Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tüm Sigara Dumanına Organotipik 3D Bronşiyal ve Burun Doku Kültürü Modelleri Tekrarlanan Pozlama Etki Değerlendirmesi

Published: February 12, 2015 doi: 10.3791/52325
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological Systems Research, Philip Morris International R&D, Philip Morris Products S.A.

Protocol

Organotipik Doku Kültürü Bronş Modelinin 1. Kültür

Not: Sulandırılarak doku modelleri kullanmaya hazır ekler olarak satın alındı. Karp ve arkadaşları 16, örneğin anlatıldığı gibi Seçenek olarak ise, kültürü birincil hücrelerden geliştirilebilir. Steril ambalaj dokuların alınmasını takiben, her zaman steril koşullar altında insan organotipik dokuları ele.

  1. Ekle başlık altında yeni bir steril 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, önceden ısıtılmış (37 ° C), deney ortamı, 0.7 ml olmuştur.
  2. Başlık altında dokuların ambalajını çıkartın ve yeni hazırlanan, 24-iyi levhaya doku kültür ekleri aktarın (adım 1.1 tarif edilmiştir. Yukarıda).
  3. 37 ° C'de (% 5 CO2,% 90 nem) bir kuluçka makinesi içinde dokuların bakımı ve kültür.
  4. Her 2 gün orta değiştirin.
  5. Orta değişikliği sırasında, onlar contaminati olan onlar sağlamak için bir ışık mikroskobu altında dokuları incelemekserbest ve bu ortamın herhangi bir sızıntı oluşmamaktadır.

Bir İn Vitro Pozlama Sistemi kullanılarak 2. Sigara Duman (CS) Pozlama

  1. Maruz kalma deneyleri öncesinde üç gün sonra, kültür ortamı 200 ul doku kültürü apikal tarafında yıkayın.
  2. Siliyer dayak ölçüm maruz önce planlanmış ise 3. bölümünde açıklandığı gibi maruz kalma gününde, siliyer dayak ölçümü için dokuları ele.
  3. In vitro maruziyet sisteminin iklim odası ve 37 ° C ekimi baz modülü Ön-sıcak. Satır başına orta 17.5 ml ekimi baz modülü doldurun.
  4. Inkübatör dokuları çıkarın ve in vitro maruziyet sisteminin ekimi baz modülüne kültür plakasından doku kültürü ekler aktarmak için kaputun altında koyun. Ayrıca, bir cam kapaklı ekimi baz modülü kapsayacak.
  5. In vitro maruziyet syste iklim odasında dokuları aktarınana dumanına maruz kalma m.
  6. In vitro pozlama sistemi mikro varsa, set-up Kuvars kristal mikrobalans mikroterazi yazılımını kullanarak bir kuvars kristali üzerinde duman gerçek zamanlı partikül birikimini ölçmek için pozlamayı çalıştırmadan önce.
    1. Seyreltme / dağıtma sisteminin her bir satıra bağlı mikroterazi modülleri kristaller değiştirin.
    2. Mikroterazi yazılımı mikro terazi modülünü bağlayın. Yazılım sıfıra ölçüm ölçeğini ayarlayın.
  7. Deneysel prosedüre uygun olarak dokuları Açığa (örn., Şekil 1 'deki gibi),
    Not: Ön pozlama, referans sigaralar (3R4F) 3402 17 standart ISO 22 ± 1 ° C ve 60 ±% 3 nispi nemde kontrollü koşullar altında 7 ve 21 gün arasında klimalı edilir.
    1. Sigara dumanı oluşturun (örneğin., 3R4F sigaradan) 30-port atlıkarınca yasaktır mach kullanarakine Kanada Sağlık Yoğun rejimine göre: yani, bir standart popo uzunluğu 2 sn boyunca 55 ml puf yaklaşık 35 mm, iki kez bir dakika ve 8 saniye pompa egzoz zamanını sigara içmektedir.
      Not: Gerekirse dozu çok toksik olmayan, böylece, ana CS seyreltin. Burada bildirilen sonuçlar olarak, duman% 16 (hacim / hacim) seyreltildi.
    2. Kontrol örnekleri için% 60 nemli-hava kullanın (hava-açık).
    3. 6-7 dakika dokuları Açığa in vitro maruziyet sistemi (yani., 1 sigara veya hava-açık)
    4. 1 saat boyunca 37 ° C'de (% 5 CO2,% 90 nem) geri inkübatör dokuları koyun.
    5. Tekrar 2.7.3 ve 2.7.4 üç kez daha yineleyin.
  8. Pozlama Deneyin sonunda, mikro terazi yazılımını durdurun. Yazılım parçacık birikimi bir grafik gösterimi ile birlikte tüm ölçümleri içeren bir dosya oluşturur.
  9. Yetiştirme b dokuların geri aktarınkültür plakasına ase modülü. Maruziyet sonrası belirli bir zaman noktasında farklı uç noktaları için ölçümler kadar 37 ° C'de (% 5 CO2,% 90 nem) geri inkübatör dokuları yerleştirin.

Silier Dayak 3. Ölçümü

Not: önce maruz kalma ve doğrudan maruz kaldıktan sonra dayak gibi deneysel planı başına (Şekil 1), kayıt kirpiksi.

