Introduction
Dextransulfat (DS) og kitosan (CS) er polysakkarider med flere erstattet negativt ladede sulfatgrupper (DS), eller positivt ladede amingrupper (deacetyleres CS). Når det blandes i en vandig løsning, de to polysakkaridene danner polyelektrolyttkomplekser gjennom elektrostatiske interaksjoner. De resulterende kompleksene kan dannes store aggregater som vil være fase-separert fra den vandige oppløsning (utfellinger), eller små partikler som er vanndispergerbar (kolloider). De spesifikke forholdene som bidrar til disse resultatene har blitt grundig studert, og er oppsummert og illustrert i detalj i en fersk gjennomgang 1. Blant disse forholdene, er de motsatt ladede polymerer må 1) ha vesentlig forskjellig molmassefordeling to grunnleggende krav for å produsere vann dispergerbare partikler; og 2) blandes i et ikke-støkiometrisk forhold. Disse forholdene vil tillate ladningsnøytralt kompleks polymere segmenter generert av kostnadnøytralisering for å segregere og danne kjernen av partikkelen, og det overskytende polymer for å danne det ytre skallet 1. Ved sukker partikler som er beskrevet i denne protokollen er ment for pulmonal levering, og er designet for å være netto negativt ladet, og av nanometer dimensjoner. Den negative overflateladning reduserer sannsynligheten for cellulært opptak av partiklene 2,3. Partikler av nanometer dimensjon lette passasjen gjennom distale luftveiene. For å oppnå dette målet, er mengden av DS anvendes i dette preparatet i overkant av CS (vektforhold 3: 1); og med høy molekylvekt DS (vekt-gjennomsnittlig MW 500.000), og med lav molekylvekt CS (MW-området 50 til 190 kDa, 75-85% deacetylert) brukes.
SDF-1α er en stamcellemålsøkende faktor, som utøver den målsøkende funksjon gjennom sin kjemotaktiske aktivitet. SDF-1α spiller en viktig rolle i homing og vedlikehold av blodkreft stamceller i benmargen, og i rekruttering av progemonitoren celler til perifert vev for skade reparasjon 4,5. SDF-1α har en heparin-bindingssete i dets proteinsekvensen, noe som gjør at proteinet binder seg til heparin / heparansulfat, danner dimerer, bli beskyttet mot protease (CD26 / DPPIV) inaktivering, og samhandle med målceller via celleoverflatereseptorene 6-8. DS har lignende strukturelle egenskaper som heparin / heparansulfat; således binding av SDF-1α til DS vil være lik den i dens naturlige polymere ligander.
I den etterfølgende protokoll beskriver vi fremstilling av SDF-1α-DS-CS nanopartikler. Prosedyrene representerer en av de formuleringer som tidligere har blitt studert 9. Protokollen er opprinnelig tilpasset fra en undersøkelse av VEGF-DS-CS nanopartikler 10. En fremstilling i liten skala er beskrevet, som lett kan skaleres opp med de samme stamløsninger og fremstillingsbetingelser. Etter fremstilling blir partiklene karakterisert by undersøke deres størrelse, zeta potensial, omfanget av SDF-1α inkorporering, in vitro frigjøringstiden, og aktiviteten av det inkorporerte SDF-1α.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av SDF-1α Glycan Nanopartikler
På grunn av formålet med in vivo levering, sterilisere alle beholdere, pipetter og tips som brukes i utarbeidelsen.
- Forbered følgende stamløsninger i ultrarent vann: 1% dekstransulfat; 1 M NaOH (sterilfiltrert med en PES-membran); 0,1% kitosan i 0,2% iseddik (filter gjennom 0,8 og 0,22 um filter etter hverandre og juster pH til 5,5 med NaOH etterpå); 0,1 M ZnSO4; 15% mannitol; og 0,92 mg / ml SDF-1α (lagret i alikvoter ved 80 ° C, og holdt ved 4 ° C igjen etter tining).
- Sterilisere lager løsninger gjennom 0,22 mikrometer filter membraner. Vurdere endotoksin nivåer i den tilberedte løsningen med limulus amebocyttlysat (LAL) gel blodpropp analysen. Sikre at nivåene er <0,06 EU / ml.
