Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Подготовка и характеристика SDF-1α-хитозан-Декстрансульфат наночастиц

Published: January 22, 2015 doi: 10.3791/52323

Introduction

Декстрансульфат (DS) и хитозан (CS) являются полисахариды с несколькими замещенных отрицательно заряженных групп сульфат (в DS), или положительно заряженные аминогруппы (деацетилируется CS). При смешивании в водном растворе, два полисахариды образуют полиэлектролитных комплексов путем электростатических взаимодействий. Полученные комплексы могут образовывать крупные агрегаты, которые будут фазовое разделение из водного раствора (выделений), или мелкие частицы, которые диспергируемые в воде (коллоиды). Конкретные условия, которые способствуют этих результатов были тщательно изучены, и были обобщены и подробно показано на недавнем обзоре 1. Среди этих условий, два основных требования для получения диспергируемые в воде частицы являются противоположно заряженные полимеры должны 1) имеют существенно различные молекулярную массу; и 2) можно смешивать в не-стехиометрическом соотношении. Эти условия позволят заряд, нейтральный образующего комплекса полимерных сегментов, генерируемых бесплатноНейтрализация отделить и образуют ядро частицы, а избыток полимера с образованием внешнюю оболочку 1. Гликан частицы, описанные в этом протоколе предназначены для доставки в легкие, и предназначены для чистой заряжены отрицательно, и нанометровых размеров. Отрицательный поверхностный заряд снижает вероятность клеточного захвата частиц 2,3. Частицы размерности нанометров облегчения прохождения через дистальных дыхательных путях. Для достижения этой цели, количество DS, используемый в этом препарате превышает CS (массовое соотношение 3: 1); и высокой молекулярной массой DS (средневзвешенный МВт 500000) и низкой молекулярной массой CS (диапазон MW 50-190 кДа, 75-85% деацетилированный) используются.

SDF-1α является фактором самонаведения стволовых клеток, который оказывает функцию самонаведения через его активности хемотаксиса. SDF-1α играет важную роль в самонаведения и обеспечения гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге, и найма PROGEnitor клетки к периферической ткани для ремонта травма 4,5. SDF-1α имеет сайт гепарин-связывающей в его последовательности белка, что позволяет белок связывается с гепарином / гепарансульфата, образуют димеры, быть защищены от протеазы (CD26 / DPPIV) инактивации и взаимодействуют с клетками-мишенями через рецепторы клеточной поверхности 6-8. DS имеет аналогичные структурные свойства, как гепарин / гепарансульфата; Таким образом, связывание SDF-1α в DS будет похож на своих природных полимерных лигандов.

В следующем протоколе мы описываем получения наночастиц SDF-1α-DS-CS. Процедуры представляют собой один из составов, которые были ранее изученных 9. Протокол изначально приспособлены из исследования VEGF-DS-CS наночастиц 10. Небольшой подготовки масштаб описано, которые могут быть легко расширены с тех же исходных растворов и условий приготовления. После подготовки, частицы характеризуются бу исследуя их размер, дзета-потенциал, степень SDF-1α регистрации, в пробирке время выпуска и деятельность объединенной SDF-1α.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка SDF-1α Glycan наночастиц

В связи с целью доставки в естественных условиях, стерилизовать все контейнеры, пипетки, а также советы, использованных при подготовке.

