Protocol
의 Organotypic 조직 기관지 문화 모델 1. 문화
참고 : 재구성 된 조직 모델을 사용할 준비가 삽입으로 구입 하였다. 카프와 동료 (16)에 의해 예를 들어 설명 된 바와 같이 대안 적으로, 일차 배양 세포로부터 개발 될 수있다. 무균 포장에서 조직의 영수증에 따라, 항상 무균 상태에서 인간의 Organotypic 조직을 처리합니다.
- 추가 후드 아래에 새 멸균 24 웰 플레이트의 각 웰에 예열 (37 ° C) 분석 매체의 0.7 ml의.
- 후드 아래에 조직의 포장을 제거하고 새로운 준비 24 웰 플레이트에 조직 배양 삽입을 전송한다 (단계 1.1에 설명. 위).
- 37 ° C (5 % CO 2, 90 % 습도)에서 인큐베이터에서 조직을 유지하고 문화.
- 2 일마다 매체를 교체합니다.
- 매질을 변경하는 동안, 그들은 그들 contaminati 아르 있도록 광학 현미경 조직 검사자유에 특정 매체의 누설이 없다.
체외 노출 시스템을 사용하여 2. 담배 연기 (CS) 노출
- 노출 실험 이전에 세 가지 일, 배양액 200 μL와 조직 문화의 혀끝의 측면을 씻는다.
- 섬모 박동의 측정이 노출되기 전에 계획하는 경우 3 항에 명시된 노출의 날, 섬모 박동 측정을위한 조직을 처리합니다.
- 체외 노광 시스템의 기후 챔버와 37 ° C로 재배 기본 모듈을 미리 가온. 행당 매체의 17.5 mL로 재배 기본 모듈을 입력합니다.
- 인큐베이터에서 조직을 제거하고 체외 노출 시스템의 재배 기본 모듈에 문화 판에서 조직 배양 삽입을 전송하는 후드 아래에 배치합니다. 또한, 유리 뚜껑 재배 기본 모듈을 커버.
- 체외 노출 정기적 복용의 기후 챔버에서 조직을 전송주류 CS 노출에 대한 m.
- 체외 노광 시스템은 마이크로 저울 장착되어있는 경우, 설정 한 수정 마이크로 저울을 마이크로 밸런스 소프트웨어를 사용하여 수정 결정에 연기의 실시간 입자 침착을 측정하는 노광을 실행하기 전에.
- 희석 / 분배 시스템의 각 행에 접속 된 마이크로 밸런스 결정 모듈을 교체.
- 마이크로 저울 소프트웨어로 마이크로 저울 모듈을 연결합니다. 소프트웨어 0으로 측정의 규모를 설정합니다.
- 실험 방법에 따라 조직을 노출 (예.,도 1에서와 같이)
참고 : 이전에 노출, 참조 담배 (3R4F은) 3402 17 ISO 표준에 따라 22 ± 1 ° C와 60 ± 3 %의 상대 습도에서 통제 된 조건 하에서 7 이십일일 사이에서 조절된다.- 담배 연기를 생성합니다 (예 :., 3R4F 담배에서) 30 포트 회전 목마 흡연 마하를 사용하여오프라인 캐나다 보건부 (Health Canada) 강렬한 정권에 따라이 : 즉, 표준 엉덩이 길이로 2 초 동안 55 ml의 퍼프 약 35mm, 두 분 8 초 펌프의 배기 시간을 담배 연기.
주 : 필요한 경우 투여 량이 너무 독성되지 않도록 주류 CS 희석. 여기에보고 된 결과, 연기는 16 % (용적 / 용적)로 희석 하였다. - 제어 샘플 60 % 가습 공기를 사용하여 (공기에 노출 된).
- 6-7 분 동안 조직을 노출 체외 노출 시스템 (예. 1, 담배 또는 공기에 노출 된)
- 1 시간 동안 37 ° C (5 % CO 2, 습도 90 %)에서 다시 인큐베이터에서 조직을 넣어.
- 반복 2.7.3과 2.7.4 세 번 단계를 반복합니다.
- 담배 연기를 생성합니다 (예 :., 3R4F 담배에서) 30 포트 회전 목마 흡연 마하를 사용하여오프라인 캐나다 보건부 (Health Canada) 강렬한 정권에 따라이 : 즉, 표준 엉덩이 길이로 2 초 동안 55 ml의 퍼프 약 35mm, 두 분 8 초 펌프의 배기 시간을 담배 연기.
- 노출 실험의 끝에서, 마이크로 밸런스 소프트웨어를 중지. 소프트웨어는 입자 증착의 그래픽 표현과 함께 모든 측정치를 포함하는 파일을 생성한다.
