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Chemistry

एसडीएफ-1α-Chitosan-dextran सल्फेट नैनोकणों की तैयारी और विशेषता

Published: January 22, 2015 doi: 10.3791/52323
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1
1Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, 2Laboratory for Biomaterials and Drug Delivery, Department of Anesthesiology, Division of Critical Care, Boston Children's Hospital

Introduction

Dextran सल्फेट (डी एस) और chitosan (सीएस) (डी एस में) एकाधिक एवजी नकारात्मक आरोप लगाया सल्फेट समूहों के साथ polysaccharides, या सकारात्मक आरोप लगाया एमाइन समूह हैं (सीएस deacetylated)। एक जलीय घोल में मिलाया है, जब दो polysaccharides electrostatic बातचीत के माध्यम से polyelectrolyte परिसरों के रूप में। जिसके परिणामस्वरूप परिसरों जलीय घोल (अवक्षेप) से चरण-अलग हो जाएगा कि बड़े समुच्चय, या पानी dispersible (कोलाइड) कर रहे हैं कि छोटे कणों फार्म कर सकते हैं। इन परिणामों के लिए योगदान है कि विशेष परिस्थितियों में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, और हाल ही में एक समीक्षा एक में संक्षेप और विस्तार में सचित्र किया गया है। इन स्थितियों के बीच, पानी dispersible कणों का निर्माण करने के लिए दो बुनियादी आवश्यकताओं oppositely आरोप लगाया पॉलिमर 1) काफी अलग दाढ़ बड़े पैमाने पर होगा रहे हैं; और 2) एक गैर stoichiometric अनुपात में मिलाया जा। इन स्थितियों के प्रभारी द्वारा उत्पन्न आरोप तटस्थ complexed बहुलक खंडों की अनुमति देगानिराकरण अलग और कण के मूल रूप में, और अतिरिक्त बहुलक बाहरी कवच एक फार्म करने के लिए। इस प्रोटोकॉल में वर्णित glycan कणों फेफड़े के वितरण के लिए इरादा कर रहे हैं, और नकारात्मक आरोप लगाया शुद्ध होने के लिए तैयार कर रहे हैं, और नैनोमीटर आयामों की। नकारात्मक सतह चार्ज कणों 2,3 के सेलुलर तेज करने की संभावना को कम कर देता है। नैनोमीटर आयाम के कण बाहर का एयरवेज के माध्यम से पारित होने की सुविधा। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, इस तैयारी में इस्तेमाल डी एस की राशि सीएस से अधिक है (वजन अनुपात 3: 1); और उच्च आणविक वजन डी एस (वजन औसत से मेगावाट 500,000) और कम आणविक वजन सीएस (मेगावाट सीमा 50-190 केडीए, 75-85% deacetylated) का इस्तेमाल किया जाता है।

एसडीएफ-1α अपने chemotactic गतिविधि के माध्यम से घर वापस आना समारोह डाल रही है जो एक स्टेम सेल घर वापस आना कारक है। एसडीएफ-1α घर वापस आना और अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और proge की भर्ती मेंचोट की मरम्मत 4,5 के लिए परिधीय ऊतकों को nitor कोशिकाओं। एसडीएफ-1α प्रोटीन प्रोटीज (CD26 / DPPIV) निष्क्रियता से संरक्षित किया जाना, हेपरिन / heparan सल्फेट, फार्म dimers करने के लिए बाध्य है, और कोशिका की सतह रिसेप्टर्स के माध्यम से लक्ष्य कोशिकाओं के साथ बातचीत करने की अनुमति देता है जो अपने प्रोटीन अनुक्रम में एक हेपरिन-बाइंडिंग साइट है 6-8। डी एस हेपरिन / heparan सल्फेट के रूप में इसी तरह के संरचनात्मक गुण है; इस प्रकार, डी एस के लिए एसडीएफ-1α के बंधन अपनी प्राकृतिक बहुलक ligands के समान होगा।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम एसडीएफ-1α-डी एस सी एस नैनोकणों की तैयारी का वर्णन है। प्रक्रियाओं 9 पहले अध्ययन किया गया है कि योगों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रोटोकॉल मूल वीईजीएफ़-डी एस सी एस नैनोकणों 10 की एक जांच से अनुकूलित है। एक छोटे पैमाने पर तैयारी आसानी से एक ही शेयर समाधान और तैयारी शर्तों के साथ बढ़ाया जा सकता है, जो वर्णन किया गया है। तैयारी के बाद, कण ख विशेषता हैY उनके आकार, जीटा संभावित, एसडीएफ-1α समावेश की हद तक, इन विट्रो रिलीज के समय, और शामिल एसडीएफ-1α की गतिविधि की जांच।

