Introduction
كبريتات ديكستران (DS) والشيتوزان (CS) هي السكريات مع عدة مجموعات استبداله سلفات سالبة الشحنة (في DS)، أو مجموعات أمين موجبة الشحنة (deacetylated CS). عندما مختلطة في محلول مائي، والسكريات اثنين تشكل المجمعات متضاعف الكتروليتي من خلال التفاعلات كهرباء. المجمعات الناتجة قد شكل المجاميع الكبيرة التي سيتم فصل-التخلص من محلول مائي (رواسب)، أو الجسيمات الصغيرة التي هي المياه التشتت (الغروية). الظروف الخاصة التي تساهم في هذه النتائج وقد تم دراسة على نطاق واسع، كما تم تلخيص وتوضيح بالتفصيل في استعراض حديث 1. ومن بين هذه الشروط، واثنين من المتطلبات الأساسية لإنتاج جزيئات الماء تبعثر هي يجب أن 1) لديهم البوليمرات اتهم معاكس مختلفة إلى حد كبير الكتلة المولية. و 2) أن تكون مختلطة في نسبة غير متكافئة. هذه الظروف ستسمح للقطاعات البوليمرية المعقد المسؤول محايد الناتجة عن تهمةتحييد لفصل وتشكل جوهر الجسيمات، والبوليمر الزائد لتشكيل الغلاف الخارجي 1. المقصود من تلك الجسيمات غليكان الموصوفة في هذا البروتوكول للتسليم الرئوي، وتهدف إلى أن تكون صافية سالبة الشحنة، وذات أبعاد نانومتر. التهمة سطح السلبي يقلل من احتمال امتصاص الخلايا للجسيمات 2،3. الجسيمات البعد نانومتر تسهيل المرور عبر الممرات الهوائية البعيدة. لتحقيق هذا الهدف، ومقدار DS المستخدمة في هذا المستحضر هو ما يزيد من CS (نسبة الوزن 3: 1)؛ وعالية الوزن الجزيئي DS (الوزن المتوسط MW 500،000) ومنخفضة الوزن الجزيئي CS (المدى MW 50-190 كيلو دالتون، 75-85٪ deacetylated) وتستخدم.
SDF-1α عامل صاروخ موجه الخلايا الجذعية، والذي يمارس وظيفة صاروخ موجه من خلال نشاطها الكيميائي. SDF-1α يلعب دورا هاما في صاروخ موجه وصيانة الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع العظام، وتوظيف PROGEخلايا nitor إلى الأنسجة الطرفية لإصلاح إصابة 4،5. SDF-1α له موقع ملزم الهيبارين في تسلسل البروتين، مما يسمح للبروتين لربط الهيبارين / كبريتات heparan، dimers النموذج، تكون محمية من البروتيني (CD26 / DPPIV) تعطيل، وتتفاعل مع الخلايا المستهدفة من خلال مستقبلات سطح الخلية 6-8. DS له خصائص هيكلية مماثلة الهيبارين / كبريتات heparan. وبالتالي فإن الربط من قوات الدفاع الذاتى-1α لDS تكون مماثلة لتلك التي بروابط لها البوليمرية الطبيعية.
في بروتوكول التالية، ونحن تصف إعداد النانوية SDF-1α-DS-CS. وتمثل الإجراءات احدة من الصيغ التي تم دراستها سابقا 9. ويتم تكييف البروتوكول في الأصل من التحقيق النانوية VEGF-DS-CS 10. ووصف إعداد نطاق ضيق، والتي يمكن زيادتها بسهولة مع حلول الأسهم نفسها وظروف التحضير. بعد التحضير، وتتميز الجزيئات بذ فحص حجمها، وإمكانات زيتا ومدى التأسيس SDF-1α، في المختبر الافراج عن الوقت، ونشاط دمج قوات الدفاع الذاتى-1α.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد SDF-1α غليكان النانوية
ونظرا لغرض في الجسم الحي التسليم، وتعقيم جميع الحاويات، الماصات، ونصائح المستخدمة في إعداد.
