Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Konsekvensutredning av gjentatt eksponering av organotypiske 3D Bronkitt og Nasal Tissue Kultur Modeller til Whole sigarettrøyk

Published: February 12, 2015 doi: 10.3791/52325
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological Systems Research, Philip Morris International R&D, Philip Morris Products S.A.

Protocol

1. Kultur av organotypiske Tissue Bronkial Culture Model

Merk: Rekonstituert vevsmodeller ble kjøpt som innstikk som er klar til bruk. Alternativt kan kulturen utvikles fra primære celler, som beskrevet for eksempel ved Karp og kolleger 16. Etter mottak av vev i steril innpakning, alltid håndtere de menneskelige organotypiske vev under sterile forhold.

  1. Legg 0,7 ml forvarmet (37 ° C) analysemedium til hver brønn av en ny steril 24-brønners plate under panseret.
  2. Fjern emballering av vevet under panseret, og overfører vevskultur innsatsene til nye stilles 24-brønners plate (beskrevet i trinn 1.1. Ovenfor).
  3. Vedlikeholde og kulturen vev i en inkubator ved 37 ° C (5% CO2, 90% luftfuktighet).
  4. Sett på medium hver 2 dager.
  5. Under en middels endring, undersøke vev under et lysmikroskop for å sikre at de er de contaminatipå-fri, og at det ikke er noen lekkasje av medium.

2. sigarettrøyk (CS) Eksponerings bruker en In Vitro Eksponeringssystem

  1. Tre dager før eksperimentene eksponerings, vasker den apikale side av vevskultur med 200 ul av kulturmediet.
  2. På dagen for eksponering, hvis målingen av stråle juling er planlagt før eksponering, håndtere vev for ciliary juling måling som beskrevet i § 3.
  3. Pre-varme klimatiske kammeret i in vitro eksponering system og dyrking basismodulen til 37 ° C. Fyll dyrking base modul med 17,5 ml medium per rad.
  4. Fjerne vev fra inkubatoren og plassere dem under panseret å overføre vevskultur innsatsene fra kulturplaten til dyrking understellsenheten av in vitro eksponering system. I tillegg omfatter dyrking understellsenhet med et glasslokk.
  5. Overføre vev i det klimatiske kammer av in vitro eksponering system for eksponering for mainstream CS.
  6. Ved in vitro-eksponering systemet er utstyrt med en mikrovekt, oppsett kvartskrystall mikrovekt før kjøring av eksponeringen for å måle sanntidspartikkel avsetning av røyk på en kvartskrystall mikrovekt ved hjelp av programvare.
    1. Erstatte krystaller i mikrovekten moduler knyttet til hver rad i fortynning / distribusjonssystem.
    2. Koble mikromodulen til mikro programvare. Angi omfanget av målingen til null i programvaren.
  7. Eksponere vevet i henhold til den eksperimentelle prosedyre (f.eks., Som i figur 1)
    Merk: Før eksponering, referanse sigaretter (3R4F) er betinget mellom 7 og 21 dager under regulerte betingelser ved 22 ± 1 ° C og relativ fuktighet på 60 ± 3% i henhold til ISO-standard 3402 17.
    1. Generere sigarettrøyk (f.eks., Fra 3R4F sigaretter) med en 30-port karusell røyking machine ifølge Health Canada Intense regime: røyke sigaretter til en standard rumpe lengde, dvs. ca 35 mm på 55 ml puff over 2 sek, to ganger ett minutt og åtte sekunder pumpe eksos tid.
      Merk: Hvis det er nødvendig, fortynne mainstream CS slik at dosen ikke er for giftig. I resultatene som presenteres her, ble røyk fortynnet til 16% (vol / vol).
    2. Bruke 60% fuktet-luft for kontrollprøvene (luft-eksponert).
    3. Expose vev for 6-7 min (ie., En sigarett eller luft eksponert) i in vitro eksponering system
    4. Sett vevet tilbake i inkubatoren ved 37 ° C (5% CO2, 90% luftfuktighet) i 1 time.
    5. Gjenta trinn 2.7.3 og 2.7.4 tre ganger.
  8. På slutten av eksponeringen eksperimentet, stopper mikrovekten programvare. Programvaren vil generere en fil som inneholder alle målingene sammen med en grafisk gjengivelse av partikkelavsetning.
  9. Overføre tilbake vev fra dyrking base modulen til kulturplate. Plasser vevet tilbake i inkubatoren ved 37 ° C (5% CO2, 90% luftfuktighet) til målingene for de forskjellige endepunktene på den spesifikke etter eksponering tidspunkter.