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Protocol

एसडीएफ-1α glycan नैनोकणों के 1. तैयारी

Vivo में प्रसव के प्रयोजन के कारण, तैयारी में इस्तेमाल सभी कंटेनर, pipettes, और सुझावों बाँझ।

  1. Ultrapure पानी में निम्नलिखित स्टॉक समाधान तैयार: 1% dextran सल्फेट; 1 एम NaOH (एक पी इ एस झिल्ली के साथ फ़िल्टर्ड बाँझ); 0.1% (लगातार 0.8 और 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर और बाद में NaOH के साथ 5.5 पीएच को समायोजित) में 0.2% हिमनदों एसिटिक एसिड में chitosan; 0.1 एम ZnSO 4; 15% mannitol; और 0.92 मिलीग्राम / एमएल एसडीएफ-1α (80 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में संग्रहीत है, और 4 डिग्री पर रखा एक बार thawed ग)।
  2. 0.22 माइक्रोन फिल्टर झिल्ली के माध्यम से शेयर समाधान जीवाणुरहित। Limulus amebocyte lysate (लाल) जेल थक्का परख के साथ तैयार समाधान में अन्तर्जीवविष के स्तर का आकलन करें। स्तरों <0.06 यूरोपीय संघ / मिलीलीटर हैं सुनिश्चित करें।
  3. एक चुंबकीय हलचल पट्टी युक्त एक 1.5 मिलीलीटर कांच की शीशी को 0.18 मिलीलीटर ultrapure पानी जोड़ें। 800 rpm पर हलचल गति सेट करें। 0.1 मिलीलीटर 1% जोड़ेंdextran सल्फेट और 2 मिनट के लिए हलचल। 0.08 मिलीग्राम एसडीएफ-1α (0.92 मिलीग्राम की 0.087 मिलीग्राम / एमएल एसडीएफ-1α समाधान) जोड़ें और 20 मिनट के लिए हलचल।
  4. 0.33 मिलीलीटर 0.1% chitosan के dropwise जोड़ें और 5 मिनट के लिए हलचल। बदले हलचल अधिकतम गति और (1 मिनट से अधिक) एक 0.1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ धीरे-धीरे 0.1 मिलीलीटर 0.1 एम ZnSO 4 जोड़ें।
  5. 800 आरपीएम के लिए हलचल गति लौटें और 30 मिनट के लिए हलचल। 0.4 मिलीलीटर 15% mannitol जोड़ें और 5 मिनट के लिए हलचल। एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण स्थानांतरण। 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
    नोट: mannitol की उपस्थिति centrifugation के बाद कणों के मेजबान की सुविधा। गोली के compactness पर निर्भर करता है, mannitol एकाग्रता 0% से 5% करने के लिए अलग किया जा सकता है। प्रत्येक centrifugation के बाद कणों की पूरी मेजबान अंतिम निलंबन में समुच्चय से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
  6. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और धीरे धीरे तरल की आखिरी बूंद को दूर करने के लिए एक विंदुक का उपयोग करें। 0.2 मिलीलीटर 5% mannitol जोड़ें। एक 0.5 मिलीलीटर के साथ गोली निलंबित, 29 जी neeDLE सिरिंज। 1 मिलीलीटर 5% mannitol जोड़ें। 15 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  7. दोहराएँ कदम 1.6।
  8. सतह पर तैरनेवाला aspirate। 0.2 मिलीलीटर 5% mannitol में गोली resuspend। 4 डिग्री सेल्सियस पर कण निलंबन स्टोर।
    नोट: कण निलंबन भी संग्रहीत -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए या lyophilized जा सकता है। निलंबन में सहित 5% mannitol ठंड और विगलन के बाद या lyophilization और पुनर्जलीकरण के बाद कणों के एकत्रीकरण को रोकने के लिए आवश्यक है। Mannitol भंडारण के बाद निलंबन की centrifugation द्वारा हटाया जा सकता है।

कण आकार और जीटा संभावित 2. मापन

कण आकार और जीटा संभावित सामग्री की सूची में दर्शाए गए एक कण विश्लेषक के साथ क्रमश: गतिशील प्रकाश बिखरने और electrophoretic प्रकाश बिखरने द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं।