- إعداد الحلول الأسهم التالية في عالى النقاء المياه: 1٪ كبريتات ديكستران. 1 M هيدروكسيد الصوديوم (العقيمة التي تمت تصفيتها مع غشاء PES)؛ 0.1٪ الشيتوزان في 0.2٪ حمض الخليك الجليدي (فلتر من خلال 0.8 و 0.22 ميكرون مرشحات على التوالي، وضبط درجة الحموضة إلى 5.5 مع هيدروكسيد الصوديوم بعد ذلك)؛ 0.1 M ZnSO 4؛ 15٪ مانيتول، و0.92 ملغ / مل SDF-1α (المخزنة في aliquots في 80 ° C، والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية إذابة مرة واحدة).
- تعقيم حلول الأوراق المالية من خلال 0.22 ميكرون أغشية الترشيح. تقييم مستويات الذيفان الداخلي في حل استعداد مع الليمول خلية أميبية الشكل المحللة (LAL) هلام تجلط الفحص. تأكد من أن مستويات هي <0.06 EU / مل.
- إضافة 0.18 مل عالى النقاء المياه للكوب 1.5 مل قارورة تحتوي على شريط مغناطيسي. ضبط سرعة ضجة في 800 دورة في الدقيقة. إضافة 0.1 مل 1٪كبريتات ديكستران وتحرك المكونات لمدة 2 دقيقة. إضافة 0.08 ملغ SDF-1α (0.087 مل من 0.92 ملغ / مل SDF-1α الحل) ويقلب لمدة 20 دقيقة.
- إضافة 0.33 مل 0.1٪ الشيتوزان قطرة قطرة ويقلب لمدة 5 دقائق. تغيير السرعة ضجة إلى أقصى حد وإضافة 0.1 مل 0.1 M ZnSO 4 ببطء مع حقنة 0.1 مل (أكثر من 1 دقيقة).
- العودة سرعة ضجة إلى 800 دورة في الدقيقة ويقلب لمدة 30 دقيقة. إضافة 0.4 مل 15٪ مانيتول ويقلب لمدة 5 دقائق. نقل خليط التفاعل إلى أنبوب 1.5 مل microfuge. الطرد المركزي في 16،000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: إن وجود مانيتول يسهل إعادة تعليق من الجسيمات بعد الطرد المركزي. اعتمادا على الاكتناز من بيليه، يمكن أن تختلف تركيز مانيتول من 0٪ إلى 5٪. إعادة تعليق كامل للجسيمات بعد كل الطرد المركزي أمر بالغ الأهمية لتجنب المجاميع في تعليق النهائي. - نضح طاف واستخدام ماصة لإزالة آخر قطرة من السائل ببطء. إضافة 0.2 مل 5٪ مانيتول. تعليق بيليه مع 0.5 مل، 29 G نيحقنة DLE. إضافة 1 مل 5٪ مانيتول. أجهزة الطرد المركزي في 16،000 x ج لمدة 15 دقيقة.
- كرر الخطوة 1.6.
- نضح طاف. Resuspend وبيليه في 0.2 مل 5٪ مانيتول. تخزين تعليق الجسيمات في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: تعليق الجسيمات يمكن أيضا تخزينها في المجمد -80 ° C أو مجفف بالتجميد. بما في ذلك 5٪ مانيتول في تعليق ضروري لمنع تجميع الجسيمات بعد تجميد والذوبان أو بعد تجفيد والإماهة. يمكن إزالتها مانيتول بواسطة الطرد المركزي للتعليق بعد التخزين.
2. قياس حجم الجسيمات وزيتا المحتملة
ويتم تحليل حجم الجسيمات وزيتا المحتملة من قبل ديناميكية تشتت الضوء وتشتت الضوء الكهربي، على التوالي، مع محلل الجسيمات هو مبين في قائمة المواد.