3. Måling av Ciliary Beating

Merk: Per eksperimentelle plan (figur 1), rekord ciliær slo før eksponering og direkte etter eksponering.

  1. Fjern de vevskulturplater fra inkubatoren og la dem under panseret ved RT i 30 min for å stabilisere flimmerhårene juling.
  2. Plasser vev under lysmikroskop koblet til CiliaMetrix Software.
  3. Spill filmen og frekvens (i Hertz) av ciliary juling. Måle frekvensen hver 3 sek i 1 minutt.
  4. Returnere vev tilbake til inkubatoren ved 37 ° C (5% CO2, 90% luftfuktighet).

4. transepitelial Elektrisk Resistance (Teer) Måling

Merk: Målingen av teer gjennomføres tre dager før og 48 timer etter eksponering under panseret i henhold steril tilstand ved hjelp av Chopstick elektrode (STX-2) koblet til en voltohmmeter.

  1. Tilsett 200 mL av dyrkningsmedier til den apikale overflaten av de menneskelige bronkial vev.
  2. Slå på EVOMX maskinen; vaske elektroden med en 70% etanolløsning.
  3. Vask elektroden med kulturmediet.
  4. Måle motstanden (Ω) ved å sette elektroden i mediet på den apikale side av vevskultur uten å berøre vev.
  5. Gjenta trinn 4.4 fem ganger for å få quintuplicate målinger.
  6. Etter at målingene, mediet forsiktig fjerne fra den apikale side av vevkulturer ved hjelp av en aspirator.
  7. Returner vevskulturer til inkubator ved ved 37 ° C (5% CO2, 90% luftfuktighet) for dyrkning.

5. cytokrom P450 (CYP) 1A1 / 1B1 aktivity

  1. Før starten av studien, forberede luciferin deteksjonsreagens ved å overføre hele innholdet i flasken av riktig tilberedning buffer til den gule flasken med luciferin deteksjonsreagens (i henhold til produsentens instruksjoner). Butikk porsjoner av 2 ml ved -20 ° C i maksimalt en måned.
  2. For 48-timers post-eksponeringstiden, inkuberes vevene i 48 timer følgende CS eksponering ved 37 ° C.
  3. Varm Luciferin deteksjonsreagens til RT.
  4. Inkuber vev innsatser i 3 timer, eller O / N med luciferin-CEE substrat (fortynnet til 1:50) i basaldyrkningsmedium.
  5. Overføring 50 ul av kulturmediet fra hvert vev sette til en 96-brønners plate ugjennomsiktig hvit luminometer ved RT.
  6. Tilsett 50 pl av luciferin deteksjonsreagensen til hver brønn for å igangsette en luminescerende reaksjon.
  7. Inkuber platen ved RT i 20 min.
  8. Les luminescens bruker en luminometer.
    Merk: For detluminometer, bruk en integrasjon tid på 0,25 til 1 sek per brønn som en retningslinje.

6. RNA-ekstraksjon.

  1. Før oppsamling av 3D organotypiske vev innsatser, forberede 1) en boks med tørris, 2) tilstrekkelig mengde av bladene (en per 3D innsats), 3) kald PBS uten kalsium og magnesiumklorid, 4) en 25 ml glass-pipette, og 5 ) sterile glass nåler for aspirasjon.
    1. Merk rør fylt med keramiske perler for å homogenisere solide cellulære prøver og legge 700 mL av Qiazol.
    2. Slå på aspirasjon maskin.
    3. Samle plate av 3D organotypic vev innstikk fra inkubatoren.
    4. Vask hver innsats på plate 3 ganger med kald PBS. Mellom vaskingene, aspirere PBS med glassålen. Etter den tredje vask, til å suge med PBS og dekkplaten hindre uttørking av innsatsen.
    5. For hver innsats fra platen, kuttet ut innsatsen membran (som 3D vev innsats ligger) til Membrane ligger flatt ned på bladet.
    6. Overføre vev (sammen med innsatsen membran) fra bladet til homogenisere tube riktig merket og skru lokket på røret, riste den og virvle det.
    7. Fryse prøven i tørris og oppbevares ved -80 ° C eller gå videre til ekstrakt RNA.
      Merk: Før utvinning av RNA, merke alle rør og kolonner i henhold til randomisering design (hvis aktuelt). Forbered alle reagenser i henhold til produsentens anbefalinger, og ta ut prøver fra -80 ° C fryser og tiner dem på is inntil de er helt tint.
  2. Homogenisering
    1. Grind prøver med homogenisere instrument på 6000 Hz for 45 sek. Gjenta om prøvene er ikke riktig homogenisert og la prøvene i 5 min ved RT.
    2. Legg 140 ul kloroform til prøven og vortex i 10-15 sek.
    3. Overfør supernatanten fra homogenisere røret til en faselåst rør og riste på enthermoshaker i 2 minutter ved 1400 rpm og RT.
    4. Ytterligere prøver inkuberes i 2 minutter ved romtemperatur og sentrifugeres prøvene ved 12 000 xg i 15 min ved 4 ° C.
  3. RNA nedbør, vask, oppheng og rensing i Qiacube.
    1. Overfør den øvre vandige fase i en ny 2 ml rør.
    2. Last alle nødvendige reagenser i utvinning robot i henhold til produsentens protokoll ark, velger du den aktuelle protokollen, stiller elueringsvolumet (30 pl) og kjøre utvinning robot.
    3. Når kjøringen er ferdig, fjerner rotor adaptere og holde elusjonstester rør umiddelbart ved 4 ° C for videre analyse eller ved -80 ° C for langtidslagring.
  4. Kvalitetskontroll av den isolerte RNA
    1. Bestemme mengden av den isolerte RNA ved hjelp av en UV-leser i henhold til produsentens instruksjoner.
    2. Sjekk kvaliteten på RNA og RNA integritet ved hjelp av mikrofluid-gel-basert lab-on-a-chip og en UV-leser, according til produsentens instruksjoner.