  1. संचय टाइम्स: निम्नलिखित कण आकार माप के लिए मानकों सेट 70; दोहराएँ टाइम्स: 4; तापमान: 25 डिग्री सेल्सियस;मंदक: पानी; तीव्रता समायोजन: ऑटो।
  2. पानी (10 गुना कमजोर पड़ने) के साथ एसडीएफ-1α-डी एस सी एस नमूना पतला। इस तरह के एक Eppendorf क्युवेट के रूप में एक डिस्पोजेबल यूवी क्युवेट के लिए नमूने के 100 μl लोड। सेल धारक में क्युवेट डालें। "इष्टतम" (~ 10,000 सीपीएस) तक पहुँचने के लिए तीव्रता समायोजन के लिए प्रतीक्षा करें। डाटा अधिग्रहण शुरू करो।
  3. माप के बाद, पूरा व्यास (एनएम) और polydispersity सूचकांक के cumulants परिणाम रिकॉर्ड। चार दोहराया रीडिंग में से प्रत्येक से प्राप्त परिणामों के औसत और मानक विचलन की गणना।
  4. लोड जीटा संभावित माप के लिए एक प्रवाह सेल करने के लिए 10 गुना पतला कण नमूना के 500 μl। संचय टाइम्स: निम्नलिखित माप के लिए मानकों सेट 10; दोहराएँ टाइम्स: 5; तापमान: 25 डिग्री सेल्सियस; मंदक: पानी; तीव्रता समायोजन: ऑटो। जीटा संभावित (एम वी) के परिणामों का रिकॉर्ड। 5 दोहराया रीडिंग में से प्रत्येक से प्राप्त परिणाम औसत है, और मानक deviatio गणनाएन।

कणों में एसडीएफ-1α 3. मात्रा

  1. 1.3x Laemmli नमूना बफर में 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, और 0.05 मिलीग्राम / एमएल की सांद्रता के लिए नि: शुल्क फार्म एसडीएफ-1α पतला। 40 μl 1.3x Laemmli नमूना बफर के साथ 6 μl एसडीएफ-1α-डी एस सी एस नमूने पतला। (फूट डालो। छोटे aliquots में शेयर समाधान 0.25 एम Tris-एचसीएल, पीएच 7.5, 8% एसडीएस, 40% ग्लिसरॉल, 0.05 मिलीग्राम / नीले bromophenol, और एमएल 8% 2-मर्केप्टोइथेनाल युक्त 4x Laemmli स्टॉक बफर तैयार है और -20 में रखना एकल उपयोग के लिए सी °।)
  2. 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर नमूने हीट। भंवर पूरी तरह से कणों को अलग कर देना करने के क्रम में 10 मिनट हीटिंग समय के दौरान दो बार नमूने (अधिकतम गति पर 10 सेकंड के लिए प्रत्येक)। 2 मिनट के लिए आरटी के लिए नमूने शांत हो जाओ। 0.5-1 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र पानी घनीभूत नीचे लाने के लिए। भंवर फिर मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए।
    नोट: इस बिंदु पर, नमूना समाधान नहीं दिखाई वेग वर्तमान के साथ स्पष्ट किया जाना चाहिए।
  3. लोड 10 &# 181; एल नमूना / अच्छी तरह से करने के लिए एक 4-20% एसडीएस जेल। 20 मिनट के लिए 200 वी पर वैद्युतकणसंचलन चलाएँ। Coomassie नीले प्रोटीन दाग के साथ जेल दाग।
  4. एक आणविक इमेजर और densitometry विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग एसडीएफ-1α के प्रोटीन बैंड घनत्व जांच करते हैं। मुक्त एसडीएफ-1α मानकों के साथ निर्माण के लिए एक मानक वक्र के खिलाफ कणों में एसडीएफ-1α की मात्रा की गणना।

इन विट्रो रिलीज परख में 4.

  1. एक एक पर कैल्शियम और मैग्नीशियम (डी पीबीएस) के बिना है Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा साथ एसडीएफ-1α glycan कणों मिक्स: 1 अनुपात (वी / वी)।
  2. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 0.05 मिलीलीटर aliquots में कण निलंबन फूट डालो। ट्यूबों के नीचे करने के लिए नमूने लोड। हवाई बुलबुले शुरू करने या तरल की सतह को परेशान करने से बचें। Parafilm के साथ ट्यूबों के शीर्ष सील।
    नोट: ऐसा करने में, तरल ट्यूब मिक्सर पर बाद में ऊपर से नीचे रोटेशन के दौरान तल पर बने रहेंगे।
  3. 37 और ट्यूबों घुमाएँ# 176; सी एक घूर्णन माइक्रो-ट्यूब मिक्सर पर। नामित समय पर ट्यूब से aliquots निकालें और तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र।
  4. Supernatants और छर्रों को अलग, और 0.05 मिलीग्राम डी पीबीएस के साथ गोली पुनर्गठित। -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान। सभी के नमूने एकत्र कर रहे हैं के बाद से ऊपर वर्णित के रूप में, एक एसडीएस जेल पर supernatants और छर्रों की जांच।