- 재배 b로부터 조직을 다시 전송문화 판에 ASE 모듈. 특정 노출 후 시간 지점에서 다른 엔드 포인트에 대한 측정을 할 때까지 37 ° C (5 % CO 2, 90 % 습도)에서 인큐베이터에서 조직을 놓습니다.
섬모 구타 3. 측정
참고 : 이전에 노출에 직접 노출 된 후 구타로 실험 계획 당 (그림 1), 기록 섬모를.
- 인큐베이터에서 조직 배양 플레이트를 제거하고 30 분은 섬모 박동을 안정 실온에서 후드를 둡니다.
- CiliaMetrix 소프트웨어에 연결된 광학 현미경 조직을 놓습니다.
- 섬모 박동의 영화 (헤르츠) 주파수를 기록합니다. 주파수 1 분 3 초마다 측정한다.
- 37 ° C (5 % CO 2, 90 % 습도)에서 인큐베이터에 조직을 돌려줍니다.
4. Transepithelial 전기 저항 (봉사자) 측정
참고 : 봉사자의 측정은 이전 3 일 voltohmmeter에 연결 젓가락 전극 (STX-2)를 사용하여 무균 상태에서 후드 아래 노출 후 48 시간을 수행한다.
- 인간의 기관지 조직의 혀끝의 표면에 배양 배지 200 μl를 추가합니다.
- EVOMX 컴퓨터를 켭니다; 70 % 에탄올 용액으로 전극을 씻는다.
- 배양액에 전극을 씻으십시오.
- 조직을 건드리지 않고 조직 배양의 정점 측 매체에 전극을 삽입하여 저항 (Ω)을 측정한다.
- 단계를 반복 4.4 5 회 quintuplicate 측정을 얻었다.
- 측정 후, 부드럽게 흡입기를 사용하여 조직 문화의 혀끝의 측면에서 매체를 제거합니다.
- 배양을 위해 37 ° C (5 % CO 2, 90 % 습도)에서의 인큐베이터로 조직 문화를 돌려줍니다.
5. 시토크롬 P450 (CYP) 1A1 / 1B1 Activi타이
- 연구 시작 전 (제조업 자의 지시에 따라) 루시페린 검출 시약을 함유하는 호박색 병에 적절한 재구성 버퍼의 병의 전체 내용을 전송하여 루시페린 검출 시약을 준비한다. 1 개월 최대 -20 ° C에서 2 ml를 저장 씩.
- 48 시간 노출 후 시간 동안, 37 ° C에서 CS 노출 다음 48 시간 동안 조직을 배양한다.
- RT로 루시페린 검출 시약을 따뜻하게.
- 기초 배지에서 (1:50 희석) 루시페린-CEE 기판과 3 시간 또는 O / N에 대한 조직 삽입을 품어.
- 전송 각 조직으로부터 배양 배지 50 ㎕를 실온에서 96 웰 루미 불투명 한 백색 판에 삽입한다.
- 발광 반응을 개시하기 위해 각 웰 루시페린 검출 시약 50 μl를 추가.
- 실온에서 20 분 동안 플레이트를 인큐베이션.
- 루미를 사용하여 발광을 읽어보십시오.
참고 : 들어루미는 지침으로 잘 당 0.25-1 초 통합 시간을 사용합니다.
6. RNA 추출.
- 3D의 Organotypic 조직 삽입물을 수집하기 전에, 드라이 아이스, 블레이드 2)에 충분한 양의 (3D 인서트 당 하나), 3) 차가운 PBS 칼슘 및 염화 마그네슘없이, 4) 하나의 25 mL 유리 피펫 및 5) 박스 1을 제조 포부) 멸균 유리 바늘.
- 고체 세포 샘플을 균질화 및 Qiazol 700 μl를 추가 세라믹 구슬로 가득 레이블 튜브.
- 흡입 기계를 켭니다.
- 인큐베이터에서 3D의 Organotypic 조직 인서트의 플레이트를 수집합니다.
- 차가운 PBS와 함께 접시에 3 회 각 삽입을 씻으십시오. 세척 사이에, 유리 바늘로 PBS를 대기음. 세 번째 세척 후, PBS 및 커버 플레이트와 대기음은 삽입의 건조를 방지합니다.
- 플레이트에서 각 삽입의 경우, membr까지 삽입 막 (3D 조직 인서트가있는) 잘라메탄은 블레이드에 아래로 평평.
- 적절하게 레이블 균질화 튜브에 블레이드에서 (삽입 막과 함께) 조직을 전송하고 튜브에 뚜껑을 나사를 흔들어 소용돌이.
- -80 ° C에서 드라이 아이스와 저장소에 샘플을 동결 또는 추출물에 RNA를 계속합니다.