  1. Inkübatör doku kültürü plakaları çıkarın ve 30 dakika kirpikler dayak stabilize etmek için oda sıcaklığında kaputun altında bırakın.
  2. CiliaMetrix Yazılım bağlı ışık mikroskobu altında dokuları yerleştirin.
  3. Siliyer dayak film ve (Hertz) frekansını kaydedin. Frekansı 1 dakika boyunca her 3 saniyede ölçün.
  4. 37 ° C (% 5 CO 2,% 90 nem) geri inkübatör dokuları dönün.

4. Transepitelyal Elektrik Direnci (TEER) Ölçme

Not: TEER ölçümü 3 gün önce ve voltohmmeter bağlı Chopstick Elektrot (STX-2) kullanılarak steril koşullar altında başlık altında maruz kaldıktan sonra 48 saat gerçekleştirilir.

  1. Insan bronşiyal dokuların tepe yüzey kültür ortamı 200 ul ekle.
  2. EVOMX Makineyi açın; % 70 etanol çözeltisi ile elektrot yıkayın.
  3. Kültür ortamı ile elektrot yıkayın.
  4. Doku dokunmadan doku kültürü apikal tarafındaki ortama elektrot yerleştirerek direnci (Ω) ölçün.
  5. Adımı yineleyin 4.4 beş kez beşlemek ölçümleri elde etmek.
  6. Ölçümlerin ardından, yavaşça bir aspiratör kullanılarak doku kültürleri apikal tarafında orta kaldırmak.
  7. Kültür, 37 ° C'de (% 5 CO2,% 90 nem) kuvöz doku kültürleri dönün.

5. Sitokrom P450 (CYP) 1A1 / 1B1 Activity

  1. Çalışmanın başlamasından önce, (imalatçının talimatlarına göre) lusiferin, belirleme reaktifini ihtiva eden bir amber şişeye uygun bir çözme tamponu şişenin tüm aktararak lusiferin saptama reaktif hazırlamak. 1 ay ve en fazla -20 ° C 'de 2 ml mağazası alikotları.
  2. 48 saat sonra maruz kalma süresi sağlamak için, 37 ° C 'de CS maruz bırakıldıktan sonra 48 saat süre ile dokuların inkübe edin.
  3. RT Luciferase algılama reaktif ısıtın.
  4. Bazal kültür ortamı içinde (1:50 seyreltilmiş) luciferase-CEE alt-tabaka ile 3 saat ya da O / N doku uçlar inkübe edin.
  5. Aktarım her bir doku kültür ortamında 50 ul, oda sıcaklığında 96 oyuklu bir opak beyaz luminometre plakasına yerleştirin.
  6. Işıldayan reaksiyonu başlatmak için her bir oyuğa lusiferin saptama reaktif 50 ul ekle.
  7. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında plaka inkübe edin.
  8. Bir luminometre kullanılarak ışık yayılması okuyun.
    Not: Satılıkluminometredir bir kılavuz olarak kuyu başına 0,25-1 saniye bir entegrasyon zaman kullanın.

6. RNA Ekstraksiyon.

  1. 3D organotipik doku ekler toplama önce, kuru buz, bıçakların 2) yeterli miktarda (3D eki başına bir), 3) Soğuk PBS kalsiyum klorür ve magnezyum klorür olmadan, 4) bir 25 ml'lik cam pipet, ve 5), bir kutu 1 hazırlamak aspirasyon için) steril cam iğneler.
    1. Katı hücresel örnekleri homojenleştirici ve Qiazol 700 ul ekleyin seramik boncuk dolu Etiket tüpleri.
    2. Aspirasyon Makineyi açın.
    3. Inkübatör 3D organotipik doku ekler plaka toplayın.
    4. Soğuk PBS ile plaka üzerinde 3 kez her parçayı yıkayın. Yıkamalar arasında, cam iğne ile PBS aspire. Üçüncü yıkamadan sonra, PBS ve kapak levhası ile aspire ekin kurumasını önlemek için.
    5. Plaka her insert için, Membr kadar insert membran (3D doku ekleme bulunduğu) kesipane bıçak aşağı düz yatıyor.
    6. Uygun şekilde etiketlenmiş homojenleştirici tüp bıçak (insert membran ile birlikte) doku aktarın ve tüp kapağı vida, onu sallayın ve vorteks.
    7. -80 ° C'de bir kuru buz ve mağazada numuneyi Dondurulmuş veya ekstrat RNA devam etmektedir.
      , Önce RNA'nın çıkarımı randomizasyon tasarımı (varsa) göre, tüm tüpleri ve sütunları etiket: Not. Üreticinin tavsiyelerine göre tüm reaktifler hazırlayın ve -80 ° C derin dondurucuda örnekler almak ve tamamen çözülür kadar buz üzerinde onları eritin.
  2. Homojenizasyon
    1. 45 saniye boyunca 6000 Hz Cihazı homojenize ile grind örnekleri. Numunenin iyice homojenleştirilir değildir ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca numune terk tekrarlayın.
    2. 10-15 saniye boyunca numune ve girdaba 140 ul kloroform ekleyin.
    3. Bir Faz kilit tüp homojenleştirme tüpten aktarın ve üzerine sallamak1400 rpm'de ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca thermoshaker.
    4. Bundan başka, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 12,000 x g'de oda sıcaklığında 2 dakika boyunca örnekleri ve santrifüj örnekleri inkübe edin.
  3. Qiacube süreci RNA yağış, yıkama, süspansiyon ve arıtma.
    1. Yeni 2 ml tüp içinde, üst sulu faz transfer.
    2. Üretici protokol sayfasına göre ekstraksiyon robot gerekli tüm reaktifleri yükleyin, uygun protokolü seçin, elüsyon hacmi (30 ul) ayarlayın ve çıkarma robot çalıştırın.
    3. Çalışma tamamlandığında, rotor adaptörleri kaldırmak ve daha fazla analiz için ya da uzun süreli saklama için -80 ° C'de 4 ° C'de hemen elüsyon tüpleri tutmak.
  4. Izole edilmiş bir RNA kalitesinin kontrolü
    1. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir UV okuyucu kullanılarak izole RNA miktarını belirler.
    2. RNA kalitesini ve kullanarak RNA bütünlüğünü kontrol lab-on-a-chip ve bir UV okuyucu, acc mikroakışkan-jel-tabanlıÜretici talimatlarına Ording.

