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Bioengineering

पूरे सिगरेट के धुएं को Organotypic 3 डी ब्रोन्कियल और नाक ऊतक संस्कृति मॉडल की कई बार प्रदर्शन के प्रभाव आकलन

Published: February 12, 2015 doi: 10.3791/52325

Protocol

Organotypic ऊतक ब्रोन्कियल संस्कृति मॉडल 1. संस्कृति

नोट: पुनर्गठन ऊतक मॉडल का उपयोग करने के लिए तैयार कर रहे हैं कि आवेषण के रूप में खरीदे गए थे। कार्प और उनके सहयोगियों ने 16 से उदाहरण के लिए वर्णित के रूप में वैकल्पिक रूप से, संस्कृति प्राथमिक कोशिकाओं से विकसित किया जा सकता है। बाँझ पैकेजिंग में ऊतकों की प्राप्ति के बाद, हमेशा बाँझ शर्तों के तहत मानव organotypic ऊतकों को संभाल।

  1. जोड़ें हुड के तहत एक नया बाँझ 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) परख माध्यम की 0.7 मिलीलीटर।
  2. हुड के नीचे के ऊतकों की पैकेजिंग निकालें, और नए तैयार 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए टिशू कल्चर आवेषण हस्तांतरण (1.1 चरण में वर्णित है। ऊपर)।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस (5% सीओ 2, 90% आर्द्रता) में एक मशीन में ऊतकों को बनाए रखने और संस्कृति।
  4. हर 2 दिन मध्यम बदलें।
  5. एक मध्यम परिवर्तन के दौरान, वे contaminati हैं कि वे यह सुनिश्चित करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे के ऊतकों की जांचमुक्त पर और उस माध्यम का कोई रिसाव नहीं है।

एक में इन विट्रो एक्सपोजर सिस्टम का उपयोग 2. सिगरेट के धुएं (सीएस) एक्सपोजर

  1. लोगों तक पहुंचाने के प्रयोगों के लिए पहले तीन दिन, संस्कृति के माध्यम से 200 μl साथ टिशू कल्चर के शिखर की ओर से धो लो।
  2. सिलिअरी पिटाई की माप के प्रदर्शन से पहले की योजना बनाई है अगर धारा 3 में वर्णित के रूप में लोगों तक पहुंचाने के दिन, सिलिअरी पिटाई माप के लिए ऊतकों को संभाल।
  3. इन विट्रो जोखिम प्रणाली की जलवायु कक्ष और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए खेती का आधार मॉड्यूल पूर्व गर्म। प्रति पंक्ति माध्यम के 17.5 मिलीलीटर के साथ खेती आधार मॉड्यूल भरें।
  4. इनक्यूबेटर से ऊतकों को हटाने और इन विट्रो जोखिम प्रणाली की खेती के आधार मॉड्यूल को संस्कृति की थाली से टिशू कल्चर आवेषण हस्तांतरण करने के लिए हुड के तहत उन्हें जगह है। इसके अतिरिक्त, एक ग्लास ढक्कन के साथ खेती आधार मॉड्यूल को कवर किया।
  5. इन विट्रो जोखिम syste के जलवायु चैम्बर में ऊतकों स्थानांतरणमुख्यधारा सीएस को लोगों तक पहुंचाने के लिए एम।
  6. इन विट्रो जोखिम प्रणाली एक Microbalance के साथ सुसज्जित है, तो सेट अप क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance Microbalance सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक क्वार्ट्ज क्रिस्टल पर धूम्रपान का वास्तविक समय कण बयान को मापने के लिए जोखिम को चलाने से पहले।
    1. कमजोर पड़ने / वितरण प्रणाली की प्रत्येक पंक्ति से जुड़ा Microbalance मॉड्यूल में क्रिस्टल बदलें।
    2. Microbalance सॉफ्टवेयर करने के लिए Microbalance मॉड्यूल कनेक्ट करें। सॉफ्टवेयर में शून्य करने के लिए माप के पैमाने पर सेट।
  7. प्रयोगात्मक प्रक्रिया के अनुसार ऊतकों को बेनकाब (जैसे।, चित्रा 1 के रूप में)
    नोट: पहले जोखिम, संदर्भ सिगरेट (3R4F) 3402 17 मानक आईएसओ के अनुसार 22 ± 1 डिग्री सेल्सियस और 60 ± 3% की सापेक्ष आर्द्रता नियंत्रित परिस्थितियों में 7 और 21 दिनों के बीच वातानुकूलित हैं।
    1. सिगरेट के धुएं उत्पन्न (जैसे।, 3R4F सिगरेट से) 30-बंदरगाह हिंडोला धूम्रपान मच का उपयोग करine स्वास्थ्य कनाडा तीव्र शासन के अनुसार:, यानी, एक मानक बट लंबाई करने के लिए 2 सेकंड से अधिक 55 मिलीलीटर कश में लगभग 35 मिमी, दो बार एक मिनट और आठ सेकंड पंप निकास समय सिगरेट पीते।
      नोट: यदि आवश्यक हो खुराक भी विषाक्त नहीं है, इसलिए है कि मुख्य धारा सीएस पतला। यहां बताया परिणामों में, धुआं 16% (खंड / खंड) को पतला था।
    2. नियंत्रण के नमूने के लिए 60% humidified-हवा का उपयोग करें (हवा में उजागर)।
    3. 6-7 मिनट के लिए ऊतकों को बेनकाब इन विट्रो जोखिम प्रणाली में (यानी।, एक सिगरेट या हवा में उजागर)
    4. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (5% सीओ 2, 90% आर्द्रता) में वापस इनक्यूबेटर में ऊतकों रखो।
    5. दोहराएँ 2.7.3 और 2.7.4 तीन से अधिक बार दोहराएँ।
  8. लोगों तक पहुंचाने के प्रयोग के अंत में, Microbalance सॉफ्टवेयर बंद करो। सॉफ्टवेयर कण जमाव की एक चित्रमय प्रतिनिधित्व के साथ साथ सभी मापन युक्त एक फ़ाइल उत्पन्न होगा।
  9. खेती ख से ऊतकों वापस स्थानांतरणसंस्कृति की थाली के लिए एएसई मॉड्यूल। विशिष्ट बाद जोखिम समय-बिंदुओं पर विभिन्न समापन के लिए माप जब तक 37 डिग्री सेल्सियस (5% सीओ 2, 90% आर्द्रता) में वापस इनक्यूबेटर में ऊतकों रखें।

