Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

הכנה ואפיון של SDF-1α-Chitosan-Dextran סולפט חלקיקים

Published: January 22, 2015 doi: 10.3791/52323

Introduction

סולפט dextran (DS) וchitosan (CS) הם סוכרים עם מטען שלילי בין מספר קבוצות החליפו סולפט (בDS), או קבוצות האמינים טעונות חיובי (deacetylated CS). כאשר מעורב בתמיסה מימית, שני סוכרים יצירת קומפלקסי polyelectrolyte דרך אינטראקציות אלקטרוסטטיות. המתחמים וכתוצאה מכך עלולים ליצור אגרגטים גדולים שיהיה לשלב מופרדים מהתמיסה המימית (משקעים), או חלקיקים קטנים שמים מסיסים (קולואידים). התנאים הספציפיים שתורמים לתוצאות אלה נחקרו רבים, וכבר סיכמו ומאוירים בפירוט בביקורת האחרונה 1. בין תנאים אלה, שתי דרישות בסיסיות לייצור חלקיקים מסיסים מים חייבים 1) יש לי הפולימרים הטעונים ההפוך מסה טוחנת שונה באופן משמעותי; ו -2) להיות מעורב ביחס הלא stoichiometric. תנאים אלה יאפשר מגזרי פולימרי complexed תשלום ניטראלי שנוצרו על ידי תשלוםנטרול להפריד ויוצר את הליבה של החלקיקים, והפולימרים העודפים כדי ליצור את המעטפת החיצונית 1. חלקיקי הסוכרים שתוארו בפרוטוקול זה נועדו למסירת ריאתי, ונועדו להיות נקי טעונים שלילי, וממדי ננומטר. תשלום המשטח השלילי מפחית את הסבירות של ספיגה התאית של החלקיקים 2,3. חלקיקים של ממד ננומטר להקל על המעבר בדרך נשימת דיסטלי. כדי להשיג מטרה זו, הסכום של DS בשימוש בתכשיר זה הוא בעודף של CS (יחס משקל 3: 1); וגבוה מולקולרי משקל-DS (MW משקל הממוצע 500,000) ומשקל מולקולרי נמוך CS (טווח MW 50-190 kDa, 75-85% deacetylated) משמש.

SDF-1α הוא גורם ביות של תאי גזע, אשר מפעיל את פונקצית הביות באמצעות פעילות chemotactic. SDF-1α ממלאים תפקיד חשוב בביות ותחזוקה של תאי גזע hematopoietic במח העצם, ובגיוס של progeתאי nitor לרקמה ההיקפית ל4,5 תיקון פציעה. יש SDF-1α אתר מחייב הפרין ברצף החלבון שלה, המאפשר לחלבון להיקשר להפרין / הפאראן גופרתי, הדימרים צורה, להיות מוגן מפני פרוטאז (CD26 / DPPIV) איון, ואינטראקציה עם תאי מטרה באמצעות קולטנים בתא השטח 6-8. יש DS תכונות מבניות דומות להפרין / הפאראן גופרתי; כך, המחייב של SDF-1α לDS יהיה דומה לזה של ligands פולימרים הטבעי שלה.

בפרוטוקול הבא, אנו מתארים את ההכנה של ננו-חלקיקי SDF-1α-DS-CS. הנהלים מייצגים את אחד הניסוחים שנחקרו בעבר 9. הפרוטוקול מותאם במקור מחקירה של חלקיקי VEGF-DS-CS 10. הכנה בקנה מידה קטנה מתוארת, אשר ניתן לשנותם בקלות עם אותו פתרונות המניות ותנאי הכנה. לאחר הכנה, החלקיקים מאופיינים בy בחינת גודלם, פוטנציאל זטה, התאגדות SDF-1α מידה, במבחנה זמן שחרור, ופעילות של SDF-1α המשולבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת SDF-1α סוכרי חלקיקים

בשל צורך משלוח in vivo, לעקר את כל המכולות, טפטפות, וטיפים לשימוש בתכשיר.

