Introduction
Disciplinen i farmakologi har brugt den isolerede vævsbad system for over 150 år. Alsidigheden af dette system har givet forskere over hele verden til at karakterisere receptorer og receptor signaltransduktion med denne viden danner grundlag for terapier, der har behandlet millioner af mennesker med sygdomme eller lidelser, såsom hypertension, hjertesvigt, diabetes, gastrointestinal sygdom, blære dysfunktion, astma, og synkebesvær, for blot at nævne nogle få. Til denne dag, den isolerede vævsbad fortsat en vigtig facet af lægemiddeludvikling og grundforskning, da det giver det væv, der fungerer som et væv. I denne JOVE lektion er en formel protokol delt at vise en visuel og virtuel eksperiment udnytte data fra en isoleret vævsbad eksperiment, der måler isometrisk kontraktion, som tillader receptor karakterisering.
Den primære fordel ved denne teknik er, at vævet lever etnd fungerer som en helhed væv, med en fysiologisk resultat (sammentrækning eller afslapning), der er relevant for kroppen. Det er en syntese af trin (lægemiddel-receptor-interaktion, signaltransduktion, anden messenger generation, ændring i glat muskulatur uro, og ændring i vævsfunktion). Mens andre teknikker tillader undersøgelse af hver af disse trin (f.eks radioligandbinding for lægemiddel affinitet, måling af second messengers), den isolerede vævsbad teknik tillader integration af alle disse 1 trin. En anden fordel er, at fastholde vævsfunktion tillader beregning af vigtige farmakologiske variabler, der er mere meningsfuld i et væv vs et cellulært indstilling; det kommer tættere på, hvordan de undersøgte lægemidler ville arbejde i kroppen som helhed.
Protocol
BEMÆRK: Alle procedurer er beskrevet i dette dokument udføres efter retningslinjer fastsat af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) i Michigan State University.
1. System Forberedelse og opsætning
- Lav 5 L af en fysiologisk saltopløsning (PSS), som er den nødvendige mængde til vævsbadet sammentrækning eksperiment, der anvender op til 50 ml vævsbade; se tabel 2 for PSS opskrift. Beregn den samlede nødvendige mængde ved at gange antal væv bade gange badet volumen og derefter gange med antallet af påkrævede vævs- vaske.
- Brug tabel 2 som en guide til at gøre PSS. Opløses saltene i ca. 4 L vand. Anbefales type I vand - HPLC: BEMÆRK
- Tilsæt 8 ml 1 M CaCl2-opløsning (147 g / L, hvis anvendelse af dihydrat salt) til opløsningen, så enden opløsningen er 1,6 mM calcium.
- Quantum sufficit PSS løsning på 5 L.
- Forvarm vævsbadet systemet til 37 ° C ved at tænde det recirkulerende opvarmet vandbad. Kritiske trin: Hver komponent i systemet er vandkappe sikre, at de er forbundet i serie til hinanden. Flowretningen er kritisk - at sikre at der strømmer vand ind i hver komponent til den lavest pigtråd forbindelse og på højeste pigtråd forbindelse.
- Tænd datafangst system. Tænd krafttransducerne mindst 15 minutter før forsøget at komme i ligevægt temperatur.
BEMÆRK: De fleste krafttransducerne ansætte strain gauges, der er følsomme over for variationer i temperatur og udviser termisk drift i første omgang, efter at strømmen er anvendt. - Lancering datafangst software og sikre forbindelse med dataopsamlingssystem. Følg fremstilling vejledning til at muliggøre dataregistrering.
- Sørg krafttransducerne kalibreres før væv placeres i vævet bad og før dataregistrering er begyndt; FOllow producentens anvisninger til kalibrering.
- Slut vævsbadet systemet til en 95% O 2/5% CO 2 medicinsk kvalitet gascylinder og kontrollere for gaslækager og derefter sætte systemet under tryk.
- Fyld vævsbadet reservoirer med PSS og lad opløsningen tid til at nå en optimal temperatur. Prime systemet, og fjern eventuelle luftbobler i systemet og slange.
- Kontroller vævsbad beluftere at sikre ensartet opløsning luftning, som ilter PSS buffer og giver Brownsk bevægelse til at distribuere lægemidler, som vil blive indført i vævsbadet under eksperimentet. Sørg beluftning / bobler ikke forårsager væv bevægelse, som vil forstyrre data optagelser; sænke gasstrømmen som nødvendigt.