  1. Подготовьте следующие растворы измерении воды: 1% сульфата декстрана; 1 М NaOH (стерильно фильтруют через мембрану PES); 0,1% хитозана в 0,2% ледяной уксусной кислоты (фильтр через 0,8 и 0,22 мкм фильтры последовательно и регулировать рН до 5,5 с помощью NaOH после); 0,1 M ZnSO 4; 15% маннита; и 0,92 мг / мл SDF-1α (хранили в аликвотах при 80 ° С, и выдерживают при 4 ° C После оттаивания).
  2. Стерилизовать растворы через фильтр 0,22 мкм мембраны. Оценка уровня эндотоксина в приготовленном растворе с Лаймулус amebocyte лизат (LAL) гель сгустка анализа. Убедитесь, что уровни <0,06 EU / мл.
  3. Добавить 0,18 мл сверхчистой воды в стекл нный сосудик на 1,5 мл, содержащую магнитную мешалку. Установите скорость перемешивают при 800 оборотах в минуту. Добавить 0,1 мл 1%сульфат декстрана и перемешивают в течение 2 мин. Добавить 0,08 мг SDF-1α (0,087 мл 0,92 мг / мл SDF-1α раствор) и перемешивали в течение 20 мин.
  4. Добавить 0,33 мл 0,1% хитозана по каплям и перемешивают в течение 5 мин. Изменение скорости перемешиванием до максимума и добавить 0,1 мл 0,1 М ZnSO 4 медленно с 0,1 мл шприца (более 1 мин).
  5. Возвращение скорости перемешиванием 800 оборотов в минуту и ​​перемешивали в течение 30 мин. Добавить 0,4 мл 15% маннита и перемешивали в течение 5 мин. Передача реакционной смеси в 1,5 мл пробирке. Центрифуга при 16000 х г при 4 ° С в течение 10 мин.
    Примечание: Наличие маннита способствует рефиксацией частиц после центрифугирования. В зависимости от компактности гранул, концентрации маннита может изменяться от 0% до 5%. Полное ресуспендирования частиц центрифугированием после каждого очень важно, чтобы избежать агрегатов в конечной суспензии.
  6. Отберите супернатант и использовать пипетку, чтобы удалить последние капли жидкости медленно. Добавить 0,2 мл 5% маннита. Приостановить осадок с 0,5 мл, 29 г урожденнаяDLE шприц. Добавить 1 мл 5% маннита. Центрифуга при 16000 х г в течение 15 мин.
  7. Повторите шаг 1,6.
  8. Аспирата супернатант. Ресуспендируют осадок в 0,2 мл 5% маннита. Хранить суспензии частиц при 4 ° С.
    Примечание: Суспензия частиц также может быть сохранена в замороженном виде при -80 ° С или лиофилизируют. В том числе 5% маннита в суспензии важно, чтобы предотвратить агрегацию частиц после замораживания и оттаивания или после лиофилизации и регидратации. Маннит может быть удален центрифугированием суспензии после хранения.

2. Измерение размера частиц и дзета-потенциал

Размер частиц и дзета-потенциал анализируют с помощью динамического рассеяния света и электрофоретического рассеяния света, соответственно, с помощью анализатора частиц указанного в списке материалов.

  1. Настройте следующие параметры для измерения размера частиц: временами накопления: 70; Повторите раз: 4; Температура: 25 ° С;Разбавитель: вода; Регулировка интенсивности: авто.
  2. Развести образец SDF-1α-DS-CS водой (10-кратным разбавлением). Загрузка 100 мкл образца к одноразовому УФ кювету, такие как кюветы Эппендорфа. Вставьте кювету в держатель клеток. Подождите для регулировки интенсивности, чтобы достичь «Оптимум» (~ 10 000 гц). Начните сбор данных.
  3. После окончания измерения, записи кумулянтов результаты диаметра (нм) и индекс полидисперсности. Нормальное результаты, полученные от каждого из 4 повторных показаний и расчета стандартного отклонения.
  4. Нагрузка 500 мкл 10-кратного разбавленного образца частиц в проточной кювете на дзета-потенциал измерения. Настройте следующие параметры для измерения: раз накопления: 10; Повторите раз: 5; Температура: 25 ° С; Разбавитель: вода; Регулировка интенсивности: авто. Запишите результаты дзета-потенциал (мВ). Среднее значение полученного результата от каждого из 5 повторных чтениях, и вычислить стандартное deviatioп.