  1. הכן את פתרונות המניות הבאות בultrapure מים: 1% סולפט dextran; 1 M NaOH (סטרילי מסונן עם קרום PES); chitosan 0.1% 0.2% בחומצה אצטית קרחונית (מסנן דרך 0.8 ו0.22 מיקרומטר מסננים ברציפות ולהתאים את ה- pH 5.5 עם NaOH לאחר מכן); 0.1 M 4 ZnSO; מניטול 15%; ו0.92 מ"ג / מיליליטר SDF-1α (מאוחסנים בaliquots על 80 מעלות צלזיוס, ושמרו על 4 מעלות צלזיוס מופשרים פעם אחת).
  2. לעקר פתרונות מניות באמצעות 0.22 מיקרומטר ממברנות סינון. להעריך את רמות רעלן פנימיות בפתרון מוכן עם assay lysate amebocyte Limulus קריש ג'ל (LAL). ודא שהרמות הן <0.06 איחוד אירופי / מיליליטר.
  3. להוסיף 0.18 מיליליטר מים ultrapure לבקבוקון זכוכית 1.5 מיליליטר מכיל בר ומערבבים מגנטי. קבע את המהירות ומערבבים ב 800 סל"ד. להוסיף 0.1 מיליליטר 1%סולפט וdextran מערבב במשך 2 דקות. להוסיף SDF-1α 0.08 מ"ג (0.087 מיליליטר של 0.92 מ"ג / מיליליטר SDF-1α פתרון) ומערבבים במשך 20 דקות.
  4. להוסיף 0.33 מיליליטר 0.1% dropwise chitosan ומערבבים במשך 5 דקות. מהירות שינוי ומערבבים עד למקסימום ולהוסיף 0.1 מיליליטר 0.1 M 4 ZnSO לאט עם מזרק 0.1 מיליליטר (מעל 1 דקות).
  5. לחזור במהירות ומערבבים עד 800 סל"ד ומערבבים למשך 30 דקות. להוסיף מניטול 0.4 מיליליטר של 15% ומערבבים במשך 5 דקות. מעביר את תערובת התגובה לצינור 1.5 מיליליטר microfuge. צנטריפוגה ב16,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    הערה: הנוכחות של מניטול מאפשרת resuspension של החלקיקים לאחר צנטריפוגה. בהתאם לקומפקטיות של גלולה, ריכוז מניטול יכול להיות מגוון בין 0% ל -5%. resuspension המלא של החלקיקים לאחר כל צנטריפוגה הוא קריטי כדי למנוע אגרגטים בהשעיה הסופית.
  6. לשאוב supernatant ולהשתמש פיפטה להסיר את הטיפה האחרונה של נוזל לאט. להוסיף מניטול 0.2 מיליליטר 5%. להשעות את גלולה עם 0.5 מיליליטר, לבית 29 Gמזרק DLE. להוסיף מניטול 1 מיליליטר של 5%. צנטריפוגה XG ב 16,000 במשך 15 דקות.
  7. חזור על שלב 1.6.
  8. לשאוב supernatant. Resuspend גלולה במניטול 0.2 מיליליטר 5%. אחסן את ההשעיה החלקיקים ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ההשעיה החלקיקים יכולה גם להיות מאוחסנת קפוא ב -80 ° C או lyophilized. מניטול 5% כולל בהשעיה הוא חיוני כדי למנוע הצטברות של החלקיקים לאחר ההקפאה והפשרה או אחרי lyophilization והתייבשות. מניטול ניתן להסיר על ידי צנטריפוגה של ההשעיה לאחר האחסון.

2. מדידה של גודל חלקיקים ופוטנציאל זטה

גודל החלקיקים ופוטנציאל זטה מנותחים על ידי פיזור אור דינמי ופיזור אור electrophoretic, בהתאמה, עם נתח של חלקיקים שצוין ברשימת חומר.

  1. להגדיר את הפרמטרים הבאים למדידת גודל חלקיקים: פעמים צבירה: 70; פעמים חוזרות: 4; טמפרטורה: 25 ° C;Diluent: מים; התאמת עוצמת: אוטומטי.
  2. לדלל את מדגם SDF-1α-DS-CS עם מים (דילול של פי 10). לטעון של המדגם לקובט UV חד פעמי 100 μl כגון קובט אפנדורף. הכנס את קובט לתוך מחזיק התא. חכה להתאמת עוצמת להגיע "אופטימום" (~ 10,000 CPS). התחל רכישת נתונים.
  3. לאחר המדידה תושלם, תרשום את תוצאות cumulants של קוטר (ננומטר) ומדד polydispersity. ממוצע התוצאות שהתקבלו מכל אחד 4 הקריאות החוזרות ולחשב את סטיית התקן.
  4. עומס 500 μl של מדגם חלקיקים בדילול של פי 10 לתא זרימה למדידת פוטנציאל זטה. להגדיר את הפרמטרים הבאים למדידה: פעמים צבירה: 10; פעמים חוזרות: 5; טמפרטורה: 25 ° C; Diluent: מים; התאמת עוצמת: אוטומטי. רשום את התוצאות של פוטנציאל זטה (mV). ממוצע התוצאות המתקבלות מכל אחד 5 קריאות חוזרות ונשנות, ולחשב את deviatio הסטנדרטיn.

3. כימות של SDF-1α בחלקיקים

  1. לדלל צורת SDF-1α חופשיות לריכוזים של 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 ומ"ג / מיליליטר במאגר מדגם 1.3x Laemmli. לדלל דגימות SDF-1α-DS-CS 6 μl עם 1.3x 40 μl חיץ מדגם Laemmli. (הכן את חיץ מניית 4x Laemmli מכיל 0.25 M טריס-HCl, pH 7.5, 8% SDS, גליצרול 40%, 0.05 מ"ג / 8% 2-mercaptoethanol מיליליטר bromophenol כחול, ו. מחלקים את פתרון המניות לתוך aliquots הקטן ולשמור ב -20 ° C לשימוש יחיד.)
  2. מחממים את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. מערבולת הדגימות פעמיים (כל אחד במשך 10 שניות במהירות המרבית) בזמן חימום 10 דקות על מנת לנתק את החלקיקים לחלוטין. לצנן את הדגימות לRT למשך 2 דקות. צנטריפוגה ב10,000 XG ל0.5-1 דקות כדי להפיל את עיבוי המים. מערבולת שוב לערבב היטב.
    הערה: בשלב זה, פתרון המדגם צריך להיות ברור שאין הווה משקע גלוי.
  3. טען 10 ו# 181; l מדגם / גם לג'ל SDS 4-20%. הפעל אלקטרופורזה ב 200 V עבור 20 דקות. כתם ג'ל עם כתם חלבון הכחול Coomassie.
  4. לבחון את צפיפות להקת חלבון של SDF-1α באמצעות תוכנת תרמי וניתוח צפיפות מולקולרית. לחשב את כמות SDF-1α בחלקיקים נגד עקומת סטנדרט נבנתה בסטנדרטים SDF-1α חופשיים.

4. במבחנת השחרור Assay

  1. לערבב חלקיקי סוכרי SDF-1α עם פוספט שנאגרו מלוח של Dulbecco ללא סידן ומגנזיום (D-PBS) בשעה 1: 1 (V / V).
  2. מחלקים את ההשעיה החלקיקים לתוך 0.05 aliquots מיליליטר ב 1.5 מיליליטר צינורות. טען את הדגימות לתחתית הצינורות. הימנע החדרת בועות אוויר או להפריע את פני השטח של הנוזל. לאטום את חלקו העליון של הצינורות עם Parafilm.
    הערה: בכך, הנוזל יישאר בתחתית בסיבוב העליון לתחתון שלאחר מכן על מיקסר הצינור.
  3. סובב את הצינורות על 37 ו# 176; C במיקסר מיקרו-Tube סיבוב. הסר aliquots מהצינורות במועדים המיועדים צנטריפוגות מייד הדגימות ב16,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  4. הפרד את supernatants וכדורים, ולשקם את הכדור עם 0.05 מיליליטר D-PBS. אחסן את הדגימות ב -20 ° C. אחרי הכל הדגימות שנאספו, לבחון את supernatants וכדוריות על ג'ל SDS כפי שתואר לעיל.

5. ההגירה Assay

assay זה מודד את פעילות chemotactic של SDF-1α. אינטראקציה של SDF-1α עם קולטה (CXCR4) על פני התא גורמת להגירה של התא לכיוון שיפוע SDF-1α. ב assay זה, התאים נטענים לתוך היטב עליון (מופרד על ידי קרום semipermeable מנמוך גם) פתרון וSDF-1α לנמוכים גם.

  1. לדלל SDF-1α (חינם או בצורה מאוגדת חלקיק) עם חיץ הגירה (בינוני RPMI-1640 המכילים 0.5% אלבומין בסרום שור) ב3-FOדילול סדרתי ld לריכוזים סופיים של 100, 33, 11, 3.7, 1.2, 0.41, 0.14, 0.05 וng / ml.
  2. להוסיף 0.6 מיליליטר של פתרון SDF-1α המדולל או חיץ הגירה (בקרה שלילית) רק כדי גם בצלחת 24 גם. הוסף חוצץ הגירה 0.57 מ"ל לטוב (שליטת תא קלט). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הנח להכניס את תרבות תא חדירה כגון Transwell (גודל נקבובית 5 מיקרומטר, בקוטר 6.5 מ"מ) על גבי נמוך גם. טען 0.1 מיליליטר תאי Jurkat (5 × 10 5) לTranswell להכניס. לטעון 0.03 מיליליטר תאים ישירות לשליטת תא הקלט היטב. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 ב5% CO 2 באינקובטור.
  3. הסר את מוסיף Transwell. העבר את התאים שהגרו לבארות התחתונות לצינור קלקר 4 מיליליטר. ספירת התאים נדדו עם cytometer זרימה.
  4. לחשב הגירה כאחוז ממספר תאי קלט (מספר תאים בשליטת תא הקלט היטב x 100/30) לאחר החיסור של המספרים בnegative פקדים (תאים היגרו לבארות המכילות מאגר הגירה בלבד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פוטנציאל הגודל וzeta של חלקיקי SDF-1α-DS-CS מוכנים נקבעים עם מנתח חלקיקים. איור 1 מציג את הניתוח של מדידת הגודל. מהתוצאות שהתקבלו מcumulants ארבע מדידות חוזרות, הקוטר הידרודינמית הממוצע של חלקיקי SDF-1α-DS-CS הוא 661 ± 8.2 (ננומטר) וpolydispersity הוא 0.23 ± 0.02. התוצאה של מדידת פוטנציאל זטה מוצגת באיור 2. מחמש מדידות חוזרות, פוטנציאל זטה של חלקיקי SDF-1α-DS-CS הוא -24.8 ± 0.5 mV. כפי שצוין לעיל, הנוכחות של מניטול 5% בהשעית חלקיקי SDF-1α-DS-CS היא חיונית למניעה של הצטברות של חלקיקים בתהליך הקפאה והפשרה. איור 3 מציגה את מדידת הגודל של החלקיקים המרחפים במים וקפוא ב -80 ° C. שיא צבירה שונה גלוי לאחר הפשרה.