7. Mikroarray İş Akışı

Not: Aşağıda tarif edilen işlem, bir kompleksin RNA hazırlanmasından itibaren Affymetrix 3 gen sentezleme kartuşları hibridizasyon için hedef sentezi için kullanılan Affymetrix GeneChip yüksek verim 3'IVT Hızlı Kit için yöntem odaklanır sıvı taşıma sistemi (örn., pipet, seyreltilmesi dağıtım veya entegre).

  1. Hazırlık
    1. Toplu etkilerini önlemek için numune Rastgele. gruplar tarafından işlenen örneklerin sayısı bir pozitif (Ticari İnsan evrensel bir referans RNA) ve bir negatif (RNazsız su) toplu iş başına kontrolü de dahil olmak üzere, 1-96 olduğunu.
    2. RNAse içermeyen su 3 ul toplam RNA 100 ng kullanarak hedef sentezini başlatır. Toplam RNA 100 ng için, 16 saatlik bir inkübasyon süresi kullanılır.
  2. RNA üretimi
    1. P hazırlayınOly-A RNA, diken-Poly-A Kontrol Seyreltme Tampon maddesi ile Poli-A RNA stokundan bir seri seyreltme ile kontrol çözeltisi:
      1. Seyreltme 1 için, 36 ul seyreltme tamponu 2 ul poli kontrol stok hazırlamak.
      2. Seyreltme 2 için, seyreltme tamponu 98 ul seyreltme 1 2 ul hazırlar.
      3. Seyreltme 3 için, seyreltme tamponu 196 ul seyreltme 2 4 ul hazırlar.
      4. Seyreltme 4 için, seyreltme tamponu 180 ul seyreltme 3 20 ul hazırlar.
    2. 33.3 ng / ul konsantrasyon elde etmek için RNAse içermeyen su içinde RNA seyreltin.
    3. Doğrudan bir 96 oyuklu bir plaka içerisinde, toplam RNA numunesinin 3 ul poli kontrol solüsyonunun 2 ul ekleyin. Bu aşama, sıvı taşıma sistemi tarafından gerçekleştirilir.
    4. Sıvı taşıma sistemi ve hedef sentezini hazırlayın. Robot tabak yerleştirin. Güvertede gerekli tüm reaktifler ve laboratuar aletlerinin yerleştirin. Robot appropriat hazırlayarak prosedürü başlayacake Master karışımı otomatik uzaktan kumandalı PCR bloğunda örnekleri inkübe ve.
    5. Önce Kalite Kontrol Kontrol: Amplifikasyon Süreci Kontrolü
      1. Arna kalitesi kabul edilebilir ise, her bir örnek için parçalanma 5X tampon 8 ul (Bu adım sıvı taşıma sistemi tarafından gerçekleştirilir) ekleyerek parçalanma adımı gerçekleştirmek. Aksi takdirde, yine RNA başlayarak bir önceki adımı gerçekleştirmek. Hemen parçalanmış Arna kullanın veya C ° (ya da -70 uzun süreli depolama için ° C) -20 ° C'de seyreltilmemiş ve parçalanmış Arna saklayın.
      2. Parçalanma verimliliğini kontrol etmek Mikroakiskan jel tabanlı sistemde plaka ve transfer 1 ul rastgele 12 örnekleri toplayarak ikinci Kalite Kontrol analiz gerçekleştirin.
  3. Hibridizasyon prosedürü
    1. Çip barkod tarama ve talimatlara göre üreticinin yazılım her örnek kayıt.