BEMÆRK: vævsbad og dataopsamlingssystem er nu klar til at starte eksperimentet.
2. Vævspræparat
- Ideelt, dissekere væv fra dyret umiddelbart før brug og placere direkte into PSS.
BEMÆRK: Visse væv kan gemmes i PSS natten over ved 4 ° C, men passende kontroller skal gøres for at validere vævsfunktion efter længere tids opbevaring se afsnit 6. - Brug den thorakale aorta som vævet i denne øvelse.
- Bedøver rotten i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer og placere rotte dorsale nedad. Bekræft bedøvelse via en tå-pinch og tab af refleks reaktion på denne smertefulde stimuli.
BEMÆRK: Denne protokol anvender 70 mg / kg pentobarbital leveres via en intraperitoneal injektion. Institutionelle retningslinjer for gnaver anæstesi kan variere. - Lav en pneumothorax ved at skabe et indsnit med en saks langs membranen i bunden af brystkassen. Derefter fortsætter snittet fra bunden af brystkassen til brystbenet og gennemskære.
- Dissekere væk eller placere bort de organer, der er på toppen af rygsøjlen og find aorta, der ligger direkte langs rygsøjlen.
BEMÆRK: Denne sTEP giver et klart arbejdsrum at dissekere ud aorta. - Afskære alle forbindelser til aorta; fra esophagus, lunge, etc. og skære aorta vinkelret på rygsøjlen på niveau med membranen.
- Hold forsigtigt aorta med pincet og bruge en saks til at dissekere aorta fra rygsøjlen. Start dissektion i den nedre membran område støder op til rygsøjlen og arbejde mod hjertet. Sørg for at tage ekstra forholdsregler for at ikke trække eller slæbebåd på aortavæv, der kan ødelægge vævet.
- Umiddelbart placerer aorta i den forberedte dissektion fad indeholder PSS.
BEMÆRK: Dissektion af aorta i ringe gøres bedst i en dissekere fad, der har en sort silastic fundament. Dette muliggør anvendelse af ledninger, der kan anvendes til kanyle aorta og fastgøres til skålen, der giver stabilitet, mens i dissektion skålen. Den sorte baggrund giver kontrast, der hjælper dissektion. Der skal udvises forsigtighed i brugen af kanylering ledninger som endothelial cellelag kan fjernes med overskydende gnidning af tråden mod lumen af fartøjet. - Tag en ledning og gøre en lille vinkel på 90 ° i den ene ende og skub den vinklede ende i silastic fundament for at forankre styretråden. Placer hele aorta i dissektion fad.
- Hold enden af ledetråden med en pincet, og derefter forsigtigt tråd tråden ind i lumen af aorta.
- Brug pincet og skub aorta på tråden. Når den frie ende af ledetråden er synligt, kurve tråden forsigtigt og placere den frie ende i silastic fundament af skålen til at stabilisere vævet.
- Brug små Vännäs saks og pincet, fjern perivaskulære fedtvæv og alle andre uvedkommende væv, blodpropper osv indtil thorax aorta forekommer hvidt og noget fiberholdigt.
- Fjern rengøres aorta fra ledninger og bruge saks til at klippe aorta i ringe, der er ca. 3-5 mm i bredden.
- Placer en aorta ring på en af et par af tissue kroge ved at holde krogen og bruge pincet til forsigtigt skubbe ringen på krogen. Gentag denne proces med den anden krog. Sørg for, krogene ikke filtrer; se figur 3.
- Kontroller, at hver krog har en anden silkesutur tilsluttet. Kontroller, at en krog har en lille knude løkke af silke, som giver mulighed for fastgørelse til et glas eller rustfrit stål stang, mens den anden er en 10-4 cm langt stykke sutur, der vil være håndholdt bundet til krafttransducer; se figur 3.
BEMÆRK: Når aorta er fastgjort til krogene, vævet er klar til at blive monteret i vævsbadet; se figur 3. - Gentag trin 2,14-2,15, at montere en anden aortaringen i andet væv badkammeret.
3. Tissue Placering i Bath
- Bemærk, at i dette system, vævsbade selv er stationær. På dette tidspunkt, fylde væv bade med opvarmet, porebeton PSS og lad opløsningen til at komme til temperature.
- Med silkesutur, binde en af krogene på vævspræparatet til PEG på rustfri stålstang. Anbring denne ende i vævsbadet kammeret. Tilslut stangen til en ring stativ og placere den anden ende i farvningen fad fyldt med PSS at holde væv nedsænket i buffer; se figur 3.