5. प्रवासन परख

यह परख एसडीएफ-1α के chemotactic गतिविधि के उपाय। कोशिका की सतह पर अपने रिसेप्टर (CXCR4) के साथ एसडीएफ-1α की बातचीत एसडीएफ-1α ढाल की ओर सेल के पलायन का कारण बनता है। इस परख में, कोशिकाओं कम अच्छी तरह से एक में और एसडीएफ-1α समाधान (एक कम अच्छी तरह से एक semipermeable झिल्ली से विभाजित) एक ऊपरी कुएं में लोड कर रहे हैं।

  1. एसडीएफ-1α पतला (मुक्त या कण-बाउंड प्रपत्र) के एक 3 एफओ में प्रवास बफर (0.5% गोजातीय सीरम albumin युक्त RPMI-1640 मध्यम) के साथ100, 33, 11, 3.7, 1.2, 0.41, 0.14, और 0.05 एनजी / एमएल के अंतिम सांद्रता के एलडी धारावाहिक कमजोर पड़ने।
  2. 24 अच्छी तरह से थाली में एक अच्छी तरह से करने के लिए पतला एसडीएफ-1α समाधान या प्रवास बफर केवल (नकारात्मक नियंत्रण) के 0.6 मिलीलीटर जोड़ें। एक अच्छी तरह से (इनपुट सेल नियंत्रण) के लिए 0.57 मिलीलीटर प्रवास बफर जोड़ें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। ऐसे कम अच्छी तरह से की चोटी पर Transwell (ताकना आकार 5 माइक्रोन, व्यास 6.5 मिमी) के रूप में एक पारगम्य सेल संस्कृति डालने रखें। Transwell में 0.1 मिलीलीटर Jurkat कोशिकाओं (5 × 10 5) सम्मिलित लोड करें। अच्छी तरह से इनपुट सेल नियंत्रण के लिए सीधे 0.03 मिलीलीटर कोशिकाओं को लोड करें। एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
  3. Transwell आवेषण निकालें। 4 एमएल polystyrene ट्यूब को कम कुओं के लिए चले गए हैं कि कोशिकाओं स्थानांतरण। एक प्रवाह कोशिकामापी के साथ चले कोशिकाओं की गणना।
  4. Negat की संख्या में घटाव के बाद इनपुट सेल नंबर (अच्छी तरह से 100/30 एक्स इनपुट सेल नियंत्रण में सेल नंबर) के एक प्रतिशत के रूप में प्रवास की गणनानियंत्रण (केवल माइग्रेशन बफर युक्त कुओं के लिए चले कोशिकाओं) ive।

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Representative Results

तैयार एसडीएफ-1α-डी एस सी एस कणों का आकार और जीटा संभावित एक कण विश्लेषक के साथ निर्धारित कर रहे हैं। एक आकार माप के विश्लेषण से पता चलता है। चार दोहराया माप से प्राप्त cumulants परिणामों से, एसडीएफ-1α-डी एस सी एस कणों की औसत hydrodynamic व्यास 661 ± 8.2 (एनएम) है और polydispersity 0.23 ± 0.02 है। जीटा संभावित माप का परिणाम चित्रा 2 में दिखाया गया है। पाँच दोहराया माप से, एसडीएफ-1α-डी एस सी एस कणों की जीटा संभावित -24.8 ± 0.5 एम वी है। जैसा कि ऊपर कहा, एसडीएफ-1α-डी एस सी एस कण निलंबन में 5% mannitol की उपस्थिति एक ठंड और विगलन प्रक्रिया के दौरान कण एकत्रीकरण की रोकथाम के लिए आवश्यक है। 3 चित्रा से पता चलता है कि पानी में निलंबित कर दिया और पर जमे हुए कणों का आकार माप -80 डिग्री सेल्सियस। एक अलग एकत्रीकरण शिखर विगलन के बाद दिखाई देता है।