    2. Gibi hibridizasyon karışımı hazırlayıntek bir reaksiyon için takip eder ve parçalanmış ve etiketlenmiş Arna 33 ul ekleyin: kontrol oligonükleotid B2 4.2 ul (3nM'lik), 20x ökaryotik melezleştirme kontrol 12.5 ul,% 100, 25 ul DMSO, 2x hibridizasyon tamponu 125 ul 216,7 ul bir son hacim için, H2O, 50 ul
      Not: melezleşme, yıkama ve örnekleri işlemeden önce pozitif ve negatif kontrolleri tarayın.
    3. Hibridizasyon Yıkama ve boyama kiti içinde yer alan ön-hibridizasyon karışımı 200 ul bir dizi ön-ıslatma sergilemez.
    4. Fırın 45 ° C'ye ayarlanmış melezleme çip ve 10 dakika boyunca 60 rpm'de yerleştirin.
    5. Bu arada, 5 dakika boyunca 99 ° C 'de, bir PCR bloğunda plaka (nihai kokteyl hibridizasyon karışımı ihtiva eden) denatüre ve 5 dakika için 45 ° C.
    6. Diziden öncesi hibridizasyon karışımı çıkarın ve melezleme kokteyl hedefinin 200 ul (çip başına bir örnek) ile değiştirin.
    7. Hybri içine dizi yerleştirindization fırın 60 RPM'lik bir dönüş hızı ile 16 saat boyunca 45 ° C (O / N) olarak belirlenmiştir.
  4. Yıkama ve boyama
    1. Yazılım menü çubuğundan "Fluidics" çalıştırın. Daha sonra, tüm modüllere Prime_450 programı seçin - Fluidics iletişim kutusunda, ilgi (4 1) modülünü seçin. Bir şişe (500 ml) içinde MiliQ suyu yanı sıra, bir şişe (200 ml) içinde bir şişe (400 mi) ve Yıkama Tamponu B yıkayın Tampon A için boru yerleştirin.
    2. Daha sonra, LCD ekran talimatlarını izleyin. Iğneler yukarı kaldırın ve 600 ul leke kokteyl 1 (SAPE Çözüm Mix) ve pozisyonları # 1 ve # 2 de mikrosantrifüj tüpler içeren 600 ul leke kokteyl 2 (Antikor Çözüm Mix) yerleştirin, ve pozisyon # 3 tampon çözeltisi Holding 900 ul Dizi.
    3. Fırında O / N inkübasyondan sonra, her modül için doğru çip atama çip kokteyl aspire ve 250 ul Yıkama Tampon A. ile mikrotertibi doldurun, FS450-001 protokolü seçmek ve her mo çalıştırındule, ekrandaki yönergeleri izleyerek. Bu işlem, 90 dakika sürer.
    4. LCD ekran "Çıkar Kartuşu" mesajını gösterir sonra, çip kaldırmak ve herhangi bir kabarcıklar varsa kontrol edin. Kabarcıkları varsa, Dizi tutan tamponu ile tamamen dizi doldurun. Tarayıcının herhangi sızıntıları önlemek ve Tarayıcı yükleme öncesinde mikroarray penceresini temizlemek için septa üzerine çıkartmalar uygulayın.
  5. Tarama.
    1. Tarayıcıyı ısıtın. Tarayıcının robotun içine çip yükleyin ve taramayı başlatın.
      Not: çip başına ~ 12 dakika sonra, çip başına .CEL dosyası oluşturulur.
    2. Görüntüyü kontrol edin ve prob hücreleri tanımlamak için noktaya (gerekirse) ızgara hizalayın.
      Not: veri kümesi (Katılım kodu = E-MTAB-1721) ArrayExpress teslim edilmiştir.

Bir Etki Değerlendirmesi 8. Ağ tabanlı Sistem Biyolojisi Analizi

  1. Mikroarray veri işleme.
    Not: Veriler bir işlemd puanlama yöntemleri R istatistik çevre sürümü 2.14 ile uygulanmıştır.
    1. R 18 oturum açın ve komutları çalıştırarak yüklü Affy 19, gcrma ve affyPLM paketlerini yüklemek: kütüphane (Affy)> kütüphane (gcrma)> kütüphane (affyPLM)
    2. Komutunu çalıştırarak ham veri dosyalarını okuyun: data.affybatch <-ReadAffy ("CEL dosyaları depolandığı klasöre yolu")
    3. Komutu çalıştırarak, gcrma paketini kullanarak prob seti ifade değerlerini oluşturmak için arka plan düzeltme ve kantil normale çıkartmak: eset.norm <-gcrma (data.affybatch)
  2. Kalite kontrol.
    1. Komutu ile RNA bozulması araziler oluşturun: ° <-AffyRNAdeg (data.affybatch)
    2. Eğim = C $ eğimi: komutunu çalıştırarak RNA bozulması eğimin katsayısı Özü
    3. Eğim katsayısını arsa ve olası outliers belirlemek.
    4. Aşağıdaki komutları çalıştırarak nkullan ve RLE araziler oluşturun: Pset <-fitPLM (data.affybatch)> RLE (Pset)> nkullan (Pset).
    5. Oluşturulan kutudiyagramlar bazı aykırı olup olmadığını belirleyin: Bir dizi aykırı kabul edilir, diğer dizilerden saptığını aşağıda tanımlanan 3 QC ölçümlerini en az 2:
      - C $ eğimi ortalama C $ yamaç farklı
      - Nkullan arsa: üst çeyrek, 0.95 altına düşerse veya 1.05 üstünde alt çeyrek eğer, yani boxplot tamamen 1.05 üstünde veya tamamen 0.95 altında ise bir dizi aykırı olarak kabul edilir..
      - RLE arsa: RLE dağılımın ortalama 0.1 ya da daha büyük -0,1 daha küçük ise, bir dizi uç değer olarak kabul edilir.
    6. Bir dizi, bir aykırı değer olarak tanımlanır, daha sonra atmak, ve adım 8.1.2 den tekrar başlayın.
    7. Özel ilgi kontrastlı verilerine genel lineer model takınız (yani. "Tedavi" ve "kontrol" koşullarının karşılaştırmaları) furt olabilir mikrotertipte ayarlanmış her bir prob, ham P değerlerinin üretilmesiOnu limma paketinin Benjamini-Hochberg prosedürü kullanılarak düzeltilmiş. 20 de tarif edildiği gibi daha sonraki analizler için gen temsilcisi olarak tutmak için genin başına probeset seçin.
      Not: Deney tasarımı bir engelleme faktörü (maruziyet plakası) veri işleme modelinde muhasebeleştirilmiştir.
  3. Ağ tabanlı analiz.
    Not: Burada uygulanan yöntem olup Martin ve diğerleri tarafından ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. (BMC biyoinformatik revizyona).
    1. Ilgi her ikili karşılaştırma için, bilgisayarlı (log2-) başlayan (aşama 8.2 dan itibaren) ağ altında her gen değişiklikleri (kontrol vs tedavi) katlayın.
    2. Işareti (i ~ j) w (i, j) düğüme i ve j arasındaki (i, j) w ağırlık bir kenar varsa - L tarafından tanımlanan ağ imzalanan Laplace matris L (i, j) = hesapla L (i, j) = C (i) i ve L (i, j) = başka 0 ağırlıklı derecesidir. i ve j omurga ve a (i, j) = 1 ise, (i, j) 'a ağırlıkça 1' e eşit olan / n = i, bir omurga düğümü ve j N neighb biridirTranskript tabakasında ors.
    3. L3 omurga düğümlerine L alt matrisi ve L2 olan satırları omurga düğümleri transkripsiyonel katman düğümlerine ve kolona karşılık L alt-matris olduğu = L3-1L2Tx f tarafından omurgası puanları hesaplayınız
    4. Tüm kenar işaretleri ters olan omurga ağı tarafından belirlenen ağ, imzalı Laplace, Q hesaplayın.
    5. NPA = fTQf tarafından NPA puan hesaplayın.
    6. Güven aralığı, omurga kenar permütasyon p-değeri ve transkript katmanı permütasyon p-değerini hesaplayınız.
      Not: (., Örneğin, bir deney grubunda örnekler arasında bir varyasyon) da deneysel hata hesaba NPA skorları güven aralıkları, ilave olarak, tamamlayıcı istatistik tarif biyoloji NPA skoru özgüllüğünü tanımlamak için türetilmiştir Ağdaki. NPA kat değişikliklerin bir kuadratik formu olduğundan, varyans bilgisayarlı kat-değişim tahmini v dayalı olabilirariances. Bir güven aralığı daha sonra merkezi limit teoremi kullanılarak elde edilir. İki permütasyon testleri sonuçları modelinde yatan kanıt (yani., Gen kat-değişikliklerin) özgü olsaydı P rakamlar * ile gösterilen bir permütasyon P-değeri (O yol, değerlendirir için sayede ilk 21 uygulanmıştır -değeri <0.05). İkincisi, ağ "neden-sonuç" katmanı önemli ölçüde ağ pertürbasyon genliği katkıda olmadığını değerlendirmek için (rakamlar K * ile gösterilen zaman P-değeri <0.05).
    7. Güven aralığı sıfır içermez VE iki permütasyon p-değerleri <0.05 yoksa tedavi etkilenen gibi ağ düşünün.
    8. NPA puanının% 80 kadar katkıda omurga anahtar düğümler olarak tanımlanır lider düğümleri hesaplayın.

Representative Results

Aşağıda tarif edilen sonuçlarda Organotipik dokular, sağlıklı, sigara içmeyen den izole edilen primer insan epitel hücreleri, Kafkas vericiler ve fibroblastlar 15 kullanılarak yeniden-teşekkül ettirilmiştir.

3D bronş ve burun doku modelleri
In vitro bronşiyal ve burun organotipik modellerde hücresel düzeyde insan solunum yolu epitel (Şekil 2) benzer.

CS maruz
Organotipik bronş ve burun doku modelleri tekrar tekrar, hava-sıvı arayüzünde ana CS maruz kalabilir. Burada gösterilen sonucu elde etmek için kullanılan dumanına maruz deney prosedürü, Şekil 1 'de tasvir edilmiştir.

Siliyer dayak Kayıt
Silyum dayak videoları 'de gösterildiği gibi, hava maruz kalan dokularda kaydedildi. CS pozlama siliyer çırpma frekansı bir azalma ile ilişkili bulunmuştur: etrafında gözlenen güçlü tepeMaruz maruz sham ve önce 4 Hz CS maruz (Şekil 3) sonra artık görülmez. Bu azalma frekans mukus ve enfeksiyöz ajanlar 22 kaldırmak için daha az verimli dayak kirpikler yapacak.

TEER ve CYP1A1 / 1B1 aktivitesi ölçümü
TEER dokusu hala işlevsel olmasını sağlamak için en son maruz kaldıktan sonra 48 saat ölçüldü. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, CYP1A1 / 1B1 aktivitesi, maruz kalma sona erdikten sonra 48 saat ölçülmüştür. CS maruz kalan dokularda TEER değerleri arasında anlamlı bir fark yoktu duman önemli bir sitotoksik etki olduğunu teyit hava maruz dokulara kıyasla Bu konsantrasyonda. 48 saat sonrası maruz kalındığında, dokularda CYP1A1 / 1B1 aktivitesi biraz maruz (Şekil 4) Aşağıdaki doku savunma mekanizması ılımlı bir artış gösteren, arttı.

Gen ekspresyon profilleri ve ağ tabanlı sistemler biology yaklaşımı ksenobiyotik metabolizması değiştirilmesi CS maruz etkisini incelemek için
Dokular, 48 saat sonra maruz zaman noktalarında toplanmıştır. Daha sonra, mikro-dizi analizi, gen ekspresyonu CS- profillerini ve hava maruz kalan dokular üretmek için gerçekleştirilmiştir. Ksenobiyotik metabolizması üzerine CS maruz Etkisi gen ifadesi profillerinden kaldıraçlı bir ağ-tabanlı sistemler biyolojisi yaklaşımı kullanılarak araştırılmıştır ve daha önceki 15 bildirdiler. Bir ağ tabanlı sistemler biyolojisi yaklaşımı kullanarak Zenobiyotik Metabolizma ağ modelinde omurga düğüm seviyesinde CS maruz kalma etkileri güzel (Şekil 5), in vitro ve in vivo veri kümelerinde korelasyon olduğunu göstermektedir. Bunun aksine, her bir gen ekspresyon değişiklikleri düzeyde zayıf korelasyon, in vitro (sigara içmeyenler genel sigara içenler) ve in vivo (hava maruz genel CS-açık) arasında gözlenmiştir.


Organotipik bronşiyal doku modelleri CS tekrarlanan maruz kalma Şekil 1. şematik prosedür Kısaltmalar:. CYP, sitokrom P450; CS, sigara dumanı; TEER, transepitelyal elektrik direnç.

Şekil 2,
Şekil 2. Organotipik bronş ve nazal epitel doku kültürü modelleri. Karikatür, hava-sıvı arayüzünde bronş (A) ve nazal (B) doku kültürü elemanını gösteren. Daha önce 15 bildirildiği gibi in vitro modeller Hematoksilen & Eosin boyanan hücrelerin apikal tabakasında gösterilen kirpikli hücreler (bronşiyal C, nazal D) içeriyordu. Modeller önemli fibroblastlar ile birlikte kültürlenmiştir büyüme ve epitel hücre farklılaşması için (oklarla gösterilmiştir). Havayolu soy belirteçleri Boyama: Daha önce 15 bildirildiği gibi p63 (nasal bronşiyal E, F) ve MUC5AC (bronşiyal G, nazal H) gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Silyum Dayak sıklığı. Silyum dayak frekansı (BKA) önce ve maruz kaldıktan sonra havayla maruz kalan ve kültür ölçülmüştür. CBF CS maruz kaldıktan sonra görüldü azaldığı (iki ekleme temsilcisi sonuçları çoğaltmak 1 (R1 olarak gösterilen) ve çoğaltmak olan 2 (R2)).

reklam / 52.325 / 52325fig4.jpg "/>
Şekil 4. CYP1A1 / CYP1B1 aktivitesi ve TEER ölçümü. Sol pannels bronş (A) ve nazal (B), doku modellerinde CYP1A1 / CYP1B1 etkinliğini gösterir. Sağ paneller bronş (C) ve nazal (D) doku modellerinde TEER ölçüm göstermektedir. SD ± araçlar gösterilir. Kısaltmalar: CS, sigara dumanı; CYP, sitokrom P450; TEER, transepitelyal elektriksel direnç; RLU, bağıl luminescense birimi.

Şekil 5,
Ksenobiyotik metabolizması bağlamında CS maruz kalma etki değerlendirmesi için Şekil 5. Ağ-tabanlı sistemler biyolojisi yaklaşımı. Gen ifadeleri düzeylerinin değişiklikler Zenobiyotik metabolizması ağ modelinin omurgası düğümün aktivasyonunu (A) hesaplamak için kullanıldı strong> önceki yayın 15 bildirildiği gibi. Sağdaki figür NPA yaklaşımını kullanarak ", diferansiyel ağ omurgası değeri" olarak da bilinen omurga düğümlerinin, miktarının kavramını göstermektedir. mavi oval omurga düğüm aktivitesini temsil (yani., fonksiyonel tabakası) ve yeşil topları genlerin ifadesini temsil (yani., transkripsiyon tabakası). Organotipik bronşiyal dokularda CS maruz Etkileri GSE16008 (temas sonrası 48 saatte alt konka burshing ile bronkoskopi ve burun epitel tarafından toplanan insan bronş epitel üzerinde sigara olanlar karşılaştırıldı (in vitro, hava maruz vs CS-açık) ) (in vivo, sigara içenlerde vs sigara içmeyen) (B). Konumlar, gen ekspresyonu arasındaki ilişki de in vitro ve in vivo veri setleri değişir. Kısaltmalar: CS, sigara dumanı; NPA, ağ pertürbasyon genlik.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Discussion

Burada, biz tekrarlanan CS maruz etkisini değerlendirmek için insan organotipik bronşiyal ve burun doku modellerinin uygulanabilirliğini göstermiştir. Hayvanlar üzerinde yapılan testlere bir alternatif olarak, tatbik sistemlerinde bir dizi (örneğin., Vitrocell, Cultex ALICE, vs.), in vitro olarak, aerosol maruz toksikolojik değerlendirmeler için geliştirilmiştir. Bu maruziyet modülleri de bu çalışmada vb havadaki kirleticilerin, havadaki partikülleri, nanopartiküllerin, bir toksikolojik değerlendirme için kullanılabilir, biz büyük ölçekli deneyler arasında düşük değişkenlik sağlayan, aynı anda 48 farklı numunelerin kadar kalabileceği Vitrocell sistemi kullanılan tedaviler. Vitro her aerosol maruz kalma, doku kültürü kirlenme riski olan azaltma deneyler boyunca doku kültürleri dikkatli kullanım gerektirir önemli bir risk olmaya devam etmektedir.

Veya sırasında, mikro gerçek zamanlı olarak parçacık birikimi ölçümüXposure deney maruz sisteminden üretilen CS dozlar beklentilerine uygun olduğunu izlemenize olanak sağlar. Ayarı-up çevrimiçi ölçüm doğru pozlama önce, örneğin, critial çünkü mikro (cm 2) alanları arasındaki farkın, Ayrıca 0'a ölçek kurma ve ölçülen partikül birikimi doğruluğunu sağlamak için doku kültürü eki (0.33 cm2), kültürlere ekin alanına nihai hesaplama arındırılmış mikro üzerinde depolanma sadece% 33 kültür eklemek gerçek birikimi göstermektedir.

Sıkı birleşim bariyer işlevini belirlemek için ve epitel tabakasının bozulmasını değerlendirmek için TEER ölçümü burada bildirilen uygulanması nispeten kolay bir işlemdir. Bronş ve burun doku modelleri mukus üreten serpiştirilmiş kadeh hücreleri içeren Ancak, apikal yıkama TEER ÇÇA önce yapılması gerekiyorkullanan akan. apikal yıkama kritik çünkü mukus tabakasının varlığı ve CS maruz kalma etkisi ile interferring kalınlığı kutu önyargı TEER ölçümü değişkenliği,. Bu kavram HILGENDORF ve Caco-2 hücrelerinin geçirgenliği mukus üreten goblet hücre hattı HT29 23 ile birlikte culturing etkilenen edildiği meslektaşları tarafından bildirilen ne ile uyum içindedir. Sağ maruz önce apikal yıkama CS doku yanıtları engel olabilir çünkü mukus önce TEER ölçümü için yıkanır gerekmektedir. Bu nedenle, ölçüm üç gün maruz önce yapılır ve maruz kalmadan önce doğru değildir.

Biz aktivite sadece mütevazı CS artarak rağmen CYP1A1 / CYP1B1 etkinliği CS maruz aşağıdaki organotipik kültür modelleri ölçülen olabileceğini gösterdi. Bu zayıf sinyal CYP1A1 / 1B1 alt-tabaka daha uzun bir kuluçka ile amplifiye edilebilir (örn., Lusiferin-CEE), örneğin çalıştırma için24 saat (veriler gösterilmemiştir). Bu çalışmada CYP etkinliği ölçümünün sınırlamalardan biri enzim aktivitesi üzerindeki değişiklik etkilenmeyen sağlamak için CYP protein düzeyi ya da gelecekteki çalışmalar için dikkate alınması gereken hücre sayısı, normalizasyon yokluğudur Protein seviyesi veya hücre sayımı ya değiştirilmesi.