AmoUNT של SDF-1α בחלקיקי SDF-1α-DS-CS מוערך על ידי ג'ל אלקטרופורזה SDS. איור 4 א תערוכות ג'ל Coomassie המוכתם כחול SDS עם סטנדרטים SDF-1α, ננו-חלקיקי DS-CS (חלקיקי שליטה ללא התאגדות SDF-1α , Ctrl NP) וננו-חלקיקי SDF-1α-DS-CS (SDF-1α NP) דגימות טעונות. עקומה סטנדרטית בנויה מניתוח הצפיפות של להקות SDF-1α סטנדרטיים (איור 4). חישוב מהעקומה סטנדרטית מצביע על כך שריכוז SDF-1α במדגם NP SDF-1α הוא 0.03 מ"ג / מיליליטר (ממוצע של כפול). מאז הדילול של המדגם עם חיץ המדגם הוא (6 + 40) / 6, ריכוז המדגם המקורי הוא 0.23 מ"ג / מיליליטר. כנפח הסופי של הכנת החלקיקים הוא 0.2 מיליליטר, SDF-1α כוללים בהשעיה הסופית הוא 0.046 מ"ג. בהתחשב במסת הקלט של SDF-1α בתערובת התגובה היא 0.08 מ"ג, יעילות המלכוד של SDF-1α בחלקיקי DS-CS הוא 57%. פִּתקָהOsan כבר דווח בעבר להכתים עם Coomassie הכחול. הצביעה, לעומת זאת, אינה משמעותית בג'ל שמוצג באיור 4 א. הוא, אולי, קשור לכמות chitosan (מטריצת חלקיקים) הטעון על הג'ל. בכל מקרה, ניתוק מוחלט והפרדה של SDF-1α ממטריצת החלקיקים הוא הכרחי עבור במדויק הערכת כמות החלבון המשולב. ג'ל זה גם מראה שSDF-1α לא מושפל במובחן, על ידי חימום ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות או על ידי תהליך המערבולת, כמו שאף להקות נמצאות בין להקת חלבון SDF-1α וחזית הצבע.

במבחנה שיעור שחרורו של SDF-1α מהחלקיקים נקבע על ידי דגירה של החלקיקים ב- 50% D-PBS על 37 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים. ב0 שעה, 3 שעות, 8 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 7 ימים, aliquots של הדגימות יוסרו ומייד centrifuged. SDF-1α שוחררו (בsupernatant) מופרד מSD-מחויב החלקיקיםF-1α (גלולה). הדגימות מנוהלות על ג'ל SDS, והסכום של SDF-1α בsupernatants וכדוריות נקבעות על ידי צביעת Coomassie וניתוח צפיפות. ג'ל SDS אופייני לניתוח מוצג באיור 5. כפי שהודגם, SDF-1α מחויבות החלקיק הוא שוחרר מינימאלי לאחר דגירה 7 ימים.

הפעילות של SDF-1α נכנסים החלקיקים נמדדה על ידי assay הגירה (assay chemotactic), ובהשוואה לזה של SDF-1α חופשיים. ב assay זה, SDF-1α בחלקיקי DS-CS הוא בדילול סדרתי עם חיץ הגירה, וטופחו עם תאי Jurkat עבור שעה 2. התאים נדדו נספרים עם cytometer זרימה. נתונים (עם ריכוזי SDF-1α של .05-11 ng ​​/ ml) הם זממו עם רגרסיה לא-ליניארי מתאים, וEC 50 מחושב. כפי שניתן לראות באיור 6, SDF-1α נכנסים החלקיקים מושרה באותה המידה של הגירה לזה של SDF-1 חינם ^5; בכל הריכוזים שנמדדו. EC 50 הערכים של הצורות חופשיות וכרוך חלקיקים של SDF-1α הם 0.55 ו0.45 ng / ml, בהתאמה.