7. Mikromatrise arbeidsflyt

Merk: Fremgangsmåten beskrevet nedenfor fokuserer på fremgangsmåte for Affymetrix Genechip høy gjennomstrømning 3'IVT Express Kit, som brukes for target-syntese for hybridisering på Affymetrix 3 'genekspresjon patroner med start fra fremstillingen av RNA til bruken av et kompleks væskehåndtering system (f.eks., pipettering, fortynning, dispensering, eller integrere).

  1. Forberedelse
    1. Random prøver å unngå batch effekter. Antall prøver behandlet av batcher er fra 1 til 96, inkludert en positiv (Commercial Menneskelig universell referanse RNA) og en negativ (RNase fritt vann) kontroll per batch.
    2. Start target-syntese ved anvendelse av 100 ng av total RNA i 3 ul RNase-fritt vann. For 100 ng av total RNA, bruke en 16 timers inkubasjonstid.
  2. RNA Amplification
    1. Klargjør Poly-A RNA spike-kontroll løsning av en serie fortynning av Poly-A RNA Stock med Poly-A Kontroll fortynningsbuffer:
      1. For fortynning 1, forberede 2 ul polyA kontroll lager i 36 mL fortynningsbuffer.
      2. For fortynning 2, forberede 2 mL av fortynning 1 i 98 mL av fortynningsbuffer.
      3. For fortynning 3, forberede 4 mL av fortynning 2 i 196 mL av fortynningsbuffer.
      4. For fortynning 4, forberede 20 mL av fortynning 3 i 180 mL av fortynningsbuffer.
    2. Fortynn RNA i RNAse fritt vann for å få en konsentrasjon på 33,3 ng / mL.
    3. Tilsett 2 ul av polyA kontrolloppløsningen til 3 pl av totalt RNA prøven direkte i en 96-brønners plate. Dette trinnet blir utført ved væskehåndteringssystemet.
    4. Klargjør flytende håndteringssystem og mål syntese. Plassere platene på roboten. Plassere alle de nødvendige reagenser og laboratorie-utstyr på dekk. Roboten vil starte prosedyren ved å forberede appropriate mastermixes og inkubere prøvene i automatiske fjernstyrt PCR-blokk.
    5. Først Quality Control Sjekk: Kontroll av Amplification Process
      1. Hvis kvaliteten på ARNA er akseptabel, utfører fragmentering trinn ved at det til hver prøve 8 ul fragmentering 5X buffer (dette trinnet er utført av væskebehandlingssystem). Ellers utfører forrige trinn igjen starter fra RNA. Bruk fragmentert Arna umiddelbart eller lagre ufortynnet og fragmentert Arna ved -20 ° C (eller -70 ° C for langtidslagring).
      2. Utføre en andre kvalitetskontroll analyse ved å plukke opp tilfeldig 12 prøvene i platen og overføre en pl på MicroFluidics gel basert system for å kontrollere effektiviteten til fragmentering.
  3. Hybridisering prosedyre
    1. Skanne chip strekkoder og registrere hver prøve i produsentens programvaren i henhold til instruksjonene.
    2. Forbered hybridiseringsblandingen somfølger for en enkelt reaksjon og legge den til 33 mL av den fragmenterte og merket Arna: 4,2 mL av kontroll oligonukleotid B2 (3Nm), 12,5 mL av 20x eukaryote hybridisering kontroller, 25 pl 100% DMSO, 125 mL av 2x hybridiseringsbuffer og 50 mL av H 2 O for et sluttvolum på 216,7 mL
      Merk: Hybridiser, vaske og skanne positive og negative kontroller før behandlingen prøvene.
    3. Pre-fukte matrise med 200 ul prehybridisering mix som finnes i Hybridisering Vask og Stain kit.
    4. Plassere brikken i hybridisering ovn innstilt på 45 ° C og 60 rpm i 10 min.
    5. I mellomtiden kan denaturere tallerkenen (inneholdende det endelige cocktail hybridisering blanding) i en PCR-blokk ved 99 ° C i 5 min og 45 ° C i 5 min.
    6. Ta av pre-hybridisering mix fra tabellen og erstatte den med 200 mL av hybridisering cocktail mål (ett eksemplar per chip).
    7. Plasser matrisen inn i hybridization ovn innstilt på 45 ° C i 16 timer (O / N) med en rotasjonshastighet på 60 RPM.
  4. Vasking og farging
    1. Kjør "lufthåndtering" fra programvaren menylinjen. I dialogboksen lufthåndtering boksen velger modulen av interesse (1-4), og velg deretter Prime_450 programmet til alle moduler. Plasser røret for Wash Buffer A i en flaske (400 ml) og for Wash Buffer B i en flaske (200 ml), så vel som for milliQ vann i en flaske (500 ml).
    2. Deretter følger du instruksjonene på LCD-skjermen. Løft opp nålene og plassere 600 mL flekken cocktail 1 (SAPE Solution Mix) og 600 mL flekken cocktail 2 (Antistoff Solution Mix) inneholder mikrosentrifugerør i posisjonene # 1 og # 2, og 900 mikroliter Array Holding bufferløsning i posisjon # 3.
    3. Etter at O ​​/ N inkubasjon i ovnen, aspirer cocktail fra brikken og fyll microarray med 250 pl Wash Buffer A. Tilordne riktig chip til hver modul, velger FS450-001 protokollen og kjøre hver module, å følge instruksjonene på skjermen. Denne prosessen varer 90 min.
    4. Når LCD-skjermen viser "Eject Cartridge" melding, fjerne brikken og inspisere om det er noen bobler. Hvis luftbobler, fylle matrisen helt med Array holder buffer. Påfør klistremerker på septa for å unngå eventuelle lekkasjer i skanneren og rengjør microarray vinduet før lasting i Scanner.
  5. Skanning.
    1. Varm opp skanneren. Laste chip inn i autolasteren av skanneren og starte skanningen.
      Merk: Etter ~ 12 min per brikke, er en .CEL fil per chip generert.
    2. Sjekk bildet og justere rutenettet (om nødvendig) til stedet for å identifisere sonde celler.
      Merk: Datasettet er sendt til Arrayexpress (Tiltredelse kode = E-mtab-1721).

8. Nettverksbaserte Systems Biology Analyse for en konsekvensutredning

  1. Microarray databehandling.
    Merk: Data behandling av end scoring metoder ble gjennomført ved hjelp av R statistisk miljø versjon 2.14.
    1. Åpne en R 18 sesjon og laste AFFY 19, gcrma og affyPLM pakker installert ved å kjøre kommandoer: bibliotek (AFFY)> bibliotek (gcrma)> bibliotek (affyPLM)
    2. Les rådatafiler kjører kommandoen: data.affybatch <-ReadAffy ("banen til mappen hvor lagres de CEL filer")
    3. Subtrahere bakgrunnen korreksjon og quantile normale å generere sonde settuttrykk verdier ved hjelp av gcrma pakken, ved å kjøre kommandoen: eset.norm <-gcrma (data.affybatch)
  2. Kvalitetskontroll.
    1. Generere RNA nedbrytnings tomter med følgende kommando: grader <-AffyRNAdeg (data.affybatch)
    2. Pakk koeffisienten av RNA degradering skråningen kjøre kommandoen: skråningen = grader $ skråning
    3. Plotte stigningstallet og identifisere mulige uteliggere.
    4. Generere nBruk og RLE tomter kjøre disse kommandoene: PSet <-fitPLM (data.affybatch)> RLE (PSet)> ndenne (PSet).
    5. Identifisere om noen av boksplott genereres er uteliggere: en rekke anses avvikende dersom minst to av de tre QC beregninger definert nedenfor avviker fra de andre matriser:
      - Grader $ skråningen er forskjellig fra gjennomsnittet grader $ skråning
      - NBruk tomt: en rekke anses avvikende hvis den øvre kvartil faller under 0,95 eller nedre kvartil over 1,05, det vil si, hvis boxplot er helt over 1,05 eller helt under 0,95..
      - RLE tomt: en rekke anses avvikende hvis medianen av RLE fordelingen er større enn 0,1 eller mindre enn -0,1.
    6. Hvis en matrise er identifisert som en avvikende, og deretter kaste, og starte på nytt fra trinn 8.1.2.
    7. Monter en samlet lineær modell til dataene for de spesifikke kontraster av interesse (ie., Sammenligninger av "behandlet" og "kontroll" forhold) generere rå P-verdiene for hver sonde satt på microarray, som kan være furthennes justeres med Benjamini-Hochberg prosedyre av Limma pakken. Velg en probeset per genet for å beholde som representant av genet for videre analyser som beskrevet i 20.
      Merk: En blokkering faktor (eksponerings plate) fra eksperimentet ble regnskapsført i modellen for databehandling.
  3. Nettverksbasert analyse.
    Merk: Fremgangsmåten gjennomføres som her er beskrevet i detalj i Martin et al. (I revisjon i BMC bioinformatikk).
    1. For hver parvise sammenligningen av interesse, starte fra beregnet (log2-) fold endringer (behandlingstilbud vs. kontroll) for hvert gen under nettverket (fra trinn 8.2).
    2. Beregn signert Laplacian matrisen L i nettverket er definert av L (i, j) = - tegn (i ~ j) w (i, j) hvis det er en kant av vekten w (i, j) mellom node i og j, l (i, j) = ° (I) er den veide grad av i og l (i, j) = 0 ellers. Vekten w (i, j) er lik 1 hvis i og j er i ryggraden, og w (i, j) = 1 / n når i er en ryggrad node, og j er en av dens N neighbORS i karakterutskriften lag.
    3. Beregne score for ryggraden ved f = L3-1L2Tx hvor L3 er under matrise av L til ryggraden noder og L2 er under matrise av L hvis radene svarer til transkripsjons lag noder og kolonnen til ryggraden noder
    4. Beregn signert Laplacian, Q, av nettverket definert av stamnettet der alle tegn edge er reversert.
    5. Beregn NPA poengsum av Norsk Folkehjelp = fTQf.
    6. Beregne konfidensintervall, ryggrad kant permutasjon p-verdi og transkripsjon lag permutasjon p-verdi.
      Merk: (. F.eks den biologiske forskjeller mellom utvalgene i en forsøksgruppe) I tillegg til konfidensintervallene av NPA score, som står for den eksperimentelle feil, selskapsdyr statistikk ble avledet for å beskrive det spesielle ved Norsk Folkehjelps poengsum til biologi beskrevet i nettverket. Fordi Norsk Folkehjelp er en kvadratisk form for brette endringer, kan dens varians beregnes basert på fold-endringen anslått variances. Et konfidensintervall senere avledet bruker sentralgrensesetningen. To permutasjon tester ble gjennomført 21, hvorved for det første å vurderer om resultatene var spesifikk for den underliggende bevis (dvs., Gene brette endringer) i modellen, som fører til en permutasjon P-verdi (angitt med * O i figurene når P -verdi <0,05). For det andre, for å vurdere hvorvidt "årsak-virkning" lag av nettverket bidratt vesentlig til amplituden av nettverket perturbasjon (betegnet med K * i figurene da P-verdi <0,05).
    7. Tenk nettverket som påvirket av behandlingen hvis konfidensintervallet ikke inneholder null og to permutasjon p-verdier <0,05.
    8. Beregn de ledende noder som er definert som viktige noder i ryggraden bidra opp til 80% av NPA poengsum.

Representative Results

I resultatene som er beskrevet nedenfor, de organotypiske vev var primære humane epitelceller isolert fra friske, ikke-røyker, kaukasiske givere og ble rekonstruert ved hjelp av fibroblaster 15.

3D bronkial og nese vevsmodeller
In vitro bronkial og nese organotypiske modeller ligne på cellenivå den menneskelige luftveiene epitel (figur 2).

CS eksponering
Organotypic bronkial og nese vevsmodeller kan gjentatte ganger utsatt for mainstream CS på luft-væske-grensesnittet. Røyken eksponering eksperimentelle prosedyren anvendt for de resultater som er vist her er vist i figur 1.

Innspilling av stråle juling
Cilia juling ble spilt inn i de luft utsatt vev som illustrert i videoene. CS eksponering ble assosiert med en reduksjon av stråle juling frekvens: jo sterkere topp observert rundt4 Hz i humbug eksponert og før påvirkning er ikke observert noen lenger etter CS eksponering (figur 3). Dette redusert frekvens ville gjøre flimmerhårene slo mindre effektiv for å fjerne slim og smittestoffer 22.

Måling av Teer og CYP1A1 / 1B1 aktivitet
Teer ble målt 48 timer etter den siste eksponering for å sikre at vevet er fremdeles funksjonelt. CYP1A1 / 1B1-aktivitet ble også målt 48 timer etter slutten av eksponeringen som illustrert i figur 1. De teer verdier i CS-eksponerte vev var ikke signifikant forskjellige i forhold til de luft eksponert vev som bekrefter at det ikke er noen vesentlig cytotoksisk effekt av røyk ved denne konsentrasjonen. Ved 48 timer etter eksponering, ble CYP1A1 / 1B1-aktivitet i vev litt økt, noe som indikerer en moderat økning av vev forsvarsmekanisme etter eksponering (figur 4).

Genekspresjonsprofiler og nettverksbaserte systemer biology tilnærming for å studere virkningen av CS eksponering på endring av xenobiotisk metabolisme
Vev ble samlet inn på 48 timer etter eksponering tidspunkter. Deretter ble gjennomført microarray analyse for å generere genekspresjonsprofiler av CS- og luft utsatt vev. Virkningen av CS eksponering på xenobiotisk metabolisme ble undersøkt ved hjelp av en nettverksbasert systembiologi tilnærming leveraged fra gen-uttrykk profiler og som rapportert tidligere 15. Ved hjelp av en nettverksbasert systembiologi tilnærming viser at CS eksponerings virkninger på nivået av ryggraden noder i xenobiotiske Metabolism nettverksmodellen var pent korrelert mellom in vitro og in vivo datasett (Figur 5). I motsetning til dette, ved nivået for hver enkelt gen-ekspresjon endringer ble observert dårlig korrelasjon mellom in vitro (CS-eksponert vs. lufteksponerte) og in vivo (røykere vs. røykere).


Figur 1. Skjematisk prosedyre for gjentatt eksponering av CS til de organotypiske bronkial vevsmodeller Forkortelser:. CYP, cytokrom P450s; CS, sigarettrøyk; Teer, transepitelial elektrisk motstand.

Figur 2
Figur 2. organotypiske bronkiale og nasale epitel-vevskultur-modeller. Tegneserie illustrerer bronkial (A) og nasal (B) vevskultur innsats ved luft-væske-grensesnittet. In vitro-modeller inneholdt cilierte celler som er vist i den apikale sjikt av Hematoxylin-eosin-fargede celler (C for bronkial, D for nasal) som rapportert tidligere 15. Modellene ble co-dyrket med fibroblaster som er viktige for vekst og differensiering av epitelceller (indikert ved pilene). Farging av luftveis avstamning markører: p63 (E for bronkial, F for nasal) og MUC5AC (G for bronkial, H for nasal) er vist som rapportert tidligere 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Cilia Slo Frequency. Cilia juling frekvens (CBF) ble målt i luft-eksponert og i kulturen før og etter eksponering. Redusert CBF ble sett etter CS eksponering (representative resultater fra to innsats er vist som replikere 1 (R1) og replikere 2 (R2)).

annonse / 52325 / 52325fig4.jpg "/>
Figur 4. Måling av CYP1A1 / CYP1B1 aktivitet og teer. Venstre pannels indikere CYP1A1 / CYP1B1 aktivitet i bronkial (A) og nasal (B) vevsmodeller. Høyre panel viser teer måling i bronkial (C) og nasal (D) vevsmodeller. Gjennomsnitt ± SD vises. Forkortelser: CS, sigarett røyk; CYP, cytokrom P450; Teer, transepitelial elektrisk motstand; RLU, relativ luminescense enhet.