एमोएसडीएफ-1α-डी एस सी एस कणों में एसडीएफ-1α की UNT एसडीएस जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अनुमान लगाया गया है। चित्रा -4 ए एसडीएफ-1α समावेश के बिना एसडीएफ-1α मानकों, डी एस सी एस nanoparticle (नियंत्रण कणों के साथ एक Coomassie नीले रंग से सना हुआ एसडीएस जेल से पता चलता है , तो Ctrl एनपी) और एसडीएफ-1α-डी एस सी एस nanoparticle (एसडीएफ-1α एनपी) लोड नमूने हैं। एक मानक वक्र एसडीएफ-1α मानक बैंड (4B चित्रा) के घनत्व विश्लेषण से निर्माण किया है। मानक वक्र से गणना एसडीएफ-1α एनपी नमूने में एसडीएफ-1α एकाग्रता 0.03 मिलीग्राम / एमएल (डुप्लिकेट का औसत) है कि इंगित करता है। नमूना बफर के साथ नमूना के कमजोर पड़ने (40 + 6) / 6 के बाद से, मूल नमूना एकाग्रता 0.23 मिलीग्राम / एमएल है। कण तैयारी की अंतिम मात्रा 0.2 मिलीग्राम है, अंतिम निलंबन में कुल एसडीएफ-1α 0.046 मिलीग्राम है। प्रतिक्रिया मिश्रण में एसडीएफ-1α के इनपुट द्रव्यमान को ध्यान में रखते 0.08 मिलीग्राम, डी एस सी एस कणों में एसडीएफ-1α की फंसाने क्षमता है 57% है। कल्लाओसान पहले से Coomassie नीले रंग के साथ दाग को सूचना दी गई है। धुंधला, हालांकि, चित्रा -4 ए में दिखाया गया जेल में महत्वपूर्ण नहीं है। यह, शायद, जेल पर लोड chitosan (कण मैट्रिक्स) की मात्रा से संबंधित है। किसी भी मामले में, कण मैट्रिक्स से एक पूरा हदबंदी और एसडीएफ-1α की जुदाई सही रूप में शामिल किया प्रोटीन की मात्रा का आकलन करने के लिए आवश्यक है। इस जेल भी कोई बैंड एसडीएफ-1α प्रोटीन बैंड और डाई सामने के बीच पाया जाता है के रूप में एसडीएफ-1α detectably, 10 मिनट के लिए या भंवर प्रक्रिया से 100 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग द्वारा अपमानित नहीं कर रहा है कि पता चलता है।

नैनोकणों से एसडीएफ-1α की इन विट्रो रिहाई दर 7 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 50% डी पीबीएस में कणों की ऊष्मायन से निर्धारित होता है। 0 घंटा, 3 घंटा, 8 घंटा, 24 घंटा, 48 घंटा, और 7 दिनों में नमूने की aliquots centrifuged तुरंत हटा दिया है और कर रहे हैं। जारी की एसडीएफ-1α (सतह पर तैरनेवाला में) कण-बाउंड एसडी से अलग हैएफ-1α (गोली)। नमूने एक एसडीएस जेल पर चलाने के लिए, और supernatants में एसडीएफ-1α की राशि और छर्रों Coomassie धुंधला और densitometry विश्लेषण द्वारा निर्धारित कर रहे हैं। विश्लेषण का एक विशिष्ट एसडीएस जेल चित्रा 5 में दिखाया गया है। के रूप में प्रदर्शन, कण बाध्य एसडीएफ-1α न्यूनतम एक 7 दिन ऊष्मायन के बाद जारी की है।

कण-बाउंड एसडीएफ-1α की गतिविधि मुक्त एसडीएफ-1α की तुलना में एक प्रवास परख (chemotactic परख) द्वारा मापा जाता है, और। इस परख में, डी एस सी एस नैनोकणों में एसडीएफ-1α क्रमानुसार एक प्रवास बफर के साथ पतला है, और दो घंटे के लिए Jurkat कोशिकाओं के साथ incubated। माइग्रेट कोशिकाओं एक प्रवाह कोशिकामापी के साथ गिना जाता है। (0.05-11 एनजी / एमएल की एसडीएफ-1α सांद्रता के साथ) के आंकड़ों गैर रेखीय प्रतिगमन फिटिंग के साथ प्लॉट किए जाते हैं, और चुनाव आयोग में 50 गणना की है। चित्रा 6 में दिखाया गया है, कण-बाउंड एसडीएफ-1α ^ मुक्त एसडीएफ-1 के रूप में प्रवास के उसी हद तक प्रेरित5; सभी सांद्रता में मापा जाता है। एसडीएफ-1α की स्वतंत्र और कण-बाउंड रूपों की चुनाव आयोग 50 मूल्यों में क्रमश: 0.55 और 0.45 एनजी / एमएल हैं।