- Placer stangen og væv i vævsbadet kammer og sørg vævet er helt nedsænket i PSS og stangen er sikkert; se figur 3.
- Bind den anden sutur til krafttransducer og sørg for at forlade slæk i suturen mellem vævet og krafttransducer.
BEMÆRK: Denne slæk vil blive fjernet ved at justere mikrometer; se figur 3.
- Gentag disse trin for den anden aortaringen og vævsbad kammer.
4. Indstilling Passiv Tension
Bemærk: Hver væv har en længde (Lo), hvor glatte muskelceller svare optimally. Indledende forsøg til at bestemme den optimale strækning spænding, som opnår denne længde skal udføres for hver enkelt vævstype, der skal undersøges. Rotten thorakalaorta har en optimal passiv strækning spænding på 4 g.
- Brug mikrometer / tandstangsdrev at øge spændingen til 2 g og vente på væv for at nå plateau. Når plateau er nået, øge spændingen yderligere 2 g og vente på væv plateau.
Bemærk: I aortaringe, efter den indledende spænding på 2 g har sat og plateau nået, vævet skal derefter slappe af til ~ 1,6 g. En anden anvendelse af 2 g ville bringe vævet til ~ 3,6 g, hvorfra vævet igen slappe af og spændingen vil falde. Således efter at have tilsat 4 g af den samlede spænding, bør programmet angive omtrent 3,2 g spænding. - Gentag disse trin for den anden aortaringen og vævsbad kammer.
5. Ækvilibrering and Drug Making
- Ækvilibrering af væv til60 minutter efter anvendelse af passiv spænding til væv.
- I ligevægt fase vaskes vævet hver 15-20 min. Tøm væv bad og erstatte PSS med PSS fra et opvarmet reservoir.
BEMÆRK: I løbet af denne tid, vil vævet slappe af, hvilket indikeres ved tab af passiv spænding. - I løbet af denne tid, forberede lægemidler til forsøget, som skal være mindst 1.000 gange mere koncentreret end den faktiske koncentration i badet, så kun en lille mængde af lægemidlet lager er nødvendig for at opnå den ønskede koncentration.
6. Indledende Challenge
- Ved afslutningen af ækvilibreringsperioden vaskes vævet en sidste gang, gemme data, og re-nul alle indgange.
- Pick en agonist (forbindelse, der vil forårsage aktiv kontraktion), som væv reagerer.
BEMÆRK: I rotte thoracic aorta, den arterielle glatte muskulatur vil aktivt kontrakt til en alfa-adrenerge receptoragonist grund af innervation afvæv af det sympatiske nervesystem. En adrenerg agonist ikke vil være nyttig i tarmvæv eftersom adrenerge agonister medfører afslapning. I dette tilfælde kan anvendes en receptor agonist, såsom acetylcholin (cholinerg receptor). Et alternativ til både phenylephrin og acetylcholin er at anvende en ikke-receptor agonist, såsom høj kalium (K) som den første udfordring. I glat muskulatur, høj K driver indirekte åbne calciumkanaler og således ses som en generel indeks af glat muskel integritet.- Udfør den første udfordring eller wake-up udfordring ved at tilføje 10 -5 M phenylephrin til vævsbadet. For at opnå denne koncentration i 50 ml vævsbad, tilsættes 50 pi af en 10 -2 M phenylephrin løsning.
BEMÆRK: 50 pi i 50 ml PSS er en 1 / 1.000 fortynding, så slutkoncentrationen er 1.000 x mindre end lager eller 10 -5 M. Kendskab til volumen og konsistent vedligeholdelse af volumen i vævsbadet cHamber er afgørende for bestemmelse af den endelige lægemiddelkoncentration.
- Udfør den første udfordring eller wake-up udfordring ved at tilføje 10 -5 M phenylephrin til vævsbadet. For at opnå denne koncentration i 50 ml vævsbad, tilsættes 50 pi af en 10 -2 M phenylephrin løsning.
- Tilsæt 10 -5 M phenylephrin til vævsbadet og tillade sammentrækning til spids og derefter plateau, når hældningen af data bliver nul. Sørg for at registrere hver eksperimentel begivenhed at støtte post-eksperimentel analyse.
- Efter plateau vaskes agonist grundigt ved tømning og genpåfyldning vævsbadet kammer med nye PSS. Sørg for at optage disse begivenheder så godt.
BEMÆRK: En tommelfingerregel er, at koncentrationen af agonist i badet reduceres 10 gange med hver vask. Selv kan mere end 3-4 gange vask være nødvendige for at bringe vævet tilbage til sin ligevægt baseline tone (spænding). - Lad vævet hvile ved baseline tone for ~ 10 minutter, før du fortsætter.
7. Eksperiment
BEMÆRK: Prazosin, en alfa-adrenerg receptor antagonist, vil blive introduceret til vævsbadet kammer at flytte koncentrationen hhvOnse kurven til phenylephrin (PE); dette er en påviselig antagonisme.
- Til et bad, tilsættes køretøjet (H2O), hvori prazosin blev opløst. Til en anden, tilsæt passende koncentration af prazosin. I dette tilfælde tilsættes 25 pi køretøjet til et bad og 25 pi 10 -5 M koncentration af prazosin til den anden for at opnå en 5 x 10 -9 M eller en 5-nM-koncentration i badet.
BEMÆRK: Mens tilføjelsen af køretøjet synes unødvendig i dette eksempel, er det bydende nødvendigt at gøre det, når du bruger andre køretøjer, der har et potentiale til at blive vasoaktive (f.eks DMSO, ethanol, acetat). Tilføj det tilsvarende køretøj, selv om lidt beviser for, at det vasoaktive. - Lad køretøj / prazosin i bade og ikke vaske vævet i 1 time.
- Mens væv ækvilibrering, forberede flere koncentrationer af agonist (PE). Omfatter en bred vifte af koncentrationer fra koncentrationer, der ikke giver respons (fx </ Em> 10 -9 M PE) for koncentrationer, der overstiger det maksimale respons (fx 10 -4 M PE). Da koncentration-responskurver er logaritmisk i naturen, gøre seks separate stamopløsninger af PE (10 -6 -10 -1 M) gennem serielle fortyndinger fra 10 -1 M stamopløsning. Sørg for, at lydstyrken er nødvendig for hver koncentration er lidt større end en tredobling af nødvendig for alle bade (dvs.> 300 pi) samlede volumen.
- Fortsæt til tilsætning agonist, som beskrevet i tabel 1.
BEMÆRK: Dette eksperiment vil generere en kumulativ koncentration-respons-kurve til PE; hver iteration tager hensyn til mængden af stof, der allerede tilsættes til badet. Tilgang forekomme, indtil de ikke længere øges sammentrækning eller hele kurven er toppet.- Tilføje hver medikamentkoncentration individuelt, indtil tærsklen væv er nået.
- Hvis ingen ændre, tilføje den næste koncentration iserien; se tabel 2.
BEMÆRK: Timingen af disse tilføjelser afhænger agonist anvendes. For eksempel, noradrenalin og phenylephrin sammentrækning udvikler sig hurtigt, og bør plateau inden for få minutter. Derimod endotelin-1 sammentrækning udvikler sig langsomt og kan ikke plateau for næsten 45 min. Andre eksperimenter kan udføres på vævet efter opførelsen af en kurve som denne, så længe (1) stoffet udvasker; og (2) det kan påvises, at vævet vender tilbage til normal kontraktile adfærd og er ikke påvirket af de tidligere stimulationer.
8. Data Analysis
- Sørg for at gemme data umiddelbart før og efter en intervention (f.eks wake up eller fuld kurve).
- Find og indstil vævet baseline for hver vævsbad kammer / indgangskanal, der vil støtte i dataanalyse.
- Når baseline er indstillet, skal du finde det maksimale respons for hver koncentration, og optag change fra baseline. Sekventielt gå gennem hver af koncentrationerne og registrere grundlinjeforskydning.
- Tegn de resulterende data. Gør dette i ethvert plotning program.
BEMÆRK: Graph Pad Prism er designet til farmakologer, og det er ideelt til den type forsøg, der præsenteres her.
Representative Results
Med hensyn til agonisme, kan den relative effekt (E max) og styrke (EC50) af en agonist i et givet væv beregnes og sammenlignes med svarene fra andre agonister i det samme væv 1. I vores forsøg blev rotten thorakalaorta inkuberet med enten vehikel eller α 1 adrenerge receptor antagonist prazosin (5 nM) i en time før tilsætning af α 1 adrenerge agonist phenylephrin til vævsbadet og generering af kontraktion (figur 1).
Figur 2 præsenterer modificerede resultater i figur 1. De grønne reaktioner har markeret den maksimale kontraktion opnås ved PE markeret som max, ½ maksimal kontraktion mærket som sådan og derefter forbundet med PE koncentration, der forårsagede, at svar. Identifikation af disse værdier er at identificere den effektive koncentration af en agonist, der opnår en halv max (50%) respons eller EF
Generere og fortolkningen af disse resultater er det vigtigt at anvende både lave og høje koncentrationer af agonist for at skabe koncentration-respons-kurve. Uden nok point til at vise en stabil basislinje og maksimal plateau, kan kun skønnes EF 50 og E MAX. Dette blev gjort grafisk i dette eksempel. Computer software, der bruger logistiske funktioner for sigmoidale kurver kan anvendes til kurvetilpasning og beregning af EC 50 værdier.
Figur 1:. Vævsbad Skematisk Cartoon repræsenterer en ring af væv placeret i den dobbelte væg, vandkappe væv bath. Buffer indstrømning og udstrømning er reguleret af en 3-vejs glas stophane integreret i bunden af kammeret. O 2 / CO 2 bobles ind gennem en belufter, der er forseglet med en pakning for at forhindre lækage af PSS eller gas. Recirkulation input er under produktionen for at opretholde god cirkulation og forhindre dannelsen af luftlommer, der ville forårsage temperatur disregulering.
Figur 2:. Rat thorakalaorta + Endothelium Figuren ovenfor viser fire separate forsøg (forskellige dyr og udført af forskellige forskere på forskellige sæt ups som repræsenteret ved forskellige farver) for at teste evnen af prazosin at flytte en PE-induceret kontraktion. Prazosin (5 nm) klart flyttet PE-induceret kontraktion kurve mod højre i en parallel måde.
Figur 3: Rat thorakalaorta + Endothelium Grafisk estimering af EC 50 -værdier for PE i fravær (køretøj) og tilstedeværelse (prazosin) af antagonist.. Grøn linje (gruppe C) kun er markeret.
| Salt | MW (g / mol) | 5 liter | ENDELIG mM |
| (gram) | |||
| NaCl | 58,45 | 37.99 | 130 |
| KCI | 74,56 | 1,75 | 4.7 |
| KH2PO4 | 136,1 | 0,8 | 1.18 |
| MgSO4• 7H20 | 246,5 | 1.45 | 1.17 |
| NaHCO3 | 84.21 | 6.25 | 14.9 |
| Dextrose | 180,16 | 5 | 5.5 |
| EDTA | 380 | 0.05 | 0.03 |
Tabel 1: Normal fysiologisk saltopløsning (PSS) Opskrift indhold bicarbonatpufret PSS anvendt i dette eksperiment.. Inkluderet er molekylvægtene af alle salte, og mængden tilsat til 5 L dH2O at opnå den ønskede koncentration.
| Koncentration i bad | Tilsætning af agonist til bad |
| 1 x 10 -9 M | 50 ml 1 x 10 -6 M |
| 3 x 10 -9 M | 100 ml 1 x 10-6 M |
| 1 x 10 -8 M | 35 ml 1 x 10 -5 M |
| 3 x 10 -8 M | 100 ml 1 x 10 -5 |
| 1 x 10 -7 M | 35 ml 1 x 10 -4 M |
| 3 x 10 7M | 100 ml 1 x 10 -4 M |
| 1 x 10 -6 M | 35 ml 1 x 10 -3 M |
| 3 x 10 -6 M | 100 ml 1 x 10 -3 M |
| 1 x 10 -5 M | 35 ml 1 x 10 -2 M |
| 3 x 10 -5 M | 100 ml 1 x 10 -2 M |
| 1 x 10 -4 M | 35 ml 1 x 10 -1 M |
Tabel 2:. Vævsbad Additiv agonist Koncentrationer Mængden af agonist, hvormed hvert bad til properly konstruere kumulative koncentration-respons-kurver. Den ønskede bad koncentration opnås ved tilsætning af sekventielle mængder af stigende koncentrationer af agonist. Hver tilsætning tager koncentrationen af agonist allerede er til stede i badet i betragtning. Dette gøres for at minimere stigningen i volumen i vævsbadet, som ville resultere i at bruge stigende mængder en enkelt koncentration af agonist.
Discussion
Måling af isometrisk kraft som værktøj for forskningen er over 150 år gammel, men det er fortsat den prototypiske teknik til receptor karakterisering i kontraktile væv 2. Effekten af denne teknik er i sin enkelhed og alsidighed: ved at optage reaktioner fremkaldt af stigende koncentrationer af en agonist i nærvær eller fravær af en antagonist, kan et utal af information udledes om de farmakologiske egenskaber af hvert lægemiddel og receptoren, som det binder 3-5. Forsøg af denne type også samle oplysninger om konkurrencesituationen versus ikke-konkurrerende karakter antagonister anvendes, samt receptor heterogenitet og uspecifikke lægemiddelvirkninger 6-8. Således, med enkle permutationer til dette isolerede vævsbad eksperiment, en relativt komplet farmakologiske profil af receptorerne, der medierer agonist-induceret muskelsammentrækning kan genereres.
Med hensyn til agonisme, the relative effekt (E max) og styrke (EC50) af en agonist i et givet væv kan beregnes og sammenlignes med svarene fra andre agonister i det samme væv 1. I vores forsøg blev rotten thorakalaorta inkuberet med enten vehikel eller α 1 adrenerge receptor antagonist prazosin (5 nM) i en time før tilsætning af α 1 adrenerge agonist phenylephrin til vævsbadet og generere sammentrækning. Figur 2 præsenterer modificerede resultater i figur 1. De grønne reaktioner er blevet markeret med den maksimale kontraktion opnås ved PE markeret som max, den ½ maksimal sammentrækning mærket som sådan og derefter tilknyttet PE koncentration, der forårsagede dette svar. Identifikation af disse værdier er at identificere den effektive koncentration af en agonist, der opnår en halv max (50%) respons eller EC50-værdi.
Desværre anvendelse agonistafhængig parameters alene at bestemme receptorbindende egenskaber kan være kompliceret 9. Ideelt, yderligere forsøg med receptor-antagonister tillader beregning af to vigtige parametre, der er nøglen til at definere interaktionen mellem et lægemiddel og en receptor: den -log 10 af antagonisten dissociationskonstant (pK B) og -log 10 i molære antagonist koncentration nødvendig for at fremkalde dobbelt højregående forskydning i koncentrations-responskurven (pA2) 10. Både K B og pA2 får deres anvendelighed fra det faktum, at de er agonist-uafhængige værdier, og forbliver konstant, selv mellem forskellige væv 11. Ud fra dataene i figur 2, kan pK B beregnes ved hjælp af følgende ligning og er baseret på EF-50, der er beregnet andetsteds:
EC50 i fravær af prazosin = 2 x 10 -8 M
EF 50 i den præmeget af prazosin = 7 x 10 -6 M
Løs for K B i følgende ligning:
log (DR-1) = log [B] - log K B
Hvor:
[B] = antagonist koncentration, eller 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8,3
DR = dosisforhold af EC 50 værdi i nærvær af antagonist / EF 50 i fravær. Hvis der er en højredrejning, vil denne værdi være større end én. Således:
DR = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M eller 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350
Substitution for [B] og dr:
log (350-1) = -8 - log K B
2,54 = -8 - log KB
pK B = 10,54
Denne værdi for prazosin er i overensstemmelse med de værdier, når prazosin interagerer med en α 1 adrenerg recepteller 12,13, tyder på, at adrenerge receptor medierer kontraktion til phenylephrin er α 1 adrenerge receptor.
Flere trin er afgørende for succes i disse forsøg. Væv skal forblive i PSS efter dissektionen for at undgå tab af levedygtighed væv. Enhver isometrisk muskel præparat har en optimal længde-spænding forhold, der genererer maksimal magt mod passiv spænding 14,15. For eksperimentet beskrevet i denne protokol, var optimal passiv spænding tidligere bestemt ved kort tilføje trin på 0,5 g passiv spænding til vævet. Vævet skal begynde uden tone og derefter efter 30 min af ligevægt blev vævet udfordret med en maksimal koncentration af KCl (80 mM), hvilket genererede aktive tone. Derefter blev vævet vasket og fik lov til at vende tilbage til basislinie tone. Efter 15 min ved baseline blev endnu 0,5 g passiv spænding anbringes, og denne proces gentages, indtil et plateau afaktiv spænding blev opnået med yderligere passiv spænding. I indledende eksperimenter blev 4 g totalt passiv spænding bestemmes for at opnå maksimal aktiv spænding generation i aortaringe og dermed denne samlede spænding anbringes på ringene før ækvilibrering. Proceduremæssigt er det bedst kendte passiv spænding ansøgning til nul, men kan gøres til enhver tid før forsøget. Over-stretching væv, på noget tidspunkt i forsøget eller dissektion, negativt vil påvirke væv levedygtighed og eksperimentelle resultater. Dette er mest afgørende, når placere væv i badet, da dette trin har den højeste sandsynlighed for overdreven strækning. Tilstrækkelig vask, i antal og varighed er påkrævet for reproducerbare virkninger. En anden udfordring for hurtigt efter en indledende udfordring eller før væv er vendt tilbage til baseline spænding, vil resultere i afvigende reaktioner. Hvis studere reversible antagonister / hæmmere bør væv ikke vaskes før agonist kommer, som inhibitor fusion vil være nedsat.
Der er bemærkelsesværdige fordele og ulemper for de isolerede vævsbad assays.
Ulemper: Væv kan opleve forskellige grader af skader under kirurgisk fjernelse eller placering af ringe på kroge. Da endotelcelle er den indvendige foring af aorta ring, skal man passe på anbringelsen af ringen på kroge for ikke at beskadige denne cellelag. Væv kan også have tydeligt forskellige længder af tid, hvor de er levedygtige i vævsbadet, og dette skal bestemmes; ikke alle væv, er de samme. Langs disse linjer, kan væv ændre sig i deres reaktionsevne hele dagen, således at tidskontrol blevet en nødvendig kontrol for hvert forsøg. Et godt eksempel på dette er marsvinluftrøret der forbedrer i kontraktilitet maksimum af 100% i løbet af en typisk 8 timer eksperiment. Lægemidler, der er tungtopløselige i vand, kan udfældes i PSS. Endelig kumulativ ennd ikke-kumulative tilsætninger af et lægemiddel, der er en agonist kan medføre forskellige resultater, hvis receptor desensibilisering til agonisten finder sted; Angiotensin II er et sådant stof, der viser hurtige tachyphylaxe.
Fordele: En af de primære fordele ved vævsbad eksperimenter er, at det er real time; man kan se eksperimentet som det udfolder sig og kan hurtigt lave konklusioner og planlægge de næste skridt, samt fejlfinding under et eksperiment. Et eksperiment tager en dag at gøre. Flere væv kan typisk fremstilles ud fra et dyr, således at et dyr kan tjene som sin egen kontrol og der tilføjer styrke til et eksperiment. Man kan også isolere væv fra andre faktorer, således at afprøve en relativt ren reaktion af vævet for lægemidlet. In vitro forsøg, såsom vævsbadet systemet tillader også anvendelse af en mindre mængde af lægemiddel sammenlignet med et in vivo eksperiment.
Det grundlæggende eksperimentelle design beskrevet heri, kan væreudstrakt ændret for at give mulighed for optagelse af yderligere parametre eller indførelse af andre eksterne stimuli. For eksempel tilsætning af elektroder tillader elektrisk felt stimulation af innerverer nerver 16,17. Med tilføjelsen af termiske eller pH-sonder, kan også måles effekten af temperatur og pH på kontraktile respons 18,19. Ligeledes kan oxygen være substitueret helt eller delvist med N2 for at evaluere hypoxi inducerede virkninger. Desuden kan de samme grundlæggende principper for isometrisk kontraktilitet måling, der anvendes i denne video bruges til at udvikle systemer, der tillader samtidig måling af isometrisk spænding udvikling og ændringer i intracellulært calcium 20. Signaltransduktion er også let undersøgt, eftersom systemer eksisterer der hurtigt kan fryse en vævsprøve i en reaktion, således at aktiviteten af en signaltransduktionsvej systemet kan kontrolleres biokemisk.
Variationen i EQUipment, der kan anvendes til at gøre dette er enorm. Hele denne ordning, enten hånd konstrueret eller automatisk, kan købes fra flere forskellige virksomheder. De væv bade og væv indehavere i denne protokol var mundblæste (væv bade) og hånd konstrueret (indehavere) af en in-house Michigan State University maskinværksteder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LabChart Software | ADInstruments | 7.2 | |
| PowerLab (4 channel) | ADInstruments | ML760 | |
| QuadBridge (4 channel) | ADInstruments | ML112 | ML112 |
| Grass Adapter Cable | ADInstruments | MLAC11 | MLAC11 |
| Grass Force-displacement Transducer | Grass Instrument Co | FT03 | FT03 |
| Grass Transducer Cable | Grass Instrument Co | TAC-7 REV-1 | |
| BNC to BNC Cable | ADInstruments | MLAC01 | |
| IsoTemp 2100 | Fisher Scientific | IC-2100 | |
| Tissue Bath | Multiple Sources | ||
| Physiological Salt Solution | PSS | ||
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Ring Stand | Humboldt MFG Co | H-2122 7 | |
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Tygon Tubing | VWR Scientific | 63010-100 | R-3603 |
| Hose Clamps | Cole-Parmer Instrument Co | 06832-08 | SNP-8 |
| 50 ml Muscle Bath | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| 250 ml Warming Chambers | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| Gas Dispersion Tube | Ace Glass | 7202-06 | 7202-02 |
| Micrometer | |||
| Custom Stands | |||
| Three-prong Clamps | VWR International | Talon | |
| S-connector | VWR International | Talon | |
| Tissue Hooks | Hand Made in House | Custom | |
| Tissue Dissection | |||
| Leica Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | 12562-36 |
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | 160-150 |
| Splinter & Fixation Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | 160-55 |
References
- Kenakin, T. P. The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues. Pharmacol. Rev. 36, 165-222 (1984).
- Scheindlin, S. A brief history of modern pharmacology. Modern Drug Discovery. 4, 87-88 (2001).
- Christopoulos, A., El-Fakahany, E. E. Qualitative and quantitative assessment of relative agonist efficacy. Biochem. Pharmacol. 58, 735-748 (1999).
- Arunlakshana, O., Schild, H. O. Some quantitative uses of drug antagonists. Br. J. Pharmacol. Chemother. 14, 48-58 (1959).
- Christopoulos, A., Kenakin, T. G. protein-coupled receptor allosterism and complexing. Pharmacol. Rev. 54, 323-374 (2002).
- Braverman, A. S., Kohn, I. J., Luthin, G. R., Ruggieri, M. R. Prejunctional M1 facilitory and M2 inhibitory muscarinic receptors mediate rat bladder contractility. Am. J. Physiol. 274, R517-523 (1998).
- Singh, J., et al. Immunoglobulins from scleroderma patients inhibit the muscarinic receptor activation in internal anal sphincter smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 297, G1206-1213 (2009).
- Goadsby, P. J., Adner, M., Edvinsson, L. Characterization of endothelin receptors in the cerebral vasculature and their lack of effect on spreading depression. J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 698-704 (1996).
- Colquhoun, D. Agonist-activated ion channels. Br. J. Pharmacol. 147, Suppl 1. S17-26 (2006).
- Wyllie, D. J., Chen, P. E. Taking the time to study competitive antagonism. Br. J. Pharmacol. 150, 541-551 (2007).
- Schild, H. O. pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. 1947. Br. J. Pharmacol. 120 (4), 29-46 (1997).
- Oshita, M., Kigoshi, S., Muramatsu, I. Pharmacological characterization of two distinct alpha 1-adrenoceptor subtypes in rabbit thoracic aorta. Br. J. Pharmacol. 108, 1071-1076 (1993).
- Hiraoka, Y., et al. Binding and functional characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes in the rat prostate. Eur. J. Pharmacol. 366, 119-126 (1999).
- Cooke, P. H., Fay, F. S. Correlation between fiber length, ultrastructure, and the length-tension relationship of mammalian smooth muscle. J. Cell Biol. 52, 105-116 (1972).
- Davis, M. J., Gore, R. W. Length-tension relationship of vascular smooth muscle in single arterioles. Am. J. Physiol. 256, H630-H640 (1989).
- Davis, R. P., et al. One-month serotonin infusion results in a prolonged fall in blood pressure in the deoxycorticosterone acetate (DOCA) salt hypertensive rat. ACS Chem. Neurosci. 4, 141-148 (2013).
- Heppner, T. J., et al. Nerve-evoked purinergic signalling suppresses action potentials, Ca2+ flashes and contractility evoked by muscarinic receptor activation in mouse urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 587, 5275-5288 (2009).
- Burdyga, T. V., Wray, S. On the mechanisms whereby temperature affects excitation-contraction coupling in smooth muscle. J. Gen. Physiol. 119, 93-104 (2002).
- Hyvelin, J. M., O'Connor, C., McLoughlin, P. Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).
- Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava. Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).
