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Bioengineering

Folgenabschätzung Wiederholte Exposition von organotypischen 3D bronchiale und nasale Zellkulturmodelle zu Whole Zigarettenrauch

Published: February 12, 2015 doi: 10.3791/52325
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological Systems Research, Philip Morris International R&D, Philip Morris Products S.A.

Protocol

1. Kultur des organotypischen Gewebe Bronchial Kultur Modell

Hinweis: Wiederhergestellte Gewebemodelle wurden als Einsätze, die sofort einsatzbereit sind gekauft. Alternativ könnte der Kultur von primären Zellen wie beispielsweise von Karp und Kollegen 16 beschrieben entwickelt werden. Nach Eingang der Gewebe steril verpackt, immer behandeln die menschliche organotypischen Gewebe unter sterilen Bedingungen.

  1. Hinzufügen von 0,7 ml der vorgewärmten (37ºC) Testmedium in jede Vertiefung einer neuen sterilen 24-Well-Platte unter der Haube.
  2. Entfernen Sie die Verpackung des Gewebes unter der Haube, und übertragen Sie die Gewebekultur-Einsätze mit dem neuen vorbereitet Platte mit 24 Vertiefungen (in Schritt 1.1 beschrieben. Oben).
  3. Pflegen und Kultur das Gewebe in einem Brutschrank bei 37 ° C (5% CO 2, 90% Luftfeuchtigkeit).
  4. Ersetzen Sie das Medium alle 2 Tage.
  5. Während einer Mediumwechsel, untersuchen das Gewebe unter einem Lichtmikroskop auf sie, dass sie contaminati sind sicher,on-frei und dass es keine Leckage von Medium.

2. Zigarettenrauch (CS) Belichtung mit einer In-vitro-Belichtungssystem

  1. Drei Tage vor der Belichtung Experimenten wasche die apikale Seite der Gewebekultur mit 200 ul Kulturmedium.
  2. Am Tag der Exposition, wenn die Messung der Zilienschlag wird vor der Bestrahlung geplant, Griff der Gewebe für Zilienschlag Messung, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
  3. Pre-warm die Klimakammer der in vitro-Belichtungssystem und den Anbau Basismodul auf 37 ° C. Füllen Sie den Anbau Basis-Modul mit 17,5 ml Medium pro Zeile.
  4. Entfernen Sie das Gewebe aus dem Inkubator und legen Sie sie unter der Haube, um die Gewebekultur-Einsätze von der Kulturplatte auf den Anbau Basismodul der in vitro-Belichtungssystem zu übertragen. Darüber hinaus umfassen die Anbaugrundmodul mit einem Glasdeckel.
  5. Übertragen Sie die Gewebe in der Klimakammer der in vitro-Exposition system für die Belastung durch Mainstream-CS.
  6. Wenn die in vitro-Belichtungssystem mit einer Mikrowaage ausgestattet, Aufbau der Quarzmikrowaage, bevor Sie die Belichtung auf die Echtzeit-Partikelablagerung des Rauches auf einem Quarzkristall-Mikrowaage mit dem Software zu messen.
    1. Ersetzen Sie die Kristalle in den Mikromodule zu jeder Zeile des Verdünnungs / Verteilungssystem angeschlossen ist.
    2. Schließen Sie das Mikromodul mit dem Mikro Software. Die Waage der Messung auf Null in der Software.
  7. Expose die Gewebe nach der Versuchsdurchführung (z. B., wie in Figur 1)
    Hinweis: Vor der Belichtung Referenz Zigaretten (3R4F) zwischen 7 und 21 Tagen unter kontrollierten Bedingungen bei 22 ± 1 ° C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 ± 3% nach ISO-Norm 3402 17 konditioniert.
    1. Genezigarettenrauch (z. B. aus 3R4F Zigaretten) mit einem 30-Port-Karussell Raucher machine nach dem Health Canada Intensive Regime: rauchen Zigaretten mit einem Standard Stumpflänge, dh etwa 35 mm bei 55 ml puff über 2 Sekunden, zweimal eine Minute und 8 Sek Pumpe Abgas Zeit.
      Hinweis: Bei Bedarf, verdünnen das Mainstream-CS, so dass die Dosis nicht zu toxisch. Im hier vorgestellten Ergebnisse, wurde Rauch auf 16% (v / v) verdünnt.
    2. Verwenden 60% befeuchteter Luft für die Kontrollproben (der Luft ausgesetzten).
    3. Expose die Gewebe für 6-7 min (dh., 1 Zigarette oder Luft ausgesetzten) in der in vitro-Belichtungssystem
    4. Setzen der Gewebe zurück in den Inkubator bei 37 ° C (5% CO 2, 90% Luftfeuchtigkeit) für 1 Stunde.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 2.7.3 und 2.7.4 noch dreimal.
  8. Am Ende der Exposition Experiment, stoppen Sie die Mikrosoftware. Die Software wird eine Datei, die alle Messungen zusammen mit einer grafischen Darstellung der Partikelabscheidung zu erzeugen.
  9. Transfer zurück das Gewebe aus dem Anbau base Modul an der Kulturplatte. Zeigen die Gewebe wieder in den Inkubator bei 37 ° C (5% CO 2, 90% Luftfeuchtigkeit), bis die Messwerte für die verschiedenen Endgeräte in der spezifischen Postexpositionszeitpunkten.

3. Messung der Zilienschlag

Hinweis: Da pro Versuchsplan (Abbildung 1), Rekord Zilienschlag vor der Belichtung und direkt nach der Exposition.

  1. Entfernen Sie die Gewebekulturplatten aus dem Inkubator und lassen sie unter der Haube bei RT für 30 Minuten, um die Zilien schlagen zu stabilisieren.
  2. Legen Sie die Gewebe unter dem Lichtmikroskop auf die CiliaMetrix Software verbunden.
  3. Notieren Sie sich den Film und Frequenz (in Hertz) des ciliary schlagen. Messen Sie die Frequenz, alle 3 Sek für 1 Minute.
  4. Liefert die dem Gewebe zurück in den Inkubator bei 37 ° C (5% CO 2, 90% Luftfeuchtigkeit).

4. transepitheliale Elektrischer Widerstand (TEER) Mess

Anmerkung: Die Messung des TEER wird 3 Tage vor und 48 h nach der Exposition unter der Haube unter sterilen Bedingungen unter Verwendung von Stäbchen Elektrode (STX-2) zu einer Cell verbunden geführt.

  1. Nach Zugabe von 200 ul Kulturmedium an die apikale Oberfläche der menschlichen Bronchialgewebe.
  2. Schalten Sie den EVOMX Maschine; Waschen Sie die Elektrode mit einer 70% igen Ethanollösung.
  3. Mit dem Kulturmedium Waschen der Elektrode.
  4. Den Widerstand (Ω) durch Einsetzen der Elektrode in das Medium auf der apikalen Seite der Gewebekultur ohne Berührung des Gewebes.
  5. Wiederholen Sie Schritt 4.4 fünfmal zu fünffacher Messungen zu erhalten.
  6. Nach den Messungen, entfernen das Medium von der apikalen Seite der Gewebekulturen unter Verwendung eines Gebläses.
  7. Gib die Gewebekulturen in den Inkubator bei 37 ° C (5% CO 2, 90% Luftfeuchtigkeit) für die Kultivierung.

5. Cytochrom P450 (CYP) 1A1 / 1B1 Activity

  1. Vor Beginn der Studie, bereiten das Luciferin Nachweisreagens durch Übertragung des gesamten Inhalts der Flasche des geeigneten Rekonstitutionspuffer auf das Amber-Flasche mit dem Luciferin-Nachweisreagens (nach Herstellerangaben). Speicher Aliquots von 2 ml bei -20 ° C für maximal 1 Monat.
  2. Für die 48 Stunden nach der Belichtungszeit, Inkubation der Gewebe für 48 Stunden nach CS Exposition bei 37 ° C.
  3. Wärmen Sie das Luciferin Detektionsreagenz auf RT.
  4. Inkubieren Gewebeeinsätze für 3 Stunden oder O / N mit dem Luciferin-CEE Substrat (um 1:50 verdünnt) in der basalen Kulturmedium.
  5. Dann werden 50 & mgr; l Kulturmedium aus jedem Gewebe einzuführen, um eine 96-well Luminometer undurchsichtigen weißen Platte bei RT.
  6. Dann werden 50 ul Luciferin Nachweisreagenz zu jeder Vertiefung, eine Lumineszenzreaktion zu initiieren.
  7. Die Platte bei Raumtemperatur für 20 min.
  8. Lesen Sie die Lumineszenz unter Verwendung eines Luminometers.
    Hinweis: Für dieLuminometer, verwenden Sie eine Integrationszeit von 0,25 bis 1 Sekunde pro Well als Richtlinie.

6. RNA-Extraktion.

  1. Vor dem Sammeln 3D organotypischen Gewebeeinlagen, bereiten 1) eine Box mit Trockeneis, 2) eine ausreichende Menge Blätter (eine pro 3D Einsatz), 3) kaltem PBS ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid, 4) einen 25-ml-Glaspipette und 5 ) sterilen Glas Nadeln für Aspiration.
    1. Beschriften Sie die Röhrchen mit Keramikkugeln zur Homogenisierung feste Zellproben und fügen Sie 700 ul von Qiazol gefüllt.
    2. Schalten Sie Aspiration Maschine.
    3. Sammeln Sie die Platte der 3D organotypischen Gewebeeinlagen aus dem Inkubator.
    4. Mit kaltem PBS waschen jeder Einsatz auf der Platte 3-mal. Zwischen den Waschanlagen absaugen PBS mit der Glasnadel. Nach dem dritten Waschen saugen mit PBS und Deckplatte, um das Trocknen des Einsatzes zu verhindern.
    5. Für jeden Einsatz von der Platte, schneiden Sie die Insert-Membran (auf dem 3D-Gewebeeinlage befindet), bis die membrane liegt flach auf der Klinge.
    6. Übertragen Sie das Gewebe (zusammen mit dem Einsatz Membran) von der Klinge auf die Homogenisierung Rohr entsprechend gekennzeichnet und schrauben Sie den Deckel auf das Rohr, schütteln Sie sie und es Wirbel.
    7. Frieren Sie die Probe in Trockeneis und bei -80 ° C oder fahren Sie mit dem Extrakt der RNA.
      Hinweis: Vor der Extraktion von RNA, kennzeichnen Sie alle Röhrchen und Spalten nach der Randomisierung Design (falls zutreffend). Bereiten Sie alle Reagenzien entsprechend den Empfehlungen des Herstellers und entnehmen Proben von -80 ° C Gefrierschrank und tauen sie auf Eis, bis sie vollständig aufgetaut werden.
  2. Homogenisierung
    1. Grind Proben mit Homogenisieren Instrument auf 6000 Hz für 45 Sekunden. Wiederholen, wenn die Proben nicht richtig homogenisiert und verlassen Proben für 5 min bei RT.
    2. Fügen Sie 140 ul Chloroform zur Probe und Vortex für 10-15 Sek.
    3. Den Überstand aus dem Homogenisieren Rohr zu einer Phase-Lock Gefäß geben und schütteln auf einemThermo für 2 min bei 1400 rpm und RT.
    4. Ferner inkubieren Proben für 2 min bei RT und Zentrifuge Proben bei 12.000 g 15 min bei 4 ° C.
  3. RNA-Niederschlag, Waschanlage, Aufhängung und Reinigung in QIAcube.
    1. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues 2-ml-Tube.
    2. Laden Sie alle notwendigen Reagenzien in der Entnahmeroboter nach dem der Hersteller Protokollblatt, wählen Sie das entsprechende Protokoll eingestellt das Elutionsvolumen (30 ul) und führen Sie den Entnahmeroboter.
    3. Wenn der Lauf beendet ist, entfernen Sie die Rotor-Adapter und Elutionsgefässe sofort halten bei 4 ° C für weitere Analysen oder bei -80 ° C für die langfristige Lagerung.
  4. Die Qualitätskontrolle der isolierten RNA
    1. Bestimmung der Menge des isolierten RNA unter Verwendung eines UV-Leser nach den Anweisungen des Herstellers.
    2. Prüfen Sie die Qualität von RNA und der RNA-Integrität mit Mikrofluidik-Gel-Basis Lab-on-a-Chip und einer UV-Leser, nachOrding in den Anweisungen des Herstellers.

7. Microarray-Workflow

Hinweis: Der im folgenden beschriebene Verfahren konzentriert sich auf die Methode zur Affymetrix Genechip hoher Durchsatz 3'IVT Express Kit, das für die Ziel Synthese zur Hybridisierung auf Affymetrix 3'-Gen-Expressionskassetten ausgehend von der Herstellung der RNA, um die Verwendung des komplexen verwendet wird Liquid-Handling-System (z. B. Pipettieren, Verdünnen, Abgabe oder Integration).

  1. Zubereitung
    1. Randomize Proben zu Charge Wirkungen zu vermeiden. Die Anzahl der Proben von Chargen verarbeitet ist 1-96, darunter eine positive (Commercial Menschen universelle Referenz-RNA) und eine negative (RNase freies Wasser) Steuer pro Charge.
    2. Das Target starten Synthese unter Verwendung von 100 ng Gesamt-RNA in 3 ul RNAse-freiem Wasser. Für 100 ng Gesamt-RNA, verwenden Sie eine Inkubationszeit von 16 h.
  2. RNA Amplification
    1. Bereiten Sie die Poly-A RNA spike in Kontroll-Lösung durch eine serielle Verdünnung des Poly-A-RNA Vektor mit Poly-A-Steuerung Verdünnungspuffer:
      1. Zur Verdünnung ein, bereiten 2 ul polyA Steuer Lager in 36 ul Verdünnungspuffer.
      2. Zur Verdünnung 2, bereiten 2 ul der Verdünnung 1 in 98 ul Verdünnungspuffer.
      3. Zur Verdünnung 3, bereiten Sie 4 ul Verdünnungs 2 in 196 ul Verdünnungspuffer.
      4. Zur Verdünnung 4, bereiten 20 ul Verdünnungs 3 in 180 ul Verdünnungspuffer.
    2. Verdünnen Sie die RNA in RNase freiem Wasser auf eine Konzentration von 33,3 ng / & mgr; l zu erhalten.
    3. Add 2 ul des polyA Kontrolllösung zu den 3 & mgr; l RNA-Probe direkt in einer 96 Well-Platte. Dieser Schritt wird durch die Flüssigkeitshandhabungssystem ausgeführt wird.
    4. Bereiten Sie die Flüssigkeitshandhabungssystem und Zielsynthese. Legen Sie die Platten auf den Roboter. Legen Sie alle benötigten Reagenzien und Laborgeräte auf dem Deck. Der Roboter bewegt sich das Verfahren durch die Vorbereitung der appropriat startenE-Mastermix und die Proben unter der automatisierten ferngesteuerte PCR-Block.
    5. Erste Qualitätskontrolle: Kontrolle über den Verstärkungsprozess
      1. Wenn die Qualität der aRNA akzeptabel ist, führen die Fragmentierungsschritt durch Zugabe zu jeder Probe 8 ul Fragmentierung 5X-Puffer (Dieser Schritt wird durch die Flüssigkeitshandhabungssystem durchgeführt). Andernfalls führen Sie den vorherigen Schritt, wieder ausgehend von der RNA. Verwenden fragmentiert aRNA sofort oder lagern unverdünnt und fragmentiert aRNA bei -20 ° C (oder 70 ° C für die längerfristige Speicherung).
      2. Führen Sie eine zweite Qualitätskontrollanalyse durch Abheben nach dem Zufallsprinzip 12 Proben in der Platte und Transfer 1 ul auf der Mikrofluidik-Gel-basiertes System, um die Effizienz der Fragmentierung zu überprüfen.
  3. Hybridisierungsverfahren
    1. Scannen Sie die Chip-Barcodes und registrieren jede Probe in der Software des Herstellers entsprechend den Anweisungen.
    2. Bereiten Sie die Hybridisierung Mixfolgt einer einzigen Reaktion, und es zu 33 ul der fragmentiert und markiert aRNA hinzuzufügen: 4,2 ul der Kontroll-Oligonukleotid B2 (3 nM), 12,5 & mgr; l 20x eukaryotischen Hybridisierungskontrollen 25 & mgr; l 100% DMSO, 125 & mgr; l 2x Hybridisierungspuffer und 50 & mgr; l H 2 O für ein Gesamtvolumen von 216,7 ul
      Anmerkung: Die Hybridisierungs, waschen und zu scannen positive und negative Kontrollen vor der Verarbeitung der Abtastwerte.
    3. Pre-nass das Array mit 200 ul Vorhybridisierung Mix in der Hybridisierung waschen und Stain Kit enthalten.
    4. Setzen Sie den Chip im Hybridisierungsofen bei 45 ° C eingestellt und 60 RPM für 10 Minuten.
    5. In der Zwischenzeit, denaturieren die Platte (mit der endgültigen Cocktail Hybridisierungsmischung) in einer PCR-Block mit 99 ° C für 5 min und 45 ° C für 5 min.
    6. Entfernen Sie die Pre-Hybridisierungsmischung aus dem Array und ersetzen Sie es mit 200 ul des Hybridisierungscocktail Ziel (eine Probe pro Chip).
    7. Stellen Sie das Array in die Hydization Ofen bei 45 ° C für 16 h (O / N) und mit einer Drehzahl von 60 UpM eingestellt.
  4. Waschen und Färben
    1. Führen Sie "Fluidik" aus der Software-Menüleiste. Wählen Sie im Dialogfeld Fluidik, wählen Sie das Modul von Interesse (1 - 4), wählen Sie dann die Prime_450 Programm auf alle Module. Das Rohr wird für Waschpuffer A in eine Flasche (400 ml) und Waschpuffer B in einer Flasche (200 ml), als auch für MilliQ-Wasser in einer Flasche (500 ml).
    2. Anschließend folgen Sie den LCD-Bildschirm. Heben Sie die Nadel und legen 600 ul Flecken Cocktail 1 (SAPE-Lösung Mix) und 600 ul Flecken Cocktail 2 (Antikörperlösung Mix) Mikrozentrifugenröhrchen, die an den Positionen # 1 und # 2, und 900 ul-Array, Pufferlösung an Position # 3.
    3. Nach dem O / N Inkubation im Ofen, saugen Sie den Cocktail von der Chip und füllen Sie den Microarray mit 250 ul Waschpuffer A. Weisen Sie den richtigen Chip auf jedem Modul, wählen Sie die FS450-001 Protokoll und führen jedes modul, folgenden Anweisungen auf dem Bildschirm. Dieser Vorgang dauert 90 min.
    4. Wenn der LCD-Bildschirm zeigt die Meldung "Eject Cartridge", entfernen Sie die Chips und überprüfen, ob es irgendwelche Blasen. Wenn Luftblasen vorhanden sind, füllen Sie das Feld vollständig mit dem Array Haltepuffer. Bewerben Aufkleber auf die Scheidewände, um jegliches Auslaufen im Scanner zu vermeiden, und reinigen Sie den Microarray-Fenster vor dem Laden in den Scanner.
  5. Scanning.
    1. Wärmen Sie den Scanner. Laden Sie den Chip in den Autoloader des Scanners und Starten des Prüfvorgangs.
      Hinweis: Nach ~ 12 min pro Chip wird ein .CEL Datei pro Chip erzeugt.
    2. Überprüfen Sie das Bild und richten Sie das Raster (falls erforderlich) an den Ort, um die Sondenzellen zu identifizieren.
      Hinweis: Der Datensatz wurde eingereicht, um Arrayexpress (Accession code = E-MTAB-1721).

8. Netzwerk-basierte Systembiologie Analyse für eine Folgenabschätzung

  1. Microarray-Datenverarbeitung.
    Hinweis: Datenverarbeitung eind Scoring-Verfahren wurden mit dem R statistischen Umgebung Version 2.14 implementiert.
    1. Öffnen Sie ein R 18 Sitzung und laden die affy 19. gcrma und affyPLM Pakete mit Hilfe der Befehle installiert: Bibliothek (affy)> Bibliothek (gcrma)> Bibliothek (affyPLM)
    2. Lesen Rohdatendateien mit dem Befehl: data.affybatch <-ReadAffy ("Pfad zu dem Ordner, wo sind die CEL-Dateien gespeichert")
    3. Subtrahieren Sie die Hintergrundkorrektur und Quantil normale bis Sondensatz Expressionswerte erzeugen mit Hilfe der gcrma Paket, indem Sie den Befehl: eset.norm <-gcrma (data.affybatch)
  2. Qualitätskontrolle.
    1. Gene RNA-Abbau Grundstücke mit dem Befehl: Grad <-AffyRNAdeg (data.affybatch)
    2. Entpacken Sie die Koeffizienten der RNA-Abbau Hang mit dem Befehl: Steigung = deg $ Hang
    3. Zeichnen Sie die Steigungskoeffizienten und mögliche Ausreißer.
    4. Gene NUSE und RLE Parzellen Sie die folgenden Befehle: Pset <-fitPLM (data.affybatch)> RLE (Pset)> NUSE (Pset).
    5. Festzustellen, ob einige der erzeugten Boxplots Ausreißer: Arrays werden als Ausreißer, wenn mindestens 2 der 3 QC Metriken unter weichen von den anderen Arrays definiert:
      - Deg $ Steigung unterscheidet sich von der durchschnittlichen deg $ Neigung
      - NUSE Grundstück: Arrays werden als Ausreißer, wenn die obere Quartil fällt unter 0,95 oder die untere Quartil über 1,05, dh wenn der Boxplot ist ganz oben oder ganz unten 1,05 0,95..
      - RLE Grundstück: Arrays werden als Ausreißer, wenn der Median der RLE Verteilung von mehr als 0,1 oder kleiner als -0,1 ist.
    6. Wenn ein Array als Ausreißer identifiziert, dann zu verwerfen, und beginnen Sie erneut mit Schritt 8.1.2.
    7. Setzen Sie eine Gesamt lineares Modell auf die Daten für die spezifischen Kontraste von Interesse (dh., Die Vergleiche von "behandelt" und "Kontrolle" Bedingungen) Erzeugen rohen P-Werte für jede Sonde auf dem Mikroarray gesetzt, die furt seinihre Anpassung unter Verwendung der Benjamini-Hochberg Verfahren der Limma Paket. Wählen Sie ein Probeset pro Gen als Vertreter des Gens für weitere Analysen wie in 20 beschrieben, zu halten.
      Hinweis: Für eine Sperrfaktor (die Belichtungsplatte) von der Versuchsplanung wurde im Modell für die Datenverarbeitung berücksichtigt.
  3. Netzwerk-basierte Analyse.
    Anmerkung: Das Verfahren wie hier implementiert ist detailliert in Martin et al. (In Revision in BMC Bioinformatik).
    1. Für jeden paarweisen Vergleich der Zinsen, gehen von der berechneten (log2-) falten Änderungen (Behandlung vs. Kontrolle) für jedes Gen unter dem Netz (ab Schritt 8.2).
    2. Berechne die unterzeichnete Laplace-Matrix L des durch L definierten Netz (i, j) = - sign (i ~ j) w (i, j), wenn es eine Kante an Gewicht w (i, j) zwischen den Knoten i und j, L (i, j) = deg (i) ist das gewichtete Grad i und L (i, j) = 0 sonst. Das Gewicht w (i, j) gleich 1, wenn i und j in der Hauptkette und w (i, j) = 1 / n, wenn i ein Backbone-Knoten und j ist eine der n Nachbors im Transkript Schicht.
    3. Berechnen Noten für die Backbone durch f = L3-1L2Tx wo L3 ist die Teilmatrix von L den Backbone-Knoten und L2 ist die Untermatrix L, deren Zeilen den Transkriptionsschichtknoten und Spalten den Backbone-Knoten
    4. Berechnen Sie die unterzeichnete Laplace, Q, der durch das Backbone-Netzwerk, in dem alle Kanten umgekehrtem Vorzeichen definiert Netzwerk.
    5. Berechnen Sie die NPA Punktzahl durch NPA = fTQf.
    6. Berechnen Sie die Konfidenzintervall, das Rückgrat Rand Permutation p-Wert und die Niederschrift Schicht Permutation p-Wert.
      Hinweis: (. ZB die biologische Variabilität zwischen Proben in einer Versuchsgruppe) zusätzlich zu den -Konfidenzintervalle der NPA Noten, die für die experimentellen Fehler zu berücksichtigen, Begleiter Statistiken abgeleitet wurden, um die Spezifität der NPA-Score zum beschriebenen biology beschreiben im Netzwerk. Da NPA ist eine quadratische Form der Falten ändert, können ihre Varianz berechnet basiert auf der fold change geschätzt variances. Ein Konfidenzintervall wird anschließend mit dem zentralen Grenzwertsatz abgeleitet. Zwei Permutationstests umgesetzt 21, wobei erstens die beurteilt, ob die Ergebnisse waren spezifisch für die zu Grunde liegenden Beweise (dh., Gene fold changes) in dem Modell, was zu einer Permutation P-Wert (mit * gekennzeichnet O in den Figuren, wenn P -Wert <0,05). Zweitens, zu beurteilen, ob die "Ursache-Wirkung" Schicht des Netzwerks wesentlich zur Amplitude der Netzwerkstörung beigetragen (von K * in den Zahlen bezeichnet, wenn P-Wert <0,05).
    7. Betrachten Sie das Netzwerk wie durch die Behandlung beeinflusst, wenn der Vertrauensbereich enthält nicht Null und die beiden Permutation p-Werte <0,05.
    8. Berechne die führende Knoten, die als die Schlüsselknoten in der Hauptkette trägt bis zu 80% der NPA-Punktzahl definiert.

Representative Results

Im unten beschriebenen Ergebnisse waren die organotypischen Gewebe primären humanen epithelialen Zellen von gesunden, Nichtraucher getrennt, Europäischer Spendern und wurden mit Fibroblasten 15 wiederhergestellt.

3D Bronchien und Nasengewebe Modelle
In vitro bronchiale und nasale organotypischen Modelle ähneln auf zellulärer Ebene das Epithel menschlichen Atemwege (Abbildung 2).

CS Exposition
Organotypische Bronchien und Nasengewebe Modelle wiederholt, um Mainstream-CS an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche ausgesetzt werden. Die Rauchexposition experimentelle Verfahren für die hier dargestellten Ergebnisse verwendet wird, in Figur 1 dargestellt ist.

Aufzeichnung von Zilienschlag
Cilia Prügel in der Luft ausgesetzten Geweben wie in den Videos dargestellt aufgezeichnet. CS Exposition war mit einer Reduktion des ciliary Schlagfrequenz verbunden: die stärkere Spitze um beobachtet4 Hz in der schein-exponierten und vor der Belichtung wird nicht mehr nach CS Exposition (Abbildung 3) beobachtet. Diese reduzierte Frequenz würde die Zilien machen schlagen weniger effizient Schleim und Infektionserreger 22 zu entfernen.

Messung des TEER und CYP1A1 / 1B1 Aktivität
TEER wurde 48 Stunden nach der letzten Exposition gemessen, um sicherzustellen, das Gewebe noch funktionsfähig ist. CYP1A1 / 1B1 Aktivität wurde ebenfalls gemessen 48 h nach Beendigung der Exposition wie in Abbildung 1 dargestellt. Die TEER-Werte in den CS-exponierten Geweben waren nicht signifikant unterschiedlich im Vergleich zu den der Luft ausgesetzten Geweben bestätigt, dass es keinen großen zytotoxische Wirkung von Rauch bei dieser Konzentration. An der 48 Stunden nach der Belichtung wurde CYP1A1 / 1B1 Aktivität der Gewebe leicht erhöht, was auf einen leichten Anstieg der Gewebeschutzmechanismus nach der Exposition (Abbildung 4).

Genexpressionsprofile und netzwerkbasierten Systeme biology Ansatz, um die Auswirkungen von CS-Exposition auf die Veränderung der Fremdstoffmetabolismus studieren
Die Gewebe wurden nach 48 Stunden nach der Exposition Zeitpunkten gesammelt. Anschließend wurden Mikroarray-Analyse durchgeführt, um Genexpressionsprofile der CS- und Luft ausgesetzten Gewebe zu erzeugen. Auswirkungen der CS Exposition auf Fremdstoffmetabolismus wurde mit Hilfe eines Netzwerk-basierten systembiologischen Ansatz aus den Genexpressionsprofilen genutzt und untersucht, wie zuvor 15 ausgewiesen. Mit einem Netzwerk-basierten systembiologischen Ansatz zeigt, dass CS Exposition Auswirkungen auf der Ebene der Backbone-Knoten in der Fremdstoffmetabolismus Netzwerkmodell waren schön zwischen der In-vitro- und In-vivo-Datensätzen (Abbildung 5) korreliert. Im Gegensatz dazu auf der Ebene jedes einzelnen Genexpressionsänderungen, schlechte Korrelationen zwischen der in vitro (CS lichteten vs. Luft ausgesetzten) und in vivo (Raucher vs. Nichtraucher) beobachtet.


Abbildung 1. Schematischer Ablauf der wiederholte Exposition von CS zu den organotypischen Bronchialgewebe Modelle Abkürzungen:. CYP, Cytochrome P450; CS, Zigarettenrauch; TEER, transepithelialen elektrischen Widerstandes.

Abbildung 2
Abbildung 2. Organotypische Bronchien und Nasen epithelialen Zellkulturmodellen. Karikatur, die die Bronchien (A) und Nasen (B) Zellkultur-Einsatz an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche. Die in vitro-Modelle enthalten in der apikalen Schicht der Hämatoxylin & Eosin gefärbten Zellen gezeigt Geißelzellen (C für bronchiale, D für die nasale), wie zuvor 15 ausgewiesen. Die Modelle wurden mit Fibroblasten, die wichtig sind, kokultiviert für das Wachstum und die Differenzierung von Epithelzellen (durch Pfeile angedeutet). Die Färbung der Atemwege Linie Marker: p63 (E für bronchiale, F für die nasale) und MUC5AC (G für bronchiale, H für die nasale) gezeigt wie zuvor 15 gemeldet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3. Cilia Schlagfrequenz. Cilia Schlagfrequenz (CBF) wurde in Luft ausgesetzten und in der Kultur vor und nach der Exposition gemessen. Verminderte CBF wurde nach CS Exposition gesehen (werden repräsentative Ergebnisse aus zwei Einsatz als Replikat 1 (R1 gezeigt) und replizieren 2 (R2)).

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Abbildung 4. Messung von CYP1A1 / CYP1B1 Aktivität und TEER. Left pannels zeigen die CYP1A1 / CYP1B1 Aktivität im bronchiale (A) und Nasen (B) Gewebemodelle. Rechts Panels zeigen TEER Messung im bronchiale (C) und Nasen (D) Gewebemodelle. Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Abkürzungen: CS, Zigarettenrauch; CYP, Cytochrom P450; TEER, transepithelialen elektrischen Widerstand; RLU relativ Lumineszenzlabor Einheit.

Abbildung 5
Abbildung 5: Netzwerkbasierte systembiologischer Ansatz für die Bewertung der Auswirkungen der CS Exposition im Rahmen der Fremdstoffmetabolismus. Die Veränderungen der Genexpression Ebenen wurden verwendet, um die Aktivierung der Backbone-Knoten des Fremdstoffmetabolismus Netzwerkmodell (A) zu berechnen strong> wie in einer früheren Veröffentlichung 15 ausgewiesen. Die Abbildung rechts zeigt das Konzept der Quantifizierung der Backbone-Knoten, auch bekannt als "Differenz Netzwerk-Backbone-Wert" mit dem NPA-Ansatz. Die blauen Ovale repräsentieren die Aktivität der Backbone-Knoten (dh., Die Funktionsschicht) und die grüne Kugeln stellen die Expression von Genen (dh., Die Transkriptionslage). Auswirkungen von CS Exposition in organotypischen Bronchialgewebe (in vitro, CS-exponierten vs. Luft ausgesetzten) an der 48 h von Postexpositions wurden mit denen des Rauchens auf die menschlichen bronchialen Epithelzellen durch Bronchoskopie und nasale Epithelzellen gesammelt durch burshing der unteren Nasenmuschel Vergleich (GSE16008 ) (in vivo, Raucher vs. Nichtraucher) (B). Einsätze ändert Korrelation der Genexpression zwischen der in vitro- und in vivo-Datensätzen. Abkürzungen: CS, Zigarettenrauch; NPA, Netzstörungsamplitude.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Discussion

Hier haben wir die Anwendbarkeit des menschlichen organotypischen Bronchien und Nasengewebemodelle, die Auswirkungen der wiederholten CS Exposition beurteilen demonstriert. Als eine Alternative zu Tierversuchen, wurde eine Reihe von Belichtungssystemen für toxikologische Beurteilungen der Aerosolexposition in vitro entwickelt (z. B. VITROCELL, Cultex, ALICE, etc.). Diese Expositions Module können auch für eine toxikologische Bewertung von Luftschadstoffen, luftgetragene Partikel, Nanopartikel, etc. In dieser Studie verwendet werden können, haben wir die VITROCELL System, das bis zu 48 verschiedene Proben gleichzeitig aufnehmen kann, so dass für größere Experimente und niedriger Variabilität zwischen Behandlungen. Für jede Aerosolexposition in vitro bleibt die Gefahr von Gewebekultur Kontamination eine große Gefahr, deren Eindämmung erfordert eine sorgfältige Handhabung der Gewebekulturen während der gesamten Experimente.

Messung von Partikelabscheidung in Echtzeit auf dem Mikrowaage während der exposure Experiment erlaubt es, zu überwachen, dass die CS-Dosen aus dem Belichtungssystem generiert werden, entsprechend den Erwartungen. Um die Genauigkeit der gemessenen Partikelabscheidung zu gewährleisten, Einrichten der Online-Messung korrekt vor der Belichtung ist critial zB die Einrichtung der Skala auf 0 Darüber hinaus, da der Unterschied zwischen den Bereichen der Mikrowaage (cm 2) und die Gewebekultureinsatz (0,33 cm 2), passten wir die endgültige Berechnung der Fläche des Kultureinsatz: nur noch 33% der Ablagerung auf der Mikrowaage die tatsächliche Ablagerung in der Kultureinsatzes.

Messung des TEER zu eng Kontaktbarriere Funktionalität zu ermitteln und zu einer Störung der Epithelschicht zu bewerten ist ein relativ einfaches Verfahren zu implementieren, die wir hier berichtet wird. , Da die Bronchien und Nasengewebe Modelle enthalten Schleim-produzierenden Becherzellen durchsetzt, muss jedoch apikal Wasch vor den TEER Messdurchgeführt werdensung. Der apikale Wasch ist kritisch, da die Gegenwart der Schleimschicht und der Variabilität ihrer Dicke vorspannen kann die Messung des TEER, interferring mit den Auswirkungen der CS-Exposition. Dieser Begriff ist in Übereinstimmung mit dem, was wurde von Hilgendorf und Kollegen, in dem die Durchlässigkeit von Caco-2-Zellen wurde durch die Co-Kultivierung mit dem Schleim-produzierenden Becherzelllinie HT29 23 betroffen ausgewiesen. Der Schleim muss weg vor TEER Mess gewaschen werden, da apikal Wasch direkt vor der Exposition kann mit den Gewebereaktionen auf CS stören. Daher wird die Messung drei Tage vor der Belichtung durchgeführt wird, und nicht direkt vor Belichtung.

Wir zeigten, dass CYP1A1 / CYP1B1 Aktivität kann sich von den organotypischen Kulturmodellen folgenden CS Exposition gemessen werden, obwohl die Aktivität wurde nur geringfügig durch CS erhöht. Dieses schwache Signal kann durch eine längere Inkubation des CYP1A1 / 1B1 Substrat amplifiziert werden (dh., Luciferin-CEE), beispielsweise für24 h (Daten nicht gezeigt). Eine der Einschränkungen des CYP Aktivitätsmessung in der vorliegenden Arbeit ist das Fehlen Normierung auf die CYP Proteinebene oder auf die Zellzahl, die unter Berücksichtigung der für zukünftige Studien unternommen werden könnten, um sicherzustellen, dass die Änderung auf die Enzymaktivität nicht beeinflusst durch die Änderung entweder der Proteinebene oder der Zellzahl.

Wir berichteten, dass CS Exposition hemmte die Zilienschlag sowohl in der nasalen und bronchialen Gewebemodelle. Ähnliche Beobachtungen wurden in verschiedenen Säugetieren und Nichtsäugetiermodelle 12 getan. Für Zilienschlag Messung, so dass das Gewebe behandelt und in ähnlicher Weise behandelt werden, ist kritisch, wenn beispielsweise mittlere Änderung implementiert wird, sollte es für alle Proben angewandt werden. Sutto und Kollegen berichteten, dass pH-Wert beeinflusst die Säugetier ciliary Schlagfrequenz 24. So beim Vergleich Schlagen Frequenzen zwischen Zellen mit verschiedenen Kombinationspräparate / Mischungen, pH behandeltAnpassung sollte in Betracht gezogen, um die Variabilität der Zilienschlag Messung zu minimieren. Darüber hinaus ist die Temperatur, bei der die Messung durchgeführt wird ebenfalls kritisch, da die Frequenz des Zilienschlag sinkt mit abnehmender Temperatur. Die Variabilität aufgrund dieser Änderungen eine Tischinkubation Inkubator mit Temperatur, CO 2, und Feuchtigkeitskontrolle ausgestattet war in dieser Studie verwendet minimieren. Trotzdem wurde beobachtet, dass die Zilienschlag Frequenzen in den Bronchialgewebe nach CS Exposition sehr variabel (dh., Zunahme der Einlage und Abnahme in der anderen Einlage), was darauf hindeutet, dass die Zilienschlag stark gestörten unmittelbar nach Exposition. Im Gegensatz dazu beobachtet man die Abwesenheit von messbaren Zilienschlag Frequenzen im Nasengewebe nach CS Exposition, was darauf hindeutet, daß die Reaktion des Nasengewebe ist empfindlicher und konsistent. Dies ist in Übereinstimmung mit einer früheren Veröffentlichung zeigt, dass das Nasengewebe hat eine geringere Kapazität als entgiftenverglichen mit dem Bronchus 25.

Schließlich haben wir gezeigt, dass Genexpressions vom organotypischen Bronchien und Nasengewebe Modelle CS ausgesetzt könnte Auswirkungen von CS auf Fremdstoffmetabolismus zu demonstrieren. Interessanterweise war die beobachtete Veränderung im Fremdstoffmetabolismus im organotypischen bronchiale und nasale in vitro-Modellen zu CS ausgesetzt ähneln, dass die in vivo Situation bei Rauchern, wie detaillierter in einer früheren Veröffentlichung 15 diskutiert. Für Genexpressionsanalysen mit Hilfe der Robotic-Instrument macht ein Hochdurchsatz-Analyse möglich. Außerdem automatischen Roboterhandhabung weiter erhöht die Konsistenz und Genauigkeit der Genexpressionsergebnisse. Dennoch schnelle Sammlung der Gewebeproben war entscheidend für den RNA-Abbau während der RNA-Extraktion vermeiden. Die RNA-Prozessierung und beschriebenen transkriptomischen Ansätze können auch für in vivo Gewebeproben angewandt werden.

Disclosures

Diese Studie wurde von Philip Morris International finanziert.

Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich bei Maurice Smith und Marja Talikka für ihre Durchsicht des Manuskripts danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MucilAir-human fibroblasts-bronchia Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/
MucilAir Culture Medium Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/
VITROCELL VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=
3R4F reference cigarette University of Kentucky http://www2.ca.uky.edu/refcig/
30-port carousel smoking machine SM2000 Philip Morris, Int.
CiliaMetrix camera and software La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland
Leica DMIL microscope  Leica, Heerbrugg, Switzerland
LED light source Titan Tool Supplies, Buffalo, NY
Chopstick Electrode STX-2 World Precision Instruments http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter  World Precision Instruments http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/
Luciferin Detection Reagent 
MagNA Lyser Instrument  Roche http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66
chloroform  Sigma-Aldrich http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=
QIAcube  Qiagen 9001882
NanoDrop Thermo Scientific http://www.nanodrop.com/
Agilent 2100 Bioanalyzer  Agilent http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106
Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit Affymetrix http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit
Scanner 3000 7G  Affymetrix http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G

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Bioengineering Menschen organotypischen Bronchialepithelzellen 3D-Kultur, Zigarettenrauch Zilien schlagen Fremdstoffmetabolismus Netzwerkmodelle Systeme Toxikologie
Folgenabschätzung Wiederholte Exposition von organotypischen 3D bronchiale und nasale Zellkulturmodelle zu Whole Zigarettenrauch
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Kuehn, D., Majeed, S., Guedj, E.,… More

Kuehn, D., Majeed, S., Guedj, E., Dulize, R., Baumer, K., Iskandar, A., Boue, S., Martin, F., Kostadinova, R., Mathis, C., Ivanov, N. V., Frentzel, S., Hoeng, J., Peitsch, M. C. Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke. J. Vis. Exp. (96), e52325, doi:10.3791/52325 (2015).

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