, 이전 RNA의 추출에 무작위 디자인 (해당되는 경우)에 따라 모든 관과 열 레이블을 참고. 제조업체의 권장 사항에 따라 모든 시약을 준비하고 -80 ° C의 냉동고에서 샘플을 꺼내 그들이 완전히 해동 될 때까지 얼음을 녹여.
- 균질화
- 45 초 동안 6000 Hz의에 악기를 균질화와 갈기 샘플. 시료가 적절하게 균질화 아니며 RT에서 5 분 동안 샘플을 떠나면 반복한다.
- 10 ~ 15 초 동안 시료와 소용돌이에 140 μL의 클로로포름을 추가합니다.
- 위상 잠금 튜브에 균질화 튜브에서 뜨는을 전송하고에 흔들1,400 rpm으로 실온에서 2 분 thermoshaker.
- 또한 4 ° C에서 15 분 동안 12,000 XG에서 RT에서 2 분 동안 샘플과 원심 분리기 샘플을 배양한다.
- QIAcube에서 RNA 침전, 세척, 서스펜션 및 정제.
- 새로운 2 ML 튜브에 위 수성 위상을 전송합니다.
- , 제조 업체 프로토콜 시트에 따라 추출 로봇에 필요한 모든 시약을로드 적절한 프로토콜을 선택, 용출 볼륨 (30 μL)을 설정하고 추출 로봇을 실행합니다.
- 실행이 완료되면, 로터 어댑터를 제거하고 추가 분석 또는 장기 저장을 위해 -80 ° C에서 39 ° C에서 용출 즉시 튜브를 유지한다.
- 분리 된 RNA의 품질 관리
- 제조업체의 지시에 따라 UV 판독기를 사용하여 격리 된 RNA의 양을 결정한다.
- RNA의 품질 및 사용 RNA 무결성 체크 랩 온어 칩 및 UV 리더, ACC 미세 유체 - 겔을 기반제조사의 지시에 ORDING.
7. 마이크로 어레이 워크 플로우
주의 : 아래에 기재된 방법은 복합체의 사용에 RNA의 제조로부터 시작 Affymetrix의 3 '유전자 발현 카트리지에 혼성화 할 대상 합성에 사용하는 어피 메트릭스 진칩 고효율 3'IVT 익스프레스 키트를위한 방법에 초점을 맞추고 액체 핸들링 시스템 (예., 피펫은, 희석 분배, 또는 통합).
- 준비하기
- 배치 효과를 피하기 위해 샘플을 랜덤. 일괄 처리에 의해 처리 된 샘플의 수는 하나의 양극 (상업용 인간 보편적 기준 RNA)과 하나의 음 (의 RNase없는 물) 제어를 포함 배치 당, 1-96이다.
- 의 RNA 분해 효소가없는 물을 3 μL에 총 RNA 100 NG를 사용하여 대상의 합성을 시작합니다. 총 RNA 100 NG를 들어, 16 시간의 배양 시간을 사용합니다.
- RNA 증폭
- P 준비OLY-A RNA 스파이크에 폴리 제어 희석 버퍼와 폴리 RNA 주식의 일련의 희석에 의해 제어 솔루션 :
- 희석 1의 경우, 36 μL 희석 버퍼에 2 μL 폴리 -A 제어 주식을 준비합니다.
- 희석 2의 경우, 희석 버퍼의 98 μL로 희석 한 2 μl를 준비합니다.
- 희석 3, 희석액 196 μL에 희석 2의 4 μl를 준비합니다.
- 희석 4, 희석액 180 μL에 희석 (3) 20 μl를 준비합니다.
- 33.3 NG / μL의 농도를 얻을 수 RNAse가없는 물에서 RNA를 희석.
- 바로 96 웰 플레이트에서 총 RNA 샘플 3 μL에 폴리 -A 대조액 2 μL를 추가한다. 이 단계는 액체 핸들링 시스템에 의해 수행된다.
- 액체 처리 시스템과 대상 합성을 준비합니다. 로봇에 접시를 놓습니다. 갑판에 필요한 모든 시약 및 실험 실용를 놓습니다. 로봇 appropriat 제조하여 절차를 시작합니다전자 mastermixes는 자동화 된 원격 제어 PCR 블록의 샘플을 배양합니다.
- 먼저 품질 관리 검사 : 증폭 프로세스의 제어
- 아르나의 품질이 만족할 경우, 각 샘플 조각 5X 완충액 8 μL를 (이 단계는 액체 핸들링 시스템에 의해 수행되는)에 의해 추가 단편화 단계를 수행한다. 그렇지 않으면, 다시 RNA에서 시작 이전 단계를 수행합니다. 즉시 세분화 ARNA를 사용하거나 C ° (또는 -70 장기 저장을위한 ° C) -20 원액과 조각 아르나를 저장합니다.
- 분열의 효율성을 확인하기 위해 마이크로 유체 젤 기반 시스템에 접시 및 전송 1 μL에 무작위로 12 샘플을 선택하여 두 번째 품질 관리 분석을 수행합니다.
- P 준비OLY-A RNA 스파이크에 폴리 제어 희석 버퍼와 폴리 RNA 주식의 일련의 희석에 의해 제어 솔루션 :
- 하이브리드 절차
- 칩 바코드를 스캔 및 지침에 따라 제조업체의 소프트웨어에서 각각의 샘플을 등록합니다.
- 같은 혼성화 믹스를 준비하나의 반응은 다음과 조각 및 표시 아르나의 33 μL에 추가 : 제어 올리고 뉴클레오티드 B2의 4.2 μL (3 ㎚), 20 배 진핵 생물의 하이브리드 컨트롤의 12.5 μL, 100 %의 25 μL DMSO 2 배 하이브리드 버퍼 125 μL와 216.7 μL의 최종 부피에 대한 H 2 O 50 μL
참고 : 잡종, 세척 및 샘플을 처리하기 전에 양극과 음극 컨트롤을 검색합니다. - 하이브리드 세척 및 얼룩 키트에 포함 된 사전 하이브리드 믹스 200 μL와 배열을 사전 젖은.
- 오븐에 45 ° C로 설정 하이브리드의 칩과 10 분 60 RPM을 놓습니다.
- 한편, 99 ℃에서 5 분간 PCR 블록 플레이트 (최종 칵테일 혼성화 믹스를 함유)를 변성하고 5 분 동안 45 ° C.
- 배열에서 사전 하이브리드 믹스를 제거하고 하이브리드 칵테일 대상 200 μL (칩 당 하나의 샘플)로 교체합니다.
- hybri으로 배열 배치dization 오븐 60 RPM의 회전 속도로 16 시간 동안 45 ° C (O / N)로 설정한다.
- 세탁과 염색
- 소프트웨어 메뉴 표시 줄에서 "유체"를 실행합니다. 다음, 모든 모듈에 Prime_450 프로그램을 선택 - 유체 대화 상자에서이자 (4 1)의 모듈을 선택합니다. 병 (500 ml)에 한 MilliQ 물뿐만 아니라, 병 (200 ㎖)의 병 (400 ml) 및 B 용 세척 완충제로 세척 완충제 용 튜브를 놓는다.
- 그 후, LCD 화면의 지시 사항을 따르십시오. 바늘을 올려 600 μL 얼룩 칵테일 1 (SAPE 솔루션 믹스) 및 위치 # 1과 # 2의 마이크로 원심 튜브를 포함하는 600 μL 얼룩 칵테일 2 (항체 솔루션 믹스)를 배치, 위치 # 3에서 완충 용액을 잡고 900 ㎕의 배열입니다.
- 오븐에서 O / N 배양 한 후, 각 모듈에 대한 권리 칩을 할당 칩에서 칵테일을 대기음 250 μL 세척 버퍼 A.와 마이크로 어레이를 작성하여 FS450-001 프로토콜을 선택하고 각 개월을 실행dule은, 화면의 지시에 따라. 이 과정은 90 분 동안 지속됩니다.
- LCD 스크린은 "배출 카트리지"라는 메시지를 표시하면, 칩을 분리하고 기포가 있는지 검사한다. 기포가 존재하는 경우, 어레이 들고 완충액으로 완전히 배열을 채운다. 스캐너의 누출을 방지하고 스캐너에 적재하기 전에 마이크로 어레이 창을 청소하는 격막에 스티커를 적용합니다.
- 검색.
- 스캐너를 따뜻하게. 스캐너의 자동 로더에 칩을 넣고 스캔을 시작합니다.
주 : 칩 당 ~ 12 분 후, 칩당 .CEL 파일이 생성된다. - 화상을 확인하고, 프로브 셀을 식별하기 위해 스폿 (필요한 경우)를 정렬 격자.
참고 : 데이터 집합 (수탁 코드 = E-mtab 파일-1721) Arrayexpress에 제출되었습니다.
- 스캐너를 따뜻하게. 스캐너의 자동 로더에 칩을 넣고 스캔을 시작합니다.
영향 평가 8. 네트워크 기반 시스템 생물학 분석
- 마이크로 어레이 데이타 처리.
참고 : 데이터를 처리D 채점 방법은 R 통계적 환경 버전 2.14을 이용하여 구현 하였다.- R 18 세션을 열고 명령을 실행하여 설치 affy 19 gcrma 및 affyPLM 패키지로드 : 라이브러리 (affy)> 라이브러리 (gcrma)> 라이브러리 (affyPLM)
- 명령을 실행 원시 데이터 파일을 읽어 data.affybatch <-ReadAffy ( "CEL 파일이 저장되어있는 폴더의 경로")
- 명령을 실행하여, gcrma 패키지를 사용하여 프로브 집합 식 값을 생성하는 배경 보정 및 분위수 사범을 빼기 : eset.norm <-gcrma (data.affybatch)
- 품질 관리.
- 명령과 함께 RNA 분해 플롯을 생성 : ℃, <-AffyRNAdeg (data.affybatch)
- 기울기 = 도의 $ 슬로프 : 명령을 실행하는 RNA 분해 경사의 계수를 추출
- 기울기 계수 플롯 가능한 아웃 라이어를 식별합니다.
- 다음 명령을 실행 NUSE과 RLE 플롯을 생성 : Pset에를 <-fitPLM (data.affybatch)> RLE (Pset에)> NUSE (Pset에).
- 생성 박스 플롯의 일부가 특이점 인 경우 식별 : 배열 특이 간주하는 경우 다른 배열 일탈 아래 정의 QC 3 메트릭 중 적어도 2 :
- 도의 $의 기울기는 평균 도의 $ 슬로프에서 다른
- NUSE 플롯 : 상위 분위는 0.95 이하로 떨어질 또는 1.05 위의 낮은 분위 경우 즉, 상자 그림은 전적으로 1.05 이상 또는 전체가 0.95 이하이면 배열이 특이 간주됩니다..
- 플롯 RLE : RLE 분포의 중앙값 0.1 -0.1보다 크거나보다 작은 경우 특이 배열로 간주된다. - 어레이 특이점으로 식별되면, 폐기하고, 단계 8.1.2에서 다시 시작한다.
- 관심있는 대조를위한 특정 데이터에 대한 전반적인 선형 모델을 장착한다 (예., "치료"및 "제어"조건의 비교) 일 수 작고에 마이크로 어레이에 설정된 각 프로브에 대한 원시 P 값을 생성하기그녀는 Limma 패키지 Benjamini-호흐 베르크 절차를 사용하여 조정했다. (20)에 설명 된대로 추가 분석을위한 유전자의 대표로 유지하기 위해 유전자 당 탐침 기를 선택합니다.
주 : 실험 설계에서 차단 인자 (노광 판)은 데이터 처리를위한 모델 차지 하였다.
- 네트워크 기반 분석.
주 : 여기에 구현되는 방법은 마틴 등의 논문에 자세히 설명되어있다. (BMC 생물 정보학의 개정).- 관심의 각 페어의 비교를 위해, 계산 된 (log2-)에서 시작 (단계 8.2에서) 네트워크에서 각 유전자에 대한 변경 (제어 대 처리)을 접습니다.
- 서명 (I ~ j) w (I, J) 노드 i와 j 사이의 (I, j) w 중량의 에지가 존재하는 경우 - L로 정의 네트워크 서명 라플라시안 행렬 L (I, J)를 = 구한다 L (I, J) = ℃에서 (i)는 i와 L (I, J) = 0의 다른 가중 정도이다. i와 j는 백본 및 w (I, J) = 1의 경우 (I, J) w 무게는 1 동일 / n를 내가 백본 노드를하고있는 경우 J는 n 개의 neighb 중 하나입니다성적 증명서 층 ORS.
- L3는 백본 노드 L의 부분 행렬이고 L2가 그 행 백본 노드 전사 층 노드 및 열에 대응 L의 서브 행렬이다 = L3-1L2Tx F로 백본 점수를 계산
- 모든 에지 징후 반전 백본 네트워크에 의해 정의 된 네트워크, 서명 라플라시안, Q를 계산한다.
- NPA = fTQf에 의해 NPA 점수를 계산합니다.
- 신뢰 구간 백본 에지 순열 P 값 및 전사 층 전치 p- 값을 계산한다.
주 :. (예, 실험군 샘플 사이의 생물학적 변이) 실험 오차를 고려 NPA 점수의 신뢰 구간에 더하여, 컴패니언 통계 설명 생물학 NPA 점수의 특이성을 설명하는 도출 된 네트워크. NPA는 배 변경의 차 형태이기 때문에, 그 차이는 계산 된 배 변화 추정 V를 기반으로 할 수 있습니다ariances. 신뢰 구간은 후속 중심 극한 정리 (central limit theorem)를 이용하여 유도된다. 두 순열 테스트 결과가 모델의 기본이되는 증거 (예. 유전자 접이식 변경)에 해당한다면 P 수치에 *로 표시 순열 P 값 (O로 이어지는, 평가하기 위해 이에 첫째, 21 구현 된 -value <0.05). 둘째, 네트워크의 "원인과 결과를"층이 상당히 네트워크 섭동의 진폭에 기여하고 있는지 여부를 평가하기 위해 (도면에 K *로 표시 할 때 P 값 <0.05). - 신뢰 구간은 0을 포함하고 두 개의 전치-P 값 <0.05 없으면 처리의 영향으로 네트워크를 생각해 보자.
- NPA 점수의 80 %를 기여하는 백본의 핵심 노드로 정의 된 주요 노드를 계산합니다.
Representative Results
아래에 설명 된 결과에서의 Organotypic 조직 건강, 금연로부터 격리 차 인간 상피 세포, 백인 기증자이었고, 섬유 아세포 (15)를 사용하여 재구성 하였다.
3D 기관지와 코 조직 모델
체외 기관지와 코의 Organotypic 모델에서 세포 수준 인간의 호흡기 상피 세포 (그림 2)에서 유사.
CS 노출
비강의 Organotypic 기관지 조직 모델 반복적 공기 - 액체 계면에서 주류 CS에 노출 될 수있다. 여기에 도시 된 결과를 사용 흡연 노출 실험 절차는도 1에 도시되어있다.
섬모 박동의 기록
속눈썹 박동이 동영상에 도시 된 바와 같이 공기에 노출 된 조직에서 기록되었다. CS 노출은 섬모 박동 주파수의 감소와 관련이 : 주위에 관찰 강한 피크를노출 노출 된 가짜 및 이전 4 Hz로는 CS 노출 (그림 3) 이후 더 이상 관찰되지 않는다. 이 감소 된 주파수는 점액과 감염원 (22)를 제거 덜 효율적 치는 속눈썹을 만들 것입니다.
봉사자 및 CYP1A1 / 1B1 활동의 측정
봉사자는 조직이 여전히 기능에 마지막 노출 후 48 시간을 측정 하였다. 도 1에 도시 된 바와 같이, CYP1A1 / 1B1 활성은 노출 종료 후 48 시간을 측정 하였다. CS에 노출 된 조직에서 티에르 값이 크게 차이가 없었다 연기의 더 큰 세포 독성 효과가 있다는 것을 확인하는 공기에 노출 된 조직에 비해 이 농도. 48 시간 후 - 노출에서, 조직의 CYP1A1 / 1B1 활동은 약간 노출 (그림 4) 다음과 같은 조직의 방어 메커니즘의 완만 한 증가를 나타내는 증가 하였다.
유전자 발현 양상 및 네트워크 기반 시스템 양방향ology 접근법 생체이 대사의 변화에 CS 노출의 영향을 연구
조직을 48 시간 노출 후 시점에서 수집 하였다. 이어서, 마이크로 어레이 분석은 유전자 발현 프로필 및 CS- 공기에 노출 된 조직을 생성하기 위해 수행 하였다. 생체 이물 대사에 CS 노출의 영향은 유전자 발현 양상에서 활용 네트워크 기반 시스템 생물학 접근 방식을 사용하여 조사하고로 이전 (15) 보도했다. 네트워크 기반 시스템 생물학 접근 방식을 사용하여 생체 이물 대사 네트워크 모델의 백본 노드의 수준에서 CS 노출에 영향을 멋지게 (그림 5) 시험 관내 사이 및 생체 데이터 세트의 상관 관계를 보여줍니다. 대조적으로, 각각의 유전자 발현 변화의 차원에서, 열악한 상관 관계 관내 (대 비 흡연자가 흡연) 및 생체 내 (공기에 노출 된 노출 대 CS) 사이에서 관찰되었다.
의 Organotypic 기관지 조직 모델 CS의 반복 노출의 그림 1. 도식 절차 약어 :. CYP, 사이토 크롬 P450s; CS, 담배 연기, 봉사자, transepithelial 전기 저항.
도 2의 Organotypic 비강 기관지 상피 조직 배양 모델. 만화 공기 - 액체 계면에서 기관지 (A)와 코 (B) 조직 배양 삽입물을 도시. 이전 15보고 체외 모델은 헤 마톡 실린 및 에오신 염색 된 세포의 꼭대기 층에 표시된 섬 모세포 (기관지에 대한 C, 비강 용 D)를 포함. 모델은 중요 아세포와 공동 배양 하였다 성장 및 상피 세포의 분화를 위해 (화살표로 표시). 기도 혈통 마커의 얼룩 : 이전에 15보고 P63 (코 기관지에 대한 E, F)와 MUC5AC (기관지에 대한 G는 코에 대한 H)가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 섬모 치는 주파수. 섬모 박동 주파수 (CBF)는 전 및 노출 후 공기에 노출과 문화 측정 하였다. CBF는 CS 노출 후 본 낮게 나타났다 (두 삽입 대표 결과가 복제 1 (R1로 표시) 및 복제되는 2 (R2)).
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그림 4. CYP1A1 / CYP1B1 활동과 봉사자의 측정. 왼쪽 pannels는 기관지 (A)과 코 (B) 조직 모델에서 CYP1A1 / CYP1B1 활동을 나타냅니다. 오른쪽 패널은 기관지 (C)과 코 (D) 조직 모델 티에르 측정을 나타낸다. SD ± 수단이 표시됩니다. 요약 : CS, 담배 연기, CYP 시토크롬 P450; 봉사자, transepithelial 전기 저항; RLU, 상대 luminescense 장치.
생체이 대사의 맥락에서 CS 노출의 영향 평가 그림 5. 네트워크 기반 시스템 생물학 방법. 유전자 발현 수준의 변화는 생체이 대사 네트워크 모델의 백본 노드의 활성화 (A)를 계산하는 데 사용 된 강한> 이전 게시 (15)에보고. 오른쪽 그림은 NPA 방식을 사용하여 "차동 네트워크 백본 값」라고도 백본 노드의 정량의 개념을 도시한다. 청색 타원은 백본 노드의 활성을 나타낸다 (예., 기능 층) 및 녹색 공은 유전자의 발현을 나타낸다 (예., 전사 층). 의 Organotypic 기관지 조직에서 CS 노출의 영향 GSE16008 (노출 후의 48 시간에서 하 비갑개를 burshing에 의해 기관지와 코 점막 상피에 의해 수집 된 인간 기관지 상피에 흡연의 것과 비교 하였다 (체외은 공기에 노출이 대 CS는 노출) ) (생체, 흡연자 대 비 흡연자의) (B). 인 세트는, 유전자 발현의 상관 관계는 시험 관내 및 생체 내 사이에 데이터 셋 변경한다. 요약 : CS, 담배 연기, NPA 네트워크 교란 진폭.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기서는 반복 CS 노출의 영향을 평가하는 인간의 Organotypic 기관지 비강 조직 모델의 적용 가능성을 보여 주었다. 동물 실험에 대한 대안으로, 노광 시스템의 수는 (예., Vitrocell, Cultex, ALICE 등) 시험관 내에서 에어로졸 노출 독성 평가를 위해 개발되었다. 이러한 노광 모듈도 본 연구 등 공수 오염 물질, 공기 중의 입자, 나노 입자의 독성 학적 평가를 위해 이용 될 수 있고, 우리는 더 큰 규모의 실험 간의 낮은 가변성을 허용 동시에 48 가지의 다른 샘플들까지 수용 할 수 Vitrocell 시스템을 사용 치료. 시험관 내에서 모든 에어로졸 노출, 조직 배양 오염의 위험은 저감 그 실험에 걸쳐 조직 배양의 취급에주의를 요구하는 주요 위험 남아있다.
E 중 미량 천칭에 실시간 입자 침착을 측정xposure 실험은 노출 시스템에서 생성 된 CS 량은 기대에 부합하는 것을 모니터링 할 수 있습니다. 설정해서 온라인 측정을 정확하게 노광 전에 것은, 예 critial 때문에 마이크로 저울 (cm 2)의 영역의 차이, 또한 0으로 스케일을 설정하고, 측정 된 입자의 증착의 정확성 조직 배양 인서트 (0.33 cm 2), 우리는 배양 인서트의 영역에 최종 계산을 조정 된 미량 천칭에 증착 단지 33 %가 배양 인서트의 실제 증착을 반영한다.
꽉 접합 장벽 기능을 확인하고 상피 층의 중단을 평가하기 위해 봉사자의 측정은 우리가 여기에보고 구현하기 비교적 쉬운 과정이다. 비강 및 기관지 조직 모델 점액 생산 산재 배 세포를 포함하기 때문에, 정점 세척 봉사자 MEAS 전에 행할 필요하여 연산. 정점 세척 중요하므로 점액층의 존재 및 CS 노출의 영향 interferring 두께 캔 바이어스 티에르의 측정 가변성. 이 개념은 Hilgendorf 및 카코-2 세포의 투과성이 점액을 생산하는 술잔 세포 라인 HT29 (23)와 공동 배양에 의해 영향을 받았다있는 동료들에 의해보고 된 것과 일치한다. 바로 노출 전에 혀끝의 세척 CS에 대한 조직 반응을 방해 할 수 있기 때문에 점액 전에 봉사자 측정에 씻어해야합니다. 따라서, 측정은 노출 3 일 전에 수행 및 노출되기 직전되지 않습니다.