- Legg 0,18 ml ultrarent vann i et 1,5 mL hetteglass inneholdende en magnetisk rørestav. Still oppstuss hastighet på 800 rpm. Tilsett 0,1 ml 1%dekstransulfat og omrør i 2 min. Legg 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml 0,92 mg / ml SDF-1α løsning) og omrør i 20 min.
- Legg 0,33 ml 0,1% kitosan dråpevis og omrør i 5 min. Endring rørehastigheten til det maksimale og tilsett 0,1 ml 0,1 M ZnSO4 langsomt med en 0,1 ml sprøyte (over 1 min).
- Returrørehastigheten til 800 opm og omrør i 30 minutter. Tilsett 0,4 ml 15% mannitol og omrør i 5 min. Overfør reaksjonsblandingen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Sentrifuger ved 16000 x g ved 4 ° C i 10 min.
Merk: Tilstedeværelsen av mannitol letter resuspensjon av partiklene etter sentrifugering. Avhengig av kompaktheten til pelleten, kan mannitol konsentrasjonen varieres fra 0% til 5%. Fullstendig resuspendering av partiklene etter hver sentrifugering er kritisk for å unngå aggregater i den endelige suspensjon. - Aspirer supernatanten og bruke en pipette for å fjerne den siste væskedråpe langsomt. Legg 0,2 ml 5% mannitol. Suspendere pellet med 0,5 ml, 29 G needle sprøyte. Tilsett 1 ml 5% mannitol. Sentrifuger ved 16000 x g i 15 min.
- Gjenta trinn 1.6.
- Aspirer supernatanten. Resuspender pelleten i 0,2 ml 5% mannitol. Oppbevar suspensjon partikkel ved 4 ° C.
Merk: Suspensjonen partikkel kan også lagres fryses ved -80 ° C eller frysetørket. Inkludert 5% mannitol i suspensjonen er avgjørende for å hindre aggregering av partiklene etter frysing og tining, eller etter lyofilisering og rehydratisering. Mannitol kan bli fjernet ved sentrifugering av suspensjonen etter lagring.
2. Måling av partikkelstørrelse og Zeta Potential
Partikkelstørrelsen og zeta-potensialet er analysert ved hjelp av dynamisk lysspredning og elektrofore lysspredning, henholdsvis med en partikkel analysator angitt i Materialliste.
- Sette opp følgende parametere for partikkelstørrelse måling: akkumulering ganger: 70; Gjenta ganger: 4; Temperatur: 25 ° C;Væske: vann; Intensitet justering: auto.
- Fortynn SDF-1α-DS-CS prøven med vann (10-gangers fortynning). Load 100 ul av prøven til en engangs UV kyvette slik som en Eppendorf kyvette. Sett kyvetten i celleholderen. Vent på intensiteten justering for å nå "optimale" (~ 10.000 cP). Starte datainnsamling.
- Etter målingen er fullført, noterer cumulants resultatene av diameter (nm) og polydispersitetsindeksen. Gjennomsnitt de oppnådde resultatene fra hver av de fire gjentatte målinger og beregne standardavviket.
- Belastnings 500 ul av 10-ganger fortynnet prøve til en partikkelstrømningscelle for måling av zeta potensialet. Sette opp følgende parametere for måling: akkumulering ganger: 10; Gjenta ganger: 5; Temperatur: 25 ° C; Væske: vann; Intensitet justering: auto. Registrere resultatene av zeta-potensial (mV). Gjennomsnittlig resultatet oppnådd fra hver av de fem gjentatte målinger, og beregne standard deviation.
3. Kvantifisering av SDF-1α i partiklene
- Fortynn fri form SDF-1α til konsentrasjoner på 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 og 0,05 mg / ml i 1,3x Laemmli-prøvebuffer. Fortynne 6 mL SDF-1α-DS-CS prøver med 40 mikroliter 1,3x Laemmli-prøvebuffer. (Forbered 4x Laemmli lagerbuffer inneholdende 0,25 M Tris-HCl, pH 7,5, 8% SDS, 40% glyserol, 0,05 mg / ml bromfenolblått, og 8% 2-merkaptoetanol. Del stamløsning i små alikvoter og holde ved -20 ° C for engangsbruk.)
- Varme opp prøvene ved 100 ° C i 10 min. Vortex prøvene to ganger (hver for 10 sek ved maksimal hastighet) i løpet av 10 min oppvarming tid for å distansere partiklene helt. Avkjøles prøvene til RT i 2 min. Sentrifuger ved 10.000 xg for 0,5-1 min for å få ned vann kondensat. Vortex igjen for å blande godt.
Note: På dette punkt bør prøveløsningen være klar uten synlig bunnfall til stede. - Last 10 &# 181; l prøve / brønn til en 4-20% SDS gel. Kjør elektroforese ved 200 V i 20 min. Flekk gelen med coomassieblått protein flekken.
- Undersøke proteinbåndet tetthet av SDF-1α ved hjelp av en molekylær imager og densitometry analyse programvare. Beregne mengden av SDF-1α i partiklene mot en standardkurve konstruert med frie SDF-1α standarder.
4. In Vitro Slipp analysen
- Bland SDF-1α glykan partikler med Dulbeccos fosfatbufret saltvann uten kalsium og magnesium (D-PBS) i 1: 1 forhold (v / v).
- Del den suspensjonen partikkel i 0,05 ml aliquoter i 1,5 ml rør. Laste prøvene til bunnen av rørene. Unngå å innføre luftbobler eller forstyrre overflaten av væsken. Forsegle toppen av rørene med Parafilm.
MERK: Ved å gjøre det, vil væsken ligge på bunnen under den påfølgende topp-til-bunn rotasjon på rørristeapparat. - Rotere rørene ved 37 &# 176; C på en roterende Micro-Tube Mixer. Fjerne alikvoter fra rørene ved de angitte tider og umiddelbart Sentrifuger prøvene ved 16 000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Separer Supernatantene og pellets, og rekonstituere pellet med 0,05 ml D-PBS. Lagring av prøvene ved -20 ° C. Etter at alle prøvene er samlet opp, undersøke supernatanter og pelleter på en SDS-gel som beskrevet ovenfor.
5. Migrasjon analysen
Denne analysen måler kjemotaktiske aktivitet av SDF-1α. Interaksjon av SDF-1α med sin reseptor (CXCR4) på celleoverflaten bevirker migrering av cellen mot SDF-1α gradient. I denne analysen blir cellene lastet inn i et øvre brønn (adskilt av en semipermeabel membran fra en nedre brønn) og SDF-1α løsning i en lavere brønnen.
- Fortynn SDF-1α (fri eller partikkelbundet form) med migreringsbuffer (RPMI-1640 medium inneholdende 0,5% bovint serumalbumin) i en 3-fold seriell fortynning til sluttkonsentrasjoner på 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14 og 0,05 ng / ml.
- Tilsett 0,6 ml av den fortynnede SDF-1α løsning eller migreringsbuffer bare (negativ kontroll) til en brønn i en 24-brønners plate. Legg 0,57 ml migrasjon buffer til et godt (input cellekontroll). Inkuber ved 37 ° C i 30 min. Plasser en gjennomtrengelig cellekulturinnsats som Transwell (porestørrelse 5 pm, diameter 6,5 mm) på toppen av den nedre brønnen. Belastning 0,1 ml Jurkatceller (5 × 10 5) inn i Transwell inn. Laste 0,03 ml celler direkte til inngangscellekontroll godt. Inkuber platen ved 37 ° C i 2 timer i en 5% CO2-inkubator.
- Fjerne Transwell inserts. Overfør de celler som har migrert til de nedre brønnene til en 4 ml polystyrenrør. Telle de migrerte celler med et strømningscytometer.
- Beregn migrering som en prosentdel av inngangscellen nummer (celleantall i inngangscellekontroll godt x 100 tredeveendedel) etter subtraksjon av tallene i negative kontroller (celler migrert til brønnene som bare inneholder migrasjon buffer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Størrelsen og zeta-potensialet for de fremstilte SDF-1α-DS-CS partikler er bestemt med en partikkel analysator. Figur 1 viser analysen av størrelsesmåling. Fra cumulants resultatene oppnådd fra fire gjentatte målinger, er den gjennomsnittlige hydrodynamisk diameter for SDF-1α-DS-CS-partikler 661 ± 8.2 (nm), og polydispersiteten er 0,23 ± 0,02. Resultatet av zeta-potensialmåling, er vist i figur 2. Fra de fem gjentatte målinger, er zeta-potensialet av SDF-1α-DS-CS partikler -24,8 ± 0,5 mV. Som nevnt ovenfor, er nærvær av 5% mannitol i SDF-1α-DS-CS partikkelsuspensjon viktig for forebyggelse av partikkelaggregatet under en frysing og tining prosessen. Figur 3 viser størrelsesmåling av partikler suspendert i vann og frosset ved -80 ° C. En distinkt aggregering peak er synlig etter tining.
Den amount av SDF-1α i SDF-1α-DS-CS partikler er anslått av SDS gelelektroforese. 4A viser en coomassieblått-farget SDS-gel med SDF-1α standarder, DS-CS nanopartikkel (kontrollpartikler uten SDF-1α innlemmelse , Ctrl NP) og SDF-1α-DS-CS nanopartikkel (SDF-1α NP) prøver lastet. En standardkurve er konstruert fra tetthetsanalyse av SDF-1α standard bånd (figur 4b). Beregning fra standardkurven indikerer at SDF-1α konsentrasjon i SDF-1α NP prøven er 0,03 mg / ml (gjennomsnitt av to eksemplarer). Etter fortynning av prøven med prøvebuffer er (6 + 40) / 6, er den opprinnelige prøvekonsentrasjon 0,23 mg / ml. Som det endelige volum av partikkel preparatet er 0,2 ml, total SDF-1α i den endelige suspensjon er 0,046 mg. Med tanke på inngangs massen av SDF-1α i reaksjonsblandingen er 0,08 mg, den omsluttende effektivitet av SDF-1α i DS-CS partiklene er 57%. ChitOsan har tidligere blitt rapportert å flekke med coomassieblått. Fargingen, er imidlertid ikke signifikant i gelen vist i figur 4A. Det er kanskje relatert til mengden av kitosan (partikkel matrise) lastet på gelen. I alle fall er det nødvendig med en fullstendig dissosiasjon og separering av SDF-1α fra partikkelmassen for nøyaktig å vurdere mengden av inkorporert protein. Denne gel viser også at SDF-1α ikke er påvisbart nedbrytes ved oppvarming ved 100 ° C i 10 min eller ved vortex prosessen, da ingen bånd er funnet mellom SDF-1α proteinbånd, og fargestoffet foran.
In vitro frigjøringshastigheten av SDF-1α fra nanopartiklene blir bestemt ved inkubering av partiklene i 50% D-PBS ved 37 ° C i 7 dager. Ved 0 timer, 3 timer, 8 timer, 24 timer, 48 timer og 7 dager, blir porsjoner av prøvene fjernet og umiddelbart sentrifugert. Den frigjorte SDF-1α (i supernatanten) separeres fra partikkelbundet SDF-1α (pellet). Prøvene blir kjørt på en SDS-gel, og mengden av SDF-1α i supernatantene og pellets bestemmes ved Coomassie-farging og densitometri analyse. En typisk SDS-gel av analysen er vist i figur 5. Som vist, er partikkelbundet SDF-1α minimal frigitt etter en 7 dagers inkubasjon.
Aktiviteten av partikkel-bundne SDF-1α måles ved en migreringsanalyse (kjemotaktisk assay), og sammenlignet med den frie SDF-1α. I denne analysen blir SDF-1α i DS-CS nanopartikler seriefortynnet med en migreringsbuffer og inkubert med Jurkat-celler i 2 timer. De migrerte celler telles med et strømningscytometer. Dataene (med SDF-1α konsentrasjoner på 0,05 til 11 ng / ml) er plottet med ikke-lineær regresjon montering, og EC 50 beregnes. Som vist i figur 6, er partikkelbundet SDF-1α indusert samme grad av migrering som for fri SDF-1 ^5; ved alle konsentrasjoner målt. De EC 50 verdier av de frie og partikkelbundne former for SDF-1α er 0,55 og 0,45 ng / ml.
Figur 1. Analyse skjermbilde som viser dynamisk lysspredning måling av partikkelstørrelse. De to øverste panelene viser plott av autokorrelasjonsfunksjon, G2 (τ), og logaritmen av [G2 (τ) -1] over tid. Instrumentets digital signalprosessor (korrelator) uttrykker den detekterte lysintensiteten som funksjon av forsinkelsestiden (τ). Plottet viser at SDF-1α-DS-CS partikler forårsaket en eksponensiell nedbrytning av intensiteten mellom 0,2-2 msek. For å få den gjennomsnittlige desintegrasjonskonstanten <Γ>
Figur 2. Analyse skjermbilde som viser elektro lysspredningmåling av partikkel zetapotensial. viser toppanelet en G2 (τ) over tid tomten. Den gradvis råtnende oscillerende funksjon er vanligvis observert i ladede partikler som er utsatt for elektroforese og lysspredning. Funksjonen reflekterer frekvensskift (Doppler-forskyvning) forårsaket av de bevegelige partikler i det elektriske felt. En Fourier-transformasjon av G2 (τ) gir effektspekteret (intensitet i forhold til frekvensdiagram) er vist i det midtre panelet. Midten av frekvensskift peak definerer mobiliteten av partiklene, som zeta-potensialet er beregnet. Den beregnede zeta-potensialet er vist i bunnen av skjermen.
Figur 3. Partikkelstørrelse måling av SDF-1 α-DS-CS-partikler etter frysing og tining i vann. I fravær av mannitol, idet partiklene danner aggregates etter frysing og tining. Legg merke til at dannelsen av en ekstra intensitet / størrelse topp og økningen i cumulants diameter og polydispersitet sammenlignet med den i figur 1.
Figur 4. Kvantifisering av SDF-1 α innlemmelse i DS-CS nanopartikler. (A) Fotografi av Coomassie-farget SDS gel lastet med gratis SDF-1α standarder, DS-CS nanopartikkel (Ctrl NP), og SDF-1α-DS- CS nanopartikkel (SDF-1α NP) prøver som angitt. SDF-1α protein band og gelen kjører fargestoff foran er merket. Ctrl NP prøvene er ikke farget med coomassieblått og kitosan band (wide) er vagt synlig. (B) Båndene blir analysert med et densitometer, hvorfra standardkurve konstruert med de frie SDF-1α standarder (gjennomsnitt av duplicate). Mengden av SDF-1α i nanopartiklene er beregnet mot standardkurven, noe som gir en gjennomsnittsverdi på 0,3 ug / brønn (10 ul).
Figur 5. SDS gel viser SDF-1 α in vitro utgivelsen tid kurset. Coomassie-farget SDS gel viser mengden utgitt SDF-1α (i supernatanter) og bundet SDF-1α (i pellets) etter inkubasjon av SDF-1α-DS -CS nanopartikler ved 37 ° C for ulike tidsperioder. Re-trykket med tillatelse fra 9.
Figur 6. Dose-responskurver for SDF-1 α (sirkler) og SDF-1α nanopartikkel (NP) (kvadrater) i en Jurkat cellemigrering assay. SDF-1α i både fri og bundet til nanopartikkelms oppviste den samme aktivitet med EC50-verdier på 0,55 og 0,45 ng / ml, henholdsvis. Re-trykket med tillatelse fra 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som nevnt ovenfor, er DS-CS nanopartikler dannet ved ladningsnøytralisering mellom polyanion (DS) og polykation (CS) molekyler. Siden ladningen interaksjon foregår lett under molekyl kollisjon, er konsentrasjonen av polymerløsninger og omrøringshastigheten under blanding avgjørende for størrelsen av de resulterende partikler. En generell trend er at mer utvannet DS og CS løsninger 15 og høyere rørehastigheten resultat i mindre partikler.
Formuleringen av SDF-1α glykan nanopartikler kan varieres. For eksempel, mengder og forhold av SDF-1α / DS / CS anvendt i denne protokollen, er 0,08 / 0,33 / 1 (mg / mg / mg), respektivt. Avhengig av den tiltenkte bruk av SDF-1α nanopartikler, kan disse forholdene endrer seg. Hvis mengden av SDF-1α tilsatt til blandingen er 0,04 mg (0,04 / 0,33 / 1, mg / mg / mg) i stedet for 0,08 mg, vil partiklene være mindre, ~ 650 nm, og SDF-1α omsluttende effektivitet svakt greater, 70-80% 9. Imidlertid, når levert in vivo, vil en større mengde av sukkermassen være tilstede pr SDF-1α. Hvis en mindre partikkelstørrelse er ønsket, kan formuleringen av SDF-1α glykan nanopartikler modifiseres ytterligere. Et alternativ er å bruke en mindre molekylvekt kitosan, som vist i 15 Ref. Det bør imidlertid bemerkes, at kitosan har en høy affinitet for endotoksin (negativt ladet lipopolysakkarider); således er nødvendig for bruk av kitosan produkter før avlevering in vivo test av endotoksin-nivå eller potensielt en rensing. Det andre alternativ er å laste SDF-1α på forhånd dannet små DS-CS nanopartikler. Siden den sistnevnte kan manipuleres lettere i partikkelstørrelse og SDF-1α har en høy affinitet for DS, lasting av en liten mengde av SDF-1α til det ytre skall av DS-CS partikler kan resultere i mindre partikler.
Sammenlignet med andre typernanopartikler (f.eks PLGA 11, polyanhydrid 12, eller gelatin 13 nanopartikler), DS-CS nanopartikler har spesielle fordeler og begrensninger. De store fordelene med DS-CS nanopartikler er: 1) partikkel forberedelse ikke innebærer organiske løsemidler eller sprek sonikasjon. Det er derfor egnet for proteinfaktor innlemmelse, som milde preparatet reduserer sannsynligheten for protein-inaktivering; 2) matrisen av partiklene har en lignende strukturell egenskap som ekstracellulære matriks, som gjør partiklene som er kompatible med vev miljø og er mindre toksiske og betennelses; og 3) glykan partikkel-bundne SDF-1α etterligner en naturlig bindingsforhold mellom protein og den ekstracellulære matriks, noe som forklarer den fulle kjemotaktisk aktivitet av SDF-1α etter å ha blitt inkorporert i sukkerpartiklene. Den fullt aktive SDF-1α i partikkelbundet form gjør at den kan tjene som et stasjonært målsøkende faktor i vev environment. Begrensningene av DS-CS nanopartikler er: 1) diametrene av partiklene er generelt større enn de ovenfor nevnte partikler; og 2) lett kollapse i saltløsninger, som kanskje ikke er egnet for direkte injeksjon i blodsirkulasjonen.
Partikkelbundet SDF-1α er funnet å være minimalt løslatt fra nanopartikler etter en syv-dagers inkubasjon. Dette fenomen henger sammen med den høye affiniteten av SDF-1α for heparin, noe som også bidrar til dens funksjon in vivo. Siden proteiner med heparin bindende domener vil generelt ha forskjellige slektskap for heparin, vil deres utslippsrater sannsynlig forskjellig. For eksempel, i en VEGF-165 -DS-CS nanopartikkel fremstilt på en lignende formulering, ble 44% av det inkorporerte VEGF 165 frigjøres i den første time, og 29% ble frigjort i de neste 47 timer i løpet av inkubasjon ved 37 ° C 14. Derfor, den in vitro frigjøringsmønster for en bestemt protEin må bli testet individuelt.
Hensikten med fremstilling av SDF-1α-DS-CS nanopartikler er å levere SDF-1α til lungen og etablere en stamcelle målsøkende signal i vevet. Partiklene kan også leveres til andre vev for det samme formålet, selv om de spesifikke nanopartikkel-formatet er ikke påkrevd for faste vev injeksjon. Det faktum at SDF-1α stabiliseres av DS i nanopartikkelmassen, og er minimalt frigjøres fra partiklene støtter stamcelle rekruttering prinsipper, og partikkelen er forventet å være fordelaktig for vevsregenerering.
Siden protein-glykan nanopartikler har en tilsvarende matrise som for celleoverflate glykosaminoglykaner og ekstracellulær matriks, er det mulig at partikkel-inkorporert proteiner kan byttes inn i disse matriser (De negativt ladede ekstracellulære matriks-molekyler kan konkurrere med bindingen av den positivt belastet protein) in vivo in vitro karakterisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd: HL671795, HL048743 og HL108630.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 | |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 | |
| SDF-1α | Prepared according to reference 8. | ||
| Syringe filter, PES membrane 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | |
| Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 | |
| Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 | |
| Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | ||
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 | |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 | |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 | |
| Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
References
- Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
- Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).
- Yue, Z. G., et al. Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).
- Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).
- Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).
- Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex. J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).
- Amara, A., et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).
- Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).
- Yin, T., et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).
- Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).
- McCall, R. L., Sirianni, R. W. PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS. J Vis Exp. (82), 51015 (2013).
- Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles. J Vis Exp. (65), 3967 (2012).
- Xu, J., Amiji, M. Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles. J Vis Exp. (59), e3612 (2012).
- Lauten, E. H., et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).
- Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes. Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).