Figur 5
Figur 5. Nettverk-baserte systemer biologi metode for vurdering av virkningen CS eksponering i sammenheng med xenobiotisk metabolisme. Forandringene av genekspresjon nivåer ble anvendt til å beregne aktivering av ryggraden node av xenobiotiske Metabolism nettverksmodell (A) strong> som rapportert i en tidligere publikasjon 15. Figuren til høyre illustrerer begrepet kvantifisering av ryggraden noder, også kjent som "differensial nettverk ryggrad verdi," ved hjelp av NPA tilnærming. De blå ovaler representerer aktiviteten av ryggraden noder (f.eks., Det funksjonelle sjikt), og de ​​grønne kuler representerer uttrykket av gener (f.eks., Den transkripsjonelle lag). Konsekvenser av CS eksponering i organotypic bronkial vev (in vitro, CS-eksponert vs. luft eksponert) ved 48 h postexposure ble sammenlignet med de av røyking på menneskelige bronkial epitel innsamlet av bronkoskopi og nasal epitel ved burshing mindreverdig turbinate (GSE16008 ) (in vivo, røykere versus røykere) (B). Innfellinger, korrelasjon av genekspresjon skifter mellom in vitro og in vivo datasett. Forkortelser: CS, sigarett røyk; Norsk Folkehjelp, nettverk perturbation amplitude.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Her har vi demonstrerte anvendbarheten av menneskelig organotypic bronkial og nese vevsmodeller å vurdere effekten av gjentatt CS eksponering. Som et alternativ til dyreforsøk, ble utviklet en rekke systemer eksponerings for toksikologiske vurderinger av aerosol eksponering in vitro (f.eks., Vitrocell, Cultex, ALICE, etc.). Disse eksponerings modulene kan også benyttes for en toksikologisk vurdering av luftbåren forurensing, luftbårne partikler, nanopartikler, etc. I denne studien brukte vi Vitrocell system som kan romme opp til 48 forskjellige prøver samtidig, noe som åpner for større skala eksperimenter og lavere variabilitet mellom behandlinger. For hver aerosoleksponering in vitro, er risikoen for forurensning vevskultur fortsatt en stor risiko for plutselig innstrammingen krever en forsiktig håndtering av vev-kulturer gjennom eksperimentene.

Måling av partikkelavsetning i sanntid på mikrovekten i løpet av eXposure eksperiment gjør det mulig å overvåke at CS doser generert fra eksponeringssystemet er i samsvar med forventningene. For å sikre nøyaktigheten av den målte partikkelavsetning, sette opp den elektroniske måle fullstendig før eksponeringen er critial, for eksempel sette opp skalaen til 0. Dessuten, på grunn av forskjellen mellom de områder av mikrovekten (2 cm) og vevskultur innsats (0,33 cm2), vi justert sluttberegningen til området av innsatskultur: kun 33% av avsetning på mikro reflektere den reelle avsetning i innsatsen kultur.

Måling av Teer å fastslå tight-krysset barriere funksjonalitet og vurdere avbrudd av epitellaget er en relativt enkel prosedyre for å implementere, som vi rapporterte her. Men fordi bronkial og nese vevsmodeller inneholde slim-produserende ispedd slimceller, må apikale vasking utføres før Teer målerurement. Den apikale vasking er kritisk fordi tilstedeværelsen av slimlaget og variasjonen i tykkelsen kan forspenne måling av teer, som forstyrrer virkningen av CS eksponering. Denne oppfatningen er i overensstemmelse med det som ble rapportert av Hilgendorf og kolleger, der permeabiliteten Caco-2 celler ble rammet av co-dyrking med slim-produserende pokal cellelinje HT29 23. Slim må vaskes bort før teer måling, fordi apikale vasking like før eksponeringen kan interferere med dels responser til CS. Derfor blir målingen utført i tre dager før eksponering, og ikke rett før eksponering.

Vi viste at CYP1A1 / CYP1B1 aktiviteten kan måles fra organotypic kultur modeller flg CS eksponering selv om aktiviteten ble bare beskjedent økt med CS. Det svake signalet kan forsterkes ved en lengre inkubasjon av CYP1A1 / 1B1 substrat (ie., Luciferin-CEE), for eksempel for24-timers (data ikke vist). En av begrensningene i den CYP aktivitetsmåling i foreliggende arbeid er fraværet av normalisering til CYP proteinnivå eller til celletallet, som kan tas i betraktning for videre undersøkelser for å sikre at den endring i enzymaktiviteten ikke er påvirket ved endring av enten protein-nivå eller celletallet.

Vi rapporterte at CS eksponering hemmet ciliary juling i både nese og bronkial vevsmodeller. Lignende observasjoner ble gjort i ulike pattedyr og ikke-pattedyr modeller 12. For stråle stolpene måling, noe som sikrer at vevet blir håndtert og behandlet på en lignende måte er kritisk, for eksempel dersom mediet endringen gjennomføres, bør det anvendes for alle prøver. Sutto og kolleger rapporterte at pH påvirket pattedyr ciliary slo frekvens 24. Dermed når man sammenligner slo frekvenser mellom celler behandlet med ulike sammensetninger / blandinger, pHjustering bør betraktes for å redusere variabiliteten av vibrerende strålemåling. Videre er den temperatur ved hvilken målingen utføres også kritisk som frekvensen av ciliær vibrerende synker med synkende temperatur. For å minimalisere variasjonen på grunn av disse forandringer, en fase-top-inkubator, utstyrt med temperatur, CO 2 og fuktighetskontroll ble brukt i denne studien. Til tross for dette, observerte vi at ciliary slo frekvenser i bronkial vev etter CS eksponering var svært variabel (ie., Øke i ett innsatsen og reduksjon i andre innsats), noe som tyder på at ciliary juling er svært forstyrret rett etter eksponering. I motsetning til dette ble det observert i fravær av målbare ciliare oppmalings frekvenser i nesevevet etter CS eksponering, noe som tyder på at responsen av nesevevet er mer følsomme og konsekvente. Dette er i overensstemmelse med en tidligere publikasjon som viser at nasal vev har en lavere kapasitet til å avgifte somsammenlignet med bronkie 25.

Til slutt viste vi at genekspresjon profilering fra organotypic bronkial og nese vevsmodeller utsatt for CS kunne demonstrere en innvirkning av CS på xenobiotisk metabolisme. Interessant, den observerte endring i xenobiotisk metabolisme i organotypiske bronkial og nasal in vitro modeller utsettes for CS likne som in vivo situasjonen hos røykere som diskutert i større detalj i en tidligere publikasjon 15. For genekspresjon analyser ved hjelp av robot instrument gjør en high-throughput analyser mulig. Videre automatisk robot håndtering ytterligere øker konsistensen og nøyaktigheten av genuttrykk resultater. Ikke desto mindre, hurtig samling av de vevsprøver var kritisk for å unngå RNA-degradering i løpet av RNA-ekstraksjon. RNA-prosessering og transcriptomic tilnærminger som er beskrevet her kan også bli brukt til in vivo vevsprøver.

Disclosures

Denne studien ble finansiert av Philip Morris.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Maurice Smith og Marja Talikka for deres vurdering av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MucilAir-human fibroblasts-bronchia Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/
MucilAir Culture Medium Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/
VITROCELL VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=
3R4F reference cigarette University of Kentucky http://www2.ca.uky.edu/refcig/
30-port carousel smoking machine SM2000 Philip Morris, Int.
CiliaMetrix camera and software La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland
Leica DMIL microscope  Leica, Heerbrugg, Switzerland
LED light source Titan Tool Supplies, Buffalo, NY
Chopstick Electrode STX-2 World Precision Instruments http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter  World Precision Instruments http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/
Luciferin Detection Reagent 
MagNA Lyser Instrument  Roche http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66
chloroform  Sigma-Aldrich http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=
QIAcube  Qiagen 9001882
NanoDrop Thermo Scientific http://www.nanodrop.com/
Agilent 2100 Bioanalyzer  Agilent http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106
Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit Affymetrix http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit
Scanner 3000 7G  Affymetrix http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).
  3. Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465 (2011).
  4. Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).
  5. Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicolog. 244, 66-76 (2008).
  6. Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).
  7. Cho, M. -H., et al. A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker. Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).
  8. Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research. Journal of Allerg. 2012, 11 (2012).
  9. Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazi. , 19-24 (2010).
  10. Chhin, B., et al. Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy. PLoS genetic. 5, e1000422 (2009).
  11. Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro. Front Me. 7, 486-491 (2013).
  12. Talbot, P. In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents. Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).
  13. Port, J. L., et al. Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract. Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).
  14. Hoeng, J., et al. A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances. Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).
  15. Iskandar, A. R., et al. Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues. Biomed Res In. 2013, 512086 (2013).
  16. Karp, P. H., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).
  17. ISO 3402: Tobacco and tobacco products -- Atmosphere for conditioning and testing. , International Organization for Standardization. (1999).
  18. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , The R Core Team. (2011).
  19. Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips. BMC Bioinformatic. 5, 111 (2004).
  20. Hermida, L., et al. Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data. BMC genomic. 14, 514 (2013).
  21. Thomson, T. M., et al. Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models. Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).
  22. Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke. Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).
  23. Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).
  24. Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH. The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).
  25. Zhang, X., et al. Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium. Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).

Tags

Bioteknologi human organotypiske bronkial epitel 3D kultur, sigarettrøyk flimmerhårene juling xenobiotisk metabolisme nettverksmodeller systemer toksikologi
Konsekvensutredning av gjentatt eksponering av organotypiske 3D Bronkitt og Nasal Tissue Kultur Modeller til Whole sigarettrøyk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuehn, D., Majeed, S., Guedj, E.,… More

Kuehn, D., Majeed, S., Guedj, E., Dulize, R., Baumer, K., Iskandar, A., Boue, S., Martin, F., Kostadinova, R., Mathis, C., Ivanov, N. V., Frentzel, S., Hoeng, J., Peitsch, M. C. Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke. J. Vis. Exp. (96), e52325, doi:10.3791/52325 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter