Introduction
Декстрансульфат (DS) и хитозан (CS) являются полисахариды с несколькими замещенных отрицательно заряженных групп сульфат (в DS), или положительно заряженные аминогруппы (деацетилируется CS). При смешивании в водном растворе, два полисахариды образуют полиэлектролитных комплексов путем электростатических взаимодействий. Полученные комплексы могут образовывать крупные агрегаты, которые будут фазовое разделение из водного раствора (выделений), или мелкие частицы, которые диспергируемые в воде (коллоиды). Конкретные условия, которые способствуют этих результатов были тщательно изучены, и были обобщены и подробно показано на недавнем обзоре 1. Среди этих условий, два основных требования для получения диспергируемые в воде частицы являются противоположно заряженные полимеры должны 1) имеют существенно различные молекулярную массу; и 2) можно смешивать в не-стехиометрическом соотношении. Эти условия позволят заряд, нейтральный образующего комплекса полимерных сегментов, генерируемых бесплатноНейтрализация отделить и образуют ядро частицы, а избыток полимера с образованием внешнюю оболочку 1. Гликан частицы, описанные в этом протоколе предназначены для доставки в легкие, и предназначены для чистой заряжены отрицательно, и нанометровых размеров. Отрицательный поверхностный заряд снижает вероятность клеточного захвата частиц 2,3. Частицы размерности нанометров облегчения прохождения через дистальных дыхательных путях. Для достижения этой цели, количество DS, используемый в этом препарате превышает CS (массовое соотношение 3: 1); и высокой молекулярной массой DS (средневзвешенный МВт 500000) и низкой молекулярной массой CS (диапазон MW 50-190 кДа, 75-85% деацетилированный) используются.
SDF-1α является фактором самонаведения стволовых клеток, который оказывает функцию самонаведения через его активности хемотаксиса. SDF-1α играет важную роль в самонаведения и обеспечения гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге, и найма PROGEnitor клетки к периферической ткани для ремонта травма 4,5. SDF-1α имеет сайт гепарин-связывающей в его последовательности белка, что позволяет белок связывается с гепарином / гепарансульфата, образуют димеры, быть защищены от протеазы (CD26 / DPPIV) инактивации и взаимодействуют с клетками-мишенями через рецепторы клеточной поверхности 6-8. DS имеет аналогичные структурные свойства, как гепарин / гепарансульфата; Таким образом, связывание SDF-1α в DS будет похож на своих природных полимерных лигандов.
В следующем протоколе мы описываем получения наночастиц SDF-1α-DS-CS. Процедуры представляют собой один из составов, которые были ранее изученных 9. Протокол изначально приспособлены из исследования VEGF-DS-CS наночастиц 10. Небольшой подготовки масштаб описано, которые могут быть легко расширены с тех же исходных растворов и условий приготовления. После подготовки, частицы характеризуются бу исследуя их размер, дзета-потенциал, степень SDF-1α регистрации, в пробирке время выпуска и деятельность объединенной SDF-1α.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка SDF-1α Glycan наночастиц
В связи с целью доставки в естественных условиях, стерилизовать все контейнеры, пипетки, а также советы, использованных при подготовке.
- Подготовьте следующие растворы измерении воды: 1% сульфата декстрана; 1 М NaOH (стерильно фильтруют через мембрану PES); 0,1% хитозана в 0,2% ледяной уксусной кислоты (фильтр через 0,8 и 0,22 мкм фильтры последовательно и регулировать рН до 5,5 с помощью NaOH после); 0,1 M ZnSO 4; 15% маннита; и 0,92 мг / мл SDF-1α (хранили в аликвотах при 80 ° С, и выдерживают при 4 ° C После оттаивания).
- Стерилизовать растворы через фильтр 0,22 мкм мембраны. Оценка уровня эндотоксина в приготовленном растворе с Лаймулус amebocyte лизат (LAL) гель сгустка анализа. Убедитесь, что уровни <0,06 EU / мл.