איור 1
איור 1. מסך ניתוח ירה מראה מדידת פיזור אור דינמית של גודל חלקיקים. שני פנלים העליונים להראות חלקות של פונקצית autocorrelation, G2 (τ), ולוגריתם של [G2 (τ) -1] לאורך הזמן. מעבד האותות הדיגיטליים של המכשיר (קורלטור) מבטא את עוצמת האור שזוהתה כפונקציה של זמן השהיה (τ). העלילה מראה כי חלקיקי SDF-1α-DS-CS גרמו דעיכה מעריכית של העצמה בין .2-2 msec. כדי להשיג את קבוע הדעיכה הממוצעת <Γ> , תכנית מנתחת את Ln [G2 (τ) -1] עלילה עם cumulants ההולם. מקדם הסדר הראשון של דהמשוואת פולינום מבותקת מוקצה ל< Γ> , באופן פרופורציונלי לשיפוע העקום. מקדם סדר השני מחולק בריבוע של <Γ> הוא מדד polydispersity, המתאר את רוחב חלוקת עוצמת. מ< Γ> מקדם הדיפוזיה הממוצע (<D> ) וקוטר חלקיקים (ד) מחושב כ: Γ = D · q ו- D = k B T / 3πη 0 ד (משוואת סטוק-איינשטיין). שני פנלי האמצע להראות התנודות של קריאת הגודל במהלך מדידות הצטברות 70, והתפלגות הגודל מחושבת ביחס לעוצמת במדידה. Cumulants הקוטר ומדד polydispersity מוצגים בחלק התחתון של המסך.

איור 2
2. מסך ניתוח הדמות ירה מראה פיזור אור electrophoreticמדידה של פוטנציאל זטה חלקיקים. הפנל העליון מראה G2 (τ) על עלילת זמן. פונקצית נדנוד מתפוררת בהדרגה הוא ציין בדרך כלל בחלקיקים טעונים שחשופים לאלקטרופורזה ופיזור אור. הפונקציה משקפת את שינוי התדר (היסט דופלר) הנגרם על ידי החלקיקים שנעים בשדה החשמלי. שינוי פורייה של G2 (τ) נותן את ספקטרום הכח (עוצמה לעומת עלילת תדר) מוצג בפנל באמצע. מרכז שיא שינוי התדר מגדיר את הניידות של החלקיקים, שממנו פוטנציאל זטה מחושב. פוטנציאל זטה מחושב מוצג בחלק התחתון של המסך.

איור 3
מדידת איור 3. חלקיקים בגודל של SDF-1 חלקיקי α-DS-CS לאחר ההקפאה והפשרה במים. בהיעדר מניטול, החלקיקים יוצרים aggregates לאחר הקפאה והפשרה. שים לב להיווצרות של עוצמה / שיא גודל נוסף והגידול בקוטר cumulants וpolydispersity בהשוואה לזה של איור 1.

איור 4
צילום איור 4. כימות התאגדות SDF-1 α בחלקיקי DS-CS. (א) לג'ל SDS הצבעוני Coomassie עמוס סטנדרטים SDF-1α חופשיים, ננו-חלקיקי DS-CS (Ctrl NP), וSDF-1α-DS- ננו-חלקיקי CS (SDF-1α NP) דגימות כפי שצוין. להקות חלבון SDF-1α וחזית צבע ג'ל ריצה מסומנות. דגימות Ctrl NP אינן מוכתמות בCoomassie הכחול ולהקות chitosan (הרחבה) הן בקושי היה ניתן לראות. (ב) הלהקות מנותחות עם densitometer, שממנו העקומה סטנדרטית בנויה בסטנדרטים SDF-1α חופשיים (ממוצע של duplicate). הסכום של SDF-1α בחלקיקים מחושב נגד העקומה סטנדרטית, אשר נותנת ערך ממוצע של 0.3 מיקרוגרם / טוב (10 μl).

איור 5
איור 5. ג'ל SDS מראה SDF-1 α במבחנה כמובן זמן שחרור. Coomassie המוכתם ג'ל SDS מציג את כמות SDF-1α שוחררו (בsupernatants) וSDF-1α כבול (בכדורים) לאחר הדגירה של SDF-1α-DS חלקיקי -CS על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופות זמן שונות. הודפס מחדש באישור 9.