Biz CS pozlama nazal ve bronş doku modelleri hem de yenerek Silier engellediğini bildirdi. Benzer gözlemler, çeşitli memeli ve memeli olmayan model 12 yapılmıştır. Kirpiksi, ölçme dayak dokular benzer bir şekilde ele alınır ve muamele edilmesini sağlayabilecekleri için orta değişiklik uygulanması halinde, tüm numuneler için uygulanması gereken örneğin önemlidir. Sutto ve arkadaşları pH frekansı 24 yenerek memeli Silier etkilediğini bildirdi. Bu nedenle, farklı bileşimlerdir / karışımları pH ile muamele edilmiş hücreler arasındaki frekanslar dayak karşılaştırırkenAyar siliyer Dayak ölçüm değişkenliği en aza indirmek için düşünülmelidir. Siliyer dayak frekansı, sıcaklığı azaldıkça düşer Üstelik, ölçüm yapılan sıcaklık, da önemlidir. Bu çalışmada kullanılan sıcaklık, CO2 ve nem kontrolü ile donatılmış, bu değişiklikler, bir sahne üstü kuluçka, bağlı değişkenliği en aza indirmek için. Buna rağmen, biz CS maruz kaldıktan sonra bronşiyal dokularda frekansları yenerek siliyer siliyer dayak maruz kaldıktan sonra son derece rahatsız hakkı olduğunu düşündüren, son derece değişken (yani., Bir ekleme artış ve diğer insert azalma) olduğunu gözlemledik. Bunun aksine, nazal doku tepkisi daha hassas ve tutarlı olduğuna işaret CS maruz kaldıktan sonra burun dokularında ölçülebilir siliyer dayak frekanslarının olmadığını gözlemledik. Bu burun dokusu gibi detoks için daha düşük bir kapasiteye sahip olduğunu gösteren bir önceki yayın ile uyum içinde olanbronş 25 ile karşılaştırıldığında.

Son olarak, biz dumanına maruz bırakılan organotipik bronşiyal ve nazal doku modelleri profil gen ifadesi ksenobiyotik metabolizması üzerine CS etkisi göstermek göstermiştir. Bir önceki yayın 15 daha ayrıntılı olarak ele alındığı gibi İlginç bir şekilde, CS maruz nitro modellerinde gözlenen Organotipik bronş ksenobiyotik metabolizma değişiklik ve burun sigara içenlerde, in vivo durumu benzeyebilir. Gen ekspresyon analizi için, robot cihaz kullanılarak yüksek verimli bir analizi mümkün kılar. Ayrıca, otomatik robotlu taşıma daha gen ifadesi sonuçlarının tutarlılığını ve doğruluğunu artırır. Bununla birlikte, doku örneklerinin hızlı toplama RNA ekstraksiyonu sırasında RNA bozulmasını önlemek için önemlidir. RNA işleme ve burada tarif edilen transkriptomik yaklaşımlar da, in vivo doku örnekleri uygulanabilir.

Disclosures

Bu çalışma, Philip Morris International tarafından finanse edildi.

Acknowledgments

Yazarlar yazının kendi gözden Maurice Smith ve Marja Talikka teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MucilAir-human fibroblasts-bronchia Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/
MucilAir Culture Medium Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/
VITROCELL VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=
3R4F reference cigarette University of Kentucky http://www2.ca.uky.edu/refcig/
30-port carousel smoking machine SM2000 Philip Morris, Int.
CiliaMetrix camera and software La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland
Leica DMIL microscope  Leica, Heerbrugg, Switzerland
LED light source Titan Tool Supplies, Buffalo, NY
Chopstick Electrode STX-2 World Precision Instruments http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter  World Precision Instruments http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/
Luciferin Detection Reagent 
MagNA Lyser Instrument  Roche http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66
chloroform  Sigma-Aldrich http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=
QIAcube  Qiagen 9001882
NanoDrop Thermo Scientific http://www.nanodrop.com/
Agilent 2100 Bioanalyzer  Agilent http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106
Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit Affymetrix http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit
Scanner 3000 7G  Affymetrix http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).
  3. Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465 (2011).
  4. Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).
  5. Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicolog. 244, 66-76 (2008).
  6. Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).
  7. Cho, M. -H., et al. A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker. Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).
  8. Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research. Journal of Allerg. 2012, 11 (2012).
  9. Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazi. , 19-24 (2010).
  10. Chhin, B., et al. Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy. PLoS genetic. 5, e1000422 (2009).
  11. Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro. Front Me. 7, 486-491 (2013).
  12. Talbot, P. In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents. Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).
  13. Port, J. L., et al. Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract. Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).
  14. Hoeng, J., et al. A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances. Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).
  15. Iskandar, A. R., et al. Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues. Biomed Res In. 2013, 512086 (2013).
  16. Karp, P. H., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).
  17. ISO 3402: Tobacco and tobacco products -- Atmosphere for conditioning and testing. , International Organization for Standardization. (1999).
  18. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , The R Core Team. (2011).
  19. Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips. BMC Bioinformatic. 5, 111 (2004).
  20. Hermida, L., et al. Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data. BMC genomic. 14, 514 (2013).
  21. Thomson, T. M., et al. Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models. Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).
  22. Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke. Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).
  23. Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).
  24. Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH. The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).
  25. Zhang, X., et al. Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium. Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).

Tags

Bioengineering Sayı 96 insan Organotipik bronşiyal epitel 3B kültür, sigara dumanı kirpikler dayak ksenobiyotik metabolizma ağ modelleri sistem toksikoloji
Tüm Sigara Dumanına Organotipik 3D Bronşiyal ve Burun Doku Kültürü Modelleri Tekrarlanan Pozlama Etki Değerlendirmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuehn, D., Majeed, S., Guedj, E.,… More

Kuehn, D., Majeed, S., Guedj, E., Dulize, R., Baumer, K., Iskandar, A., Boue, S., Martin, F., Kostadinova, R., Mathis, C., Ivanov, N. V., Frentzel, S., Hoeng, J., Peitsch, M. C. Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke. J. Vis. Exp. (96), e52325, doi:10.3791/52325 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter