，其允许蛋白结合到肝素/硫酸乙酰肝素，形式二聚体，被保护免受蛋白酶（CD26 / DPPIV）失活，并通过细胞表面受体与靶细胞相互作用6-8。 DS也有类似的结构性质肝素/硫酸乙酰肝素;因此，SDF-1α对DS中的结合将是类似于其天然的聚合物配位体。
在下面的协议中，我们描述了SDF-1α-DS-CS纳米颗粒的制备。该程序表示先前已经研究了9所述的制剂中的一个。该协议最初是改编自VEGF-DS-CS纳米粒子10进行调查。一个小规模的制备进行了说明，可以很容易地按比例放大以相同储备溶液和制备条件。制备后，该颗粒的特征在于BÝ检查其尺寸，zeta电位，SDF-1α结合的程度， 在体外释放时间，以及掺入的SDF-1α活性。
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Protocol
1.准备SDF-1α聚糖纳米粒子
由于在体内递送的目的，消毒的所有容器，移液管，并在制备中使用的提示。
- 制备下列储备溶液在超纯水：1％硫酸葡聚糖; 1 M氢氧化钠（无菌过滤用PES膜）;在0.2％的冰醋酸0.1％的壳聚糖（过滤器通过0.8和0.22微米的过滤器，并连续调节pH值至5.5，用NaOH之后）; 0.1M的硫酸锌; 15％甘露醇;和0.92毫克/毫升，SDF-1α（在80℃下以等分试样储存，并保持在4℃，一旦解冻）。
- 消毒原液通过0.22微米的滤膜。与鲎变形细胞溶解物（LAL）的凝胶凝块测定中制备的溶液进行评估的内毒素水平。保证水平是<0.06 EU /毫升。
- 添加0.18毫升超纯水，使含有磁搅拌棒在1.5毫升的玻璃小瓶中。在800 RPM设定搅拌速度。加入0.1毫升1％硫酸葡聚糖并搅拌2分钟。添加0.08毫克，SDF-1α（0.087毫升的0.92毫克/毫升的SDF-1α溶液）并搅拌20分钟。
- 添加0.33毫升0.1％脱乙酰壳多糖的溶液，并搅拌5分钟。改变搅拌速度为最大，并添加0.1毫升的0.1M 硫酸锌慢慢用0.1毫升注射器（超过1分钟）。
- 返回搅拌速度800rpm，并搅拌30分钟。添加0.4毫升15％甘露糖醇，搅拌5分钟。将反应混合物转移到1.5ml微量离心管中。离心机在16000 xg离心在4℃下进行10分钟。
注意：甘露醇的存在有利于离心后，颗粒的再悬浮。根据粒料的紧凑性，甘露醇浓度可以变化从0％到5％。每次离心后的颗粒完全悬浮关键是要避免聚集在最终悬浮液中。 - 吸去上清液，并使用移液管除去的液体最后一滴缓慢。中加入0.2ml的5％甘露糖醇。暂停颗粒用0.5毫升29克东东DLE注射器。加入1毫升5％甘露醇。离心在16000×g离心15分钟。
- 重复步骤1.6。
- 吸出上清液。重悬在0.2ml的5％甘露糖醇的颗粒。存储颗粒悬浮液在4℃下。
注意：该微粒悬浮液也可以被冷冻储存在-80℃或冻干。在悬浮液中含5％甘露糖醇是必不可少的，以防止颗粒的聚集冷冻和解冻之后，或冻干和再水化之后。甘露醇可以通过在保存后的悬浮液的离心分离除去。
2.测量粒度和Zeta电位
的粒径和zeta电位是通过动态光散射和电泳光散射，分别进行分析，并在物料清单指示的颗粒分析器。
- 设置为粒度测量以下参数：累积次数：70;重复次数：4;温度：25℃;稀释剂：水;强度调节：自动。
- 稀释的SDF-1α-DS-CS样品用水（10倍稀释）。加载100微升样品到一次性紫外比色皿的诸如的Eppendorf试管中。插入反应杯进入细胞支架。等待强度调节，以达到“最佳”（〜万厘泊）。开始数据采集。
- 测量完成后，记录直径（nm），而多分散性指数的累积量的结果。平均从各4重复读数的所获得的结果，并计算标准偏差。
- 负载500微升10倍稀释的粒子试样用于zeta电位测量的流动细胞。建立起来用于测量以下参数：累积次数：10;重复次数：5;温度：25℃;稀释剂：水;强度调节：自动。记录的ζ电位（mV）的结果。平均每个重复5次读数的所获得的结果，并计算标准deviatioñ。
3.量化SDF-1α的颗粒
- 稀游离形式的SDF-1α为0.01，0.02，0.03，0.04，和0.05毫克/毫升在1.3倍的Laemmli样品缓冲液中的浓度。稀释6微升的SDF-1α-DS-CS样品用40微升1.3倍Laemmli样品缓冲液中。 （准备含有0.25M三盐酸，pH值7.5，8％SDS，40％甘油，0.05毫克/毫升溴酚蓝，和8％的2-巯基乙醇的Laemmli 4倍储备缓冲。除以原液成小等份，并保持在-20 °下单使用。）
- 加热该样品在100℃下进行10分钟。涡流在10分钟的加热时间以完全离解的颗粒两次样品（各为10秒的最大速度）。冷却样品至室温2分钟。离心机在10,000 XG为0.5-1分钟打倒冷凝水。再次涡旋拌匀。
注意：在这一点上，将样品溶液应当清楚，没有可见的沉淀物存在。 - 负载10＃181;升样品/孔至4-20％SDS凝胶。运行电泳在200V进行20分钟。染色用考马斯亮蓝染色的蛋白质凝胶。
- 审查的SDF-1α使用分子成像器和光密度分析软件的蛋白条带密度。计算针对与游离的SDF-1α标准建造的标准曲线的粒子的SDF-1α的量。
4. 体外释放试验
- 在1混合用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水，SDF-1α聚糖颗粒不含钙和镁（D-PBS）：1的比例（体积/体积）。
- 划分颗粒悬浮到0.05毫升等分在1.5ml管。加载样品到管的底部。避免引入气泡或扰乱液体的表面上。用封口膜密封的管的顶部。
注：在这样做时，液体将在管混合器随后顶部至底部在旋转过程中保持在底部。 - 旋转的管子在37＃176; C对一个旋转微管混合器。从管中取出等分试样，在指定的时间，并立即离心样品在16000×g离心10分钟，在4℃。
- 分离上清液和小球，并重新构成粒料与0.05毫升D-PBS。存储所述样品在-20℃。之后所有的样品被收集，如上所述检查在SDS凝胶上清液和颗粒。
5.迁移实验
此测定法测定的SDF-1α的趋化活性。 SDF-1α，其在细胞表面上的受体（CXCR4）的相互作用导致对SDF-1α梯度的细胞迁移的影响。在该测定中，将细胞加载到上部井和SDF-1α溶液低级阱（通过半透膜从下部井分离）成。
- 稀SDF-1α（游离或颗粒结合形式），在一个3-FO迁移缓冲液（含有0.5％牛血清白蛋白的RPMI-1640培养基）LD连续稀释至最终浓度为100，33，11，3.7，1.2，0.41，0.14，和0.05纳克/毫升。
- 添加0.6毫升稀释的SDF-1α溶液或迁移缓冲液只（阴性对照）对一个井在24孔板中。添加0.57毫升迁移缓冲井（输入单元控制）。孵育在37℃下30分钟。放置一个可渗透性细胞培养插管，如上的下部井顶部Transwell小（孔径为5μm，直径6.5毫米）。负载0.1毫升Jurkat细胞（5×10 5）插入Transwell小插入。直接加载0.03毫升细胞到输入单元的控制良好。孵育板在37℃下2小时，在5％CO 2的培养箱中培养。
- 取出Transwell小刀片。传送已迁移到低孔中，以一个4毫升聚苯乙烯管中的细胞。计数迁移的细胞用流式细胞仪。
- 计算迁移作为输入细胞数目（在输入单元的控制以及X 100/30单元编号）中negat数字的减法后的百分比香港专业教育学院对照（细胞迁移到仅含有迁移缓冲液的孔中）。
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Representative Results
所制备的SDF-1α-DS-CS粒子的大小和ζ电位均用颗粒分析仪确定的。 图1示出了尺寸测量的分析。从来自四个重复测量得到的累积的结果，所述SDF-1α-DS-CS颗粒的平均流体动力学直径是661±8.2（nm），而多分散性是0.23±0.02。 zeta电位的测量结果示于图2中 。在5次重复测量中，SDF-1α-DS-CS粒子的ζ电位为-24.8±0.5毫伏。如上所述，在SDF-1α-DS-CS粒子悬浮液的5％甘露糖醇的存在是为在一个冷冻和解冻过程中防止颗粒聚集的必不可少的。 图3示出悬浮在水中并冷冻于颗粒的尺寸测量-80℃。一个明显的聚集峰解冻后可见。
古物古迹办事处UNT SDF-1α在SDF-1α-DS-CS颗粒估计通过SDS凝胶电泳。 图4A示出了没有SDF-1α结合的考马斯蓝染色的SDS凝胶带的SDF-1α标准，DS-CS纳米颗粒（控制颗粒，按Ctrl NP）和SDF-1α-DS-CS纳米粒子（SDF-1αNP）装载样品。标准曲线从SDF-1α标准带（ 图4B）的密度分析构建。从标准曲线计算表明SDF-1α浓度SDF-1α的NP样品中为0.03毫克/毫升（平均重复的）。因为与样品缓冲液样品的稀释（6 + 40）/ 6，原始样品浓度为0.23毫克/毫升。作为颗粒制剂的最终体积为0.2毫升总SDF-1α在最终悬浮液中是0.046毫克。考虑SDF-1α在反应混合物中的输入质量为0.08毫克，SDF-1α在DS-CS颗粒的包封效率是57％。捷乌山先前已报道染色用考马斯蓝。染色，然而，这不是在图4A中所示的凝胶显著。据，或许，与脱乙酰壳多糖（颗粒基质）上的凝胶装载的量。在任何情况下，一个完整的解离和SDF-1α的分离从颗粒基质是必要的准确评估掺入蛋白质的量。该凝胶还显示，SDF-1α未检测地通过加热在100℃下分解为10分钟或通过涡流的过程中，由于没有带被所述的SDF-1α蛋白带和染料前之间找到。
SDF-1α从纳米颗粒的体外释放速率在50％的D-PBS中的颗粒温育在37℃下7天被确定。在0小时，3小时，8小时，24小时，48小时和7天，将样品的等分试样取出并立即离心。被释放的SDF-1α（在上清液中）从颗粒结合的SD分离F-1α（粒料）。将样品上运行的SDS凝胶，和SDF-1α的上清液中的量和颗粒通过考马斯染色和光密度分析测定。该分析的典型SDS凝胶示于图5，作为证明，颗粒势必SDF-1α是一个7天的孵育之后微创释放。
颗粒结合SDF-1α的活性是通过一个迁移测定（趋化测定法）进行测定，并与该自由SDF-1α。在该测定中，SDF-1α在DS-CS纳米颗粒串联用迁移缓冲液稀释，并孵育的Jurkat细胞2小时。迁移的细胞进行计数用流式细胞仪。数据（具有0.05-11纳克/ ml的SDF-1α的浓度）绘制与非线性回归拟合，并且EC 50的计算方法。 如图6所示 ，颗粒结合SDF-1α诱导的迁移的相同的程度，自由的SDF-1 ^5;在所有浓度测定。的自由和颗粒结合形式的SDF-1α的EC 50值是0.55和0.45纳克/毫升。
图1.分析屏幕截图示出颗粒尺寸的动态光散射测定。该顶两个面板显示的自相关函数的图，G2（τ），以及对数〔G2（τ）-1]随时间。仪器的数字信号处理器（相关器），表示检测到的光强度作为延迟时间（τ）的函数。该图显示，SDF-1α-DS-CS粒子引起的强度的指数衰减0.2-2毫秒之间。为了获得平均衰减常数<Γ>
图2.分析屏幕上显示拍摄电泳光散射的粒子的ζ电势测量，前面板显示了G2（τ）随着时间的推移图。在逐渐衰减振荡函数通常观察到在经受电泳和光散射带电粒子。函数反映了频移（多普勒频移）所引起的电场的移动粒子。 G2的（τ）傅立叶变换给出了中间面板显示的功率谱（强度与频率图）。频移的峰值的中心限定了粒子，从该ζ电位，计算的移动性。计算出的ζ电位显示在屏幕的底部。
SDF-1的α-DS-CS颗粒的冷冻和解冻的水之后，图3的粒子大小的测量。在没有甘露醇，所述颗粒形成股份公司冷冻和解冻后gregates。注意，形成一个额外的强度/尺寸峰和相比， 图1的增加，累积直径和多分散性。
考马斯亮蓝染色的SDS凝胶图4. SDF-1α纳入DS-CS纳米粒子的定量。（A）照片装有免费SDF-1α标准，DS-CS纳米粒子（按Ctrl NP）和SDF-1α-DS- CS纳米颗粒（SDF-1αNP）的样品所指示的。在SDF-1α蛋白带和运行凝胶染色前被标记。在按Ctrl NP样品不考马斯亮蓝染色和壳聚糖带（宽）是隐约可见。 （B）中的条带用密度计，从该标准曲线是与自由的SDF-1α标准建造（平均duplica的分析TE）。 SDF-1α中的纳米颗粒的量，计算针对标准曲线，这给0.3微克的平均值/孔（10微升）。
图5. SDS凝胶显示SDF-1的α 的体外释放时间过程。考马斯染色的SDS凝胶显示发布的SDF-1α，SDF-1α-DS的温育后的量（在上清液）和结合SDF-1α（粒料） -CS纳米颗粒在37℃下为不同的时间。重新印有许可9。
图6.剂量-反应的SDF-1α（圆）和SDF-1α纳米粒子（NP）（正方形）中的Jurkat细胞迁移实验。SDF-1α在免费和纳米粒子开往曲线毫秒表现出与0.55 EC 50值和0.45纳克/毫升的相同的活性，分别。重新印有许可9。
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Discussion
如上所述，在DS-CS纳米颗粒通过电荷中和聚阴离子（DS）和聚阳离子（CS）的分子之间形成。由于电荷相互作用的分子碰撞时容易发生时，聚合物溶液和搅拌速度的混合期间的浓度是对所产生的粒子的大小是至关重要的。一个总的趋势是，越来越稀释DS和CS的解决方案15和更高的搅拌速度导致更小的粒子。
所述SDF-1α聚糖纳米颗粒的制剂可以改变。例如，SDF-1α/ DS / CS在这个协议中所使用的量和比率0.08 / 0.33 / 1（毫克/毫克/毫克）表示。根据预期用途，SDF-1α纳米颗粒，这些比率可以改变。如果加入到混合物中的SDF-1α的量为0.04毫克（0.04 / 0.33 / 1，毫克/毫克/毫克）代替0.08毫克，颗粒会更小，〜650纳米，且SDF-1α包封率略微克reater，70-80％9。然而，当在体内递送，更大量的聚糖基质将是每SDF-1α存在。如果一个较小粒度是期望的，SDF-1α聚糖纳米颗粒的制剂可进一步修饰。一个替代方案是使用一个更小的分子量的壳聚糖，这表现在参考文献15。应当指出，然而，脱乙酰壳多糖具有用于内毒素具有高亲和性（带负电荷的脂多糖）;因此，内毒素水平的测试或潜在的纯化是必要的体内递送之前使用任何壳聚糖产品。第二种选择是要加载的SDF-1α上预先形成微小的DS-CS纳米颗粒。因为后者可以更容易地在粒子大小和SDF-1α操纵具有的DS具有高亲和性，装载量小的SDF-1α到DS-CS颗粒的外壳可导致更小的颗粒。
与其他类型的比较纳米颗粒（ 例如 ，PLGA 11，聚酐12或明胶13纳米），在DS-CS纳米颗粒具有特别的优点和局限性。在DS-CS纳米颗粒的主要优点是：1）粒子的制备不涉及有机溶剂或剧烈超声处理。中，因此，适合于蛋白质因子结合，作为平缓制剂减少蛋白质失活的可能性; 2）颗粒的矩阵具有类似的结构特性作为细胞外基质，这使得与组织环境相容的粒子和较少的毒性和炎症;和3）聚糖颗粒结合SDF-1α模仿蛋白和细胞外基质，这解释了被掺入聚糖颗粒后，SDF-1α的完整趋化活性之间的自然绑定关系。全活性的SDF-1α在颗粒结合形式允许它充当在组织E-静止归巢因子nvironment。在DS-CS纳米颗粒的限制是：1）颗粒的直径通常比上述粒子越大;和2）容易崩溃中的盐溶液，这可能不适合于直接注射入血液循环。
颗粒结合SDF-1α被发现是最小的纳米颗粒释放的七天孵育后。这种现象是与SDF-1α对肝素的高亲和力，这也有助于其在体内的功能。因为与肝素结合结构域的蛋白通常具有不同的亲和力的肝素，其释放速率很可能会有所不同。例如，在一个血管内皮生长因子165 -DS-CS纳米颗粒制备了类似的配方中，掺入的VEGF 165的44％被释放在第一个小时和29％，在37℃下温育14过程中释放，在未来47小时。因此，对于一个具体PROT的体外释放模式EIN需要被单独测试。
制备的SDF-1α-DS-CS纳米颗粒的目的是提供SDF-1α至肺和在组织中建立了干细胞归巢信号。所述颗粒还可被传递到其他组织为同样的目的，虽然不需要用于固体组织注入特定纳米颗粒的格式。该SDF-1α由DS在纳米颗粒基质稳定并最低限度地从颗粒中释放的事实支持干细胞募集的原则，并且颗粒预计将有利于组织再生。
由于蛋白聚糖纳米颗粒具有类似的矩阵，以该细胞表面糖胺聚糖和细胞外基质，它是可能的粒子 - 结合的蛋白质可以交换到这些矩阵（带负电荷的胞外基质分子可以与带正竞争结合体内电荷的蛋白质） 在体外表征的初始后进一步研究。
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Acknowledgments
HL671795，HL048743和HL108630：这项工作是由美国国立卫生研究院资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 | |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 | |
| SDF-1α | Prepared according to reference 8. | ||
| Syringe filter, PES membrane 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | |
| Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 | |
| Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 | |
| Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | ||
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 | |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 | |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 | |
| Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
References
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