रोमक पिटाई की 3. मापन

नोट: पूर्व प्रदर्शन करने के लिए और सीधे प्रदर्शन के बाद की धड़कन के रूप में प्रायोगिक योजना के अनुसार (चित्रा 1), रिकॉर्ड सिलिअरी।

  1. इनक्यूबेटर से टिशू कल्चर प्लेटें निकालें और 30 मिनट सिलिया की धड़कन को स्थिर करने के लिए आरटी पर हुड के तहत उन्हें छोड़ दें।
  2. CiliaMetrix सॉफ्टवेयर से जुड़ा प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत ऊतकों रखें।
  3. सिलिअरी पिटाई की फिल्म है और (हर्ट्ज में) आवृत्ति रिकार्ड। आवृत्ति 1 मिनट के लिए हर 3 सेकंड उपाय।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस (5% सीओ 2, 90% आर्द्रता) में वापस इनक्यूबेटर ऊतकों लौटें।

4. Transepithelial विद्युत प्रतिरोध (Teer) माप

नोट: Teer की माप के पहले 3 दिन और एक voltohmmeter से जुड़ा Chopstick इलेक्ट्रोड (STX-2) का उपयोग कर बाँझ शर्त के तहत हुड के तहत प्रदर्शन के बाद 48 घंटा आयोजित किया जाता है।

  1. मानव ब्रोन्कियल ऊतकों के शिखर सतह के लिए संस्कृति मीडिया के 200 μl जोड़ें।
  2. EVOMX मशीन पर बारी; एक 70% इथेनॉल समाधान के साथ इलेक्ट्रोड धो लें।
  3. संस्कृति के माध्यम से इलेक्ट्रोड धो लें।
  4. ऊतक को छूने के बिना टिशू कल्चर के शिखर तरफ माध्यम में इलेक्ट्रोड डालने से प्रतिरोध (Ω) को मापने।
  5. दोहराएँ कदम 4.4 पांच बार quintuplicate माप प्राप्त करने के लिए।
  6. माप के बाद, धीरे एक Aspirator का उपयोग ऊतक संस्कृतियों के शिखर की ओर से मध्यम निकालें।
  7. संवर्धन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (5% सीओ 2, 90% आर्द्रता) में कम से इनक्यूबेटर ऊतक संस्कृतियों लौटें।

5. साइटोक्रोम P450 (CYP) 1A1 / 1B1 activiTy

  1. अध्ययन की शुरुआत से पहले, (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) luciferin पता लगाने अभिकर्मक युक्त एम्बर बोतल के लिए उपयुक्त पुनर्गठन बफर की बोतल की संपूर्ण सामग्री को स्थानांतरित करके luciferin पता लगाने अभिकर्मक तैयार करते हैं। एक महीने की एक अधिकतम के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिलीलीटर के स्टोर aliquots।
  2. 48 घंटा के बाद जोखिम समय के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर सीएस प्रदर्शन के बाद 48 घंटे के लिए ऊतकों सेते हैं।
  3. आरटी के लिए Luciferin पता लगाने अभिकर्मक गर्म।
  4. बेसल मध्यम संस्कृति में (01:50 पर पतला) Luciferin-CEE सब्सट्रेट के साथ 3 घंटा या हे / N के लिए ऊतक आवेषण सेते हैं।
  5. स्थानांतरण प्रत्येक ऊतक से संस्कृति के माध्यम से 50 μl आरटी पर एक 96 अच्छी तरह से अपारदर्शी सफेद luminometer थाली करने के लिए सम्मिलित करें।
  6. एक luminescent प्रतिक्रिया आरंभ करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए luciferin पता लगाने अभिकर्मक के 50 μl जोड़ें।
  7. 20 मिनट के लिए आरटी पर थाली सेते हैं।
  8. एक luminometer का उपयोग कर luminescence पढ़ें।
    नोट: के लिएluminometer, एक दिशानिर्देश के रूप में अच्छी तरह से प्रति 0.25-1 सेकंड के एकीकरण के समय का उपयोग करें।

6. शाही सेना निकालना।

  1. 3 डी organotypic ऊतक आवेषण इकट्ठा करने से पहले, सूखी बर्फ, ब्लेड के 2) पर्याप्त मात्रा में (3 डी डालने के प्रति एक), 3) ठंड पीबीएस कैल्शियम क्लोराइड और मैग्नीशियम क्लोराइड के बिना, 4) एक 25 एमएल कांच pipet, और 5) के साथ एक बॉक्स एक को तैयार आकांक्षा के लिए) बाँझ कांच सुइयों।
    1. ठोस सेलुलर नमूने homogenizing और Qiazol के 700 μl जोड़ने के लिए चीनी मिट्टी के मोतियों से भर लेबल ट्यूबों।
    2. आकांक्षा मशीन चालू करें।
    3. इनक्यूबेटर से 3 डी organotypic ऊतक आवेषण की थाली ले लीजिए।
    4. ठंड पीबीएस के साथ थाली पर 3 बार प्रत्येक डालने धो लें। Washes के बीच, कांच सुई के साथ पीबीएस महाप्राण। तीसरे धोने के बाद, पीबीएस और कवर प्लेट के साथ महाप्राण डालने के सूखने से रोकने के लिए।
    5. थाली से प्रत्येक डालने के लिए, membr तक डालने झिल्ली (3 डी ऊतक डालने रहता है जिस पर) में कटौती से बाहरane ब्लेड पर नीचे फ्लैट निहित है।
    6. उचित लेबल homogenizing के ट्यूब को ब्लेड से (डालने झिल्ली के साथ) ऊतक स्थानांतरण और ट्यूब पर ढक्कन पेंच है, इसे हिला और भंवर।
    7. -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखी बर्फ और दुकान में नमूना फ्रीज या निकालने के लिए आरएनए जारी है।
      , पहले शाही सेना की निकासी के लिए यादृच्छिकीकरण डिजाइन (यदि लागू हो) के अनुसार सभी ट्यूबों और स्तंभ लेबल: ध्यान दें। निर्माता की सिफारिशों के अनुसार सभी अभिकर्मकों को तैयार है और -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से बाहर नमूने लेने के लिए और वे पूरी तरह से defrosted कर रहे हैं जब तक उन्हें बर्फ पर पिघलना।
  2. Homogenization
    1. 45 सेकंड के लिए 6000 हर्ट्ज पर साधन homogenizing के साथ पीस नमूने हैं। नमूने ठीक से homogenized नहीं हैं और आरटी पर 5 मिनट के लिए नमूनों को छोड़ अगर दोहराएँ।
    2. 10-15 सेकंड के लिए नमूना और भंवर 140 μl क्लोरोफॉर्म जोड़ें।
    3. एक चरण ताला ट्यूब homogenizing के ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण और एक पर हिला1400 rpm और आरटी पर 2 मिनट के लिए thermoshaker।
    4. इसके अलावा 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर आरटी पर 2 मिनट के लिए नमूने और अपकेंद्रित्र नमूने सेते हैं।
  3. QIAcube में शाही सेना वर्षा, धोने, निलंबन और शुद्धि।
    1. एक नया 2 मिलीलीटर ट्यूब में ऊपरी जलीय चरण हस्तांतरण।
    2. , निर्माता प्रोटोकॉल शीट के अनुसार निकासी रोबोट में सभी आवश्यक अभिकर्मकों लोड उचित प्रोटोकॉल का चयन करें, क्षालन मात्रा (30 μl) की स्थापना की और निकासी रोबोट चला रहे हैं।
    3. रन समाप्त हो गया है, रोटर एडेप्टर हटाने के लिए और आगे के विश्लेषण के लिए या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत क्षालन ट्यूबों रहते हैं।
  4. पृथक शाही सेना की गुणवत्ता नियंत्रण
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक यूवी रीडर का उपयोग कर पृथक शाही सेना की मात्रा निर्धारित करते हैं।
    2. शाही सेना की गुणवत्ता और उपयोग करते हुए शाही सेना अखंडता की जाँच प्रयोगशाला पर एक चिप और एक यूवी पाठक, एसीसी microfluidic जेल आधारितनिर्माता के निर्देशों के ording।