3. Количественная оценка SDF-1α в частицах

  1. Развести в свободной форме SDF-1α в концентрации 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, и 0,05 мг / мл в 1,3 раза Laemmli буфера для образцов. Развести 6 мкл образцов SDF-1α-DS-CS с 40 мкл 1.3x Лэммли буфера для образца. (Подготовка 4x Laemmli запаса буфер, содержащий 0,25 М Трис-HCl, рН 7,5, 8% SDS, 40% глицерина, 0,05 мг / мл бромфенолового синего, и 8% 2-меркаптоэтанола. Разделить маточного раствора в виде небольших аликвот и держать при температуре от -20 ° C для одноразового использования.)
  2. Тепло образцов при 100 ° С в течение 10 мин. Vortex образцы в два раза (на 10 секунд при максимальной скорости) в течение 10 мин время нагрева для того, чтобы отделить частицы полностью. Охладить образцы до комнатной температуры в течение 2 мин. Центрифуга на 10000 мкг в течение 0,5-1 мин, чтобы сбить водный конденсат. Vortex снова хорошо перемешать.
    Примечание: В этот момент раствор образца должно быть ясно, без каких-либо видимого осадка настоящее время.
  3. Загрузить еще 10 &# 181; л образца / хорошо 4-20% SDS гель. Запуск электрофореза на 200 V в течение 20 мин. Пятно гель с голубым Кумасси белков пятно.
  4. Проверьте плотность полосы белка SDF-1α с помощью молекулярной тепловизором и анализа денситометрия программного обеспечения. Рассчитать количество SDF-1α в частицах по сравнению со стандартной кривой, построенной с бесплатными SDF-1α стандартам.

4. В пробирке Пробирной релиз

  1. Смешайте SDF-1α гликанов частицы с фосфатным буферным солевым раствором Дульбекко без кальция и магния (D-PBS) в соотношении 1: 1 (объем / объем).
  2. Разделите суспензии частиц в 0,05 мл аликвоты в 1,5 мл пробирки. Загрузка образцов в нижней части трубы. Избегать введения пузырьков воздуха или нарушения поверхности жидкости. Печать в верхней части трубки с парафильмом.
    Примечание: В этом жидкость будет оставаться в нижней во время последующей верхней до нижней вращения на смеситель трубки.
  3. Поворот трубы на 37 и# 176; C на вращающемся Micro-Тюбе Mixer. Удалить аликвот из труб на установленное время и сразу же центрифуги образцов при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  4. Отдельные супернатанты и гранул, и восстановить гранул с 0,05 мл D-PBS. Хранить образцы при -20 ° С. После того как все образцы собирали, рассмотрим супернатанты и гранул на геле SDS, как описано выше.

5. Миграция Пробирной

Этот анализ измеряет активность хемотаксиса из SDF-1α. Взаимодействие SDF-1α с его рецептором (CXCR4) на поверхности клетки вызывает миграцию клетки в направлении SDF-1α градиента. В этом анализе клетки загружают в верхнюю лунку (разделенные полупроницаемой мембраной из нижней а) и SDF-1α раствора в нижнюю лунку.