- إعداد المعلمات التالية لقياس حجم الجسيمات: مرات تراكم: 70. كرر مرات: 4؛ درجة الحرارة: 25 ° C.مخفف: المياه؛ كثافة التعديل: السيارات.
- تمييع عينة SDF-1α-DS-CS مع الماء (التخفيف 10 أضعاف). تحميل 100 ميكرولتر من العينة إلى كوفيت الأشعة فوق البنفسجية يمكن التخلص منها مثل كفيت إيبندورف. إدراج كفيت في حامل الخلية. انتظر لتعديل كثافة للوصول إلى "الأمثل" (~ 10،000 من القانون الجنائي). بدء الحصول على البيانات.
- بعد الانتهاء من القياس، تسجيل نتائج cumulants من قطر (نانومتر) ومؤشر التشتت المتعدد. متوسط النتائج المتحصل عليها من كل من القراءات المتكررة 4 وحساب الانحراف المعياري.
- تحميل 500 ميكرولتر من 10 أضعاف المخفف عينة الجسيمات إلى خلية تدفق لقياس المحتملة زيتا. إعداد المعلمات التالية لقياس: مرات تراكم: 10؛ كرر مرات: 5؛ درجة الحرارة: 25 ° C. مخفف: المياه؛ كثافة التعديل: السيارات. تسجيل نتائج إمكانات زيتا (بالسيارات). متوسط النتيجة التي حصل عليها من كل من قراءات متكررة 5، وحساب deviatio القياسيةن.
3. الكمي لقوات الدفاع الذاتى-1α في الجسيمات
- تمييع مجانا شكل قوات الدفاع الذاتى-1α لتركيزات من 0.01، 0.02، 0.03، 0.04، و 0.05 ملغ / مل في 1.3x Laemmli عينة العازلة. تمييع 6 ميكرولتر عينات SDF-1α-DS-CS مع 40 ميكرولتر 1.3x Laemmli عينة العازلة. (إعداد 4X Laemmli عازلة الأسهم التي تحتوي على 0.25 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 8٪ SDS، الجلسرين 40٪، 0.05 ملغ / مل برموفينول الأزرق، و 8٪ 2-المركابتويثانول. يقسم الحل الأسهم إلى مأخوذة الصغيرة والحفاظ على -20 ° C للاستخدام مرة واحدة).
- تسخين العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. دوامة العينات مرتين (كل لمدة 10 ثانية في أقصى سرعة) خلال فترة التسخين 10 دقيقة من أجل فصل الجزيئات تماما. تهدئة عينات لRT لمدة 2 دقيقة. الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 0.5-1 دقيقة لاسقاط المكثفات المياه. دوامة مرة أخرى إلى المزيج جيدا.
ملاحظة: عند هذه النقطة، يجب أن يكون الحل عينة واضح مع أي راسب مرئية الحاضر. - تحميل 10 &# 181؛ ل عينة / جيد إلى 4-20٪ هلام SDS. تشغيل الكهربائي في 200 V لمدة 20 دقيقة. وصمة عار الجل مع Coomassie الأزرق البروتين وصمة عار.
- فحص كثافة الفرقة البروتين من قوات الدفاع الذاتى-1α باستخدام الجزيئي تصوير وتحليل كثافة البرامج. حساب كمية من قوات الدفاع الذاتى-1α في الجسيمات ضد منحنى القياسية التي شيدت مع معايير SDF-1α الحرة.
4. في المختبر الإصدار الفحص
- خلط جزيئات غليكان SDF-1α مع الفوسفات مخزنة المالحة Dulbecco ودون الكالسيوم والمغنيسيوم (D-PBS) في نسبة 1: 1 (ت / ت).
- تقسيم تعليق الجسيمات إلى 0.05 مل مأخوذة في 1.5 مل أنابيب. تحميل العينات إلى أسفل الأنابيب. تجنب إدخال فقاعات الهواء أو إزعاج سطح السائل. ختم الجزء العلوي من الأنابيب مع بارافيلم.