איור 6
6. מנה תגובה עקום איור של α SDF-1 (עיגולים) וננו-חלקיקי SDF-1α (NP) (ריבועים) בassay נדידת תאי Jurkat. SDF-1α בשני חופשי וננו-חלקיקים קשורים לms הציג את אותה פעילות עם EC 50 ערכים של 0.55 ו0.45 ng / ml, בהתאמה. הודפס מחדש באישור 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כפי שצוין לעיל, נוצרים חלקיקי DS-CS באמצעות נטרול מטען בין polyanion (DS) וpolycation מולקולות (CS). מאז האינטראקציה תשלום מתרחשת בקלות במהלך ההתנגשות המולקולרית, הריכוז של פתרונות הפולימר ומהירות ערבוב במהלך הערבוב הוא קריטי לגודל של החלקיקים שנוצר. מגמה כללית היא שיותר מדוללת פתרונות DS וCS 15 ותוצאת מהירות ערבוב גבוהה יותר בחלקיקים קטנים יותר.

גיבוש חלקיקי סוכרי SDF-1α יכול להיות מגוון. לדוגמא, בסכומים וביחסים של SDF-1α / DS / CS שימוש בפרוטוקול זה הם 0.08 / 0.33 / 1 (מ"ג / מ"ג / מ"ג), בהתאמה. בהתאם לשימוש המיועד של חלקיקי SDF-1α, יחסים אלו יכולים לשנות. אם כמות SDF-1α הוסיפה לתערובת הוא 0.04 מ"ג (0.04 / 0.33 / 1, מ"ג / מ"ג / מ"ג) במקום 0.08 מ"ג, החלקיקים יהיו קטנים יותר, ~ 650 ננומטר, ואת יעילות מלכוד SDF-1α מעט greater, 70-80% 9. עם זאת, כאשר נמסרו in vivo, כמות גדולה יותר של מטריצת הסוכרים תהיה נוכחת לSDF-1α. אם גודל חלקיקים קטן יותר הוא רצוי, הניסוח של חלקיקי סוכרי SDF-1α יכול להיות שונה יותר. חלופה אחת היא להשתמש chitosan משקל מולקולרי קטן יותר, כפי שהודגם ב- 15 Ref. יש לציין, עם זאת, יש chitosan שזיקה גבוהה לרעלן פנימי (מטען שלילי lipopolysaccharides); כך, בדיקה של רמת רעלן פנימית או פוטנציאל טיהור היא הכרחית לשימוש בכל מוצרי chitosan לפני מסירת in vivo. החלופה השנייה היא לטעון SDF-1α על חלקיקי DS-CS מראש יצרו קטנים. מאז ניתן להשפיע האחרון יותר בקלות בגודל חלקיקים וSDF-1α זיקה גבוהה לDS, טעינת כמות קטנה של SDF-1α למעטפת החיצונית של חלקיקי DS-CS יכול לגרום לחלקיקים קטנים יותר.

בהשוואה לסוגים אחרים שלחלקיקים (למשל, 11 PLGA, polyanhydride 12, או ג'לטין 13 חלקיקים), יש לי חלקיקי DS-CS יתרונות ומגבלות מסוימים. יתרונותיו העיקריים של חלקיקי DS-CS הם: 1) הכנת החלקיקים אינה כרוכה בממסים אורגניים או sonication הנמרץ. זהו, אם כן, מתאים להתאגדות גורם חלבון, כהכנה עדינה מפחיתה את הסבירות של איון חלבון; 2) המטריצה ​​של החלקיקים יש רכוש מבני דומה למטריצת חוץ-תאית, מה שהופך את החלקיקים בקנה אחד עם סביבת רקמות והוא פחות רעיל ודלקתי; ו 3) מחקה SDF-1α נכנסים חלקיקים סוכרי יחסים מחייבים טבעיים בין החלבון וחוץ-התאי, מה שמסביר את פעילות chemotactic המלאה של SDF-1α לאחר ששולב בחלקיקי הסוכרים. SDF-1α הפעילים באופן מלא בצורה מאוגדת החלקיקים מאפשר לו לשמש כגורם ביות נייח בדואר רקמהnvironment. המגבלות של חלקיקי DS-CS הן: 1) בקטרים ​​של החלקיקים הם בדרך כלל גדולים יותר מהחלקיקים שהוזכרו לעיל; ו 2) בקלות לקרוס בפתרונות מלח, אשר לא יכול להיות מתאימה להזרקה ישירה לתוך מחזור דם.

SDF-1α נכנסים החלקיק נמצאים להשתחרר מינימאלי מהחלקיקים לאחר דגירה של שבעה ימים. תופעה זו קשורה לזיקה הגבוהה של SDF-1α להפרין, אשר תורמת גם לתפקודו in vivo. מאז חלבונים עם תחומים מחייבים הפרין בדרך כלל זיקות שונות להפרין, שיעורי שחרורם צפויים להיות שונים. לדוגמא, בVEGF 165 ננו-חלקיקי -DS-CS נערכו בניסוח דומה, 44% מVEGF התאגד 165 שוחרר בשעה הראשונה ו -29% שוחרר בשעה 47 הבאה במהלך דגירה על 37 מעלות צלזיוס 14. לכן, דפוס שחרור במבחנה לprot ספציפיein צריך להיבדק לגופו.

המטרה של הכנת ננו-חלקיקי SDF-1α-DS-CS היא לספק SDF-1α לריאות ולהקים אות ביות של תאי גזע ברקמות. החלקיקים יכולים גם להיות מועברים לרקמות אחרות לאותה מטרה, למרות שפורמט ננו-חלקיקים מסוימים אינו נדרש להזרקת רקמה מוצקה. העובדה שSDF-1α הוא התייצב על ידי DS במטריצת ננו-החלקיקים והוא שוחררו מינימאלי מהחלקיקים תומכת נובעת עקרונות גיוס תא, והחלקיקים צפוי להיות מועיל לשחזור רקמות.

מאז יש לי חלקיקי החלבון-סוכרי מטריצה ​​דומה לזה של glycosaminoglycans פני תא וחוץ-תאי, זה אפשרי, כי החלבונים שולבו חלקיקים ניתן להחליף למטריצות אלה (מולקולות חוץ-התאיות טעונות השלילי יכולות להתחרות עם עקידת חיובית חלבון טעון) in vivo באפיון חוץ גופית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH: HL671795, HL048743, וHL108630.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran sulfate Fisher BP1585-100
Chitosan, low molecular weight  Sigma 448869
Zinc sulfate heptahydrate Sigma 204986
D-Mannitol Sigma M9546
UltraPure water  Invitrogen  10977-023
SDF-1α Prepared according to reference 8.
Syringe filter, PES membrane 0.22 μm Millipore SLGP033RS
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) Fisher  14-513-63
Glass vial Kit; SUN-SRi Fisher  14-823-182
Delsa Nano C Particle Analyzer  Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets Eppendorf 952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel Bio-Rad 456-1096
GelCode Blue Safe Protein Stain Fisher  PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System BioRad 170-8640
Corning Transwell Permeable Supports Corning 3421
Accuri C6 Flow Cytometer BD Biosciences
Dulbecco’s phosphate buffered saline  Sigma D8537
Pyrogent plus kit Fisher NC9753738

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
  2. Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).
  3. Yue, Z. G., et al. Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).
  4. Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).
  5. Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).
  6. Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex. J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).
  7. Amara, A., et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).
  8. Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).
  9. Yin, T., et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).
  10. Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).
  11. McCall, R. L., Sirianni, R. W. PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS. J Vis Exp. (82), 51015 (2013).
  12. Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles. J Vis Exp. (65), 3967 (2012).
  13. Xu, J., Amiji, M. Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles. J Vis Exp. (59), e3612 (2012).
  14. Lauten, E. H., et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).
  15. Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes. Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).

Tags

כימיה גיליון 95 סולפט Dextran chitosan SDF-1α סוכרים, ננו-חלקיקים מורכב polyelectrolyte
הכנה ואפיון של SDF-1α-Chitosan-Dextran סולפט חלקיקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bader, A. R., Li, T., Wang, W.,More

Bader, A. R., Li, T., Wang, W., Kohane, D. S., Loscalzo, J., Zhang, Y. Y. Preparation and Characterization of SDF-1α-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles. J. Vis. Exp. (95), e52323, doi:10.3791/52323 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter