Introduction
Disciplinen i farmakologi har använt den isolerade vävnadsbadet system för över 150 år. Mångsidig av detta system har tillåtit vetenskapsmän över hela världen för att karakterisera receptorer och receptor signaltransduktion, med denna kunskap som ligger till grund för terapier som har behandlats miljontals individer med sjukdomar eller störningar som högt blodtryck, hjärtsvikt, diabetes, mag-tarmsjukdom, urinblåsa dysfunktion, astma, och sväljstörningar, för att bara nämna några. Till denna dag återstår den isolerade vävnadsbadet en viktig aspekt av läkemedelsutveckling och grundforskning, eftersom det tillåter vävnaden att fungera som en vävnad. I den här JUPITER lektionen, är en formell protokoll delas för att visa en visuell och virtuell experiment utnyttja data från en isolerad vävnad bad experiment som mäter isometrisk kontraktion, vilket tillåter receptor karakterisering.
Den främsta fördelen med denna teknik är att vävnaden lever ettnd fungerar som helhet vävnad, med en fysiologisk utfall (sammandragning eller avslappning) som är relevant för kroppen. Det är en syntes av stegen (läkemedelsreceptorinteraktioner, signaltransduktion, andra budbärare generation, förändring i glatt muskulatur retbarhet, och ändra i vävnad funktion). Medan andra tekniker tillåter studier av vart och ett av dessa steg (t.ex. radioligandbindning för drog affinitet, mätning av andra budbärare), gör den isolerade vävnadsbadet teknik för integrering av alla dessa steg 1. En annan fördel är att behålla vävnad funktion medger beräkning av viktiga farmakologiska variabler som är mer meningsfullt i en vävnad vs en cellulär miljö; det kommer närmare hur de undersökta läkemedlen skulle fungera i kroppen som en helhet.
Protocol
OBS: Alla förfaranden som beskrivs i detta dokument utförs enligt riktlinjer fastställda av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) i Michigan State University.
1. System Förberedelse och inställning
- Gör 5 L av en fysiologisk saltlösning (PSS), vilket är det belopp som behövs för en vävnadsbadet kontraktion experiment som använder upp till 50 ml vävnadsbad; se tabell 2 för PSS recept. Beräkna totala erforderliga volymen genom att multiplicera antal vävnads bad gånger badet volymen och sedan multiplicera med antalet vävnad tvättar.
- Använd tabell 2 som en guide för att göra PSS. Lös upp salterna i approximativt 4 L vatten. OBS: HPLC - Typ I vatten rekommenderas
- Lägg 8 ml 1 M CaCl2-lösning (147 g / L om dihydratet saltet) till lösningen, så att slutlösningen är 1,6 mM kalcium.
- Quantum sufficit PSS lösningen till 5 L.
- Förvärm vävnadsbadet systemet till 37 ° C genom att slå på den recirkulerande uppvärmt vattenbad. Kritisk Step: Varje komponent i systemet är vattenmantlad, se till att de är anslutna i serie med varandra. Flödesriktningen är kritisk - se till att vattnet rinner in varje komponent till lägsta hullingförsedda anslutningen och ut på högsta hullingförsedda anslutningen.
- Slå på datainsamlingssystem. Ström på kraftgivarna minst 15 minuter före experimentet till jämvikt temperatur.
OBS: De flesta kraftgivare använder töjningsgivare som är känsliga för variationer i temperatur och uppvisar termisk drift initialt efter strömmen slås på. - Starta datainsamling programvara och se samband med datainsamlingssystem. Följ tillverkning instruktioner för att möjliggöra dataregistrering.
- Se till kraftgivarna är kalibrerade innan vävnaden placeras i vävnadsbadet och före datainspelning har startat; follow tillverkarens instruktioner för kalibrering.
- Anslut vävnadsbadet systemet till en 95% O2 / 5% CO 2 medicinsk kvalitet gascylinder och kontrollera gasläckage och sedan trycksätta systemet.
- Fyll vävnads bad reservoarer med PSS och låt tiden lösningen för att nå optimal temperatur. Prime systemet och avlägsna eventuella luftbubblor i systemet och slangar.
- Kontrollera vävnads bad luftare för att säkerställa konsekvent lösning luftning, vilket syresätter PSS buffert och ger Brownsk rörelse för att distribuera läkemedel som kommer att införas i vävnaden badet under experimentet. Kontrollera luftning / bubblor orsakar inte vävnadsrörelse, vilket kommer att störa uppgiftsinspelningar; minska gasflödet vid behov.
OBS: vävnadsbad och datainsamlingssystem är nu redo att starta experimentet.
2. Vävnadsberedning
- Helst dissekera vävnader från djuret omedelbart före användning och placera direkt into PSS.
OBS: Vissa vävnader kan sparas i PSS natten vid 4 ° C, men lämpliga kontroller måste göras för att validera vävnadsfunktion efter långvarig förvaring; se avsnitt 6. - Använd bröstaortan som vävnaden i denna övning.
- Söva råttan i enlighet med institutionens riktlinjer och placera råttan ryggsidan nedåt. Bekräfta anesthetization via en tå-nypa och förlusten av reflex svar på denna smärtsamma stimuli.
NOTERA: Detta protokoll använder 70 mg / kg av pentobarbital levereras via en intraperitoneal injektion. Institutionella riktlinjer för gnagare anestesi kan skilja. - Skapa en pneumotorax genom att skapa ett snitt med en sax längs membranet vid botten av bröstkorgen. Fortsätt sedan snittet från botten av bröstkorgen till bröstbenet och bisect.
- Dissekera bort eller placera undan de organ som är på toppen av ryggraden och lokalisera aorta, som ligger direkt längs ryggraden.
OBS: Detta ärtep ger en tydlig arbetsutrymme för att dissekera ut aorta. - Sever alla anslutningar till aorta; från matstrupen, lungor, etc och skär aortan vinkelrät till ryggraden vid nivån för membranet.
- Håll försiktigt aorta med pincett och använda sax för att dissekera aorta från ryggraden. Starta dissektion i nedre membranområdet intill ryggraden och arbetet mot hjärtat. Se till att ta extra försiktighetsåtgärd för att inte dra eller ryck i aortavävnad, vilket kan skada vävnaden.
- Placera omedelbart aorta i förberedda dissektion skålen innehåller PSS.
OBS: Dissekering av aorta i ringar görs bäst i en dissekera maträtt som har en svart silastic stiftelse. Detta möjliggör användning av trådar som kan användas för att kanylera aortan och fästas till skålen, vilket ger stabilitet medan i dissektion skålen. Den svarta bakgrunden ger kontrast som hjälper dissektion. Försiktighet bör iakttas vid användning av kanyletrådar som endothelial cellskikt kan avlägsnas med överskott gnidning av tråden mot lumen av kärlet. - Ta en tråd och gör en liten 90 ° vinkel vid en ände och pressa den vinklade änden i silastic fundamentet för att förankra styrtråden. Placera hela aorta i dissektion skålen.
- Håll i änden av styrtråden med pincett, och sedan försiktigt trär tråden in i lumen av aorta.
- Använd pincett och skjut aorta på wiren. När den fria änden av styrtråden är synlig, kurva tråden försiktigt och placera den fria änden i silastic fundamentet av skålen för att stabilisera vävnaden.
- Med små Vannas sax och pincett, ta bort perivaskulära fettvävnad och alla andra främmande vävnad, blodproppar, etc. tills bröstaortan verkar vitt och lite fibrösa.
- Ta det rengjorda aorta från tråd och använda sax för att klippa aorta i ringar som är ungefär 3-5 mm i bredd.
- Placera en aortaring på en av ett par av tissue krokar genom att hålla kroken och använda pincett för att försiktigt glida ringen på kroken. Upprepa denna process med den andra kroken. Var noga med att krokarna inte trasslar; se figur 3.
- Kontrollera att varje krok har en annan silkessutur bifogas. Kontrollera att en krok har en liten knutna slinga av siden som möjliggör fastsättning på en glas eller stång av rostfritt stål, medan den andra är en 04/10 cm lång bit sutur som kommer att vara hand-bundna till kraftgivare; se figur 3.
ANMÄRKNING: När aortan är fäst krokarna, är redo att monteras i vävnadsbadet vävnaden; se figur 3. - Upprepa steg 2,14-2,15, att montera en andra aorta ring i den andra vävnadsbadet kammaren.
3. Vävnads Placering i Bath
- Observera att i detta system, bad vävnads själva är stillastående. Vid denna tid, fylla vävnadsbad med uppvärmd, kolsyrat PSS och låt lösningen komma till Temperature.
- Med silkessutur, binda en av hakarna på vävnadspreparat till stiftet på stång i rostfritt stål. Placera detta i vävnaden badet kammaren. Anslut stången till en ring stativ och placera den andra änden i färgskål fylld med PSS att hålla vävnad nedsänkt i buffert; se figur 3.
- Placera stången och vävnaden i vävnaden badkammaren och se till att vävnaden är helt nedsänkt i PSS och staven är säker; se figur 3.
- Knyt den andra sutur till kraftgivare och se till att lämna slack i suturen mellan vävnaden och kraftgivare.
OBS: Denna slack kommer att tas bort genom att justera mikrometer; se figur 3.
- Upprepa stegen för den andra aortaringen och vävnadsbadet kammare.
4. Inställning Passiv Tension
OBS: Varje vävnad har en längd (Lo) där glatta muskelceller svarar optimally. Preliminära experiment för att bestämma den optimala stretching spänningar som uppnår denna längd måste utföras för varje enskild vävnadstyp som skall undersökas. Råttan bröstaortan har en optimal passiv stretching spänning 4 g.
- Använd mikrometer / kuggstångsstyrning att öka spänningen till 2 g och vänta vävnaden att nå platån. När platå nås, ökar spänningen ytterligare 2 g och vänta på vävnaden till platån.
OBS: I aortaringar, efter den inledande spänningen av 2 g har satt och platå nåtts, vävnaden ska sedan koppla till ~ 1,6 g. En andra tillämpning av 2 g skulle föra vävnaden till ~ 3,6 g, från vilken vävnad kommer åter koppla och spänning kommer att minska. Alltså, efter att ha lagt 4 g total spänning, bör programmet anger ungefär 3,2 g spänning. - Upprepa stegen för den andra aortaringen och vävnadsbadet kammare.
5. Ekvilibrering and Drug Making
- Jämvikta vävnaden för60 min efter applicering passiv spänning till vävnaden.
- Under jämviktsfasen, tvätta vävnaden varje 15-20 min. Töm vävnader bad och ersätta PSS med PSS från en uppvärmd reservoar.
OBS: Under denna tid, kommer vävnaden slappna av, vilket indikeras av förlusten av passiv spänning. - Under denna tid, förbereda läkemedel för experimentet, som måste vara åtminstone 1000 gånger mer koncentrerad än den faktiska koncentrationen i badet, så behövs endast en liten volym av drogen lager för att uppnå den önskade koncentrationen.
6. Första Utmaning
- Vid slutet av jämviktsperioden, tvätta vävnaden en sista gång, spara data, och åter noll alla ingångar.
- Plocka en agonist (förening som kommer att orsaka aktiv kontraktion) till vilken vävnaden svarar.
OBSERVERA: I råttbröstaorta, den arteriella glatta muskulaturen kommer aktivt att minska till en alfa-adrenerg receptoragonist grund av innervationen avvävnad av det sympatiska nervsystemet. En adrenerg agonist inte skulle vara användbar i tarmvävnader med tanke på att adrenerga agonister orsaka avkoppling. I det här fallet skulle kunna användas en receptoragonist såsom acetylkolin (kolinerga receptor). Ett alternativ till både fenylefrin och acetylkolin är att använda en icke-receptoragonist såsom hög kalium (K) som den första utmaningen. I glatt muskulatur, driver hög K till indirekt öppna kalciumkanaler och därmed ses som ett allmänt index på glatt muskulatur integritet.- Utför den första utmaningen eller väcknings utmaningen genom att lägga 10 -5 M fenylefrin till vävnadsbadet. För att uppnå denna koncentration i 50 ml vävnadsbad, tillsätt 50 | il av en 10 -2 M fenylefrin lösning.
OBS: 50 | il i 50 ml PSS är en 1/1000 utspädning, så att den slutliga koncentrationen är 1,000x mindre än lager, eller 10 -5 M. Kunskap om volym och konsekvent underhåll av volymen inuti vävnadsbadet cHamber är kritisk för att bestämma den slutliga läkemedelskoncentrationen.
- Utför den första utmaningen eller väcknings utmaningen genom att lägga 10 -5 M fenylefrin till vävnadsbadet. För att uppnå denna koncentration i 50 ml vävnadsbad, tillsätt 50 | il av en 10 -2 M fenylefrin lösning.
- Lägg 10 -5 M fenylefrin till vävnadsbadet och tillåta kontraktion till topp och sedan platå, när lutningen av data blir noll. Se till att spela in varje experimentell händelsen till stöd efter experimentell analys.
- Efter platå, tvätta agonist ut ordentligt genom att tömma och fylla vävnadsbadet kammaren med nya PSS. Se till att spela in dessa händelser också.
OBS: En tumregel är att koncentrationen av agonist i badet reduceras 10 gånger med varje tvätt. Även kan mer än 3-4 tvättar vara nödvändigt att föra vävnaden tillbaka till sitt jämvikts baslinjen tonen (spänning). - Låt vävnaden vila vid baslinjen tonen för ~ 10 min innan du fortsätter.
7. Experiment
OBS: Prazosin, en alfa-adrenerg receptorantagonist, kommer att introduceras till vävnadsbadet kammaren för att förskjuta koncentrationen respOnse kurvan till fenylefrin (PE); detta är en påvisbar antagonism.
- Till ett bad, lägga fordonet (H2O) i vilken prazosin upplöstes. Till en annan, lägga till lämplig koncentration av prazosin. I detta fall, tillsätt 25 pl fordon till ett bad och 25 ^ 10 -5 M koncentration av prazosin till den andra för att uppnå en 5 x 10 -9 M eller 5 nM koncentration i badet.
OBS: Även tillägg av fordonet verkar onödigt i detta exempel, är det absolut nödvändigt att göra så när man använder andra fordon som har en potential att bli vasoaktiva (t.ex. DMSO, etanol, acetat). Lägg i motsvarande fordon, även om lite bevis föreligger för att det ska vara vasoaktiva. - Lämna bilen / prazosin i baden och tvättar inte vävnaden under 1 timme.
- Medan vävnader jämvikt, förbereda flera koncentrationer av agonist (PE). Inkludera ett brett spektrum av koncentrationer, från koncentrationer som framkallar något svar (t.ex. </ Em> 10 -9 M PE) till koncentrationer som överträffar det maximala svaret (t.ex. 10 -4 M PE). Eftersom koncentration-responskurvor är logaritmisk i naturen, gör sex separata stamlösningar av PE (10 -6 -10 -1 M) genom seriespäd från 10 -1 M stamlösning. Kontrollera att volymen som behövs för varje koncentration är något större än tredubbla den totala volymen som behövs för alla bad (dvs.> 300 | il).
- Gå vidare till tillsats agonist, som beskrivs i tabell 1.
OBS: Detta experiment kommer att generera en kumulativ koncentrationssvarskurva till PE; varje iteration tar hänsyn till mängden ämne som redan till badet. Tillägg förrän de inte längre ökar kontraktion, eller hela kurvan har planat.- Lägg varje läkemedelskoncentration individuellt tills tröskelvävnaden nås.
- Om ingen förändring sker, lägga till nästa koncentration iserien; se tabell 2.
OBS: Tidpunkten för dessa tillägg beror på agonist som används. Till exempel, utvecklar noradrenalin och fenylefrin kontraktion snabbt, och bör platå inom några minuter. Däremot utvecklar endotelin-1 kontraktion långsamt och kan inte platån för nära 45 min. Andra experiment kan göras på vävnaden efter byggandet av en kurva som denna, så länge (1) ämnet tvättar ut; och (2) det kan visas att vävnaden återgår till det normala kontraktila beteende och påverkas inte av de tidigare stimuli.
8. Data Analysis
- Se till att spara data omedelbart före och efter en intervention (t.ex. väckning eller full kurva).
- Hitta och ställa vävnaden baslinje för varje vävnad badkammaren / ingångskanal, vilket kommer att underlätta dataanalys.
- När baslinjen är inställd, hittar den maximala responsen för varje koncentration, och registrera chanGE från baslinjen. Sekventiellt gå igenom var och en av de koncentrationer och registrera baslinjeförskjutning.
- Plotta resulterande data. Gör detta i någon grafprogram.
OBS: Graph Pad Prism är utformad för farmakologer, och detta är idealiskt för den typ av experiment som presenteras här.
Representative Results
I termer av agonism, kan den relativa effekten (E MAX) och potens (EC50) av en agonist i en given vävnad beräknas och jämföras till svar från andra agonister i samma vävnad 1. I vårt experiment, råttan bröstaorta inkuberades med antingen vehikel eller α en adrenerg receptorantagonist prazosin (5 nM) under en timme före tillsats av α en adrenerg agonist fenylefrin till vävnadsbadet och alstra kontraktion (Figur 1).
Figur 2 presen modifierade resultaten av figur 1. De gröna svaren har markerat den maximala kontraktion uppnås av PE markeras som max, ½ maximal kontraktion märkt som sådan och sedan i samband med PE koncentration som orsakade detta svar. Identifiera dessa värden är att identifiera den effektiva koncentrationen av en agonist som uppnår en halv max (50%) svar eller EG
Vid alstring och tolkning av dessa resultat, är det viktigt att använda både låga och höga koncentrationer av agonist för att skapa koncentration-respons-kurvan. Utan tillräckligt med poäng för att visa en stabil baslinje och maximal platå, kan EG 50 och E MAX bara uppskattas. Detta gjordes grafiskt i detta exempel. Dataprogram som använder logistikfunktioner för sigmoidala kurvor kan användas för kurvanpassning och beräkning av EC50-värden.
Figur 1:. Tissue Bath Schematisk tecknad som representerar en ring av vävnad placeras i dubbelvägg, vattenmantlad vävnads bath. Buffert inflöde och utflöde regleras av ett tre-vägs glas kranen integrerad i botten av kammaren. O 2 / CO 2 bubblas in genom en luftare som är tätad med en packning för att förhindra läckage av PSS eller gas. Återcirkulation ingång är under produktionen för att upprätthålla god cirkulation och förhindra uppkomst av luftfickor som skulle orsaka temperatur felreglering.
Figur 2:. Rat bröstaortan + endotelet Figuren ovan visar fyra separata experiment (olika djur och utförs av olika utredare på olika upplägg som representeras av olika färger) för att testa förmågan hos prazosin att skifta ett PE-inducerad kontraktion. Prazosin (5 nM) tydligt skiftat PE-inducerad kontraktion kurvan åt höger i ett parallellt sätt.
Figur 3: Rat bröstaortan + endotelet Grafisk uppskattning av EC 50 -värden för PE i frånvaro (fordon) och närvaro (prazosin) av antagonist.. Gröna linjen (grupp C) endast är markerad.
| Salt | MW (g / mol) | 5 liter | FINAL mM |
| (gram) | |||
| NaCl | 58,45 | 37,99 | 130 |
| KCl | 74,56 | 1,75 | 4,7 |
| KH2PO4 | 136,1 | 0,8 | 1,18 |
| MgSO4• 7H20 | 246,5 | 1,45 | 1,17 |
| NaHCO3 | 84,21 | 6,25 | 14,9 |
| Dextros | 180,16 | 5 | 5,5 |
| EDTA | 380 | 0,05 | 0,03 |
Tabell 1: Normal fysiologisk saltlösning (PSS) Recept Innehåll i bikarbonatbuffert PSS användes i detta experiment.. Inkluderat är molekylvikterna för alla salter och den mängd som tillsätts till 5 L av dH 2 O för att uppnå den önskade koncentrationen.
| Koncentration i badet | Tillsats av agonist göras till badet |
| 1 x 10 -9 M | 50 ml 1 x 10 -6 M |
| 3 x 10 -9 M | 100 ml 1 x 10-6 M |
| 1 x 10 -8 M | 35 ml 1 x 10 -5 M |
| 3 x 10 -8 M | 100 ml 1 x 10 -5 |
| 1 x 10 -7 M | 35 ml 1 x 10 -4 M |
| 3 x 10 -7 M | 100 ml 1 x 10 -4 M |
| 1 x 10 -6 M | 35 ml 1 x 10 -3 M |
| 3 x 10 -6 M | 100 ml 1 x 10 -3 M |
| 1 x 10 -5 M | 35 ml 1 x 10 -2 M |
| 3 x 10 -5 M | 100 ml 1 x 10 -2 M |
| 1 x 10 -4 M | 35 ml 1 x 10 -1 M |
Tabell 2:. Tissue badtillsats Agonist Koncentrationer Mängden av agonist som skall sättas till varje bad till proPerly konstruera kumulativa koncentration-responskurvor. Den önskade badkoncentration uppnås genom tillsats av sekventiella mängder ökande koncentrationer av agonist. Varje tillsats tar hänsyn till koncentrationen av agonist som redan är närvarande i badet. Detta görs för att minimera volymökning i vävnaden bad som skulle bli följden av att använda ökande volymer av en enda koncentration av agonist.
Discussion
Mätning av isometrisk kraft som ett forskningsverktyg är över 150 år gammal, men det fortsätter att vara den prototypiska teknik för receptor karakterisering i kontraktila vävnader 2. Kraften i denna teknik är i sin enkelhet och mångsidighet: genom att spela in svar framkallat av ökande koncentrationer av en agonist i närvaro eller frånvaro av en antagonist, kan en myriad av information härledas om de farmakologiska egenskaperna för varje läkemedel och receptorn till vilken det binder 3-5. Experiment av denna typ samla även information om konkurrens kontra icke-konkurrenskraftiga arten av de antagonister som används, liksom receptor heterogenitet och icke-specifika läkemedelseffekter 6-8. Således, med enkla permutationer till denna isolerade vävnadsbad experiment kan alstras en relativt komplett farmakologiska profilen hos de receptorer som medierar agonistinducerad muskelkontraktion.
I termer av agonism, the relativa effekten (E MAX) och potens (EC50) av en agonist i en given vävnad kan beräknas och jämföras till svar från andra agonister i samma vävnad 1. I vårt experiment, råttan bröstaorta inkuberades med antingen vehikel eller α en adrenerg receptorantagonist prazosin (5 nM) under en timme före tillsats av α en adrenerg agonist fenylefrin till vävnadsbadet och alstra kontraktion. Figur 2 presenterar modifierade resultat i figur 1. De gröna svar har markerats med maximal kontraktion uppnås av PE markeras som max, ½ maximal kontraktion markerade som sådana och sedan i samband med PE koncentration som orsakade detta svar. Identifiera dessa värden är att identifiera den effektiva koncentrationen av en agonist som uppnår en halv max (50%) svar eller EC50 värde.
Olyckligtvis använder agonistberoende parameters själva att bestämma receptorbindande egenskaper kan vara komplicerat 9. Helst ytterligare experiment med receptorantagonister tillåter beräkning av två viktiga parametrar som är avgörande för att definiera samverkan mellan ett läkemedel och en receptor: det -log 10 av antagonisten dissociationskonstanten (pK B) och -log 10 i molar antagonisten koncentration som är nödvändig för att framkalla två-faldig högerförskjutning i koncentration-svarskurva (pA 2) 10. Både K B och pA 2 vinst deras användbarhet från det faktum att de är agonistoberoende värden, och förblir konstant även mellan olika vävnader 11. Från data i figur 2, kan pK B beräknas med följande ekvation och bygger på EG 50 beräknade värdena på andra ställen:
EG 50 i frånvaro av prazosin = 2 x 10 -8 M
EG 50 i presinne för prazosin = 7 x 10 -6 M
Lös för K B i följande ekvation:
log (DR-1) = log [B] - log K B
Var:
[B] = antagonistkoncentration, eller 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8,3
dr = förhållandet dos av EG 50 värde i närvaro av antagonist / EG 50 i frånvaro. Om det finns en högerförskjutning, kommer detta värde att vara större än ett. Alltså:
dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M eller 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350
Ersätta [B] och dr:
log (350-1) = -8 - log K B
2.54 = -8 - log KB
pKg = 10,54
Detta värde för prazosin är förenlig med de värden som erhölls när prazosin samverkar med ett α en adrenerg recepteller 12,13, vilket tyder på att den adrenerga receptorn medla kontraktion till fenylefrin är α 1 adrenerga receptorn.
Flera steg är avgörande för framgången för dessa experiment. Vävnader måste förbli i PSS efter dissekering för att förhindra förlust av vävnad livskraft. Alla isometrisk muskel beredning har en optimal längd-spänning relation som genererar maximal kraft mot passiv spänning 14,15. För experimentet beskrivs i detta protokoll, var optimal passiv spänning som tidigare bestämts genom att kort lägga steg om 0,5 g passiv spänning till vävnaden. Vävnaden bör inledas utan tonen och sedan efter 30 min av jämvikts, var vävnaden utmanas med en maximal koncentration av KCl (80 mM), vilket genererade aktiva tonen. Därefter ades vävnaden tvättades och tilläts återvända till baslinjen tonen. Efter 15 min vid baslinjen tillsattes ytterligare 0,5 g passiv spänning placerad och denna process upprepas tills en platå avaktiv spänning uppnåddes med ytterligare passiva spänning. I preliminära experiment, var 4 g totalt passiv spänning fast beslutna att uppnå maximal aktiv spänning generering i aortaringar, och därmed denna totala mängden spänning läggs på ringarna innan jämvikt. Procedurmässigt är det bäst att noll tidigare passiva spänning ansökan, men kan göras när som helst före experimentet. Över stretching vävnader, vid någon punkt i experimentet eller dissektion, kommer att negativt påverka vävnadsviabilitet och experimentella resultat. Detta är mest viktigt när du placerar vävnader i badet, eftersom detta steg har den högsta sannolikheten för överdriven stretch. Adekvat tvätt, i antal och längd krävs för reproducerbara effekter. En andra utmaning för tidigt efter en inledande utmaning, eller före vävnader har återvänt till baslinjen spänning, kommer att resultera i avvikande svar. Om studera reversibla antagonister / hämmare bör vävnader inte tvättas före agonist dessutom som inhibitor koncentrationen kommer att minska.