우리는 활동이 완만 한 CS 증가되었지만 CYP1A1 / CYP1B1 활동이 CS 노출 다음의 Organotypic 문화 모델에서 측정 될 수 있음을 보여 주었다. 이 약한 신호는 CYP1A1 / 1B1 기판의 장기간 배양에 의해 증폭 될 수있다 (예., 루시페린 - CEE), 예컨대 대24 시간 (데이터 미기재). 본 연구에서 CYP 활성 측정의 한계 중 하나는 효소 활성에 변화가 영향을받지 않도록 CYP 단백질 수준 또는 미래 연구를 위해 고려 될 수있는 세포 수로 정규화 결석 단백질 수준 또는 세포 수의 변화 중 하나에 의하여.
우리는 CS 노출은 비강과 기관지 조직 모델을 모두 제치고 섬모를 억제 보도했다. 비슷한 관찰 다양한 포유 동물 및 비 - 포유 동물 모델 (12)에서 수행 하였다. 섬모가 측정 치는 조직을 유사한 방식으로 처리하고 처리하도록 할 변화 매체가 구현되는 경우, 모든 샘플에 적용되어야한다, 예를 들면, 중요하다. Sutto와 동료들은 pH가 주파수 (24)를 때리고 포유 동물의 섬모에 영향을 보도했다. 따라서, 다른 compunds / 혼합물의 pH로 처리 한 세포 사이의 주파수를 치고 비교할 때조정은 모양체 박동 측정의 변동을 최소화하기 위해 고려되어야한다. 모양체 고해 주파수가 감소함에 따라 온도 강하 더욱이, 측정이 수행되는 온도는 중요하다. 본 연구에서 사용 된 온도, CO 2, 조습 갖추고 이러한 변화, 탑 스테이지 배양기에 의한 변동을 최소화. 그럼에도 불구하고, 우리는 CS 노출 후 기관지 조직에 주파수를 치는 섬모는 섬모 구타 노출 후 매우 방해 권리가 있음을 시사 매우 변수 (예., 하나 삽입 증가하고 다른 삽입 감소)이라고 관찰했다. 대조적으로, 우리는 비강 조직의 반응이 더 민감하고 일관성이 있음을 시사 CS 노광 후의 비강 조직에서 측정 모양체 비팅 주파수의 유무를 관찰했다. 이 비강 조직으로 독을 제거하기 위해 낮은 용량을 가지고 있음을 보여주는 이전의 출판물과 일치한다기관지 (25)와 비교.
마지막으로, 우리는 CS에 노출의 Organotypic의 기관지와 코 조직 모델에서 프로파일 유전자 발현이 생체 이물 대사에 CS의 영향을 설명 할 수 있음을 보여 주었다. 이전 출판 (15)에 자세히 설명한 바와 같이 흥미롭게도, CS에 노출 체외 모델에서 관찰의 Organotypic의 기관지에서 생체 이물 대사 변경과 코는 흡연자의 생체 내 상황의 유사. 유전자 발현 분석을 위해, 로봇 기기를 사용하면 높은 처리량 분석을 가능하게한다. 또한, 자동 핸들링 로봇은 상기 유전자 발현 결과의 일관성 및 정확성을 증가시킨다. 그럼에도 불구하고, 조직 샘플의 신속한 수집 RNA 추출 중에 RNA의 분해를 방지하는 것이 중요했다. RNA 프로세싱 및 여기서 설명 transcriptomic 접근법은 또한 생체 조직 샘플에 적용될 수있다.
Disclosures
이 연구는 필립 모리스 인터내셔널 (Philip Morris International)에 의해 투자되었다.
Acknowledgments
저자는 원고의 자신의 검토를 위해 모리스 스미스와 Marja Talikka에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MucilAir-human fibroblasts-bronchia | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/ | |
| MucilAir Culture Medium | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/ | |
| VITROCELL | VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany | http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R= | |
| 3R4F reference cigarette | University of Kentucky | http://www2.ca.uky.edu/refcig/ | |
| 30-port carousel smoking machine SM2000 | Philip Morris, Int. | ||
| CiliaMetrix camera and software | La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland | ||
| Leica DMIL microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | ||
| LED light source | Titan Tool Supplies, Buffalo, NY | ||
| Chopstick Electrode STX-2 | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/ | |
| EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/ | |
| Luciferin Detection Reagent | |||
| MagNA Lyser Instrument | Roche | http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion= | |
| QIAcube | Qiagen | 9001882 | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/ | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106 | |
| Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit | |
| Scanner 3000 7G | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G |
References
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