Introduction
Dextransulfat (DS) og chitosan (CS) er polysaccharider med flere substituerede negativt ladede sulfatgrupper (i DS) eller positivt ladede aminogrupper (deacetyleret CS). Når den blandes i en vandig opløsning, de to polysaccharider danner polyelektrolytkomplekser gennem elektrostatiske interaktioner. De resulterende komplekser kan danne store aggregater, der vil blive faseadskilt fra den vandige opløsning (bundfald), eller små partikler, der er vanddispergerbare (kolloider). De særlige betingelser, der bidrager til disse resultater er blevet grundigt undersøgt, og er blevet sammenfattet og illustreret i detaljer i en nylig undersøgelse 1. Blandt disse betingelser er de modsat ladede polymerer skal 1) have væsentligt forskellige molarmasse to grundlæggende krav til produktion af vanddispergerbare partikler; og 2) blandes i en ikke-støkiometrisk forhold. Disse betingelser vil give charge-neutral kompleksbundne polymere segmenter genereret af afgiftneutralisering for at adskille og danner kernen af partiklen, og overskydende polymer for at danne den ydre skal 1. Glycanen partikler er beskrevet i denne protokol er beregnet til pulmonal levering, og er designet til at være netto negativt ladet, og nanometer dimensioner. Den negative overfladeladning reducerer sandsynligheden for cellulære optagelse af partiklerne 2,3. Partikler af nanometer dimension lette passagen gennem de distale luftveje. For at nå dette mål, mængden af DS i dette præparat overstiger CS (vægtforhold 3: 1); og høj molekylvægt DS (vægt-gennemsnitlig MW 500.000) og lav molekylvægt CS (MW 50-190 kDa, 75-85% deacetyleret) anvendes.
SDF-1α er en stamcelle homing faktor, som udøver den målsøgende funktion gennem dens kemotaktiske aktivitet. SDF-1α spiller en vigtig rolle i homing og vedligeholdelse af hæmatopoietiske stamceller i knoglemarven, og rekruttering af progenitor celler til det perifere væv til skade reparation 4,5. SDF-1α har en heparin-bindingsstedet i proteinsekvens, som gør det muligt for proteinet at binde til heparin / heparansulfat, danne dimerer, beskyttes mod protease (CD26 / DPPIV) inaktivering og interagere med målceller via celleoverfladereceptorer 6-8. DS har lignende strukturelle egenskaber som heparin / heparansulfat; Således ville binding af SDF-1α til DS være svarende til den af dens naturlige polymere ligander.
I den følgende protokol beskriver vi fremstilling af SDF-1α-DS-CS nanopartikler. Procedurerne udgør en af de formuleringer, der tidligere er blevet undersøgt 9. Protokollen er oprindeligt tilpasset fra en undersøgelse af VEGF-DS-CS nanopartikler 10. En skala forberedelse lille beskrives, som let kan skaleres op med de samme stamopløsninger og forberedelse betingelser. Efter fremstilling partiklerne kendetegnet by undersøgelse af deres størrelse, zeta potentiale, omfanget af SDF-1α inkorporering, in vitro frigivelse tid, og aktiviteten af den inkorporerede SDF-1α.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af SDF-1α Glycan Nanopartikler
På grund af formålet med in vivo levering, sterilisere alle beholdere, pipetter og tips der anvendes ved fremstillingen.
- Forbered følgende stamopløsninger i ultrarent vand: 1% dextransulfat; 1 M NaOH (sterilfiltreret med en PES-membran); 0,1% chitosan i 0,2% iseddikesyre (filter gennem 0,8 og 0,22 um filtre i træk og justere pH til 5,5 med NaOH bagefter); 0,1 M ZnSO4; 15% mannitol; og 0,92 mg / ml SDF-1α (opbevaret i portioner ved 80 ° C, og holdt ved 4 ° C, når optøet).
- Steriliser stamopløsninger gennem 0,22 um filter membraner. Vurdere endotoksinniveauer i den fremstillede opløsning med limulus amebocytlysat (LAL) gel blodprop assay. Sørg for, at niveauerne er <0,06 EU / ml.
- Tilføj 0,18 ml ultrarent vand til et 1,5 ml glasbeholder indeholdende en magnetisk omrørerstav. Indstil omrøringshastigheden på 800 omdrejninger pr. Tilføj 0,1 ml 1%dextransulfat og omrør i 2 min. Tilføj 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml 0,92 mg / ml SDF-1α opløsning) og omrøres i 20 min.
- Tilføj 0,33 ml 0,1% chitosan dråbevis, og der omrøres i 5 min. Skift omrøringshastigheden til det maksimale og tilføje 0,1 ml 0,1 M ZnSO4 langsomt med en 0,1 ml sprøjte (over 1 min).
- Retur omrøringshastigheden til 800 rpm, og der omrøres i 30 minutter. Tilføj 0,4 ml 15% mannitol og omrør i 5 minutter. Overfør reaktionsblandingen til et 1,5 ml mikrofugerør. Der centrifugeres ved 16.000 xg ved 4 ° C i 10 min.
Bemærk: tilstedeværelsen af mannitol letter resuspension af partiklerne efter centrifugering. Afhængigt af kompakthed pelleten kan mannitol koncentration varieres fra 0% til 5%. Komplet resuspension af partiklerne efter hver centrifugering er afgørende for at undgå aggregater i den endelige suspension. - Aspirer supernatanten og bruge en pipette til at fjerne den sidste dråbe væske langsomt. Tilsæt 0,2 ml 5% mannitol. Suspender pillen med en 0,5 ml, 29 g neeDLE sprøjte. Tilsæt 1 ml 5% mannitol. Centrifuger ved 16.000 xg i 15 min.
- Gentag trin 1.6.
- Aspirer supernatanten. Resuspender pellet i 0,2 ml 5% mannitol. Opbevar partikel suspension ved 4 ° C.
Bemærk: Partikelsuspensionen kan også opbevares frosset ved -80 ° C eller frysetørret. Herunder 5% mannitol i suspensionen er afgørende for at forhindre aggregering af partiklerne efter frysning og optøning eller efter frysetørring og rehydrering. Mannitol kan fjernes ved centrifugering af suspensionen efter opbevaring.
2. Måling af partikelstørrelse og zeta-potentialet
Partikelstørrelsen og zeta-potentialet analyseres ved dynamisk lysspredning og elektroforese lysspredning, henholdsvis med en partikelstørrelse analysator angivet i Material List.
- Opsæt følgende parametre til måling partikelstørrelse: Akkumulerende gange: 70; Gentag gange: 4; Temperatur: 25 ° C;Fortynder: vand; Intensitet justering: auto.
- SDF-1α-DS-CS prøve med vand (10-fold fortynding) fortyndes. Load 100 pi af prøven til et engangs UV cuvette såsom en Eppendorf kuvette. Sæt kuvetten i celleholderen. Vent på, at tilpasningen intensitet for at nå "Optimum" (~ 10.000 cps). Start dataopsamling.
- Efter målingen er afsluttet, registrere kumulanter resultater af diameter (nm) og polydispersitetsindeks. Beregn gennemsnittet af de opnåede resultater fra hver af de 4 gentagne aflæsninger og beregne standardafvigelsen.
- Load 500 pi af 10-fold fortyndet partikel prøve til en strømningscelle for zetapotentialet måling. Opsæt følgende parametre til måling: Akkumulerende gange: 10; Gentag gange: 5; Temperatur: 25 ° C; Fortynder: vand; Intensitet justering: auto. Registrere resultaterne af zetapotentialet (mV). Gennemsnittet opnået fra hver af de 5 gentagne aflæsninger resultat, og beregne den standard deviation.
3. Kvantificering af SDF-1α i partiklerne
- Fortynd fri form SDF-1α til koncentrationer på 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 og 0,05 mg / ml i 1,3 x Laemmli-prøvebuffer. Fortynd 6 pi SDF-1α-DS-CS prøver med 40 pi 1,3x Laemmli prøvebuffer. (Forbered 4x Laemmli stock buffer indeholdende 0,25 M Tris-HCI, pH 7,5, 8% SDS, 40% glycerol, 0,05 mg / ml bromphenolblåt, og 8% 2-mercaptoethanol. Opdel stamopløsning i små portioner og holde ved -20 ° C til engangsbrug.)
- Opvarm prøverne ved 100 ° C i 10 min. Vortex prøverne to gange (hver i 10 sekunder ved maksimal hastighed) i løbet af 10 min opvarmning tid for at adskille partiklerne fuldstændigt. Køl ned prøverne til stuetemperatur i 2 min. Centrifuger ved 10.000 xg i 0,5-1 minutter til at bringe ned i vandet kondensat. Vortex igen for at blande godt.
Bemærk: På dette tidspunkt bør prøveopløsningen være klar uden synlig udfældning stede. - Load 10 &# 181; l prøve / brønd til en 4-20% SDS gel. Kør elektroforese ved 200 V i 20 minutter. Farv gelen med Coomassie blue protein pletten.
- Undersøg proteinbånd tætheden af SDF-1α under anvendelse af en molekylær imager og densitometri analyse software. Beregn mængden af SDF-1α i partiklerne mod en standardkurve konstrueret med frie SDF-1α standarder.
4. In vitro-frigivelsesassay
- Bland SDF-1α glycan partikler med Dulbeccos phosphatbufret saltvand uden calcium og magnesium (D-PBS) ved en 1: 1 ratio (v / v).
- Opdel partikelsuspensionen i 0,05 ml alikvoter i 1,5 ml rør. Læg prøverne til bunden af rørene. Undgå indføre luftbobler eller forstyrre væskens overflade. Forsegl toppen af rørene med parafilm.
BEMÆRK: Herved vil væsken forblive på bunden i den efterfølgende top til bund rotation på røret mixer. - Drej rørene ved 37 &# 176; C på en roterende Micro-Tube Mixer. Fjern aliquoter fra rørene på de angivne tidspunkter og straks centrifugere prøverne ved 16.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Adskil supernatanter og pellets, og rekonstruere pelleten med 0,05 ml D-PBS. Opbevare prøverne ved -20 ° C. Når alle prøver er indsamlet, undersøge supernatanterne og pellets på en SDS-gel som beskrevet ovenfor.
5. Migration Assay
Dette assay måler den kemotaktiske aktivitet af SDF-1α. Interaktion af SDF-1α med sin receptor (CXCR4) på celleoverfladen forårsager migrering af cellen mod SDF-1α-gradient. I dette assay bliver celler fyldt i en øvre brønd (adskilt af en semipermeabel membran fra en nedre brønd) og SDF-1α opløsning i en nedre brønd.
- Fortynd SDF-1α (gratis eller partikel-bundne form) med migration buffer (RPMI-1640 medium indeholdende 0,5% bovint serumalbumin) i en 3-fold seriefortynding til slutkoncentrationer på 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14 og 0,05 ng / ml.
- Tilføj 0,6 ml af det fortyndede SDF-1α opløsning eller migration buffer kun (negativ kontrol) til en brønd i 24-brønds plade. Tilføj 0,57 ml migration buffer til et godt (inputcelle kontrol). Der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Placer en permeabel celledyrkningsinsert såsom Transwell (porestørrelse 5 um, diameter 6,5 mm) på toppen af den nedre brønd. Load 0,1 ml Jurkat-celler (5 x 10 5) i Transwell indsætte. Load 0,03 ml celler direkte til indgangen cellekontrol godt. Inkubér pladen ved 37 ° C i 2 timer i en 5% CO 2-inkubator.
- Fjern Transwell inserts. Overfør celler, der er migreret til de nedre brønde til et 4 ml polystyrenrør. Tæl migrerede celler med et flowcytometer.
- Beregn migration som en procentdel af input celleantal (celletal i inputcelle kontrol godt x 100/30) efter subtraktion af tallene i negative kontrol (celler migreret til brøndene, der kun indeholder migration buffer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Størrelsen og zeta-potentialet af de fremstillede SDF-1α-DS-CS partikler bestemmes med en partikel analysatoren. Figur 1 viser analysen af målingen størrelse. Fra kumulanter resultater opnået fra fire gentagne målinger, den gennemsnitlige hydrodynamiske diameter af SDF-1α-DS-CS-partikler er 661 ± 8,2 (nm) og polydispersiteten er 0,23 ± 0,02. Resultatet af zetapotentialet måling er vist i figur 2. Fra de fem gentagne målinger, zetapotentialet af SDF-1α-DS-CS partikler -24,8 ± 0,5 mV. Som nævnt ovenfor nærvær af 5% mannitol i SDF-1α-DS-CS partikelsuspension er afgørende for forebyggelse af partikelaggregering under en nedfrysning og optøning proces. Figur 3 viser størrelsen måling af partikler suspenderet i vand og frosset ved -80 ° C. En særskilt sammenlægning peak er synligt efter optøning.
AMOUNT af SDF-1α i SDF-1α-DS-CS partikler anslås ved SDS gelelektroforese. Figur 4A viser en Coomassie blue-farvet SDS-gel med SDF-1α standarder, DS-CS nanopartikel (kontrol partikler uden SDF-1α inkorporering , Ctrl NP) og SDF-1α-DS-CS nanopartikler (SDF-1α NP) prøver indlæst. En standardkurve konstrueres ud fra densiteten analyse af SDF-1α standard bånd (figur 4B). Beregning fra standardkurven indikerer, at koncentrationen SDF-1α i SDF-1α NP prøve er 0,03 mg / ml (gennemsnit af to eksemplarer). Da fortynding af prøven med prøvebuffer er (6 + 40) / 6, den oprindelige prøve koncentrationen er 0,23 mg / ml. Som det endelige volumen af præparatet partikel er 0,2 ml i alt SDF-1α i den endelige suspension er 0,046 mg. I betragtning af input massen af SDF-1α i reaktionsblandingen er 0,08 mg, Opfangningseffektiviteten af SDF-1α i DS-CS partikler er 57%. ChitOsan er tidligere blevet rapporteret at farve med Coomassie blåt. Farvningen er dog ikke signifikant i gelen vist i figur 4A. Det er måske relateret til mængden af chitosan (partikel matrix) fyldt på gelen. Under alle omstændigheder er det nødvendigt med en komplet dissociation og adskillelse af SDF-1α fra partiklen matrix for nøjagtigt at vurdere størrelsen af den inkorporerede protein. Denne gel viser også, at SDF-1α ikke påviseligt nedbrydes ved opvarmning ved 100 ° C i 10 minutter eller ved vortex processen, da der ikke findes bånd mellem SDF-1α proteinbånd og farvefronten.
In vitro frigivelseshastigheden af SDF-1α fra nanopartiklerne bestemmes ved inkubering af partiklerne i 50% D-PBS ved 37 ° C i 7 dage. Ved 0 timer, 3 timer, 8 timer, 24 timer, 48 timer, og 7 dage, er portioner af prøverne fjernet og straks centrifugeret. Det frigivne SDF-1α (i supernatanten) er adskilt fra den partikelbundne SDF-1α (pellet). Prøverne er kørt på en SDS-gel, og mængden af SDF-1α i supernatanterne og pellets bestemmes ved Coomassie-farvning og densitometri analyse. En typisk SDS-gel af analysen er vist i figur 5. Som vist, er partikel bundet SDF-1α minimalt frigivet efter en 7 dages inkubation.
Aktiviteten af partikelbundne SDF-1α måles ved en migration assay (kemotaktisk assay), og sammenlignet med frit SDF-1α. I dette assay er SDF-1α i DS-CS nanopartikler seriefortyndet med en migration buffer og inkuberet med Jurkat-celler i 2 timer. De migrerede celler tælles med et flowcytometer. Dataene (med SDF-1α koncentrationer fra 0,05 til 11 ng / ml) er afbildet med ikke-lineær regression montering og EC 50 beregnes. Som vist i figur 6 partikelbundne SDF-1α induceret samme omfang migration som frie SDF-1 ^5; ved alle koncentrationer målt. EC 50 værdier af de frie og partikel-bundne former af SDF-1α er 0,55 og 0,45 ng / ml.
Figur 1. Analyse skærmbillede viser dynamisk lysspredning måling af partikelstørrelse. De to øverste paneler viser afbildninger af autokorrelationsfunktionen, G2 (τ) og logaritmen til [G2 (τ) -1] over tid. Instrumentets digital signalprocessor (korrelator) udtrykker den detekterede lysintensitet som en funktion af forsinkelse (τ). Plottet viser, at SDF-1α-DS-CS-partikler forårsagede en eksponentiel henfald af intensiteten mellem 0,2-2 ms. At få den gennemsnitlige henfaldskonstanten <Γ>
Figur 2. Analyse skærmbillede viser elektroforetisk lysspredningmåling af partikel zetapotentialet. Det øverste panel viser et G2 (τ) over tid plot. Den gradvist henfaldende oscillerende funktion typisk observeret i ladede partikler, der udsættes for elektroforese og lysspredning. Funktionen afspejler frekvensskiftet (Doppler forskydning) forårsaget af de bevægelige partikler i det elektriske felt. En Fourier transformation af G2 (τ) giver effektspektrum (intensitet vs. frekvens plot) vises midt panel. I midten af frekvensskiftet peak definerer mobilitet af partiklerne, hvorfra zetapotentialet beregnes. Den beregnede zetapotentiale er vist nederst på skærmen.
Figur 3. Partikelstørrelse måling af SDF-1 α-DS-CS-partikler efter frysning og optøning i vand. I fravær af mannitol, partiklerne danner aggregates efter nedfrysning og optøning. Bemærk dannelsen af en yderligere intensitet / størrelse peak og stigningen i kumulanter diameter og polydispersitet sammenlignet med figur 1.
Figur 4. Kvantificering af SDF-1 α inkorporering i DS-CS nanopartikler. (A) Fotografi af Coomassie-farvet SDS-gel fyldt med gratis SDF-1α standarder, DS-CS nanopartikel (Ctrl NP), og SDF-1α-DS CS nanopartikel (SDF-1α NP) prøver som angivet. SDF-1α proteinbånd og gelen kører farvestof foran er markeret. CTRL NP prøver ikke farvet med Coomassie blue og chitosan bånd (bredt) er vagt synlige. (B) Båndene analyseres med et densitometer, hvorfra standardkurven er konstrueret med de frie SDF-1α standarder (gennemsnit af duplicate). Mængden af SDF-1α i nanopartiklerne er beregnet over standardkurven, hvilket giver en gennemsnitlig værdi på 0,3 ug / brønd (10 pi).
Figur 5. SDS gel, der viser SDF-1 α in vitro frigivelse tidsforløb. Coomassie-farvet SDS-gel viser mængden af frigjort SDF-1α (i supernatanter) og bundet SDF-1α (pellets) efter inkubation af SDF-1α-DS CS nanopartikler ved 37 ° C for forskellige perioder. Re-trykt med tilladelse fra 9.
Figur 6. Dosis-respons-kurver for SDF-1 α (cirkler) og SDF-1α nanopartikel (NP) (firkanter) i et Jurkat cellemigrationsassay. SDF-1α i både fri og nanopartikel vej tilMS udviste den samme aktivitet med EF 50 værdier på 0,55 og 0,45 ng / ml. Re-trykt med tilladelse fra 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som nævnt ovenfor er de DS-CS nanopartikler dannet ved ladningsneutralisering mellem polyanion (DS) og polykation (CS) molekyler. Da interaktion ladningen sker let under den molekylære kollision koncentrationen af polymeropløsningerne og omrøringshastigheden under blanding er kritisk for størrelsen af de resulterende partikler. En generel tendens er, at mere fortyndede DS og CS-løsninger 15 og højere rørehastighed resultat i mindre partikler.
Formuleringen af SDF-1α glycan nanopartikler kan varieres. For eksempel de beløb og nøgletal for SDF-1α / DS / CS anvendes i denne protokol er 0,08 / 0,33 / 1 (mg / mg / mg), hhv. Afhængigt af den tilsigtede anvendelse af SDF-1α nanopartikler, kan disse forhold ændres. Hvis mængden af SDF-1α tilsat til blandingen er 0,04 mg (0,04 / 0,33 / 1, mg / mg / mg) i stedet for 0,08 mg, vil partiklerne være mindre, ~ 650 nm, og SDF-1α indkapslingseffektivitet lidt greater, 70-80% 9. Men når de leveres in vivo, vil en større mængde af glycan matrix være til stede pr SDF-1α. Hvis der ønskes en mindre partikelstørrelse kan formuleringen af SDF-1α glycan nanopartikler modificeres yderligere. Et alternativ er at anvende en mindre molekylvægt chitosan, som vist i Ref 15. Det skal imidlertid bemærkes, at chitosan har en høj affinitet for endotoksin (negativt ladede lipopolysaccharider); således er nødvendig for brugen af chitosanprodukter før in vivo levering en test af endotoksin niveau eller potentielt en oprensning. Det andet alternativ er at indlæse SDF-1α på præformede små DS-CS nanopartikler. Da sidstnævnte kan manipuleres lettere i partikelstørrelse og SDF-1α har en høj affinitet for DS, indlæsning af en lille mængde af SDF-1α til den ydre skal af DS-CS partikler kan resultere i mindre partikler.
Sammenlignet med andre typer afnanopartikler (f.eks PLGA 11, polyanhydrid 12, eller gelatine 13 nanopartikler), DS-CS nanopartikler har særlige fordele og begrænsninger. De store fordele ved DS-CS nanopartikler er: 1) fremstilling partikel ikke involverer organiske opløsningsmidler eller kraftig sonikering. Det er derfor velegnet til protein faktor inkorporering blid præparat reducerer sandsynligheden for protein inaktivering; 2) matrix af partiklerne har en lignende strukturel egenskab som ekstracellulære matrix, hvilket gør partiklerne er kompatible med væv miljø og er mindre toksisk og inflammatorisk; og 3) glycan partikelbundne SDF-1α efterligner et naturligt bindende forhold mellem proteinet og den ekstracellulære matrix, hvilket forklarer den fulde kemotaktisk aktivitet af SDF-1α efter at være blevet inkorporeret i glycan partikler. Det fuldt aktive SDF-1α i partikel-bundne form, gør det muligt at danne en stationær homing faktor i væv eMiljøplanlægning. Begrænsningerne i DS-CS nanopartikler er: 1) diametre af partiklerne er generelt større end de ovennævnte partikler; og 2) let bryde sammen i saltopløsninger, som måske ikke er egnet til direkte injektion i blodcirkulationen.
Den partikelbundne SDF-1α findes at være minimalt frigives fra nanopartiklerne efter en syv dages inkubation. Dette fænomen er relateret til den høje affinitet af SDF-1α til heparin, hvilket også bidrager til dens funktion in vivo. Da proteiner med heparinbindende domæner generelt vil have forskellige affiniteter for heparin, vil deres frigivelseshastigheder sandsynligvis variere. For eksempel i en VEGF 165 -DS-CS nanopartikel fremstillet på en lignende formulering, blev 44% af det inkorporerede VEGF 165 frigives i den første time og 29% blev frigivet i næste 47 timer under inkubation ved 37 ° C 14. Derfor in vitro frigivelse mønster for en specifik protEin skal testes individuelt.
Formålet med udarbejdelsen af SDF-1α-DS-CS nanopartikler er at levere SDF-1α til lungerne og etablere en stamcelle homing signal i vævet. Partiklerne kan også leveres til andre væv til samme formål, selv om den specifikke nanopartikel format ikke er nødvendigt for fast væv injektion. Den omstændighed, at SDF-1α stabiliseres af DS i nanopartikel matrix og minimalt frigives fra partiklerne støtter stamcelle rekruttering principper, og partiklen forventes at være til gavn for vævsregenerering.
Eftersom protein-glycan nanopartikler har en lignende matrix til af celleoverflade glycosaminoglycaner og ekstracellulær matrix, er det muligt, at partiklen inkorporeret proteiner kan udveksles i disse matricer (De negativt ladede ekstracellulære matrix-molekyler kan konkurrere med bindingen af den positivt ladede protein) in vivo in vitro karakterisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud: HL671795, HL048743 og HL108630.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 | |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 | |
| SDF-1α | Prepared according to reference 8. | ||
| Syringe filter, PES membrane 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | |
| Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 | |
| Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 | |
| Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | ||
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 | |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 | |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 | |
| Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
References
- Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
- Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).
- Yue, Z. G., et al. Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).
- Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).
- Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).
- Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex. J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).
- Amara, A., et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).
- Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).
- Yin, T., et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).
- Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).
- McCall, R. L., Sirianni, R. W. PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS. J Vis Exp. (82), 51015 (2013).
- Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles. J Vis Exp. (65), 3967 (2012).
- Xu, J., Amiji, M. Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles. J Vis Exp. (59), e3612 (2012).
- Lauten, E. H., et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).
- Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes. Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).