चित्रा 1
चित्रा 1. विश्लेषण स्क्रीन कण आकार के गतिशील प्रकाश बिखरने माप दिखा गोली मार दी। शीर्ष दो पैनलों autocorrelation समारोह के भूखंडों, G2 है (τ), और के लघुगणक [G2 है (τ) -1] समय के साथ दिखा। साधन के डिजिटल सिग्नल प्रोसेसर (correlator) देरी समय (τ) के एक समारोह के रूप में पहचान की रोशनी की तीव्रता व्यक्त करता है। भूखंड एसडीएफ-1α-डी एस सी एस कणों 0.2-2 मिसे के बीच तीव्रता का एक घातीय क्षय के कारण होता है कि पता चलता है। औसत क्षय निरंतर प्राप्त करने के लिए <Γ> एक कार्यक्रम एल.एन. [G2 है (τ) -1] फिटिंग cumulants साथ साजिश का विश्लेषण करती है। डे के पहले के आदेश गुणांकrived बहुपद समीकरण को सौंपा है <Γ> , जो वक्र के ढलान के लिए आनुपातिक है। के वर्ग से भाग दूसरा आदेश गुणांक <Γ> तीव्रता वितरण चौड़ाई का वर्णन है जो polydispersity सूचकांक है। से <Γ> औसत प्रसार गुणांक (<घ> ) और कण व्यास (घ) के रूप में गणना कर रहे हैं: Γ = डी · क्यू और डी = कश्मीर बी टी / 3πη 0 डी (स्टोक-आइंस्टीन समीकरण)। बीच दो पैनलों 70 संचय माप के दौरान आकार पढ़ने के उतार-चढ़ाव, और माप में तीव्रता के लिए सम्मान के साथ गणना आकार के वितरण दिखा। cumulants व्यास और polydispersity सूचकांक स्क्रीन के नीचे दिखाई जाती हैं।

चित्रा 2
चित्रा 2. विश्लेषण स्क्रीन electrophoretic प्रकाश बिखरने दिखा गोली मार दीकण जीटा संभावित की माप। शीर्ष पैनल समय भूखंड पर एक G2 है (τ) से पता चलता है। धीरे-धीरे खस्ताहाल दोलन समारोह आम तौर पर वैद्युतकणसंचलन और रोशनी बिखरने के अधीन हैं आरोप लगाया है कि कणों में मनाया जाता है। समारोह बिजली के क्षेत्र में आगे बढ़ कणों की वजह से आवृत्ति पारी (डॉपलर पाली) को दर्शाता है। G2 है (τ) की एक फूरियर परिवर्तन मध्यम पैनल में दिखाया शक्ति स्पेक्ट्रम (आवृत्ति साजिश बनाम तीव्रता) देता है। आवृत्ति परिवर्तन शिखर के केंद्र जीटा संभावित गणना की जाती है, जिसमें से कणों की गतिशीलता को परिभाषित करता है। गणना की जीटा संभावित स्क्रीन के नीचे दिखाया गया है।

चित्रा 3
ठंड और पानी में विगलन के बाद एसडीएफ -1 α-डी एस सी एस कणों की चित्रा 3. कण आकार माप। Mannitol के अभाव में, कणों एजी फार्मठंड और विगलन के बाद gregates। एक अतिरिक्त तीव्रता / आकार चोटी के गठन और चित्रा 1 की तुलना में cumulants व्यास और polydispersity में वृद्धि पर ध्यान दें।

चित्रा 4
मुक्त एसडीएफ-1α मानकों, डी एस सी एस nanoparticle (Ctrl एनपी), और एसडीएफ-1α-डी एस के साथ भरी हुई Coomassie से सना हुआ एसडीएस जेल चित्रा 4 डी एस सी एस नैनोकणों में एसडीएफ -1 α समावेश की मात्रा। (ए) तस्वीर सीएस nanoparticle (एसडीएफ-1α एनपी) नमूने के रूप में संकेत। एसडीएफ-1α प्रोटीन बैंड और जेल से चल रहे डाई सामने चिह्नित कर रहे हैं। Ctrl एनपी नमूने Coomassie नीले और chitosan बैंड (विस्तृत) अस्पष्ट दिखाई दे रहे हैं साथ दाग नहीं कर रहे हैं। (बी) के बैंड मानक वक्र (मुक्त एसडीएफ-1α मानकों के साथ निर्माण duplica का औसत है, जिसमें से एक densitometer, साथ विश्लेषण कर रहे हैंते)। नैनोकणों में एसडीएफ-1α की राशि एक औसत 0.3 माइक्रोग्राम प्रति के मूल्य / अच्छी तरह से (10 μl) देता है जो मानक वक्र, के खिलाफ गणना की है।

चित्रा 5
एसडीएफ -1 α इन विट्रो रिलीज के समय पाठ्यक्रम दिखा चित्रा 5. एसडीएस जेल। एसडीएस जेल Coomassie से सना हुआ एसडीएफ-1α-डी एस के ऊष्मायन के बाद (supernatants में) जारी एसडीएफ-1α की राशि और (छर्रों में) बाध्य एसडीएफ-1α से पता चलता है समय के विभिन्न अवधियों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर -CS नैनोकणों। 9 से अनुमति के साथ फिर से छपी।

चित्रा 6
एसडीएफ -1 α (हलकों) और एसडीएफ-1α nanoparticle (एनपी) एक Jurkat सेल प्रवास परख में (वर्ग)। एसडीएफ-1α मुक्त और nanoparticle दोनों में लिए बाध्य चित्रा 6. खुराक प्रतिक्रिया घटताएमएस क्रमश: 0.55 के चुनाव आयोग 50 मूल्यों और 0.45 एनजी / एमएल के साथ एक ही गतिविधि का प्रदर्शन किया। 9 से अनुमति के साथ फिर से छपी।

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Discussion

जैसा कि ऊपर कहा, डी एस सी एस नैनोकणों polyanion (डी एस) और polycation (सीएस) के अणुओं के बीच आरोप निराकरण के माध्यम से बनते हैं। प्रभारी बातचीत आणविक टक्कर के दौरान आसानी से होता है, मिश्रण के दौरान बहुलक समाधान और सरगर्मी गति की एकाग्रता परिणामी कणों के आकार के लिए महत्वपूर्ण है। एक सामान्य प्रवृत्ति अधिक डी एस और सीएस समाधान 15 और छोटे कणों में उच्च सरगर्मी गति परिणाम पतला है।

एसडीएफ-1α glycan नैनोकणों के सूत्रीकरण अलग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया एसडीएफ-1α / डी एस / सीएस की मात्रा और अनुपात क्रमश: 0.08 / 0.33 / 1 (मिलीग्राम / मिलीग्राम / मिलीग्राम) कर रहे हैं। एसडीएफ-1α नैनोकणों के उपयोग पर निर्भर करता है, ये अनुपात बदल सकते हैं। एसडीएफ-1α की राशि मिश्रण करने के लिए जोड़ा है ~, कण, छोटा होगा 650 एनएम 0.04 मिलीग्राम के बजाय 0.08 मिलीग्राम की (0.04 / 0.33 / 1, मिलीग्राम / मिलीग्राम / मिलीग्राम) है, और एसडीएफ-1α फंसाने दक्षता थोड़ा जीreater, 70-80% 9। विवो में दिया हालांकि, जब glycan मैट्रिक्स की एक बड़ी राशि एसडीएफ-1α प्रति उपस्थित रहेंगे। एक छोटे कण आकार वांछित है, एसडीएफ-1α glycan नैनोकणों के निर्माण के लिए आगे संशोधित किया जा सकता है। रेफरी 15 में प्रदर्शन के रूप में एक विकल्प है, एक छोटे आणविक वजन chitosan के उपयोग करने के लिए है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए, हालांकि, कि chitosan के अन्तर्जीवविष के लिए एक उच्च संबंध है (नकारात्मक lipopolysaccharides चार्ज); इस प्रकार, अन्तर्जीवविष स्तर का एक परीक्षण या संभवतः एक शुद्धि पूर्व vivo में प्रसव के लिए किसी भी chitosan के उत्पादों के उपयोग के लिए आवश्यक है। दूसरे विकल्प के पूर्व गठित छोटे डी एस सी एस नैनोकणों पर एसडीएफ-1α लोड करने के लिए है। बाद के कण आकार और एसडीएफ-1α में और अधिक आसानी से चालाकी से किया जा सकता है के बाद से छोटे कणों में परिणाम कर सकते डी एस सी एस कणों के बाहरी कवच ​​को एसडीएफ-1α की एक छोटी राशि लोड हो रहा है, डी एस के लिए एक उच्च संबंध है।

के अन्य प्रकार के साथ तुलनानैनोकणों (जैसे, PLGA 11, polyanhydride 12, या जिलेटिन 13 नैनोकणों), डी एस सी एस नैनोकणों विशेष फायदे और सीमाएं हैं। डी एस सी एस नैनोकणों के प्रमुख लाभ इस प्रकार हैं: 1) कण तैयारी कार्बनिक सॉल्वैंट्स या जोरदार sonication के शामिल नहीं है। कोमल तैयारी प्रोटीन निष्क्रियता की संभावना को कम कर देता है, क्योंकि यह है, इसलिए, प्रोटीन कारक शामिल करने के लिए उपयुक्त है; 2) कणों की मैट्रिक्स ऊतक वातावरण के साथ संगत कणों बनाता है और कम विषाक्त और भड़काऊ है जो बाह्य मैट्रिक्स के रूप में एक समान संरचनात्मक संपत्ति है; और 3) glycan कण-बाउंड एसडीएफ-1α mimics प्रोटीन और glycan कणों में शामिल होने के बाद एसडीएफ-1α से भरा chemotactic गतिविधि बताते हैं जो बाह्य मैट्रिक्स, के बीच एक प्राकृतिक बंधन रिश्ता। कण-बद्ध रूप में पूरी तरह से सक्रिय एसडीएफ-1α यह ऊतक ई में एक स्थिर घर वापस आना कारक के रूप में सेवा करने के लिए अनुमति देता हैnvironment। डी एस सी एस नैनोकणों की सीमाएं हैं: 1) कणों के व्यास से ऊपर उल्लेख किया कणों से आम तौर पर अधिक से अधिक कर रहे हैं; और 2) आसानी से रक्त परिसंचरण में प्रत्यक्ष इंजेक्शन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है, जो नमक समाधान है, में पतन।

कण-बाउंड एसडीएफ-1α न्यूनतम सात दिन ऊष्मायन के बाद नैनोकणों से रिहा हो पाया है। यह घटना भी vivo में अपने कार्य के लिए योगदान देता है, जो हेपरिन के लिए एसडीएफ-1α के उच्च आत्मीयता, से संबंधित है। हेपरिन बाध्यकारी डोमेन के साथ प्रोटीन हेपरिन के लिए विभिन्न समानताएं आम तौर पर होगा, उनकी रिहाई की दरें अलग-अलग होने की संभावना होगी। उदाहरण के लिए, एक वीईजीएफ़ में 165 -DS-सीएस nanoparticle एक समान तैयार करने में तैयार, निगमित वीईजीएफ़ 165 का 44% पहले घंटे में जारी किया गया था और 29% 37 डिग्री सेल्सियस 14 पर ऊष्मायन के दौरान अगले 47 घंटे में जारी किया गया था। इसलिए, एक विशिष्ट prot के लिए इन विट्रो रिलीज पैटर्नEin व्यक्तिगत रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए।

एसडीएफ-1α-डी एस सी एस नैनोकणों की तैयारी के उद्देश्य के फेफड़ों को एसडीएफ-1α देने और ऊतकों में एक स्टेम सेल घर वापस आना संकेत स्थापित करने के लिए है। विशिष्ट nanoparticle के प्रारूप ठोस ऊतक इंजेक्शन के लिए आवश्यक नहीं है, हालांकि कण भी, एक ही उद्देश्य के लिए अन्य ऊतकों के लिए दिया जा सकता है। एसडीएफ-1α nanoparticle मैट्रिक्स में डी एस द्वारा स्थिर है और न्यूनतम कणों से जारी है तथ्य यह है कि सेल भर्ती सिद्धांतों स्टेम समर्थन करता है, और कण ऊतक उत्थान के लिए फायदेमंद होने की उम्मीद है।

प्रोटीन-glycan नैनोकणों कोशिका की सतह glycosaminoglycans और बाह्य मैट्रिक्स की है कि इसी तरह के एक मैट्रिक्स है के बाद से, यह कण-निगमित प्रोटीन नकारात्मक आरोप लगाया बाह्य मैट्रिक्स अणुओं सकारात्मक का बंधन के साथ प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं (ये matrixes में विमर्श किया जा सकता है कि संभव है विवो में आरोप लगाया प्रोटीन) विट्रो लक्षण वर्णन में प्रारंभिक के बाद जांच करने की जरूरत है, प्रोटीन रिलीज कैनेटीक्स बदल सकते हैं, और।

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Acknowledgments

HL671795, HL048743, और HL108630: यह काम एनआईएच अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran sulfate Fisher BP1585-100
Chitosan, low molecular weight  Sigma 448869
Zinc sulfate heptahydrate Sigma 204986
D-Mannitol Sigma M9546
UltraPure water  Invitrogen  10977-023
SDF-1α Prepared according to reference 8.
Syringe filter, PES membrane 0.22 μm Millipore SLGP033RS
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) Fisher  14-513-63
Glass vial Kit; SUN-SRi Fisher  14-823-182
Delsa Nano C Particle Analyzer  Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets Eppendorf 952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel Bio-Rad 456-1096
GelCode Blue Safe Protein Stain Fisher  PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System BioRad 170-8640
Corning Transwell Permeable Supports Corning 3421
Accuri C6 Flow Cytometer BD Biosciences
Dulbecco’s phosphate buffered saline  Sigma D8537
Pyrogent plus kit Fisher NC9753738

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References

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रसायन विज्ञान अंक 95 dextran सल्फेट Chitosan glycan एसडीएफ-1α nanoparticle है Polyelectrolyte जटिल
एसडीएफ-1α-Chitosan-dextran सल्फेट नैनोकणों की तैयारी और विशेषता
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Bader, A. R., Li, T., Wang, W., Kohane, D. S., Loscalzo, J., Zhang, Y. Y. Preparation and Characterization of SDF-1α-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles. J. Vis. Exp. (95), e52323, doi:10.3791/52323 (2015).

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