7. माइक्रोएरे कार्यप्रवाह

नोट: नीचे वर्णित प्रक्रिया के एक परिसर का उपयोग करने के लिए शाही सेना की तैयारी से शुरू Affymetrix 3 'जीन अभिव्यक्ति कारतूस पर संकरण के लिए लक्ष्य संश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है जो Affymetrix GeneChip उच्च throughput 3'IVT एक्सप्रेस किट, के लिए विधि पर केंद्रित तरल हैंडलिंग प्रणाली (उदाहरण के लिए।, pipetting, गिराए वितरण, या को एकीकृत)।

  1. तैयारी
    1. बैच प्रभाव से बचने के लिए नमूने यादृच्छिक करें। बैचों द्वारा संसाधित नमूनों की संख्या एक सकारात्मक (वाणिज्यिक मानव सार्वभौमिक संदर्भ आरएनए) और एक नकारात्मक (RNase मुक्त पानी) प्रति बैच नियंत्रण सहित, 1-96 है।
    2. RNase मुक्त पानी के 3 μl में कुल शाही सेना के 100 एनजी का उपयोग कर लक्ष्य संश्लेषण शुरू करो। कुल शाही सेना के 100 एनजी के लिए, एक 16 घंटे ऊष्मायन समय का उपयोग करें।
  2. आरएनए प्रवर्धन
    1. पी तैयार करेंOLY-ए शाही सेना कील में पाली-एक नियंत्रण कमजोर पड़ने बफर के साथ पाली-ए शाही सेना शेयर की एक धारावाहिक कमजोर पड़ने से नियंत्रण समाधान:
      1. कमजोर पड़ने के लिए 1, 36 μl कमजोर पड़ने बफर में 2 μl Pólya नियंत्रण स्टॉक तैयार करते हैं।
      2. कमजोर पड़ने 2 के लिए, कमजोर पड़ने बफर के 98 μl में कमजोर पड़ने 1 से 2 μl तैयार करते हैं।
      3. कमजोर पड़ने 3 के लिए, कमजोर पड़ने बफर के 196 μl में कमजोर पड़ने 2 के 4 μl तैयार करते हैं।
      4. कमजोर पड़ने 4 के लिए, कमजोर पड़ने बफर के 180 μl में कमजोर पड़ने 3 के 20 μl तैयार करते हैं।
    2. 33.3 एनजी / μl के एक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए RNase मुक्त पानी में शाही सेना पतला।
    3. सीधे एक 96 अच्छी तरह से थाली में कुल शाही सेना के नमूने के 3 μl को Pólya नियंत्रण समाधान के 2 μl जोड़ें। यह कदम तरल हैंडलिंग प्रणाली द्वारा किया जाता है।
    4. तरल हैंडलिंग प्रणाली और लक्ष्य संश्लेषण तैयार करें। रोबोट पर प्लेटें प्लेस। डेक पर सभी आवश्यक अभिकर्मकों और Labware रखें। रोबोट appropriat तैयारी से प्रक्रिया शुरू कर देंगेई mastermixes स्वचालित रिमोट नियंत्रित पीसीआर ब्लॉक में नमूने सेते हैं और।
    5. सबसे पहले गुणवत्ता नियंत्रण की जांच: प्रवर्धन प्रक्रिया का नियंत्रण
      1. Arna की गुणवत्ता में स्वीकार्य है, तो प्रत्येक नमूने के विखंडन 5X बफर के 8 μl (यह कदम तरल हैंडलिंग प्रणाली द्वारा किया जाता है) को जोड़कर विखंडन कदम प्रदर्शन करते हैं। अन्यथा, फिर शाही सेना से शुरू पिछले चरण प्रदर्शन करते हैं। तुरंत खंडित Arna का प्रयोग करें या डिग्री सेल्सियस (या -70 लंबी अवधि के भंडारण के लिए डिग्री सेल्सियस) -20 पर undiluted और खंडित Arna की दुकान।
      2. विखंडन की दक्षता की जांच करने के लिए microfluidics जेल आधारित प्रणाली पर प्लेट और हस्तांतरण एक μl में बेतरतीब ढंग से 12 नमूने उठा द्वारा एक दूसरे गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण करते हैं।
  3. संकरण प्रक्रिया
    1. चिप बारकोड को स्कैन और निर्देशों के अनुसार निर्माता के सॉफ्टवेयर में प्रत्येक नमूने रजिस्टर।
    2. के रूप में संकरण मिश्रण तैयार करेंएक भी प्रतिक्रिया के लिए इस प्रकार है और खंडित और लेबल Arna के 33 μl में जोड़ें: नियंत्रण oligonucleotide बी 2 की 4.2 μl (3NM), 20x यूकेरियोटिक संकरण नियंत्रण के 12.5 μl, 100% के 25 μl DMSO के, 2x संकरण बफर के 125 μl और 216.7 μl के अंतिम मात्रा के लिए एच 2 ओ के 50 μl
      नोट: संकरण, धोने और नमूने प्रक्रिया से पहले सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण स्कैन।
    3. संकरण वॉश और दाग किट में निहित पूर्व संकरण मिश्रण के 200 μl के साथ सरणी पूर्व गीला।
    4. ओवन में 45 डिग्री सेल्सियस पर सेट संकरण में चिप और 10 मिनट के लिए 60 आरपीएम रखें।
    5. इस बीच, 5 मिनट के लिए 99 डिग्री सेल्सियस पर एक पीसीआर ब्लॉक में प्लेट (अंतिम कॉकटेल संकरण मिश्रण युक्त) denature और 5 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस।
    6. सरणी से पूर्व संकरण मिश्रण निकालें और संकरण कॉकटेल लक्ष्य के 200 μl (चिप प्रति एक नमूना) के साथ बदलें।
    7. Hybri में सरणी रखेंdization ओवन 60 rpm के एक रोटेशन की गति के साथ 16 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस (हे / एन) पर निर्धारित किया है।
  4. धुलाई और धुंधला
    1. सॉफ्टवेयर मेनू पट्टी से "fluidics" चलाएँ। तो, सभी मॉड्यूल के लिए Prime_450 प्रोग्राम का चयन करें - fluidics संवाद बॉक्स में, ब्याज (4 1) के मॉड्यूल का चयन करें। एक बोतल (500 मिलीलीटर) में MilliQ पानी के लिए के रूप में अच्छी तरह से, एक बोतल (200 मिलीलीटर) में एक बोतल (400 मिलीलीटर) और धो बफर बी के लिए में धो बफर के लिए ट्यूबिंग रखें।
    2. इसके बाद, एलसीडी स्क्रीन निर्देशों का पालन करें। सुइयों लिफ्ट और 600 μl दाग कॉकटेल 1 (SAPE समाधान मिक्स) और पदों # 1 और # 2 पर microcentrifuge ट्यूब युक्त 600 μl दाग कॉकटेल 2 (एंटीबॉडी समाधान मिक्स) जगह है, और स्थिति # 3 पर बफर समाधान होल्डिंग 900 μl सरणी।
    3. ओवन में हे / एन ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक मॉड्यूल के लिए सही चिप निरुपित चिप से कॉकटेल महाप्राण और 250 μl धो बफर ए के साथ माइक्रोएरे भरने, FS450-001 प्रोटोकॉल का चयन करें और प्रत्येक मो चलानेdule, स्क्रीन पर निर्देशों का पालन। इस प्रक्रिया में 90 मिनट तक रहता है।
    4. एलसीडी स्क्रीन "इजेक्ट कारतूस" संदेश इंगित करता है एक बार, चिप को हटाने और किसी भी बुलबुले हैं अगर निरीक्षण किया। बुलबुले मौजूद हैं, ऐरे पकड़े बफर के साथ पूरी तरह सरणी भरें। स्कैनर में किसी भी लीक से बचने और स्कैनर में लोड हो रहा है के लिए पहले माइक्रोएरे खिड़की साफ करने के लिए सेप्टा पर स्टिकर लागू करें।
  5. स्कैनिंग।
    1. स्कैनर गर्म। स्कैनर के autoloader में चिप लोड और स्कैनिंग शुरू करते हैं।
      नोट: चिप प्रति ~ 12 मिनट के बाद, चिप प्रति एक .CEL फ़ाइल उत्पन्न होता है।
    2. छवि की जाँच करें और जांच कोशिकाओं की पहचान करने के लिए हाजिर करने के लिए (यदि आवश्यक) ग्रिड पंक्ति में।
      नोट: डाटासेट (परिग्रहण कोड = ई-MTAB-1721) Arrayexpress करने के लिए प्रस्तुत किया गया है।

एक प्रभाव आकलन के लिए 8. नेटवर्क-आधारित सिस्टम्स बायोलॉजी विश्लेषण

  1. माइक्रोएरे डाटा प्रोसेसिंग।
    नोट: डेटा प्रसंस्करणडी स्कोरिंग विधियों आर सांख्यिकीय पर्यावरण संस्करण 2.14 का उपयोग कर लागू किया गया।
    1. एक आर 18 सत्र खोलें और आदेश चलाकर स्थापित affy 19, gcrma, और affyPLM संकुल लोड: पुस्तकालय (affy)> लाइब्रेरी (gcrma)> लाइब्रेरी (affyPLM)
    2. कमांड चलाने कच्चे डेटा फ़ाइलों पढ़ें: data.affybatch <-ReadAffy ("सीईएल फ़ाइलों को संग्रहित कर रहे हैं, जहां फ़ोल्डर का पथ")
    3. आदेश चलाकर, gcrma पैकेज का उपयोग कर जांच सेट अभिव्यक्ति मूल्यों को उत्पन्न करने के लिए पृष्ठभूमि सुधार और quantile नॉर्मले घटाना: eset.norm <-gcrma (data.affybatch)
  2. गुणवत्ता नियंत्रण।
    1. कमांड के साथ शाही सेना गिरावट भूखंडों उत्पन्न: डिग्री <-AffyRNAdeg (data.affybatch)
    2. ढलान = डिग्री $ ढलान: कमांड चलाने आरएनए गिरावट ढलान के गुणांक निकालें
    3. ढलान गुणांक साजिश और संभव outliers की पहचान।
    4. निम्न आदेशों चल Nuse और आरएलई भूखंडों उत्पन्न: Pset <-fitPLM (data.affybatch)> आरएलई (Pset)> Nuse (Pset)।
    5. उत्पन्न boxplots के कुछ outliers हैं अगर पहचानें: एक सरणी ग़ैर माना जाता है कि अगर अन्य सरणियों से विचलित नीचे परिभाषित 3 क्यूसी मेट्रिक्स के कम से कम 2:
      - डिग्री $ ढलान औसत डिग्री $ ढलान से अलग है
      - Nuse साजिश: ऊपरी चतुर्थक, 0.95 से नीचे गिर जाता है या 1.05 से ऊपर कम चतुर्थक अगर यानी, boxplot पूरी तरह 1.05 से ऊपर या पूरी तरह 0.95 से नीचे है अगर एक सरणी ग़ैर माना जाता है।।
      - आरएलई साजिश: आरएलई वितरण की औसत 0.1 से अधिक है या -0.1 से छोटी है अगर एक सरणी ग़ैर माना जाता है।
    6. एक सरणी एक ग़ैर रूप में पहचान की है, तो त्यागने, और कदम 8.1.2 से फिर से शुरू करते हैं।
    7. ब्याज की विशेष विरोधाभासों के लिए डेटा के लिए एक समग्र रेखीय मॉडल फिट (यानी।, "इलाज" और "नियंत्रण" की स्थिति की तुलना) furt हो सकता है जो माइक्रोएरे पर सेट प्रत्येक जांच के लिए कच्चे पी मूल्यों को पैदा करनेउसके Limma पैकेज की Benjamini-Hochberg प्रक्रिया का उपयोग कर समायोजित। 20 में वर्णित के रूप में आगे के विश्लेषण के लिए जीन के प्रतिनिधि के रूप में रखने के लिए जीन प्रति एक probeset का चयन करें।
      नोट: प्रयोग डिजाइन से एक को अवरुद्ध कारक (जोखिम प्लेट) डाटा प्रोसेसिंग के लिए मॉडल में जिम्मेदार था।
  3. नेटवर्क-आधारित विश्लेषण।
    नोट: यहां कार्यान्वित के रूप में विधि मार्टिन एट अल में विस्तार से वर्णन किया गया है। (बीएमसी जैव सूचना विज्ञान में संशोधन में)।
    1. ब्याज की प्रत्येक जोड़ो में तुलना के लिए, अभिकलन (log2-) से शुरू (कदम 8.2 से) नेटवर्क के तहत प्रत्येक जीन के लिए परिवर्तन (नियंत्रण बनाम उपचार) गुना।
    2. , चिह्न (मैं ~ जे) डब्ल्यू (मैं, जम्मू) नोड मैं और जम्मू के बीच (मैं, जम्मू) डब्ल्यू वजन का एक छोर है, अगर वहाँ - एल द्वारा परिभाषित नेटवर्क का हस्ताक्षर किए Laplacian मैट्रिक्स एल (मैं, जम्मू) = कंप्यूट एल (मैं, जम्मू) = डिग्री (मैं) मैं और एल (मैं, जम्मू) = किसी और 0 से भारित की डिग्री है। मैं और जम्मू रीढ़ की हड्डी और डब्ल्यू (मैं, जम्मू) = 1 में हैं (मैं, जम्मू) डब्ल्यू वजन 1 के बराबर हैं / एन मैं एक रीढ़ नोड है और अगर जम्मू इसकी एन neighb में से एक हैप्रतिलेख परत में अन्य रैंकों।
    3. L3 रीढ़ नोड्स के लिए एल के उप-मैट्रिक्स है और L2 जिसका पंक्तियों रीढ़ नोड्स के लिए ट्रांसक्रिप्शनल परत नोड्स और कॉलम के अनुरूप एल के उप-मैट्रिक्स है जहां = L3-1L2Tx च द्वारा रीढ़ की हड्डी के लिए स्कोर कंप्यूट
    4. सभी बढ़त के संकेत उलट हैं, जहां रीढ़ नेटवर्क द्वारा परिभाषित नेटवर्क की, पर हस्ताक्षर किए Laplacian, क्यू कंप्यूट।
    5. एनपीए = fTQf द्वारा एनपीए स्कोर की गणना।
    6. विश्वास अंतराल, रीढ़ की हड्डी के किनारे क्रमचय पी मूल्य और प्रतिलेख परत क्रमचय पी मूल्य की गणना करें।
      नोट: (। उदाहरण के लिए, एक प्रयोगात्मक समूह में नमूने के बीच जैविक विभिन्नता) प्रयोगात्मक त्रुटि के लिए खाते में जो एनपीए स्कोर के विश्वास अंतराल, के अलावा, साथी आँकड़े वर्णित जीव विज्ञान के लिए एनपीए स्कोर की विशिष्टता का वर्णन करने के लिए प्राप्त किए गए नेटवर्क में। एनपीए गुना परिवर्तन का एक द्विघात रूप है, क्योंकि इसके विचरण अभिकलन गुना-परिवर्तन का अनुमान वी के आधार पर किया जा सकता हैariances। एक विश्वास अंतराल बाद में केंद्रीय सीमा प्रमेय का उपयोग कर ली गई है। दो क्रमचय परीक्षण परिणामों मॉडल में अंतर्निहित सबूत (यानी।, जीन गुना-परिवर्तन) के लिए विशिष्ट थे अगर पी जब आंकड़े में * से चिह्नित एक क्रमचय पी मूल्य (ओ के लिए अग्रणी का आकलन करने के लिए जिससे पहले, 21 से लागू किया गया -value <0.05)। दूसरा, नेटवर्क के "कारण और प्रभाव" परत काफी नेटवर्क गड़बड़ी के आयाम के लिए योगदान का आकलन है कि (आंकड़े में कश्मीर * से चिह्नित जब पी मूल्य <0.05)।
    7. विश्वास अंतराल शून्य होते हैं और दो क्रमचय पी-मूल्यों 0.05 <नहीं करता है तो उपचार से प्रभावित के रूप में नेटवर्क पर विचार करें।
    8. एनपीए स्कोर का 80% अप करने के लिए योगदान रीढ़ की हड्डी में महत्वपूर्ण नोड्स के रूप में परिभाषित कर रहे हैं, जो प्रमुख नोड्स कंप्यूट।

Representative Results

नीचे वर्णित परिणामों में, organotypic ऊतकों स्वस्थ, गैर धूम्रपान से अलग प्राथमिक मानव उपकला कोशिकाओं, कोकेशियान दाताओं थे और fibroblasts 15 का उपयोग कर पुनर्गठित किया गया।

3 डी ब्रोन्कियल और नाक ऊतक मॉडल
इन विट्रो ब्रोन्कियल और नाक organotypic मॉडल में सेलुलर स्तर मानव श्वसन तंत्र उपकला (चित्रा 2) में समान है।

सीएस जोखिम
Organotypic ब्रोन्कियल और नाक ऊतक मॉडल को बार-बार हवा तरल इंटरफेस में मुख्यधारा सीएस से अवगत कराया जा सकता है। यहाँ सचित्र परिणामों के लिए इस्तेमाल किया धूम्रपान जोखिम प्रयोगात्मक प्रक्रिया चित्र 1 में दिखाया गया है।

सिलिअरी पिटाई की रिकॉर्डिंग
सिलिया पिटाई वीडियो में सचित्र के रूप में हवा में उजागर ऊतकों में दर्ज की गई थी। सीएस जोखिम सिलिअरी पिटाई आवृत्ति की कमी के साथ जुड़े थे: आसपास मनाया मजबूत शिखरजोखिम उजागर दिखावा में और इससे पहले 4 हर्ट्ज सीएस जोखिम (चित्रा 3) के बाद अब किसी भी नहीं मनाया जाता है। यह कम आवृत्ति बलगम और संक्रामक एजेंटों 22 को निकालने के लिए कम कुशल पिटाई सिलिया करना होगा।

Teer और CYP1A1 / 1B1 गतिविधि की माप
Teer ऊतक अभी भी कार्यात्मक है सुनिश्चित करने के लिए पिछले प्रदर्शन के बाद 48 घंटा मापा गया था। चित्रा 1 में सचित्र के रूप में CYP1A1 / 1B1 गतिविधि भी लोगों तक पहुंचाने के अंत के बाद 48 घंटे मापा गया था। सीएस उजागर ऊतकों में Teer मूल्यों में काफी अलग नहीं थे धुएं की कोई बड़ी साइटोटोक्सिक प्रभाव है कि वहाँ की पुष्टि हवा उजागर ऊतकों की तुलना में इस एकाग्रता में। 48 घंटे के बाद जोखिम पर, ऊतकों के CYP1A1 / 1B1 गतिविधि थोड़ा जोखिम (चित्रा 4) निम्नलिखित ऊतक सुरक्षा तंत्र की एक मामूली वृद्धि का संकेत है, वृद्धि की गई थी।

जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल और नेटवर्क-आधारित सिस्टम द्विology के दृष्टिकोण जीनोबायोटिक चयापचय के परिवर्तन पर सीएस लोगों तक पहुंचाने के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए
ऊतकों 48 घंटे के बाद जोखिम समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए थे। इसके बाद, माइक्रोएरे विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति CS- की प्रोफाइल और हवा में उजागर ऊतकों उत्पन्न करने के लिए आयोजित किया गया। जीनोबायोटिक चयापचय पर सीएस जोखिम के प्रभाव जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल से leveraged एक नेटवर्क आधारित प्रणालियों जीव विज्ञान दृष्टिकोण का उपयोग कर जांच की गई है और के रूप में पहले 15 की सूचना दी। एक नेटवर्क आधारित प्रणालियों जीव विज्ञान दृष्टिकोण का प्रयोग xenobiotic चयापचय नेटवर्क मॉडल में रीढ़ की हड्डी नोड्स के स्तर पर सीएस लोगों तक पहुंचाने के प्रभावों को अच्छी तरह से (चित्रा 5) में इन विट्रो के बीच और vivo डेटासेट में सहसंबद्ध थे कि पता चलता है। इसके विपरीत, प्रत्येक व्यक्ति के जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के स्तर पर, गरीब सहसंबंध इन विट्रो (nonsmokers बनाम धूम्रपान करने वालों) और vivo में (हवा में उजागर बनाम सीएस उजागर) के बीच मनाया गया।


Organotypic ब्रोन्कियल ऊतक मॉडल के लिए सीएस की कई बार प्रदर्शन के चित्रा 1. योजनाबद्ध प्रक्रिया लघुरूप:। CYP, साइटोक्रोम P450s; सीएस, सिगरेट के धुएं; Teer, transepithelial विद्युत प्रतिरोध।

चित्र 2
चित्रा 2. Organotypic ब्रोन्कियल और नाक उपकला ऊतक संस्कृति मॉडल। कार्टून हवा तरल इंटरफेस में ब्रोन्कियल (ए) और नाक (बी) के ऊतक संस्कृति डालने illustrating। पहले से 15 के रूप में रिपोर्ट में इन विट्रो मॉडल Hematoxylin और eosin दाग कोशिकाओं के शिखर परत में दिखाया गया रोमक कोशिकाओं (ब्रोन्कियल के लिए सी, नाक के लिए डी) निहित। मॉडल के लिए महत्वपूर्ण हैं कि fibroblasts के साथ सह-सुसंस्कृत थे विकास और उपकला कोशिकाओं के भेदभाव के लिए (तीर द्वारा संकेत)। Airway के वंश मार्कर का धुंधला: पहले 15 के रूप में रिपोर्ट P63 (नाक के लिए ब्रोन्कियल के लिए ई, एफ) और Muc5AC (ब्रोन्कियल के लिए जी, नाक के लिए एच) दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Cilia बैरंग फ्रीक्वेंसी। Cilia पिटाई आवृत्ति (CBF) से पहले और प्रदर्शन के बाद हवा में उजागर में और संस्कृति में मापा गया था। CBF सीएस प्रदर्शन के बाद देखा गया था कमी आई (दो डालने से प्रतिनिधि परिणामों को दोहराने 1 (आर 1 के रूप में दिखाया गया है) और दोहराने कर रहे हैं 2 (आर 2))।

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चित्रा 4. CYP1A1 / CYP1B1 गतिविधि और Teer के मापन। वाम pannels ब्रोन्कियल (ए) और नाक (बी) के ऊतक मॉडल में CYP1A1 / CYP1B1 गतिविधि का संकेत मिलता है। सही पैनल ब्रोन्कियल (सी) और नाक (डी) ऊतक मॉडल में Teer माप संकेत मिलता है। एसडी ± मतलब दिखाए जाते हैं। लघुरूप: सीएस, सिगरेट के धुएं; CYP, साइटोक्रोम P450; Teer, transepithelial विद्युत प्रतिरोध; RLU, रिश्तेदार luminescense इकाई।

चित्रा 5
जीनोबायोटिक चयापचय के संदर्भ में सीएस जोखिम के प्रभाव के आकलन के लिए 5 चित्रा नेटवर्क-आधारित प्रणालियों जीव विज्ञान दृष्टिकोण। जीन अभिव्यक्ति के स्तर के परिवर्तन xenobiotic चयापचय नेटवर्क मॉडल की रीढ़ नोड के सक्रियण (ए) की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया strong> पिछले प्रकाशन 15 में सूचना दी। दाईं तरफ आंकड़ा एनपीए दृष्टिकोण का उपयोग, "अंतर नेटवर्क रीढ़ मूल्य" के रूप में भी जाना जाता रीढ़ नोड्स, की मात्रा का ठहराव की अवधारणा को दिखाता है। नीले अंडाकार रीढ़ नोड्स की गतिविधि का प्रतिनिधित्व करते हैं (यानी।, कार्यात्मक परत) और हरे रंग की गेंदों जीनों की अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं (यानी।, ट्रांसक्रिप्शनल परत)। Organotypic ब्रोन्कियल ऊतकों में सीएस जोखिम के प्रभावों GSE16008 (postexposure के 48 घंटे में अवर turbinate burshing द्वारा ब्रोंकोस्कोपी और नाक उपकला द्वारा एकत्र मानव ब्रोन्कियल उपकला पर धूम्रपान के उन लोगों की तुलना कर रहे थे (इन विट्रो में, हवा में उजागर बनाम सीएस उजागर) ) (विवो, धूम्रपान करने वालों बनाम nonsmokers में) (बी)। Insets, जीन अभिव्यक्ति के संबंध में इन विट्रो के बीच और vivo डेटासेट में बदल जाता है। लघुरूप: सीएस, सिगरेट के धुएं; एनपीए, नेटवर्क गड़बड़ी आयाम।ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ, हम दोहराया सीएस लोगों तक पहुंचाने के प्रभाव का आकलन करने के लिए मानव organotypic ब्रोन्कियल और नाक ऊतक मॉडल की प्रयोज्यता प्रदर्शन किया है। पशु परीक्षण के लिए एक विकल्प के रूप में, जोखिम प्रणालियों के एक नंबर (जैसे।, Vitrocell, Cultex, एलिस, आदि) के लिए इन विट्रो में एयरोसोल जोखिम की विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए विकसित किए गए। इन लोगों तक पहुंचाने के मॉड्यूल भी इस अध्ययन में आदि हवाई प्रदूषण, हवाई कणों, नैनोकणों के विषाक्तता के आकलन के लिए उपयोग किया जा सकता है, हम बड़े पैमाने पर प्रयोग के बीच कम परिवर्तनशीलता के लिए अनुमति देता है, एक साथ 48 विभिन्न नमूनों को समायोजित कर सकते हैं कि Vitrocell प्रणाली का इस्तेमाल किया उपचार। इन विट्रो में हर एयरोसोल लोगों तक पहुंचाने के लिए, टिशू कल्चर संदूषण का जोखिम जिसका शमन प्रयोगों के दौरान ऊतक संस्कृतियों का सावधानी से निपटने की मांग एक बड़ा जोखिम बना रहता है।

ई दौरान Microbalance पर वास्तविक समय में कण बयान मापनेxposure प्रयोग जोखिम प्रणाली से उत्पन्न सीएस खुराक उम्मीदों के अनुरूप रहे हैं कि निगरानी करने के लिए अनुमति देता है। सेटिंग-अप ऑनलाइन माप सही ढंग से लोगों तक पहुंचाने से पहले, जैसे, critial है क्योंकि Microbalance (2 सेमी) के क्षेत्रों के बीच अंतर का, इसके अतिरिक्त 0 करने के लिए पैमाने की स्थापना और, मापा कण बयान की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए टिशू कल्चर डालें (0.33 सेमी 2), हम संस्कृति डालने के क्षेत्र में अंतिम गणना समायोजित: Microbalance पर बयान के केवल 33% संस्कृति डालने में वास्तविक बयान दर्शाते हैं।

तंग-जंक्शन बाधा कार्यक्षमता का पता लगाने के लिए और उपकला परत के विघटन का आकलन करने के Teer का मापन हम यहां बताया जो लागू करने के लिए एक अपेक्षाकृत आसान प्रक्रिया है। ब्रोन्कियल और नाक ऊतक मॉडल बलगम उत्पादक interspersed जाम कोशिकाओं होते हैं क्योंकि हालांकि, शिखर धोने Teer meas के पहले प्रदर्शन करने की जरूरत हैurement। शिखर धोने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि बलगम परत की उपस्थिति और सीएस जोखिम के प्रभाव के साथ interferring इसकी मोटाई कर सकते हैं पूर्वाग्रह Teer की माप की परिवर्तनशीलता,। इस धारणा Hilgendorf और Caco-2 कोशिकाओं की पारगम्यता बलगम उत्पादक जाम सेल लाइन HT29 23 के साथ सह संवर्धन से प्रभावित किया गया था, जिसमें उनके सहयोगियों द्वारा सूचित किया गया है के साथ समझौते में है। सही लोगों तक पहुंचाने से पहले शिखर धोने सीएस के लिए ऊतक प्रतिक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, क्योंकि बलगम, पूर्व Teer माप को धुल जाने की जरूरत है। इसलिए, माप तीन दिनों के प्रदर्शन से पहले प्रदर्शन किया, और लोगों तक पहुंचाने से पहले सही नहीं है।

हम गतिविधि केवल विनय सीएस की वृद्धि हुई थी, हालांकि CYP1A1 / CYP1B1 गतिविधि सीएस प्रदर्शन के बाद organotypic संस्कृति मॉडल से मापा जा सकता है कि पता चला है। इस कमजोर संकेत CYP1A1 / 1B1 सब्सट्रेट की एक लंबी ऊष्मायन से परिलक्षित किया जा सकता है (यानी।, Luciferin-CEE), उदाहरण के लिए के लिए24 घंटा (डेटा) नहीं दिखाया। वर्तमान काम में CYP गतिविधि माप की सीमाओं में से एक एंजाइम गतिविधि पर परिवर्तन को प्रभावित नहीं कर रहा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए CYP प्रोटीन के स्तर तक या भविष्य के अध्ययन के लिए ध्यान में रखा जा सकता है जो कोशिका गिनती, को सामान्य बनाने का अभाव है प्रोटीन के स्तर या सेल गिनती या तो परिवर्तन से।

हम सीएस लोगों तक पहुंचाने के नाक और ब्रोन्कियल ऊतक दोनों मॉडलों में पिटाई सिलिअरी हिचकते कि सूचना दी। इसी प्रकार टिप्पणियों विविध स्तनधारी और गैर स्तनधारी मॉडल 12 में किया गया। सिलिअरी, माप पिटाई ऊतकों एक समान तरीके से संभाला और इलाज कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए मध्यम परिवर्तन कार्यान्वित किया जाता है, तो यह सभी नमूनों के लिए लागू किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए महत्वपूर्ण है। Sutto और उनके सहयोगियों ने पीएच आवृत्ति 24 पिटाई स्तनधारी सिलिअरी प्रभावित है कि सूचना दी। इस प्रकार, विभिन्न compunds / मिश्रण, पीएच के साथ इलाज किया कोशिकाओं के बीच आवृत्तियों पिटाई की तुलना करते समयसमायोजन सिलिअरी पिटाई माप की परिवर्तनशीलता को कम से कम करने के लिए विचार किया जाना चाहिए। सिलिअरी पिटाई की आवृत्ति तापमान घटने के साथ बूंदों के रूप में इसके अलावा, माप आयोजित किया जाता है, जिस पर तापमान भी महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था तापमान, सीओ 2, और आर्द्रता नियंत्रण के साथ सुसज्जित इन परिवर्तनों, एक मंच टॉप इनक्यूबेटर के कारण परिवर्तनशीलता को कम से कम करने के लिए। इस के बावजूद, हम सीएस प्रदर्शन के बाद ब्रोन्कियल ऊतकों में आवृत्तियों की धड़कन सिलिअरी सिलिअरी पिटाई प्रदर्शन के बाद अत्यधिक परेशान सही है, सुझाव है कि अत्यधिक चर (यानी।, एक डालने में वृद्धि और अन्य डालने में कमी) थे कि मनाया। इसके विपरीत, हम नाक के ऊतकों की प्रतिक्रिया और अधिक संवेदनशील और सुसंगत है, सुझाव है कि सीएस प्रदर्शन के बाद नाक के ऊतकों में औसत दर्जे का सिलिअरी पिटाई आवृत्तियों के अभाव मनाया। यह नाक के ऊतकों के रूप में detoxify करने के लिए एक कम क्षमता दिखा रहा है कि पिछले एक प्रकाशन के साथ समझौते में हैश्वसनी 25 के साथ तुलना में।

अंत में, हम सीएस से अवगत कराया organotypic ब्रोन्कियल और नाक ऊतक मॉडल से की रूपरेखा जीन अभिव्यक्ति जीनोबायोटिक चयापचय पर सीएस का एक प्रभाव का प्रदर्शन कर सकता है कि पता चला है। पिछले एक प्रकाशन 15 में अधिक विस्तार से चर्चा के रूप में दिलचस्प है, सीएस के संपर्क में इन विट्रो मॉडल में मनाया organotypic ब्रोन्कियल में जीनोबायोटिक चयापचय में परिवर्तन और नाक धूम्रपान करने वालों में vivo में स्थिति की कि जैसे लगते हैं। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए, रोबोट उपकरण का उपयोग कर एक उच्च throughput विश्लेषण संभव बनाता है। इसके अलावा, स्वचालित रोबोट से निपटने के आगे जीन एक्सप्रेशन परिणाम की स्थिरता और सटीकता बढ़ जाती है। बहरहाल, ऊतकों के नमूनों की तेजी संग्रह शाही सेना निकासी के दौरान शाही सेना गिरावट से बचने के लिए महत्वपूर्ण था। आरएनए प्रसंस्करण और यहाँ वर्णित transcriptomic दृष्टिकोण भी vivo में ऊतकों के नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है।

Disclosures

इस अध्ययन में फिलिप मॉरिस इंटरनेशनल द्वारा वित्त पोषित किया गया।

Acknowledgments

लेखकों पांडुलिपि की उनकी समीक्षा के लिए मौरिस स्मिथ और Marja Talikka को धन्यवाद देना चाहूंगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MucilAir-human fibroblasts-bronchia Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/
MucilAir Culture Medium Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/
VITROCELL VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=
3R4F reference cigarette University of Kentucky http://www2.ca.uky.edu/refcig/
30-port carousel smoking machine SM2000 Philip Morris, Int.
CiliaMetrix camera and software La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland
Leica DMIL microscope  Leica, Heerbrugg, Switzerland
LED light source Titan Tool Supplies, Buffalo, NY
Chopstick Electrode STX-2 World Precision Instruments http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter  World Precision Instruments http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/
Luciferin Detection Reagent 
MagNA Lyser Instrument  Roche http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66
chloroform  Sigma-Aldrich http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=
QIAcube  Qiagen 9001882
NanoDrop Thermo Scientific http://www.nanodrop.com/
Agilent 2100 Bioanalyzer  Agilent http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106
Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit Affymetrix http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit
Scanner 3000 7G  Affymetrix http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G

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References

  1. Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).
  3. Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465 (2011).
  4. Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).
  5. Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicolog. 244, 66-76 (2008).
  6. Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).
  7. Cho, M. -H., et al. A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker. Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).
  8. Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research. Journal of Allerg. 2012, 11 (2012).
  9. Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazi. , 19-24 (2010).
  10. Chhin, B., et al. Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy. PLoS genetic. 5, e1000422 (2009).
  11. Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro. Front Me. 7, 486-491 (2013).
  12. Talbot, P. In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents. Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).
  13. Port, J. L., et al. Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract. Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).
  14. Hoeng, J., et al. A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances. Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).
  15. Iskandar, A. R., et al. Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues. Biomed Res In. 2013, 512086 (2013).
  16. Karp, P. H., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).
  17. ISO 3402: Tobacco and tobacco products -- Atmosphere for conditioning and testing. , International Organization for Standardization. (1999).
  18. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , The R Core Team. (2011).
  19. Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips. BMC Bioinformatic. 5, 111 (2004).
  20. Hermida, L., et al. Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data. BMC genomic. 14, 514 (2013).
  21. Thomson, T. M., et al. Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models. Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).
  22. Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke. Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).
  23. Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).
  24. Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH. The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).
  25. Zhang, X., et al. Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium. Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).

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बायोइन्जिनियरिंग अंक 96 मानव organotypic ब्रोन्कियल उपकला 3 डी संस्कृति, सिगरेट का धुआँ सिलिया पिटाई जीनोबायोटिक चयापचय नेटवर्क मॉडल सिस्टम विष विज्ञान
पूरे सिगरेट के धुएं को Organotypic 3 डी ब्रोन्कियल और नाक ऊतक संस्कृति मॉडल की कई बार प्रदर्शन के प्रभाव आकलन
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Kuehn, D., Majeed, S., Guedj, E., Dulize, R., Baumer, K., Iskandar, A., Boue, S., Martin, F., Kostadinova, R., Mathis, C., Ivanov, N. V., Frentzel, S., Hoeng, J., Peitsch, M. C. Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke. J. Vis. Exp. (96), e52325, doi:10.3791/52325 (2015).

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