  1. Развести SDF-1α (бесплатно или частиц связаны, образуют) с миграцией буфера (RPMI-1640, содержащей 0,5% бычьего сывороточного альбумина) в 3-FOLD последовательного разведения до конечных концентраций 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14, и 0,05 нг / мл.
  2. Добавить 0,6 мл разбавленного раствора SDF-1α или миграции буфер, только (отрицательный контроль), чтобы хорошо в 24-луночного планшета. Добавить 0,57 мл миграции буфера в лунку (входного контроля клетки). Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Поместите проницаемую вставку для культивирования клеток, таких как Transwell (размер пор 5 мкм, диаметр 6,5 мм) в верхней части ниже, а также. Добавить 0,1 мл Jurkat клетки (5 × 10 5) в Transwell вставить. Загрузка 0,03 мл клеток непосредственно в управления вводом клеток также. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 2 ч в 5% CO 2 инкубаторе.
  3. Снимите вставки Transwell. Передача клетки, которые мигрировали к нижней лунки в 4 мл полистирола трубки. Граф мигрировавших клеток с цитометром потока.
  4. Рассчитать миграции в процентах от числа входных клеток (количество клеток в контроле клеточной и входного х 100/30) после вычитания чисел в negatив управления (клетки мигрировали в лунках, содержащих только буфер миграции).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Размер и дзета-потенциал подготовленных частиц SDF-1α-DS-CS определяются с помощью анализатора частиц. На рисунке 1 представлен анализ измерения размера. Из результатов, полученных в кумулянтов четыре повторных измерений, средний гидродинамический диаметр частиц SDF-1α-DS-CS является 661 ± 8,2 (нм) и полидисперсность 0,23 ± 0,02. Результат измерения дзета-потенциал показано на фиг.2. Из этих пяти повторных измерений, дзета-потенциал частиц SDF-1α-DS-CS является -24,8 ± 0,5 мВ. Как упоминалось выше, наличие 5% маннита в суспензии SDF-1α-DS-CS частиц имеет важное значение для предотвращения агрегации частиц в процессе замораживания и оттаивания. 3 показана измерение размера частиц, взвешенных в воде и замораживают при -80 ° С. Отчетливый пик агрегации видна после оттаивания.

AMOЕНТ в SDF-1α в частицах SDF-1α-DS-CS оценивается с помощью гель-электрофореза в SDS. показывает Кумасси синий окрашенных SDS гель с SDF-1α стандартов, DS-CS наночастицы (частицы управление без SDF-1α регистрации , Ctrl NP) и SDF-1α-DS-CS наночастиц (SDF-1α NP) образцы загружено. Стандартная кривая строится на основе анализа плотности SDF-1α стандартных диапазонах (рис 4б). Расчет по калибровочной кривой показывает, что концентрация SDF-1α в SDF-1α образца НП составляет 0,03 мг / мл (в среднем двух экземплярах). Поскольку разведение образца с буфера выборки является (6 + 40) / 6, первоначальная концентрация образца 0,23 мг / мл. Как конечный объем препарата частиц составляет 0,2 мл, общий SDF-1α в конечной суспензии составляет 0,046 мг. Учитывая входной массу SDF-1α в реакционной смеси составляет 0,08 мг, эффективность захвата из SDF-1α в частицах DS-CS является 57%. КрошкаОсан уже сообщалось ранее, чтобы окрасить с голубым Кумасси. Окрашивание, однако, не имеет существенного значения в геле, показанной на фиг.4А. Это, возможно, связано с количеством хитозана (матрицы) частиц загруженного на гель. В любом случае, полный диссоциации и разделение SDF-1α из матрицы частиц необходимо для точной оценки количества включенного белка. Этот гель также показывает, что SDF-1α не обнаруживаемой понижена нагреванием при 100 ° С в течение 10 мин или в процессе вихревого, а не полосы не будут найдены между группой белка SDF-1α и перед красителя.

В пробирке скорость высвобождения SDF-1α из наночастиц определяется путем инкубации частиц в 50% D-PBS при 37 ° С в течение 7 дней. В 0 часов, 3 часа, 8 часов, 24 часов, 48 часов и 7 дней, аликвоты образцов были удалены, и сразу же центрифугировали. Выпущен SDF-1α (в супернатанте) отделена от частиц SD-связаннымF-1α (пеллет). Образцы работать на геле SDS, а количество SDF-1α в супернатантах и ​​гранулы определяется Кумасси окрашивания и анализа денситометрии. Типичный SDS гель-анализа показано на фиг.5. Как показано, частица, связанная SDF-1α минимально освобожден после 7-дневной инкубации.