Det finns noter fördelar och nackdelar med de isolerade vävnadsbad analyser.
Nackdelar: Vävnader kan uppleva olika grader av skador under kirurgiskt avlägsnande eller placering av ringar på krokar. Eftersom endotelceller är den inre delen av aortaringen, måste man se på placeringen av ringen på krokar för att inte skada denna cellager. Vävnader kan också ha helt olika längder av tid som de är livskraftiga i vävnaden badet, och detta måste bestämmas; inte alla vävnader är desamma. Längs dessa linjer kan vävnaderna förändras i deras lyhördhet under hela dagen så att tidskontroller blivit en nödvändig kontroll för varje experiment. Ett bra exempel på detta är den luftstrupe från marsvin som förbättrar i maximal kontraktilitet med 100% under en typisk 8 tim experiment. Läkemedel som är dåligt lösliga i vatten kan fällas ut i PSS. Slutligen kumulativ and icke-kumulativa tillsatser av ett läkemedel som är en agonist kan resultera i olika resultat om receptor desensibilisering för agonisten sker; angiotensin II är en sådan drog som visar snabba takyfylaxi.
Fördelar: En av de främsta fördelarna med vävnadsbad experiment är att det är realtid; kan man se experimentet som det utvecklar sig och kan snabbt dra slutsatser och planera nästa steg, samt felsökning under ett experiment. Ett experiment tar en dag att göra. Flera vävnader kan normalt framställas från ett djur så att ett djur kan fungera som sin egen kontroll, och det ger styrka till ett experiment. Man kan även isolera vävnaden från andra faktorer för att testa en relativt ren respons av vävnaden för läkemedlet. In vitro-försök såsom vävnadsbadet systemet medge även användning av en liten mängd av läkemedel jämfört med ett in vivo experiment.
Den grundläggande experimentella designen som beskrivs häri kan varaomfattande modifierats för att möjliggöra registrering av ytterligare parametrar eller införandet av andra yttre stimuli. Till exempel tillägg av elektroder möjliggör elektriskt fält stimulering av innerverar nerver 16,17. Med tillägg av termiska eller pH-givare, kan effekterna av temperatur och pH på kontraktila svaren också mätas 18,19. På samma sätt kan syre ersättas helt eller delvis med N2 för att utvärdera hypoxi inducerade effekter. Dessutom kan samma grundläggande principer om isometrisk kontraktilitet mätning som används i den här videon att användas för att utveckla system som möjliggör samtidig mätning av isometrisk spänning utvecklingen och förändringar i intracellulär kalcium 20. Signaltransduktion är också lätt studeras, eftersom systemen existerar som snabbt kan frysa ett vävnadsprov under ett svar, så att kan verifieras aktiviteten hos en signaltransduktionsväg systemet biokemiskt.
Variationen av ekvipment som kan användas för att göra detta är enorm. Hela detta system, antingen för hand konstruerat eller automatiserad, kan köpas från flera olika företag. Vävnadsbaden och innehavare vävnad som används i detta protokoll var handblåst (vävnads bad) och hand konstruerat (innehavare) genom en intern Michigan State University verkstäder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LabChart Software | ADInstruments | 7.2 | |
| PowerLab (4 channel) | ADInstruments | ML760 | |
| QuadBridge (4 channel) | ADInstruments | ML112 | ML112 |
| Grass Adapter Cable | ADInstruments | MLAC11 | MLAC11 |
| Grass Force-displacement Transducer | Grass Instrument Co | FT03 | FT03 |
| Grass Transducer Cable | Grass Instrument Co | TAC-7 REV-1 | |
| BNC to BNC Cable | ADInstruments | MLAC01 | |
| IsoTemp 2100 | Fisher Scientific | IC-2100 | |
| Tissue Bath | Multiple Sources | ||
| Physiological Salt Solution | PSS | ||
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Ring Stand | Humboldt MFG Co | H-2122 7 | |
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Tygon Tubing | VWR Scientific | 63010-100 | R-3603 |
| Hose Clamps | Cole-Parmer Instrument Co | 06832-08 | SNP-8 |
| 50 ml Muscle Bath | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| 250 ml Warming Chambers | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| Gas Dispersion Tube | Ace Glass | 7202-06 | 7202-02 |
| Micrometer | |||
| Custom Stands | |||
| Three-prong Clamps | VWR International | Talon | |
| S-connector | VWR International | Talon | |
| Tissue Hooks | Hand Made in House | Custom | |
| Tissue Dissection | |||
| Leica Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | 12562-36 |
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | 160-150 |
| Splinter & Fixation Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | 160-55 |
References
- Kenakin, T. P. The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues. Pharmacol. Rev. 36, 165-222 (1984).
- Scheindlin, S. A brief history of modern pharmacology. Modern Drug Discovery. 4, 87-88 (2001).
- Christopoulos, A., El-Fakahany, E. E. Qualitative and quantitative assessment of relative agonist efficacy. Biochem. Pharmacol. 58, 735-748 (1999).
- Arunlakshana, O., Schild, H. O. Some quantitative uses of drug antagonists. Br. J. Pharmacol. Chemother. 14, 48-58 (1959).
- Christopoulos, A., Kenakin, T. G. protein-coupled receptor allosterism and complexing. Pharmacol. Rev. 54, 323-374 (2002).
- Braverman, A. S., Kohn, I. J., Luthin, G. R., Ruggieri, M. R. Prejunctional M1 facilitory and M2 inhibitory muscarinic receptors mediate rat bladder contractility. Am. J. Physiol. 274, R517-523 (1998).
- Singh, J., et al. Immunoglobulins from scleroderma patients inhibit the muscarinic receptor activation in internal anal sphincter smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 297, G1206-1213 (2009).
- Goadsby, P. J., Adner, M., Edvinsson, L. Characterization of endothelin receptors in the cerebral vasculature and their lack of effect on spreading depression. J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 698-704 (1996).
- Colquhoun, D. Agonist-activated ion channels. Br. J. Pharmacol. 147, Suppl 1. S17-26 (2006).
- Wyllie, D. J., Chen, P. E. Taking the time to study competitive antagonism. Br. J. Pharmacol. 150, 541-551 (2007).
- Schild, H. O. pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. 1947. Br. J. Pharmacol. 120 (4), 29-46 (1997).
- Oshita, M., Kigoshi, S., Muramatsu, I. Pharmacological characterization of two distinct alpha 1-adrenoceptor subtypes in rabbit thoracic aorta. Br. J. Pharmacol. 108, 1071-1076 (1993).
- Hiraoka, Y., et al. Binding and functional characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes in the rat prostate. Eur. J. Pharmacol. 366, 119-126 (1999).
- Cooke, P. H., Fay, F. S. Correlation between fiber length, ultrastructure, and the length-tension relationship of mammalian smooth muscle. J. Cell Biol. 52, 105-116 (1972).
- Davis, M. J., Gore, R. W. Length-tension relationship of vascular smooth muscle in single arterioles. Am. J. Physiol. 256, H630-H640 (1989).
- Davis, R. P., et al. One-month serotonin infusion results in a prolonged fall in blood pressure in the deoxycorticosterone acetate (DOCA) salt hypertensive rat. ACS Chem. Neurosci. 4, 141-148 (2013).
- Heppner, T. J., et al. Nerve-evoked purinergic signalling suppresses action potentials, Ca2+ flashes and contractility evoked by muscarinic receptor activation in mouse urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 587, 5275-5288 (2009).
- Burdyga, T. V., Wray, S. On the mechanisms whereby temperature affects excitation-contraction coupling in smooth muscle. J. Gen. Physiol. 119, 93-104 (2002).
- Hyvelin, J. M., O'Connor, C., McLoughlin, P. Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).
- Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava. Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).