ملاحظة: في القيام بذلك، سوف يظل السائل في أسفل أثناء الدوران من أعلى إلى أسفل لاحق على خلاط أنبوب. - تدوير أنابيب في 37 و# 176؛ C على الدوارة الصغيرة أنبوب خلاط. إزالة مأخوذة من الأنابيب في الأوقات المعينة وأجهزة الطرد المركزي على الفور العينات عند 16،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- فصل supernatants والكريات، وإعادة تشكيل بيليه مع 0.05 مل D-PBS. تخزين العينات في -20 ° C. بعد أن يتم جمع كل العينات، دراسة supernatants والكريات على هلام SDS كما هو موضح أعلاه.
5. هجرة الفحص
ويقيس هذا الاختبار النشاط الكيميائي لقوات الدفاع الذاتى-1α. تفاعل SDF-1α مع مستقبلات لها (CXCR4) على سطح الخلية يسبب هجرة الخلية نحو الانحدار SDF-1α. في هذا الاختبار، يتم تحميل الخلايا في بئر العلوي (مفصولة غشاء نصف نافذ من أقل أيضا) حل وSDF-1α إلى أقل أيضا.
- تمييع SDF-1α (مجانا أو شكل محدد الجسيمات) مع العازلة الهجرة (متوسطة RPMI-1640 تحتوي على 0.5٪ ألبومين المصل البقري) في 3-FOالتخفيف المتسلسل دينار لتركيزات النهائية من 100، 33، 11، 3.7، 1.2، 0.41، 0.14، و 0.05 نانوغرام / مل.
- إضافة 0.6 مل من محلول SDF-1α المخفف أو عازلة الهجرة فقط (المراقبة السلبية) إلى بئر في لوحة 24-جيدا. إضافة 0.57 مل عازلة الهجرة إلى بئر (سيطرة خلية الإدخال). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وضع نفاذية إدراج الثقافة الخلية مثل Transwell (حجم المسام 5 ميكرون، وقطرها 6.5 ملم) على أعلى من أقل أيضا. تحميل 0.1 مل خلايا Jurkat (5 × 10 5) في Transwell إدراج. تحميل 0.03 مل الخلايا مباشرة لسيطرة خلية إدخال جيدا. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في 5٪ CO 2 الحاضنة.
- إزالة إدراج Transwell. نقل الخلايا التي هاجروا إلى انخفاض الآبار إلى أنبوب البوليسترين 4 مل. عد الخلايا هاجر مع عداد الكريات التدفق.
- حساب الهجرة كنسبة مئوية من عدد الخلايا الإدخال (عدد الخلايا في السيطرة خلية إدخال جيدا س 100/30) بعد الطرح من الأرقام في negatإيف الضوابط (خلايا هاجروا إلى الآبار التي تحتوي عازلة الهجرة الوحيد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تحديد حجم وزيتا إمكانات مستعدة الجسيمات SDF-1α-DS-CS مع محلل الجسيمات الشكل 1 يوضح تحليل قياس الحجم. من نتائج cumulants تم الحصول عليها من أربعة القياسات المتكررة، فإن متوسط قطرها الهيدروديناميكية من الجسيمات SDF-1α-DS-CS هو 661 ± 8.2 (نانومتر) والتشتت المتعدد هو 0.23 ± 0.02. وأظهرت نتيجة قياس المحتملة زيتا في الشكل 2. من القياسات خمسة المتكررة، وإمكانات زيتا من الجسيمات SDF-1α-DS-CS هي -24.8 ± 0.5 بالسيارات. وكما ذكر أعلاه، فإن وجود 5٪ مانيتول في الجسيمات تعليق SDF-1α-DS-CS ضروري للوقاية من الجسيمات تجميع خلال عملية التجميد والذوبان. ويبين الشكل 3 قياس حجم الجسيمات العالقة في المياه وتجميدها في -80 ° C. ذروة تجميع متميزة مرئيا بعد الذوبان.
وعموويقدر الاتحاد الوطني للعمال من قوات الدفاع الذاتى-1α في الجسيمات SDF-1α-DS-CS بواسطة SDS هلام الكهربائي. ويبين الشكل 4A على Coomassie الأزرق الملطخة هلام SDS مع المعايير قوات الدفاع الذاتى 1α، DS-CS جسيمات متناهية الصغر (جزيئات السيطرة من دون دمج قوات الدفاع الذاتى-1α ، والسيطرة NP) وقوات الدفاع الذاتى-1α-DS-CS جسيمات متناهية الصغر (SDF-1α NP) عينات تحميلها. هي التي شيدت منحنى قياسي من تحليل كثافة العصابات القياسية SDF-1α (الشكل 4B). حساب من المنحنى القياسي يشير إلى أن تركيز قوات الدفاع الذاتى-1α في العينة NP-SDF 1α هو 0.03 ملغ / مل (متوسط مكررة). منذ التخفيف من العينة مع عينة العازلة هو (6 + 40) / 6، وتركيز العينة الأصلي هو 0.23 ملغ / مل. وبما أن الحجم النهائي من إعداد الجسيمات 0.2 مل، ومجموع SDF-1α في تعليق النهائي هو 0.046 ملغ. وبالنظر إلى كتلة مدخلات SDF-1α في خليط التفاعل هو 0.08 ملغ، وكفاءة انحباس SDF-1α في الجسيمات DS-CS هو 57٪. فتاة وقحةتم اوسان عنها سابقا إلى وصمة عار مع Coomassie الأزرق. تلطيخ، ومع ذلك، ليست كبيرة في هلام هو مبين في الشكل 4A. هو، ربما، يعود ذلك إلى كمية من الشيتوزان (الجسيمات المصفوفة) محملة على هلام. في أي حال، والتفكك الكامل والفصل بين قوات الدفاع الذاتى-1α من مصفوفة الجسيمات ضروري لتقييم دقيق لكمية من البروتين يدمج. ويظهر هذا الجل أيضا أن قوات الدفاع الذاتى-1α ألا تتدهور detectably عن طريق التسخين في 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة أو عن طريق عملية دوامة، كما لم يتم العثور على العصابات بين قوات الدفاع الذاتى-1α الفرقة البروتين والجبهة صبغ.
يتم تحديد في المختبر معدل إطلاق SDF-1α من الجسيمات النانوية التي كتبها حضانة للجسيمات في 50٪ D-PBS عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام. في 0 ساعة، 3 ساعات، 8 ساعة، 24 ساعة، 48 ساعة و 7 أيام، يتم إزالة aliquots من العينات وطرد على الفور. يتم فصل صدر SDF-1α (في طاف) من المؤتلفة مع الجزيئات SDF-1α (بيليه). يتم تشغيل عينات على هلام SDS، ومقدار SDF-1α في supernatants ويتم تحديد الكريات التي كتبها Coomassie تلطيخ وتحليل كثافة. ويرد جل SDS نموذجية للتحليل في الشكل 5. كما يتبين، أن يتم الافراج عن الجسيمات ملزمة SDF-1α الحد الأدنى بعد حضانة لمدة 7 أيام.
ويقاس النشاط للبالجسيمات SDF-1α التي كتبها مقايسة الهجرة (الفحص الكيميائي)، ومقارنة بما كان عليه مجانا SDF-1α. في هذا الاختبار، يتم تخفيف SDF-1α في النانوية DS-CS متسلسل مع العازلة الهجرة، وحضنت مع الخلايا Jurkat لمدة 2 ساعة. تحسب الخلايا هاجر مع عداد الكريات التدفق. يتم رسم البيانات (مع تركيزات قوات الدفاع الذاتى 1α من 0،05-11 نانوغرام / مل) مع الانحدار غير الخطية المناسب، ويتم احتساب EC 50. كما هو مبين في الشكل (6)، والمرتبطة بالجزيئات SDF-1α يسببها بنفس القدر من الهجرة كما أن حرية SDF-1 ^5؛ في جميع التركيزات المقاسة. قيم EC 50 من أشكال حرة ومحددة الجسيمات من قوات الدفاع الذاتى-1α هي 0.55 و 0.45 نانوغرام / مل على التوالي.
أطلقت الشكل 1. الشاشة تظهر دينامية تحليل قياس تشتت الضوء من حجم الجسيمات. وتظهر اثنين من كبار وحات المؤامرات وظيفة الارتباط الذاتي، G2 (τ)، ووغاريتم [G2 (τ) -1] مع مرور الوقت. معالج الاشارات الرقمية الصك (خاسسرح) يعبر عن شدة الضوء الكشف عن كدالة للزمن التأخير (τ). وتظهر المؤامرة التي الجسيمات SDF-1α-DS-CS تسبب اضمحلال الأسي لكثافة بين 0،2-2 مللي ثانية. للحصول على ثابت متوسط تسوس <Γ>
أطلقت الشكل 2. تحليل الشاشة تظهر تشتت الضوء الكهربيقياس إمكانات زيتا الجسيمات. وتظهر اللوحة العلوية في G2 (τ) على مدى مؤامرة الوقت. وعادة ما يلاحظ وظيفة تتأرجح المتحللة تدريجيا في الجسيمات المشحونة التي تخضع لالكهربائي وتشتت الضوء. وتعكس وظيفة التحول التردد (دوبلر التحول) التي تسببها الجزيئات تتحرك في مجال كهربائي. وتحول فورييه من G2 (τ) يعطي طيف الطاقة (كثافة مقابل مؤامرة التردد) يظهر في لوحة المتوسطة. وسط ذروة التحول تردد يحدد حركة الجزيئات، والتي يتم احتساب إمكانات زيتا. ويظهر إمكانات زيتا المحسوبة في الجزء السفلي من الشاشة.
الشكل 3. الجسيمات قياس حجم قوات الدفاع الذاتى-1 α-DS-CS الجسيمات بعد تجميد والذوبان في الماء. وفي غياب مانيتول، والجسيمات تشكل AGgregates بعد تجميد والذوبان. لاحظ تشكيل إضافية الكثافة / حجم الذروة والزيادة في cumulants قطر والتشتت المتعدد مقارنة بما كان عليه في الشكل 1.
الشكل 4. الكمي لقوات الدفاع الذاتى-1 α التأسيس في النانوية DS-CS. (A) صورة من Coomassie الملون وهلام SDS محملة معايير SDF-1α الحرة، DS-CS جسيمات متناهية الصغر (السيطرة NP)، وقوات الدفاع الذاتى-1α-DS- CS جسيمات متناهية الصغر (SDF-1α NP) عينات كما هو مبين. يتم وضع علامة على العصابات البروتين قوات الدفاع الذاتى 1α وهلام تشغيل جبهة صباغة. لا ملطخة العينات السيطرة NP مع Coomassie الأزرق والعصابات الشيتوزان (واسعة) تكون مرئية بشكل غامض. ويتم تحليل (B) والعصابات مع قياس شدة الضوء، والتي يتم إنشاء منحنى القياسية مع المعايير قوات الدفاع الذاتى 1α مجانية (المتوسط duplicaالشركة المصرية للاتصالات). ويتم احتساب مبلغ SDF-1α في النانوية ضد المنحنى القياسي، الذي يعطي متوسط قيمة 0.3 ميكروغرام / جيد (10 ميكرولتر).
الشكل 5. SDS هلام تظهر SDF-1 α في المختبر الإفراج بالطبع الوقت. Coomassie الملطخة SDS هلام يظهر مبلغ صدر SDF-1α (في supernatants) والمربوطة SDF-1α (في الكريات) بعد حضانة SDF-1α-DS النانوية -CS عند 37 درجة مئوية لفترات مختلفة من الزمن. إعادة طبع بإذن من 9.
الشكل 6. منحنيات الجرعة والاستجابة لقوات الدفاع الذاتى-1 α (الدوائر) وقوات الدفاع الذاتى-1α جسيمات متناهية الصغر (NP) (المربعات) في Jurkat فحص الهجرة الخلية. SDF-1α في كل مجانا وجسيمات متناهية الصغر متجهة إلىمللي عرضت نفس النشاط مع EC 50 قيم 0.55 و 0.45 نانوغرام / مل على التوالي. إعادة طبع بإذن من 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما ذكر أعلاه، يتم تشكيل النانوية DS-CS من خلال تحييد تهمة بين polyanion (DS) وpolycation (CS) الجزيئات. منذ التفاعل تهمة يحدث بسهولة خلال الاصطدام الجزيئية، وتركيز الحلول البوليمر وسرعة التحريك أثناء الخلط هو أمر حاسم لحجم الجسيمات الناتجة. والاتجاه العام هو أن أكثر المخفف DS وCS حلول 15 وأعلى نتيجة سرعة التحريك في جسيمات أصغر.
يمكن أن تختلف صياغة النانوية غليكان SDF-1α. على سبيل المثال، للمبالغ ونسب SDF-1α / DS / CS المستخدمة في هذا البروتوكول هي 0.08 / 0.33 / 1 (ملغ / ملغ / ملغ)، على التوالي. اعتمادا على الاستخدام المقصود من الجسيمات النانوية SDF-1α، يمكن لهذه النسب تتغير. إذا كان مقدار SDF-1α تضاف إلى الخليط هو 0.04 ملغ (0.04 / 0.33 / 1، ملغ / ملغ / ملغ) بدلا من 0.08 ملغ، الجزيئات سوف يكون أصغر حجما، ~ 650 نانومتر، وكفاءة باعتلالات انحشار SDF-1α قليلا زreater، 70-80٪ 9. ومع ذلك، وعندما سلمت في الجسم الحي، وأكبر كمية من المصفوفة غليكان تكون موجودة في SDF-1α. إذا كان المطلوب حجم الجسيمات أصغر، وصياغة-SDF 1α النانوية غليكان يمكن تعديل أبعد من ذلك. بديل واحد هو استخدام أصغر الجزيئي والشيتوزان الوزن، كما هو موضح في المرجع 15. وتجدر الإشارة، مع ذلك، أن الشيتوزان لديه قابلية عالية للالذيفان الداخلي (سالبة الشحنة lipopolysaccharides)؛ وبالتالي، اختبارا لمستوى الذيفان الداخلي أو يحتمل أن تكون تنقية ضروري لاستخدام أي من منتجات الشيتوزان قبل في الجسم الحي التسليم. البديل الثاني هو لتحميل SDF-1α على ما قبل تشكيل الصغيرة النانوية DS-CS. حيث أن الأخير يمكن التلاعب بها بسهولة أكبر في حجم الجسيمات وSDF-1α لديها قابلية عالية للDS، تحميل كمية صغيرة من قوات الدفاع الذاتى-1α إلى الغلاف الخارجي للجسيمات DS-CS يمكن أن يؤدي إلى جسيمات أصغر.
مقارنة مع أنواع أخرى منالنانوية (على سبيل المثال، PLGA 11، polyanhydride 12، أو الجيلاتين 13 النانوية)، والجسيمات النانوية DS-CS لها مزايا وقيود معينة. أهم مزايا النانوية DS-CS هي: 1) لا تشمل إعداد الجسيمات المذيبات العضوية أو صوتنة قوية. ولذلك، ومناسبة لعامل البروتين التأسيس، كتحضير لطيف يقلل من احتمال تعطيل البروتين. 2) مصفوفة من الجسيمات لها خاصية هيكلية مشابهة مثل المصفوفة خارج الخلية، مما يجعل جزيئات متوافقة مع البيئة الأنسجة وأقل سمية والتهابات. و3) غليكان محددة الجسيمات يقلد SDF-1α علاقة ملزمة الطبيعية بين البروتين والمصفوفة خارج الخلية، وهو ما يفسر النشاط الكيميائي الكامل لقوات الدفاع الذاتى-1α بعد أن تدرج في جزيئات غليكان. ونشط بشكل كامل SDF-1α في شكل محدد الجسيمات يسمح لها أن تكون بمثابة عامل صاروخ موجه ثابتة في الأنسجة البريدnvironment. القيود المفروضة على الجسيمات النانوية DS-CS هي: 1) بأقطار من الجسيمات هي أكبر عموما من الجزيئات المذكورة أعلاه؛ و2) تنهار بسهولة في الحلول الملح، والتي قد لا تكون مناسبة للحقن المباشر في الدورة الدموية.
تم العثور على SDF-1α المرتبطة بالجزيئات التي ستصدر الحد الأدنى من الجسيمات النانوية بعد حضانة لمدة سبعة أيام. ويرتبط هذا الظاهرة إلى تقارب عالية من قوات الدفاع الذاتى-1α لالهيبارين، والذي يساهم أيضا في وظيفتها في الجسم الحي. منذ البروتينات مع مجالات ملزمة الهيبارين سيكون عموما الانتماءات المختلفة للالهيبارين، ومن المرجح أن تختلف معدلات إطلاق سراحهم. على سبيل المثال، في VEGF 165 -DS-CS جسيمات متناهية الصغر أعدت في صيغة مشابهة، تم الإفراج عن 44٪ من VEGF أدرجت 165 في الساعة الأولى، وأفرج عنه 29٪ في 47 ساعة القادمة خلال الحضانة عند 37 درجة C 14. ولذلك، فإن نمط الافراج عنه في المختبر لالبروتوكول الاضافي محددعين يحتاج لفحصها بشكل فردي.
والغرض من إعداد النانوية SDF-1α-DS-CS هو تقديم SDF-1α إلى الرئة وإنشاء الخلايا الجذعية إشارة صاروخ موجه في الأنسجة. ويمكن أيضا أن يتم تسليم الجزيئات إلى الأنسجة الأخرى لنفس الغرض، على الرغم من أن شكل جسيمات متناهية الصغر محدد غير مطلوب للحقن الأنسجة الصلبة. حقيقة أن قوات الدفاع الذاتى-1α يستقر بواسطة DS في مصفوفة جسيمات متناهية الصغر ويتم تحرير الحد الأدنى من الجسيمات يدعم وقف المبادئ تجنيد خلية، ومن المتوقع أن يكون مفيدا لتجديد الأنسجة الجسيم.
منذ النانوية البروتين غليكان لديها مصفوفة مماثلة لتلك التي الجليكوزامينوجليكان سطح الخلية والمصفوفة خارج الخلية، فمن الممكن أن البروتينات دمج الجسيمات يمكن تبادل في هذه المصفوفات (ويمكن للجزيئات المصفوفة خارج الخلية سالبة الشحنة تتنافس مع الملزم للإيجابيا البروتين مشحونة) في الجسم الحي في توصيف المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل عن طريق منح المعاهد الوطنية للصحة: HL671795، HL048743، وHL108630.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 | |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 | |
| SDF-1α | Prepared according to reference 8. | ||
| Syringe filter, PES membrane 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | |
| Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 | |
| Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 | |
| Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | ||
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 | |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 | |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 | |
| Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
References
- Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
- Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).
- Yue, Z. G., et al. Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).
- Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).
- Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).
- Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex. J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).
- Amara, A., et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).
- Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).
- Yin, T., et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).
- Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).
- McCall, R. L., Sirianni, R. W. PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS. J Vis Exp. (82), 51015 (2013).
- Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles. J Vis Exp. (65), 3967 (2012).
- Xu, J., Amiji, M. Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles. J Vis Exp. (59), e3612 (2012).
- Lauten, E. H., et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).
- Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes. Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).