Активность частиц связанного SDF-1α измеряется с помощью анализа миграции (хемотаксическая анализа), а по сравнению с свободного SDF-1α. В этом анализе, SDF-1α в наночастицах DS-CS серийно разводили буфером миграции, и инкубировали с клетками Jurkat в течение 2 ч. В мигрировавших клеток подсчитывают с цитометра потока. Данные (с SDF-1α концентрации 0.05-11 нг / мл) приведены в нелинейный регрессионный фитинг, и ЕС 50 вычисляют. Как показано на фиг.6, связанного с твердыми частицами SDF-1α индуцируется такой же степени, как и миграции свободного SDF-1 ^5; при всех концентрациях измерить. EC 50 значения свободных и связанных с частицами форм SDF-1α являются 0,55 и 0,45 нг / мл, соответственно.

Рисунок 1
Рисунок 1. Экран анализа выстрел, показывая динамических измерений рассеяния света от размера частиц. Два верхних панелей показывают сюжеты автокорреляционной функции, G2 (τ) и логарифм [G2 (τ) -1] с течением времени. Цифровой процессор сигнала инструмента (коррелятор) выражает обнаруженную интенсивность света в зависимости от времени задержки (τ). График показывает, что SDF-1α-DS-CS частицы вызвало экспоненциальный спад интенсивности между 0,2-2 мс. Чтобы получить константу в среднем распада <Γ> , Программа анализирует Ln [G2 (τ) -1] участок с кумулянтов фитингов. Первый коэффициент порядок DEпривели к расколу полиномиальное уравнение присваивается <Γ> , Которая пропорциональна наклону кривой. Второй коэффициент порядок делится на квадрат <Γ> это индекс полидисперсности, который описывает ширину распределения интенсивности. С <Γ> Средний коэффициент диффузии (<D> ) И диаметр частиц (d) рассчитывается как: Γ = D · Q и D = K B T / 3πη 0 d (уравнение Сток-Эйнштейна). Средние две панели показывают колебания чтения размера во время измерений накопления 70 и распределение по размерам, рассчитанный по отношению к интенсивности при измерении. Диаметр кумулянты и индекс полидисперсности показаны в нижней части экрана.

Фиг.2
Рисунок 2. Экран анализа выстрел, показывая электрофореза рассеяние светаИзмерение дзета-потенциала частицы. Верхняя панель показывает G2 (τ) по времени сюжета. Постепенно распадалась осциллирующей функцией, как правило, наблюдается в заряженных частиц, которые подвергают электрофорезу и рассеяния света. Функция отражает сдвиг частоты (доплеровского сдвига), вызванной подвижных частиц в электрическом поле. Преобразование Фурье G2 (τ) дает энергетический спектр (интенсивность в зависимости от частоты участок), показанный в средней панели. Центр пика частотного сдвига определяет подвижность частиц, из которых рассчитывается дзета-потенциал. Расчетное дзета-потенциал показан в нижней части экрана.

Рисунок 3
Рисунок 3. Измерение частиц размером SDF-1 α-DS-CS частиц после замораживания и оттаивания в воде. При отсутствии маннита, частицы образуют AGgregates после замораживания и оттаивания. Обратите внимание на формирование дополнительной интенсивности / пик численности и увеличение диаметра Кумулянты и полидисперсности по сравнению с, что на рис 1.

Рисунок 4
Рисунок 4. Количественная оценка SDF-1 α включения в наночастицах DS-CS. () Фотография Кумасси окрашенных SDS гель загружен с бесплатными SDF-1α стандартов, DS-CS наночастицы (Ctrl NP), и SDF-1α-DS- CS наночастиц (SDF-1α НП) Образцы, как указано. В SDF-1α полосы белка и переднего краситель гель работает выделены. Образцы Ctrl NP не окрашивали Кумасси синий и хитозана полос (WIDE) смутно видны. (Б) полосы анализировали с помощью денситометра, из которого стандартная кривая строится со свободными SDF-1α стандартов (в среднем duplicaTE). Количество SDF-1α в наночастиц, рассчитывается относительно стандартной кривой, которая дает среднее значение 0,3 мкг / лунку (10 мкл).