- Добавить 0,18 мл сверхчистой воды в стекл нный сосудик на 1,5 мл, содержащую магнитную мешалку. Установите скорость перемешивают при 800 оборотах в минуту. Добавить 0,1 мл 1%сульфат декстрана и перемешивают в течение 2 мин. Добавить 0,08 мг SDF-1α (0,087 мл 0,92 мг / мл SDF-1α раствор) и перемешивали в течение 20 мин.
- Добавить 0,33 мл 0,1% хитозана по каплям и перемешивают в течение 5 мин. Изменение скорости перемешиванием до максимума и добавить 0,1 мл 0,1 М ZnSO 4 медленно с 0,1 мл шприца (более 1 мин).
- Возвращение скорости перемешиванием 800 оборотов в минуту и перемешивали в течение 30 мин. Добавить 0,4 мл 15% маннита и перемешивали в течение 5 мин. Передача реакционной смеси в 1,5 мл пробирке. Центрифуга при 16000 х г при 4 ° С в течение 10 мин.
Примечание: Наличие маннита способствует рефиксацией частиц после центрифугирования. В зависимости от компактности гранул, концентрации маннита может изменяться от 0% до 5%. Полное ресуспендирования частиц центрифугированием после каждого очень важно, чтобы избежать агрегатов в конечной суспензии. - Отберите супернатант и использовать пипетку, чтобы удалить последние капли жидкости медленно. Добавить 0,2 мл 5% маннита. Приостановить осадок с 0,5 мл, 29 г урожденнаяDLE шприц. Добавить 1 мл 5% маннита. Центрифуга при 16000 х г в течение 15 мин.
- Повторите шаг 1,6.
- Аспирата супернатант. Ресуспендируют осадок в 0,2 мл 5% маннита. Хранить суспензии частиц при 4 ° С.
Примечание: Суспензия частиц также может быть сохранена в замороженном виде при -80 ° С или лиофилизируют. В том числе 5% маннита в суспензии важно, чтобы предотвратить агрегацию частиц после замораживания и оттаивания или после лиофилизации и регидратации. Маннит может быть удален центрифугированием суспензии после хранения.
2. Измерение размера частиц и дзета-потенциал
Размер частиц и дзета-потенциал анализируют с помощью динамического рассеяния света и электрофоретического рассеяния света, соответственно, с помощью анализатора частиц указанного в списке материалов.
- Настройте следующие параметры для измерения размера частиц: временами накопления: 70; Повторите раз: 4; Температура: 25 ° С;Разбавитель: вода; Регулировка интенсивности: авто.
- Развести образец SDF-1α-DS-CS водой (10-кратным разбавлением). Загрузка 100 мкл образца к одноразовому УФ кювету, такие как кюветы Эппендорфа. Вставьте кювету в держатель клеток. Подождите для регулировки интенсивности, чтобы достичь «Оптимум» (~ 10 000 гц). Начните сбор данных.
- После окончания измерения, записи кумулянтов результаты диаметра (нм) и индекс полидисперсности. Нормальное результаты, полученные от каждого из 4 повторных показаний и расчета стандартного отклонения.
- Нагрузка 500 мкл 10-кратного разбавленного образца частиц в проточной кювете на дзета-потенциал измерения. Настройте следующие параметры для измерения: раз накопления: 10; Повторите раз: 5; Температура: 25 ° С; Разбавитель: вода; Регулировка интенсивности: авто. Запишите результаты дзета-потенциал (мВ). Среднее значение полученного результата от каждого из 5 повторных чтениях, и вычислить стандартное deviatioп.
3. Количественная оценка SDF-1α в частицах
- Развести в свободной форме SDF-1α в концентрации 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, и 0,05 мг / мл в 1,3 раза Laemmli буфера для образцов. Развести 6 мкл образцов SDF-1α-DS-CS с 40 мкл 1.3x Лэммли буфера для образца. (Подготовка 4x Laemmli запаса буфер, содержащий 0,25 М Трис-HCl, рН 7,5, 8% SDS, 40% глицерина, 0,05 мг / мл бромфенолового синего, и 8% 2-меркаптоэтанола. Разделить маточного раствора в виде небольших аликвот и держать при температуре от -20 ° C для одноразового использования.)
- Тепло образцов при 100 ° С в течение 10 мин. Vortex образцы в два раза (на 10 секунд при максимальной скорости) в течение 10 мин время нагрева для того, чтобы отделить частицы полностью. Охладить образцы до комнатной температуры в течение 2 мин. Центрифуга на 10000 мкг в течение 0,5-1 мин, чтобы сбить водный конденсат. Vortex снова хорошо перемешать.
Примечание: В этот момент раствор образца должно быть ясно, без каких-либо видимого осадка настоящее время. - Загрузить еще 10 &# 181; л образца / хорошо 4-20% SDS гель. Запуск электрофореза на 200 V в течение 20 мин. Пятно гель с голубым Кумасси белков пятно.
- Проверьте плотность полосы белка SDF-1α с помощью молекулярной тепловизором и анализа денситометрия программного обеспечения. Рассчитать количество SDF-1α в частицах по сравнению со стандартной кривой, построенной с бесплатными SDF-1α стандартам.
4. В пробирке Пробирной релиз
- Смешайте SDF-1α гликанов частицы с фосфатным буферным солевым раствором Дульбекко без кальция и магния (D-PBS) в соотношении 1: 1 (объем / объем).
- Разделите суспензии частиц в 0,05 мл аликвоты в 1,5 мл пробирки. Загрузка образцов в нижней части трубы. Избегать введения пузырьков воздуха или нарушения поверхности жидкости. Печать в верхней части трубки с парафильмом.
Примечание: В этом жидкость будет оставаться в нижней во время последующей верхней до нижней вращения на смеситель трубки. - Поворот трубы на 37 и# 176; C на вращающемся Micro-Тюбе Mixer. Удалить аликвот из труб на установленное время и сразу же центрифуги образцов при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
- Отдельные супернатанты и гранул, и восстановить гранул с 0,05 мл D-PBS. Хранить образцы при -20 ° С. После того как все образцы собирали, рассмотрим супернатанты и гранул на геле SDS, как описано выше.
5. Миграция Пробирной
Этот анализ измеряет активность хемотаксиса из SDF-1α. Взаимодействие SDF-1α с его рецептором (CXCR4) на поверхности клетки вызывает миграцию клетки в направлении SDF-1α градиента. В этом анализе клетки загружают в верхнюю лунку (разделенные полупроницаемой мембраной из нижней а) и SDF-1α раствора в нижнюю лунку.
- Развести SDF-1α (бесплатно или частиц связаны, образуют) с миграцией буфера (RPMI-1640, содержащей 0,5% бычьего сывороточного альбумина) в 3-FOLD последовательного разведения до конечных концентраций 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14, и 0,05 нг / мл.
- Добавить 0,6 мл разбавленного раствора SDF-1α или миграции буфер, только (отрицательный контроль), чтобы хорошо в 24-луночного планшета. Добавить 0,57 мл миграции буфера в лунку (входного контроля клетки). Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Поместите проницаемую вставку для культивирования клеток, таких как Transwell (размер пор 5 мкм, диаметр 6,5 мм) в верхней части ниже, а также. Добавить 0,1 мл Jurkat клетки (5 × 10 5) в Transwell вставить. Загрузка 0,03 мл клеток непосредственно в управления вводом клеток также. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 2 ч в 5% CO 2 инкубаторе.
- Снимите вставки Transwell. Передача клетки, которые мигрировали к нижней лунки в 4 мл полистирола трубки. Граф мигрировавших клеток с цитометром потока.
- Рассчитать миграции в процентах от числа входных клеток (количество клеток в контроле клеточной и входного х 100/30) после вычитания чисел в negatив управления (клетки мигрировали в лунках, содержащих только буфер миграции).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Размер и дзета-потенциал подготовленных частиц SDF-1α-DS-CS определяются с помощью анализатора частиц. На рисунке 1 представлен анализ измерения размера. Из результатов, полученных в кумулянтов четыре повторных измерений, средний гидродинамический диаметр частиц SDF-1α-DS-CS является 661 ± 8,2 (нм) и полидисперсность 0,23 ± 0,02. Результат измерения дзета-потенциал показано на фиг.2. Из этих пяти повторных измерений, дзета-потенциал частиц SDF-1α-DS-CS является -24,8 ± 0,5 мВ. Как упоминалось выше, наличие 5% маннита в суспензии SDF-1α-DS-CS частиц имеет важное значение для предотвращения агрегации частиц в процессе замораживания и оттаивания. 3 показана измерение размера частиц, взвешенных в воде и замораживают при -80 ° С. Отчетливый пик агрегации видна после оттаивания.
AMOЕНТ в SDF-1α в частицах SDF-1α-DS-CS оценивается с помощью гель-электрофореза в SDS. 4А показывает Кумасси синий окрашенных SDS гель с SDF-1α стандартов, DS-CS наночастицы (частицы управление без SDF-1α регистрации , Ctrl NP) и SDF-1α-DS-CS наночастиц (SDF-1α NP) образцы загружено. Стандартная кривая строится на основе анализа плотности SDF-1α стандартных диапазонах (рис 4б). Расчет по калибровочной кривой показывает, что концентрация SDF-1α в SDF-1α образца НП составляет 0,03 мг / мл (в среднем двух экземплярах). Поскольку разведение образца с буфера выборки является (6 + 40) / 6, первоначальная концентрация образца 0,23 мг / мл. Как конечный объем препарата частиц составляет 0,2 мл, общий SDF-1α в конечной суспензии составляет 0,046 мг. Учитывая входной массу SDF-1α в реакционной смеси составляет 0,08 мг, эффективность захвата из SDF-1α в частицах DS-CS является 57%. КрошкаОсан уже сообщалось ранее, чтобы окрасить с голубым Кумасси. Окрашивание, однако, не имеет существенного значения в геле, показанной на фиг.4А. Это, возможно, связано с количеством хитозана (матрицы) частиц загруженного на гель. В любом случае, полный диссоциации и разделение SDF-1α из матрицы частиц необходимо для точной оценки количества включенного белка. Этот гель также показывает, что SDF-1α не обнаруживаемой понижена нагреванием при 100 ° С в течение 10 мин или в процессе вихревого, а не полосы не будут найдены между группой белка SDF-1α и перед красителя.
В пробирке скорость высвобождения SDF-1α из наночастиц определяется путем инкубации частиц в 50% D-PBS при 37 ° С в течение 7 дней. В 0 часов, 3 часа, 8 часов, 24 часов, 48 часов и 7 дней, аликвоты образцов были удалены, и сразу же центрифугировали. Выпущен SDF-1α (в супернатанте) отделена от частиц SD-связаннымF-1α (пеллет). Образцы работать на геле SDS, а количество SDF-1α в супернатантах и гранулы определяется Кумасси окрашивания и анализа денситометрии. Типичный SDS гель-анализа показано на фиг.5. Как показано, частица, связанная SDF-1α минимально освобожден после 7-дневной инкубации.
Активность частиц связанного SDF-1α измеряется с помощью анализа миграции (хемотаксическая анализа), а по сравнению с свободного SDF-1α. В этом анализе, SDF-1α в наночастицах DS-CS серийно разводили буфером миграции, и инкубировали с клетками Jurkat в течение 2 ч. В мигрировавших клеток подсчитывают с цитометра потока. Данные (с SDF-1α концентрации 0.05-11 нг / мл) приведены в нелинейный регрессионный фитинг, и ЕС 50 вычисляют. Как показано на фиг.6, связанного с твердыми частицами SDF-1α индуцируется такой же степени, как и миграции свободного SDF-1 ^5; при всех концентрациях измерить. EC 50 значения свободных и связанных с частицами форм SDF-1α являются 0,55 и 0,45 нг / мл, соответственно.
Рисунок 1. Экран анализа выстрел, показывая динамических измерений рассеяния света от размера частиц. Два верхних панелей показывают сюжеты автокорреляционной функции, G2 (τ) и логарифм [G2 (τ) -1] с течением времени. Цифровой процессор сигнала инструмента (коррелятор) выражает обнаруженную интенсивность света в зависимости от времени задержки (τ). График показывает, что SDF-1α-DS-CS частицы вызвало экспоненциальный спад интенсивности между 0,2-2 мс. Чтобы получить константу в среднем распада <Γ>
Рисунок 2. Экран анализа выстрел, показывая электрофореза рассеяние светаИзмерение дзета-потенциала частицы. Верхняя панель показывает G2 (τ) по времени сюжета. Постепенно распадалась осциллирующей функцией, как правило, наблюдается в заряженных частиц, которые подвергают электрофорезу и рассеяния света. Функция отражает сдвиг частоты (доплеровского сдвига), вызванной подвижных частиц в электрическом поле. Преобразование Фурье G2 (τ) дает энергетический спектр (интенсивность в зависимости от частоты участок), показанный в средней панели. Центр пика частотного сдвига определяет подвижность частиц, из которых рассчитывается дзета-потенциал. Расчетное дзета-потенциал показан в нижней части экрана.
Рисунок 3. Измерение частиц размером SDF-1 α-DS-CS частиц после замораживания и оттаивания в воде. При отсутствии маннита, частицы образуют AGgregates после замораживания и оттаивания. Обратите внимание на формирование дополнительной интенсивности / пик численности и увеличение диаметра Кумулянты и полидисперсности по сравнению с, что на рис 1.
Рисунок 4. Количественная оценка SDF-1 α включения в наночастицах DS-CS. () Фотография Кумасси окрашенных SDS гель загружен с бесплатными SDF-1α стандартов, DS-CS наночастицы (Ctrl NP), и SDF-1α-DS- CS наночастиц (SDF-1α НП) Образцы, как указано. В SDF-1α полосы белка и переднего краситель гель работает выделены. Образцы Ctrl NP не окрашивали Кумасси синий и хитозана полос (WIDE) смутно видны. (Б) полосы анализировали с помощью денситометра, из которого стандартная кривая строится со свободными SDF-1α стандартов (в среднем duplicaTE). Количество SDF-1α в наночастиц, рассчитывается относительно стандартной кривой, которая дает среднее значение 0,3 мкг / лунку (10 мкл).
Рисунок 5. SDS гель, показывающий SDF-1 α в пробирке выпуска временной ход. Кумасси-SDS гель окрашивали показывает количество выпущенной SDF-1α (в супернатантах) и связанного SDF-1α (в гранулах) после инкубации SDF-1α-DS -Cs наночастицы при 37 ° С в течение различных периодов времени. Re-печатается с разрешения 9.
Рисунок 6. Кривые доза-ответ из SDF-1 α (кружки) и SDF-1α наночастицы (NP) (квадраты) в Jurkat клеточной миграции анализа. SDF-1α в свободной и наночастицы, связанные дляMS выставлен такой же активностью с EC 50 значений 0,55 и 0,45 нг / мл, соответственно. Re-печатается с разрешения 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как упоминалось выше, наночастицы DS-CS сформированы с помощью нейтрализации заряда между полианиона (DS) и поликатиона (CS) молекул. Поскольку взаимодействие заряда происходит легко при молекулярном столкновения, концентрация полимерных растворов и перемешивание скорости во время смешивания имеет решающее значение для размера получаемых частиц. Общая тенденция состоит в том, что более разбавляют DS и CS решения 15 и более высокий результат скорости перемешивания в более мелкие частицы.
Формулировка SDF-1α гликанов наночастиц может изменяться. Например, суммы и соотношения SDF-1α / DS / CS, используемые в настоящем Протоколе 0,08 / 0,33 / 1 (мг / мг / мг), соответственно. В зависимости от предполагаемого использования наночастиц SDF-1α, эти отношения могут меняться. Если количество SDF-1α добавляют к смеси 0,04 мг (0,04 / 0,33 / 1, мг / мг / мг) вместо 0,08 мг, частицы будут меньше, ~ 650 нм, и SDF-1α захват эффективность несколько гля большей, 70-80% 9. Тем не менее, при поставке в естественных условиях, большее количество гликанов в матрице будет присутствовать в SDF-1α. Если размер частиц меньше, желательно, оформление SDF-1α гликанов наночастиц может быть дополнительно модифицированы. Один из вариантов заключается в использовании меньший молекулярный вес хитозан, как показано в работе 15. Следует отметить, однако, что хитозан имеет высокое сродство к эндотоксина (отрицательно заряженные липополисахариды); Таким образом, тест на уровне эндотоксина или потенциально очистки является необходимым для использования каких-либо продуктов хитозана до поставки в естественных условиях. Второй вариант заключается в загрузке SDF-1α на предварительно образованных наночастиц небольших DS-CS. Поскольку последний можно манипулировать легче по размеру частиц и SDF-1α имеет высокое сродство к DS, загрузка небольшое количество SDF-1α к внешней оболочке частиц DS-CS может привести к более мелких частиц.
По сравнению с другими типаминаночастицы (например, PLGA 11, полиангидрид 12, или желатин 13 наночастицы), наночастицы DS-CS имеют свои преимущества и недостатки. Основные преимущества наночастиц DS-CS являются: 1) подготовка частица не включать органические растворители или сильное ультразвуком. Это, следовательно, подходит для введения белкового фактора, как нежный препарат уменьшает вероятность инактивации белка; 2) матрица частиц имеет аналогичные структурные свойства, как внеклеточного матрикса, что делает частицы совместимыми с окружающей средой ткани и менее токсичен и воспалительные; и 3) гликановые связанных с частицами SDF-1α имитирует естественный связывание отношения между белком и внеклеточного матрикса, который объясняет полное хемотактическую деятельность SDF-1α после их включения в гликановых частиц. Полностью активным SDF-1α в частицы-связанной форме позволяет ему служить в качестве стационарного фактора наведения в тканевой еnvironment. Ограничения наночастиц DS-CS являются: 1) диаметры частиц, как правило, больше, чем в указанных выше частиц; и 2) в растворах солей, которые не могут быть пригодны для прямого введения в кровоток легко разрушаются.
SDF-1α связанного с твердыми частицами будет обнаружено, что минимально освобожден от наночастиц после семи дней инкубации. Это явление связано с высоким сродством SDF-1α для гепарина, что также способствует его функции в живом организме. С белки с гепарином связывающих доменов, как правило, имеют различные сродство к гепарин, их скорости высвобождения, скорее всего, отличаются. Например, в VEGF 165 -DS-CS наночастиц получали аналогичным композиции, 44% от объединенного VEGF 165 был выпущен в течение первого часа и 29% был выпущен в следующем 47 ч при инкубации при 37 ° С 14. Таким образом, выпуск модели в пробирке в течение определенного протEin необходимо индивидуально проверены.
Цель подготовки наночастиц SDF-1α-DS-CS является предоставление SDF-1α в легкие и установить сигнал стволовых клеток самонаведения в ткани. Частицы также могут быть доставлены в другие ткани для той же самой цели, хотя конкретный формат наночастиц не требуется для инъекции твердого ткани. Тот факт, что SDF-1α стабилизируется DS в матрице наночастиц и минимально выпущен из частиц поддерживает стволовые клетки принципы найма, и частица, как ожидается, будет полезным для регенерации тканей.
Поскольку наночастицы белка-гликанов имеют аналогичную матрицу, что клеточной поверхности гликозаминогликанов и внеклеточного матрикса, вполне возможно, что белки частиц, включены могут быть обменены в этих матриц (Отрицательно заряженные молекулы внеклеточного матрикса могут конкурировать со связыванием положительно заряженный белок) в естественных условиях в пробирке характеристики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH гранты: HL671795, HL048743 и HL108630.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 | |
Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 | |
Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 | |
D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 | |
SDF-1α | Prepared according to reference 8. | ||
Syringe filter, PES membrane 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | |
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 | |
Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 | |
Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | ||
Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 | |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 | |
GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 | |
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 | |
Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 | |
Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
References
- Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
- Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).
- Yue, Z. G., et al. Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).
- Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).
- Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).
- Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex. J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).
- Amara, A., et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).
- Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).
- Yin, T., et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).
- Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).
- McCall, R. L., Sirianni, R. W. PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS. J Vis Exp. (82), 51015 (2013).
- Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles. J Vis Exp. (65), 3967 (2012).
- Xu, J., Amiji, M. Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles. J Vis Exp. (59), e3612 (2012).
- Lauten, E. H., et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).
- Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes. Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).