Рисунок 5
Рисунок 5. SDS гель, показывающий SDF-1 α в пробирке выпуска временной ход. Кумасси-SDS гель окрашивали показывает количество выпущенной SDF-1α (в супернатантах) и связанного SDF-1α (в гранулах) после инкубации SDF-1α-DS -Cs наночастицы при 37 ° С в течение различных периодов времени. Re-печатается с разрешения 9.

Рисунок 6
Рисунок 6. Кривые доза-ответ из SDF-1 α (кружки) и SDF-1α наночастицы (NP) (квадраты) в Jurkat клеточной миграции анализа. SDF-1α в свободной и наночастицы, связанные дляMS выставлен такой же активностью с EC 50 значений 0,55 и 0,45 нг / мл, соответственно. Re-печатается с разрешения 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Как упоминалось выше, наночастицы DS-CS сформированы с помощью нейтрализации заряда между полианиона (DS) и поликатиона (CS) молекул. Поскольку взаимодействие заряда происходит легко при молекулярном столкновения, концентрация полимерных растворов и перемешивание скорости во время смешивания имеет решающее значение для размера получаемых частиц. Общая тенденция состоит в том, что более разбавляют DS и CS решения 15 и более высокий результат скорости перемешивания в более мелкие частицы.

Формулировка SDF-1α гликанов наночастиц может изменяться. Например, суммы и соотношения SDF-1α / DS / CS, используемые в настоящем Протоколе 0,08 / 0,33 / 1 (мг / мг / мг), соответственно. В зависимости от предполагаемого использования наночастиц SDF-1α, эти отношения могут меняться. Если количество SDF-1α добавляют к смеси 0,04 мг (0,04 / 0,33 / 1, мг / мг / мг) вместо 0,08 мг, частицы будут меньше, ~ 650 нм, и SDF-1α захват эффективность несколько гля большей, 70-80% 9. Тем не менее, при поставке в естественных условиях, большее количество гликанов в матрице будет присутствовать в SDF-1α. Если размер частиц меньше, желательно, оформление SDF-1α гликанов наночастиц может быть дополнительно модифицированы. Один из вариантов заключается в использовании меньший молекулярный вес хитозан, как показано в работе 15. Следует отметить, однако, что хитозан имеет высокое сродство к эндотоксина (отрицательно заряженные липополисахариды); Таким образом, тест на уровне эндотоксина или потенциально очистки является необходимым для использования каких-либо продуктов хитозана до поставки в естественных условиях. Второй вариант заключается в загрузке SDF-1α на предварительно образованных наночастиц небольших DS-CS. Поскольку последний можно манипулировать легче по размеру частиц и SDF-1α имеет высокое сродство к DS, загрузка небольшое количество SDF-1α к внешней оболочке частиц DS-CS может привести к более мелких частиц.

По сравнению с другими типаминаночастицы (например, PLGA 11, полиангидрид 12, или желатин 13 наночастицы), наночастицы DS-CS имеют свои преимущества и недостатки. Основные преимущества наночастиц DS-CS являются: 1) подготовка частица не включать органические растворители или сильное ультразвуком. Это, следовательно, подходит для введения белкового фактора, как нежный препарат уменьшает вероятность инактивации белка; 2) матрица частиц имеет аналогичные структурные свойства, как внеклеточного матрикса, что делает частицы совместимыми с окружающей средой ткани и менее токсичен и воспалительные; и 3) гликановые связанных с частицами SDF-1α имитирует естественный связывание отношения между белком и внеклеточного матрикса, который объясняет полное хемотактическую деятельность SDF-1α после их включения в гликановых частиц. Полностью активным SDF-1α в частицы-связанной форме позволяет ему служить в качестве стационарного фактора наведения в тканевой еnvironment. Ограничения наночастиц DS-CS являются: 1) диаметры частиц, как правило, больше, чем в указанных выше частиц; и 2) в растворах солей, которые не могут быть пригодны для прямого введения в кровоток легко разрушаются.

SDF-1α связанного с твердыми частицами будет обнаружено, что минимально освобожден от наночастиц после семи дней инкубации. Это явление связано с высоким сродством SDF-1α для гепарина, что также способствует его функции в живом организме. С белки с гепарином связывающих доменов, как правило, имеют различные сродство к гепарин, их скорости высвобождения, скорее всего, отличаются. Например, в VEGF 165 -DS-CS наночастиц получали аналогичным композиции, 44% от объединенного VEGF 165 был выпущен в течение первого часа и 29% был выпущен в следующем 47 ч при инкубации при 37 ° С 14. Таким образом, выпуск модели в пробирке в течение определенного протEin необходимо индивидуально проверены.

Цель подготовки наночастиц SDF-1α-DS-CS является предоставление SDF-1α в легкие и установить сигнал стволовых клеток самонаведения в ткани. Частицы также могут быть доставлены в другие ткани для той же самой цели, хотя конкретный формат наночастиц не требуется для инъекции твердого ткани. Тот факт, что SDF-1α стабилизируется DS в матрице наночастиц и минимально выпущен из частиц поддерживает стволовые клетки принципы найма, и частица, как ожидается, будет полезным для регенерации тканей.

Поскольку наночастицы белка-гликанов имеют аналогичную матрицу, что клеточной поверхности гликозаминогликанов и внеклеточного матрикса, вполне возможно, что белки частиц, включены могут быть обменены в этих матриц (Отрицательно заряженные молекулы внеклеточного матрикса могут конкурировать со связыванием положительно заряженный белок) в естественных условиях в пробирке характеристики.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH гранты: HL671795, HL048743 и HL108630.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran sulfate Fisher BP1585-100
Chitosan, low molecular weight  Sigma 448869
Zinc sulfate heptahydrate Sigma 204986
D-Mannitol Sigma M9546
UltraPure water  Invitrogen  10977-023
SDF-1α Prepared according to reference 8.
Syringe filter, PES membrane 0.22 μm Millipore SLGP033RS
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) Fisher  14-513-63
Glass vial Kit; SUN-SRi Fisher  14-823-182
Delsa Nano C Particle Analyzer  Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets Eppendorf 952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel Bio-Rad 456-1096
GelCode Blue Safe Protein Stain Fisher  PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System BioRad 170-8640
Corning Transwell Permeable Supports Corning 3421
Accuri C6 Flow Cytometer BD Biosciences
Dulbecco’s phosphate buffered saline  Sigma D8537
Pyrogent plus kit Fisher NC9753738

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
  2. Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).
  3. Yue, Z. G., et al. Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).
  4. Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).
  5. Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).
  6. Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex. J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).
  7. Amara, A., et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).
  8. Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).
  9. Yin, T., et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).
  10. Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).
  11. McCall, R. L., Sirianni, R. W. PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS. J Vis Exp. (82), 51015 (2013).
  12. Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles. J Vis Exp. (65), 3967 (2012).
  13. Xu, J., Amiji, M. Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles. J Vis Exp. (59), e3612 (2012).
  14. Lauten, E. H., et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).
  15. Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes. Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).

Tags

Химия выпуск 95 декстран сульфат хитозан гликана SDF-1α наночастиц полиэлектролитный комплекс
Подготовка и характеристика SDF-1α-хитозан-Декстрансульфат наночастиц
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bader, A. R., Li, T., Wang, W.,More

Bader, A. R., Li, T., Wang, W., Kohane, D. S., Loscalzo, J., Zhang, Y. Y. Preparation and Characterization of SDF-1α-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles. J. Vis. Exp. (95), e52323, doi:10.3791/52323 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter