Abstract
إمكانات سطح هي الخصائص الجسدية يغفل عادة أن يلعب دورا مهيمنا في التصاق الميكروبات إلى الركيزة الأسطح. كلفن القوة التحقيق المجهري (KPFM) هو وحدة من مجهر القوة الذرية (AFM) الذي يقيس فرق الجهد الاتصال بين السطوح في مقياس النانو. مزيج من KPFM مع AFM يسمح للجيل في وقت واحد من إمكانات السطحية والخرائط الطوبوغرافية من العينات البيولوجية مثل الخلايا البكتيرية. هنا، ونحن توظيف KPFM لدراسة الآثار المحتملة على سطح التصاق الميكروبات على الأسطح ذات الصلة طبيا مثل الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب. كشفت سطح خرائط المحتملة الاختلافات في إمكانية السطح لالأغشية الميكروبية على ركائز مواد مختلفة. تم إنشاء رسم بياني خطوة الارتفاع لإظهار الفرق في الإمكانيات السطح في منطقة الحدود بين سطح الركيزة والكائنات الحية الدقيقة. وقد تم ربط التغيرات في الخلوية إمكانات سطح الغشاء مع التغييرالصورة في الأيض الخلوي والحركة. ولذلك، KPFM يمثل أداة قوية التي يمكن استخدامها لدراسة التغيرات في الميكروبية إمكانات سطح الغشاء على الانضمام إلى السطوح المختلفة الركيزة. في هذه الدراسة، ونحن لشرح إجراءات لتوصيف إمكانات سطح الخلايا الفردية المقاومة للميثيسيلين المكورات العنقودية الذهبية USA100 على الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب باستخدام KPFM.
Introduction
الأغشية الحيوية المنتجة على أسطح المعدات والجروح الجلدية تمثل مشكلة للصناعة الطبية والأغشية الحيوية هي المتمردة لإزالة ويمكن أن تؤدي إلى زيادة معدلات انتقال المرض ومقاومة مضادات الميكروبات. المرفق هو الخطوة الأولى في تشكيل بيوفيلم وهي الخطوة الأكثر أهمية بسبب عكس لها 1-3. خصائص سطح الركيزة تلعب دورا حاسما في مرفق الميكروبي. وقد تبين أن عوامل مثل صلابة السطح، المسامية، خشونة، وللا مائية لإحداث مرفق الميكروبي. ومع ذلك، فقد تم القيام به القليل من البحث دراسة دور إمكانات سطح الركيزة (SP) على التصاق الميكروبات 4،5. الأسطح المشحونة سلبا منع المرفق من الجراثيم العصوية باسيلوس لالميكا، السيليكون، والذهب 6. تغيرات في غشاء المحتملة الخلوية هي تشير لتغييرات في مرفق الخلوي والحركة 5،7. وقد لوحظ أن هوم كهربائياالسطوح ogeneous تعزيز بسهولة أكبر الميكروبية التصاق 5. يمكن أن تميز إمكانات سطح البكتيريا على مقياس النانو توفير وسيلة جديدة لفهم حركية التصاق البكتيريا إلى مختلف الأسطح، وبالتالي يمكن أن تساعد في تطوير استراتيجيات مكافحة biofouling. وعلى عكس الطرق الأخرى المستخدمة لوصف حركية الكهربائية من البكتيريا، مثل تشتت الضوء الكهربي، وإمكانات زيتا، وتحديد نقطة تساوي الكهربائية، كلفن التحقيق قوة المجهر (KPFM) يسمح لفحص الخلايا الفردية بدلا من الثقافات كلها 8-11. وهذا مفيد عند الرغبة في مقارنة خلية خلية أو بيوفيلم الخصائص الكهربائية بدقة عالية ودقة.
KPFM هو وحدة من مجهر القوة الذرية (AFM). وقد وضعت AFM كنتيجة مباشرة للمجهر المسح النفقي (STM) 12. وقد أجريت هذه الصور نشرت لأول مرة باستخدام STM من قبل جيرد بينيج وهاينريش Rorhrer في عام 1982 12 12. ويمكن أيضا أن يتم STM في السوائل باستخدام نصائح التحقيق المتخصصة 13. وقد تبين ذلك من خلال ليندساي وآخرون، الذين استخدموا STM وAFM إلى صورة جزيئات الحمض النووي في 10 ملي HClO 4 و في الماء، على أقطاب الذهب 13. وقد تجلى KPFM في تحديد إمكانات سطح DNA والبروتين تحليل 25 والجزيئات الحيوية التفاعل مع بروابط 26.
KPFM تعمل عن طريق قياس اتصال فرق الجهد (CPD) بين AFM موصل طرف ناتئ وعينة موصل مثالي (الشكل 1، ط) 14،15. عينات لا يتعين بالضرورة أن يكون موصل (أي sampl البيولوجيالخانات). يمكن أن يتم التصوير بها على الميكا، والزجاج، والسطوح السيليكون (غير موصل) طالما سطح غير موصل رقيقة، وهناك مادة موصلة الكامنة 6،7. وثيقة البرنامج القطري ما يعادل سطح المحتملين الجهد ويمكن وصفها بأنها الفرق في وظائف العمل بين طرف (φ طرف) وعينة (عينة φ)، مقسوما على شحنة الإلكترون السالب (- ه). عندما يتم إحضارها تلميح AFM موصل على مقربة من سطح العينة (مفصولة المسافة د)، يتم إنشاء القوة الكهروستاتيكية (عناوين F) وذلك بسبب الفرق في الطاقات فيرمي (الشكل 1، والثاني، أ) 15. في هذه المرحلة، والطاقات فراغ من طرف وعينة (E ت) هي في حالة توازن والانحياز. على جلب غيض أقرب إلى سطح العينة، وغيض وعينة سطح تتلامس الكهربائية والتصرف كما المكثفات لوحة موازية (الشكل 1، والثاني، ب 14،15. في هذه النقطة، والطاقات فيرمي من طرف وعينة السطح تصبح الانحياز، التوصل إلى توازن الحالة المستقرة (الشكل 1، والثاني، ب). وستحمل سطح طرف وعينة وسوف تشكل CPD V بسبب وجود اختلاف في E ضد الصورة والعمل وظائف. A F فاق أفعال على منطقة الاتصال الكهربائية بسبب CPD V تشكيلها. وألغى هذه القوة في وقت لاحق من خلال تطبيق على DC V الخارجية إلى طرف له نفس الحجم مثل CPD V شكلت (الشكل 1، والثاني، ج). هذا تطبيق DC الجهد يلغي تهمة السطحية في مجال الاتصال الكهربائية، ومقدار V DC ضرورية للقضاء على وفاق F من V CPD يساوي الفرق في وظائف العمل بين ساmple السطحية وطرف 15. وتجدر الإشارة إلى أن وظيفة عمل من طرف معروفة وتقديمها من قبل الشركات المصنعة. في جميع وسائل KPFM، وهو الجهد AC (V AC، ما يقرب من 100-500 فولت) يتم تطبيق أيضا إلى طرف من أجل توليد القوى الكهربائية تتأرجح بين طرف والعينة 14. وهذا يوفر أفضل قرار عند قياس التغيرات في V CPD و / أو وفاق F. في هذا الصدد، والتغيرات في التردد أو السعة من التذبذب الكهربائية يمكن تصحيحها عن طريق V DC، وسطح يمكن إنشاء الخرائط المحتملة. بيانات من مناطق محددة من هذه الخرائط يمكن تحليلها لتوفير المعلومات حول الميزات الكهربائية الطبوغرافية محددة.
KPFM يمكن تشغيلها في ثلاثة أوضاع: (1) وضع المصعد، (2) تعديل السعة (AM) واسطة، و (3) تضمين التردد (FM) واسطة 14،16. كان وضع ارفع المؤتمر الوطني العراقي الأوليarnation من KPFM. يعتمد وضع رفع على طريقة بتمريرين التي يتم سحب تلميح تأرجحت عبر السطح للحصول على صورة الطبوغرافية. للمسار الثاني يتم رفع رأس مسافة محددة مسبقا فوق العينة (10-100 نانومتر) ومسحها العودة عبر نفس المنطقة. ونتيجة لهذا الأسلوب تمرير اثنين، ووضع المصعد، مقارنة صباحا و وFM-KPFM، ويأخذ وقتا أطول لاكتساب صورة. رفع طرف بعيدا عن سطح يضمن أن يتم قياس طويلة المدى فقط F وفاق. أيضا، يتم فصله عبر الحديث بين التضاريس والسطح قياسات المحتملة على حساب زيادة قرار الجانبي والحساسية.
AM-KPFM يحسن قرار الجانبي والحساسية باستخدام الترددات المزدوجة في وقت واحد لقياس تضاريس العينة وإمكانات السطحية (واحدة تمر مسح) 14. في AM النمط، تراوح ناتئ ميكانيكيا، عموما 5٪ أقل من الأول ترددها الرنانة (و 0)، وتأرجحت كهربائيا (رhrough لV AC) في ترددها الثاني الرنانة (و 1). التغيرات في اتساع و 0 تؤدي إلى توليد البيانات الطبوغرافية، في حين أن التغيرات في اتساع و 1، نتيجة للتغيرات في وفاق F وV CPD، وإعطاء بيانات القياس المحتملة السطح. و 0 و 1 و للناتئ تكون مفصولة الترددات والطاقات الكبيرة التي تشير إلى أدنى حد ممكن عبر الحديث 14. مربع الالكترونيات رئيس (عب) من AFM يفصل من الإشارات اثنين لإعطاء كلا الطوبوغرافية والسطحية البيانات المحتملة في وقت واحد في مسح واحد. FM-KPFM يحسن قرار أبعد من AM-KPFM على الأسطح البيولوجية 14. FM-KPFM يعمل بشكل مختلف عن AM-KPFM في أنه يقيس التغيرات في التدرجات القوة الكهروستاتيكية بدلا من القوة الكهروستاتيكية (عناوين F) 15. مثل AM اسطة، ووضع FM يستخدم الترددات المزدوجة وسينغلتمريرة الإلكترونية آلية المسح الضوئي للحصول على الطبوغرافية والسطحية البيانات المحتملة في وقت واحد 14. في وضع FM، وتأرجحت ناتئ ميكانيكيا في f 0 وتأرجحت كهربائيا في التردد المنخفض المعدلة (و وزارة الدفاع، وعادة 1-5 كيلو هرتز). على التفاعلات كهرباء، و 0 و F مزيج زارة الدفاع لإنتاج أشرطة جانبية و و 0 ± وزارة الدفاع. هذه sidebands حساسة جدا للتغيرات في القوة الكهروستاتيكية، ويمكن فصلها عن و 0 إلى HEB على AFM ل. منذ FM-KPFM يقيس التغيرات في التدرجات القوة الكهروستاتيكية، نصائح على شكل ذروتها ولها صيانة / سلامة تلعب دورا حاسما في السطح الكلي قرار محتمل 14 و 15. السطحية قرار محتمل باستخدام AM وسائط FM هي في حدود 1 نانومتر أفقيا 14 -16. وتجدر الإشارة إلى أن KPFM التصوير يمكن القيام به في السوائل غير القطبية، وأكثر من ذلك في الآونة الأخيرة، وقد تبين مما ينبغي عمله في (<10 ملم) السوائل القطبية منخفضة الأيونية (فيوسائط KPFM حلقة مفتوحة والتي لا تتطلب ردود الفعل التحيز، مما يغني عن تطبيق التحيز DC) مثل المياه MilliQ. ومع ذلك، لم يتم بعد القيام KPFM التصوير على الخلايا الحية في حلول القطبية 17-20. التحديات الإضافية المرتبطة التصوير SP في السائل هو أن الحلول التي تستخدم عادة للخلايا الحفاظ على (أي الفوسفات مخزنة المالحة) لديها تركيزات عالية من الأيونات النقالة، والتي من شأنها أن تؤدي إلى ردود فعل Faradaic، وديناميات تهمة الناجم عن التحيز، والأيونات نشر / إعادة توزيع 20. وهكذا، على هذه التجربة، وقد أخذت مقاييس من خلايا MRSA المجففة والميتة على أسطح بين functionalized الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب بولي-L-يسين في ظل الظروف المحيطة. يمكن أن يتم التصوير في ظروف الهواء أو الفراغ على العينات البيولوجية التي تم سابقا المجففة أو يجمد على السطوح 20. وقد تبين أيضا أن تؤثر الظروف الرطبة التصوير KPFM الأسطح 6.
في هذه الدراسة، قمنا بتوظيف FM-KPFMوAFM إلى دراسة دور SP على المرفق المقاومة للميثيسيلين المكورات العنقودية الذهبية USA100 (MRSA) إلى السطوح بين functionalized بولي-L-يسين الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب. هذه الجرثومة قد اثار مؤخرا وضعية متعددة والمقاومة للعقاقير (MDR) "بكتيريا" بسبب مقاومته اختيار طبيعي لكثير من المضادات الحيوية β لاكتام والسيفالوسبورين 21. التهابات MRSA هي الآن أكثر تحديا، صعبة، وهائلة لعلاج، مما أدى إلى استخدام مضادات الميكروبات أقسى مثل فانكومايسين أو oxazolidinones التي لديها مستويات سمية أعلى في البشر، وبالتالي لا يمكن استخدامها في العلاجات طويلة الأجل 22. وقد تم اختيار الفولاذ المقاوم للصدأ نظرا لأهميتها الطبية والاستخدام المشترك كمادة في إبر الحقن، مدفئة السرير، مقابض الأبواب، والمصارف، وما إلى ذلك كان يستخدم الذهب كمعدن المقارن. استخدمت FM-KPFM لفحص إذا تغير الميكروبية غشاء SP على التعلق ركائز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد زجاجيات والثقافات
- قبل الشروع في هذه التجربة، وإعداد أجار الدم 5٪ الغنم (SBA) لوحات لزراعة هذه الجرثومة. احتضان لوحات SBA لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية. بعد هذا الوقت، يجب أن تكون واحدة، مستعمرات معزولة جيدا الحالي لاستخدامها في التلقيح اللاحقة في وسائل الإعلام السائلة. متجر يشوبه وحات SBA مع المستعمرات واحد في 4 درجات مئوية لمدة 1 - 2 أشهر.
ملاحظة: لوحات أجار الدم الأغنام وتأتي في حزم مسبقة الصنع تحتوي على ما بين 20 - 25 لوحات على أساس الشركة المصنعة، وتتكون عادة من قاعدة أجار الصويا زيتية مع إضافة 5٪ ث / الدم ضد الغنم. - جعل 500 مل من مرق الصويا زيتية (TSB) تستكمل مع 1٪ جلوكوز و 0.1٪ كلوريد الصوديوم. بعد هذا، جمع وتنظيف 2 أنابيب الاختبار الزجاجية. إذا الأغطية autoclavable غير متوفرة للأنابيب الاختبار، واستخدام رقائق الألومنيوم بمثابة الغطاء. الأوتوكلاف TSB وأنابيب اختبار مع علبة من 1 مل نصائح ماصة.
- في إطار مجلس الوزراء السلامة البيولوجية أو بالقرب من الكعك أون الموقد، ماصة 5 مل من قبل تعقيمها TSB في أنابيب الاختبار تعقيمها. كن حذرا لضمان ما يكفي من الوقت وقد أعطيت للسماح للTSB وأنابيب اختبار يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. من مجزع سابقا 5٪ SBA لوحة، وتطعيم مستعمرة واحدة في 6 مل TSB مرق. واحد يحتوي على MRSA، وسيتم استخدام أنبوب الاختبار الثاني كعنصر تحكم سلبية لضمان العقم.
- خذ الملقحة TSB أنابيب الاختبار ووضعها في حاضنة متبادلة لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية، وعند 200 دورة في الدقيقة. بعد هذا الوقت ينبغي أن يكون النمو الميكروبي واضح في أنبوب الاختبار MRSA في حين لا ينبغي أن النمو قد حدثت في أنبوب اختبار السيطرة.
- تأخذ 1 مل من ثقافة 24 ساعة وماصة في 6 مل من TSB الطازجة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات في 200 دورة في الدقيقة.
- ماصة 1 مل من 6 ساعات الثقافة الفرعية في أنبوب 1.5 مل microfuge. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 850 ز س. إزالة طاف واعادة تعليق بيليه في 1 مل من H 2 O. منزوع الأيونات أجهزة الطرد المركزي، وتكرار، وإعادة تعليق.
"jove_title"> 2. التنظيف والتلقيح من الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب ركائز
- خذ الفولاذ المقاوم للصدأ وعينة الأقراص AFM الذهب (عيار 20 ملم و 10 ملم أقطار التوالي) وتنظيف كل جانب مع 5 مل من H 2 O. منزوع الأيونات عقد الأقراص عينة في اليد المهيمنة مع ملقط واستخدام اليد subdominant لماصة 5 مل على كل جانب من القرص العينة. بعد غسل كلا الجانبين، والأقراص عينة مكان في كوب تحتوي على 20 مل من H 2 O منزوع الأيونات تليها صوتنة لمدة 1 دقيقة.
- بعد استخدام ملقط صوتنة لإزالة الأقراص عينة من الكأس. وضع الأقراص بحيث الهزيل في زاوية 60 درجة ضد حافة لوحة بيتري مفتوحة على منشفة ورقية. استخدام غطاء لوحة بيتري لتغطية الأقراص التجفيف. السماح الأقراص تجف تماما قبل المتابعة. وقت التجفيف يمكن أن تختلف بين 4-8 ساعة.
- الجاف مرة واحدة، واستخدام ملقط لوضع الأقراص العينة إلى لوحة بيتري.
- اختياريا، functionalize أسطح الأقراص عينة مع أي مادة (على سبيل المثال، الكولاجين، وحمض الهيالورونيك، والفضة نانو جزيئات، وما إلى ذلك).
- لهذه التجربة، واستخدام بولي-L-ليسين لمعطف سطح الركيزة. للبولي-L-يسين functionalization، ماصة 200-400 ميكرولتر من 0.1٪ بولي-L-ليسين (في H 2 O) على الأقراص العينة، والسماح احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في طبق بتري.
- بعد 1 ساعة، واستخدام ملقط لعقد القرص العينة، وتغسل مع 1 مل من H 2 O. منزوع الأيونات اسمحوا الجافة على مناشف ورقية كما هو موضح في الخطوة 2.2.
- خذ 2X غسلها إعادة علقت الخلايا ولوحة 200-400 ميكرولتر على أقراص عينة داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. إذا والمغلفة أقراص عينة مع بولي-L-ليسين، احتضان لمدة 0.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- بعد مرور فترة الحضانة من الخلايا على أقراص عينة، وغسل أقراص عينة بلطف مع 1 مل من H 2 O. منزوع الأيونات السماح الأقراص تجف بين عشية وضحاها قبل التصوير.
3. KPFM التصوير
ملاحظة: للحصول على هذه التجربة،استخدام سلسلة اجيلنت 5500 ILM-AFM.
- لبدء AFM، بدوره على وحدة الكمبيوتر جنبا إلى جنب مع HEB وMAC III تحكم في AFM ل. برامج التصوير المفتوحة AFM (على سبيل المثال، PicoView اجيلنت). تأكد من تحديد ACAFM أو أيهما تسمية الصحيح هو على AFM للتصوير في وضع متقطعة-الاتصال في البداية.
- باستخدام ملقط AFM في اليد المهيمنة، وعقد مقطع حامل بنابض مفتوحة مع اليد subdominant، ضع ناتئ KPFM إلى أن رئيس من قطعة. كن حذرا عند التعامل مع ونقل AFM رئيس من قطعة إلى AFM كما هذه الوحدة (على الأقل في 5500 ILM-AFM) يحتوي على وحدة بيزو الكريستال الهشة التي تسيطر X، Y، Z وdirectionalities المسح.
ملاحظة: الكابولي KPFM المستخدمة في هذه الحالة كانت Mikromasch موصل DPE (منخفضة الضوضاء) الكابولي مع متوسط الترددات الرنانة من 80 كيلو هرتز والربيع ثوابت 2.7 N / م. وقد تم اختيار الكابولي مع هذه الترددات الرنانة والثوابت الربيع نظرا لسهولة استخدامها.ويمكن أيضا الكابولي مع ثوابت الربيع اكبر والترددات الرنانة أعلى أن تستخدم للتصوير. - تحميل بعناية رأس من قطعة إلى AFM وربط الأسلاك المناسبة (في هذه الحالة تحتاج اثنين من الأسلاك ليكون في صوم: ضوء الليزر ومرحلة رفع السيارات).
- محاذاة الليزر على غيض من ناتئ. بعض وحدات تحتوي على وظائف الكاميرا التي تسمح للمحاذاة أسهل. إذا وظائف الكاميرا ليست موجودة على AFM، محاذاة على طرف ناتئ كما هو موضح بعد ذلك:
- تناوب على مقبض الباب في اتجاه عقارب الساعة الجبهة إلى الخلف لتحريك الليزر فاق رقاقة ناتئ. عندما يصل ليزر رقاقة سيتم حظره ولن تكون مرئية. تتحول فقط على مقبض عدة مرات.
- تناوب على مقبض الباب الجبهة إلى الخلف عكس اتجاه عقارب الساعة حتى يظهر بقعة الليزر. الليزر هو الآن على حافة رقاقة.
- تناوب على مقبض الباب من اليسار إلى اليمين لوضع الليزر على ناتئ. كما يمر الليزر على ناتئ وسوف تختفي وتعود الى الظهور طن تعاقب سريع. يجب أن يكون بقعة الليزر مرئية في غطاء زجاج بلوري حيث وحدة الثنائي الضوئي سيجلس في وقت لاحق.
- أدر مفتاح الأمامي إلى الخلف عكس اتجاه عقارب الساعة لتحريك بقعة أسفل ناتئ نحو الطرف حتى بقعة على زجاج بلوري يختفي.
- تحويل إلى الوراء في اتجاه عقارب الساعة مقبض الباب الأمامي قليلا فقط من أجل وضع الليزر بحيث يجلس فقط على طرف ناتئ. سوف بقعة الليزر الظهور على زجاج بلوري.
ملاحظة: هذا هو الأسلوب تحديد المواقع ليزر لالكابولي الغوص متنها. لالكابولي الثلاثي، وعملية المواءمة تختلف قليلا.
- مرة واحدة يتم محاذاة الليزر، وعقد المحرك مرحلة رفع في موقف "فتح" لمدة 10 ثانية لضمان مساحة كافية بين ناتئ والعينة عند إرفاق العينة إلى AFM.
- ضع العينة على مرحلة عينة KPFM. الأرض العينة باستخدام الأسلاك النحاسية. ربط الأسلاك المناسبة من AFM إلى مرحلة العينة. ربط الصورةالمئوية إلى AFM. في معظم الحالات يتم عقد المرحلة في مكانها باستخدام المغناطيس.
- في البرنامج AFM، ضبط ناتئ ثم يبدأ نهج من طرف ناتئ للعينة. ضمان تسوية الوقت الذي وضعت في ما لا يزيد عن 10 ميللي ثانية، وهذا النهج بسرعة لا تتجاوز 2.0 ميكرون / ثانية من أجل تجنب الضرر طرف.
- مرة واحدة طرف ناتئ على سطح العينة، حدد حجم إطار التصوير ومنطقة التصوير المثالي. تحسين المكاسب الأول وP جنبا إلى جنب مع نقطة مجموعة ناتئ بحيث يتم تحسين التصوير الطوبوغرافي.
- مرة واحدة هو الأمثل التصوير الطوبوغرافي، بدوره على وحدة KPFM (إما FM أو AM اسطة؛ هنا، استخدام وضع FM). وتجدر الإشارة إلى أن KPFM التصوير هو صعبة للغاية خارج من 5 ميكرون × 5 ميكرون نافذة التصوير. أيضا، لتصوير KPFM الأمثل، واستخدام دقة 512 × 512 مع السرعات البطيئة المسح الضوئي (0،02-0،05 خطوط / ثانية).
- لإعدادات FM-KPFM (لا ACAFM إعدادات)، تعيين محرك الأقراص في المئة بين 5-10٪. تعيين الاب ناتئequency بين 1-5 كيلو هرتز مع عرض النطاق الترددي من 2 كيلو هرتز. تعيين الأول والمكاسب P للحصول على الضبط FM-KPFM إلى 0.3٪.
- تختلف عرض النطاق الترددي إشارة وأنا والمكاسب P بين الأسطح العينة. لتحسين التصوير SP، مما زاد من ضبط عرض النطاق الترددي إشارة وأنا والمكاسب P للحصول على صور مثالية. النطاق الموصى به من مكاسب أنا وP هم 0،22-0،35٪.
- عملية جمع وتحليل الصور KPFM باستخدام ما بعد الصورة برامج معالجة لجمع البيانات SP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
القدرة على قياس SP باستخدام KPFM تعتمد على مبدأ أن كلا من سطح العينة وناتئ طرف وموصل إلى حد ما. الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب تصرف الأسطح الموصلة على النحو الذي كانت تعلق MRSA. واتخذت صورة KPFM من 15 خلايا MRSA على كل الأسطح مع 512 × 512 القرارات، ومع المناطق المسح تتراوح بين 5 × 5 ميكرون إلى 10 × 10 ميكرون. وأجري المسح خارجا مع الخط بسرعة تتراوح بين 0.02 خطوط / ثانية إلى 0.05 خطوط / ثانية. لذلك، مع 512 نقاط البيانات التي تم جمعها في خطوط خط و 512 لمسح وتراوحت مرات المسح الضوئي من 2.84 ساعة إلى 7.11 ساعة. ويمكن رؤية أنواع الصور التي تم جمعها في الشكل 2. KPFM تعمل باستخدام ترددات مزدوجة، وعلى هذا النحو، يتم جمع الصور الطبوغرافية في وقت واحد جنبا إلى جنب مع بيانات عن الخصائص الكهربائية من السطح. طبقت مرشحات الحرارية ليرة سورية الخرائط من أجل تمييز أكثر سهولة تغييرات صغيرة في إمكانية السطح (الشكل 2). البيانات من خرائط SP ثكما حلل برامج معالجة ما بعد صورة لتحديد متوسط إمكانات السطحية والانحرافات المعيارية. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام البرمجة R المصدر المفتوح الإحصائية. أجريت طالب تي اختبارات لمقارنة المجموعات مع P <0.05 يجري النظر كبيرة.
وقد تم تحليل الصور SP لتحديد الميكروبية إمكانات سطح الغشاء. وكانت هذه ثم مقارنة مع نمو على السطوح الركيزة مختلفة. وقد تم ذلك من أجل تحديد ما إذا كان نوع السطح تأثير على الجراثيم إمكانات سطح الغشاء. في البداية حاولنا احتضان خلايا MRSA بشكل ثابت لمدة 3 ساعة على السطوح الركيزة. ومع ذلك، لم تكن هناك أية ميكروبات المرفقة مرئية تحت AFM. تم تحديد البيانات SP لنظيف وبولي-L-يسين السطوح بين functionalized من 5 × 5 ميكرون المناطق الممسوحة ضوئيا. وأظهرت بالاشعة SP من ركائز الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب العارية العارية إمكانات سطح السلبية عموما (-0.045 ± 0.057 V و-0.126 ± 0.052 V، على التوالي، P = 0.047، الشكل 3). تم استخدام بولي-L-ليسين من أجل functionalize السطوح لجعلها أكثر ملاءمة للمرفق الخلية. وأظهرت السطوح بين functionalized التحول إلى إمكانات سطح إيجابية للأسطح الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب (0.133 ± 0.063 V و0.126 ± 0.030 V، على التوالي، الشكل 3). درسنا في وقت لاحق إمكانات غشاء من هذه الجرثومة على السطوح بين functionalized بولي-L-يسين الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب. وقد وجد أن إمكانات غشاء الخلية MRSA تنوعت بين الفولاذ المقاوم للصدأ والأسطح الذهب. أسطح الفولاذ المقاوم للصدأ أدت إلى المنتجات الخاصة غشاء إيجابية أكبر بكثير لخلايا بالمقارنة مع نظيره الذهب. على سبيل المثال، SP الخلايا MRSA تحول من الموجب إلى المنتجات الخاصة السلبية. أظهر MRSA إيجابي SP على أسطح الفولاذ المقاوم للصدأ مع المنتجات الخاصة من 0.160 ± 0.022 V وSP من -0.025 ± 0.016 V على الأسطح الذهب (P <0.001).
لإظهار القدرات الكاملة للKPFM، مثالرسم بياني خطوة ارتفاع MRSA على الفولاذ المقاوم للصدأ وتقدم (الشكل 4). وهذا يدل على الفرق في الإمكانيات السطح بين سطح الركيزة والغشاء الميكروبي.
الشكل 1. مبادئ العامل المجهر الذري قوة (ط) وكلفن القوة التحقيق المجهر (ب) أعيد طبعها بإذن من (15). ويظهر التكوين الأساسي للAFM في (ط). في AFM، ويرد تلميح شحذ إلى ناتئ من خلال ترسب الكهروكيميائية. واستخدمت Mikromasch موصل DPE (منخفضة الضوضاء) الكابولي المغلفة البلاتين في هذه التجربة كان لأبعاد 210 × 30 ميكرون، تردد صدى 80 كيلو هرتز، والثوابت الربيع من 2.7 N / م. كانت تعلق الكابولي لشريحة أكبر من أجل السماح لسهولة التعامل. تجميعها مرة واحدة في AFM، يتم محاذاة الليزر على طرف ناتئ. الانحرافات في cantilتم الكشف عن معلومات سرية من أي وقت مضى من خلال الثنائي الضوئي. وتستخدم الانحرافات لتوليد الصور الطوبوغرافية. (الثاني، أ، ب، ج) ويبين مبدأ عمل KPFM. يتم جلب ناتئ قريبة بما فيه الكفاية إلى السطح للسماح للاتصال الكهربائي تحدث. الاختلافات في الإمكانيات السطح بين طرف وسطح تتسبب في تلميح إلى درئه. يتم تطبيق DC الجهد لتصحيح هذا الانحراف. هذا DC الجهد المطبق يساوي احتمال سطح سطح الركيزة. اعتمادا على نوع وضع التصوير المستخدمة (أسانسير، AM، FM)، وهذا مبدأ العمل يختلف قليلا. الشكل (1) (ب) تم تعديل من 15.
الشكل 2. تضاريس السطح الممثل وخرائط المحتملة لهذه الجرثومة على ركائز بين functionalized بولي-L-يسين الفولاذ المقاوم للصدأ والذهب. الصور (الأول والثالث) وتظهر الصور تضاريس التمثيلية الخلايا MRSA على الفولاذ المقاوم للصدأ والأسطح الذهب، على التوالي. ويمكن رؤية أبعاد الصورة في X و Y محور هذه الصور جنبا الى جنب مع الملونة الشخصية ارتفاع المقابلة. (الثاني والرابع) تظهر المقابلة الخرائط SP من هذه الجرثومة على السطوح كل منهما. طبقت "الذهب" مرشحات لونية معيار لتضاريس الصور بينما طبقت مرشحات الحرارية ليرة سورية الصور لتبين بسهولة أكبر التغييرات الصغيرة في SP. وتجدر الإشارة إلى أن SP السطوح الركيزة لم يكن متجانسا. تم العثور SP ليتم توزيعها بتباين مع المناطق الإيجابية والسلبية واضحة على كل السطوح الركيزة. ويمكن ملاحظة ذلك حول الخلايا MRSA حيث لوحظ المنتجات الخاصة غير متجانسة على ركائز الصلب غير القابل للصدأ والذهب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
52327 / 52327fig3highres.jpg "/>
الشكل 3. إمكانات سطح من السطوح الركيزة وMRSA الأغشية الخلوية. ويبين الشكل 3 البيانات المناظرة KPFM من الفولاذ المقاوم للصدأ (المسمى هنا كما SS) والسطوح الذهب، فضلا عن بيانات من 15 الخلايا. تمثل العلامات النجمية اختلافات كبيرة بين عينات مع عدد من العلامات النجمية المقابلة لعينات مقارنة. وقد تم جمع بيانات هذه الجرثومة من خلايا تعلق على السطوح بين functionalized بعد 30 دقيقة من الحضانة. وقد تم ذلك يرجع ذلك إلى حقيقة أن أي خلايا تم العثور على لنعلق على السطوح الركيزة العارية بعد 3 ساعة.
الرقم 4. الخطوة الارتفاع سطح الصورة المحتملة لهذه الجرثومة على بولي-L-يسين بين functionalized الفولاذ المقاوم للصدأ. عن طريق ما بعد الصورة برامج معالجة، تم إنشاؤها على الرسم البياني خطوة الارتفاع في أجل إظهار capabiliالعلاقات من البرنامج، وكذلك، والفرق ملحوظ في SP بين سطح الركيزة وغشاء الخلية. يتم تمثيل منطقة مستعرضة المختار على الخريطة SP المطابقة مع خط رمادي. التحول من 0.15 V على سطح الخلية إلى 0.21 V على سطح الركيزة هو واضح بشكل واضح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| شركة | التحقيق النوع | الربيع ثابت (N / م) | تردد الرنين (كيلو هرتز) | ناتئ الأبعاد | تلميح قمة قطر |
| بحوث اللجوء | AC240TM-R3 | 2 | 70 | طول = 240 ميكرون العرض = 40 ميكرومتر </ td> | 28 نانومتر |
| بروكر AFM المسابر | SCM-PIT | 2.8 | 75 | طول = 225 ميكرون العرض = 28 ميكرون | 20 نانومتر |
| Mikromasch | موصل DPE (منخفضة الضوضاء) الكابولي | 2.7 | 80 | طول = 210 ميكرون العرض = 30 ميكرون | 40 نانومتر |
| نانو وأكثر USA | PTSI-NCH | 42 | 330 | طول = 125 ميكرون العرض = 30 ميكرون | > 25 نانومتر |
| الآلات علم النانو | AppNano موصل التنصت على الوضع AFM تحقيقات. | 40 | 300 | طول = 125 ميكرون العرض = 35 ميكرون | 30 نانومتر |
| الآلات علم النانو | AppNano موصل التنصت على الوضع AFM تحقيقات. | 40 | 300 | طول = 125 ميكرون العرض = 35 ميكرون |
الجدول 1. الشركات التي تقدم مجموعة واسعة من تحقيقات KPFM. مجموعة متنوعة من الشركات تقدم الآن KPFM طرف مع اختلاف أقطار تلميح مهيمنة، والثوابت الربيع، والترددات الرنانة. تلميح التخصيص بالقرب لا حدود لها، مع الشركات التي تقدم عادة لبناء الكابولي بمواصفات مخصصة لتجربة المقصودة. معظم تحقيقات KPFM هي البلاتين المغلفة نيتريد السيليكون. تقدم البلاتين وظائف الموصلة إلى ناتئ. وتشمل مواد الطلاء الشائعة الأخرى الايريديوم والبلاتين + الايريديوم، والذهب. ويمكن أيضا أن معظم النصائح KPFM أن تستخدم بدلا من ذلك لمجهر القوة الكهربائية (EFM). تلميح قمة مهمة لالكابولي KPFM. نصائح قطرها أكبر التضحية أعلى التصوير قرار تضاريس لأقل من الضجيج الكهربائي. وعلى العكس، نصائح قطرها أصغر (<25 نانومتر) العرض تحسين دقة وضوح الصورة تضاريس ولكن هم أكثر عرضة للضوضاء الكهربائية. لهذه الدراسة، استخدم الباحثون Mikromasch السلوكإيف DPE (منخفضة الضوضاء) الكابولي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كان يعمل KPFM كتقنية جديدة للحصول على بيانات الكهربائية السطح. وعادة قد تستخدم كوسيلة من وسائل لدراسة توزيع تهمة في الكيمياء وبدأت مؤخرا فقط ليتم تطبيقها لدراسة النظم البيولوجية على المتناهية الصغر والمقاييس نانو. من البيانات التي تم جمعها وجدنا أن الميكروبات لا يبدو أن نعلق بسهولة لتنظيف الأسطح غير القابل للصدأ الصلب والذهب، وحتى بعد 3 ساعات من الحضانة ثابتة. وأظهرت بولي-L-يسين السطوح بين functionalized مرفق الميكروبي السريع بعد 30 دقيقة. أدت مرات حضانة أطول من الميكروبات على الأسطح بين functionalized إلى خلية الاكتظاظ على السطوح عينة، والصور تضاريس الفقيرة. أدى functionalization السطح إلى التحول من السلبية إلى الإيجابية SP SP لغير القابل للصدأ الأسطح الصلب والذهب. وقد أظهرت دراسات سابقة أن الكائنات الحية الدقيقة وعادة ما يكون المنتجات الخاصة سلبية بسبب عزل أيونات سالبة الشحنة حول الخلايا للحفاظ على ناضح والتوازن الأيوني 23. ومن المعروف أيضاأن وجود مجموعات الفوسفات في غرام الكائنات الحية الدقيقة السلبية والأحماض تيكوئيكية في الكائنات الحية الدقيقة موجبة الجرام يؤدي أيضا على تشكيل سلبي المنتجات الخاصة 24. علم الكيمياء الأساسية للغرام أغشية الخلايا الإيجابية والسلبية أدت بنا أن نفترض أن المنتجات الخاصة الركيزة إيجابية من شأنه أن يؤدي إلى التعلق الميكروبي السريع. لكن، وكما يمكن أن يرى في الأرقام 2-4، أن كان هناك تحول كبير من الموجب إلى المنتجات الخاصة خلية MRSA سلبية على ركائز الصلب غير القابل للصدأ والذهب، على التوالي. مرفق الميكروبية يمكن أن حدثت في البداية من تنحية الأيونات السالبة حول الغشاء. على غسل الخلايا والسماح لهم الجافة على السطوح الركيزة، يمكننا أن تم غسل بعيدا عن هذه الوسائط الأيونية. أيضا، تجدر الإشارة إلى أن البيانات KPFM هو فقط شامل للمناطق جدار الخلية الخارجية للموجبة الجرام (MRSA) الخلايا. ولقد ثبت في بعض الحالات أن إمكانات غشاء الخلية الكائنات الحية الدقيقة قد تتغير على وجود catioالببتيدات المضادة للميكروبات شركة الاستثمارات الوطنية أو غيرها من الإجهاد 8.
العيب الرئيسي واحد من KPFM مقارنة القياسات المحتملة زيتا القياسية على مزارع الخلايا الجرثومية هو أنه في KPFM يتم البيانات التي تم جمعها على الخلايا الميتة والمجففة. وقد استخدم KPFM لدراسة الاتجاهات العامة في التحولات المحتملة سطح الخلية فيما يتعلق مختلفة الأسطح مرفق الركيزة. تطبيق DC الفولتية إلى طرف ناتئ (لمواجهة وفاق F)، جنبا إلى جنب مع اشتراط وجود سطح العينة موصل، والحد من KPFM القياسية لفتح الهواء التصوير. التصوير في السائل القطبي غير ممكن حاليا مع KPFM القياسية، وبالتالي تصوير الخلايا الحية باستخدام KPFM ليس اعتبارا من بعد ممكن. وقد أظهرت تطورات جديدة حلقة مفتوحة وسائط KPFM التردد المزدوج وعد في قدرتها على الأسطح الصورة في الحلول المنخفضة الأيونية 18-20. ويحدونا الأمل في أن يتم في المستقبل تم تطوير هذه التكنولوجيا مزيد ذلك يمكن القيام به أن التصوير على ليفمزارع الخلايا ه. ان التصوير من الخلايا في بيئة طبيعية أكثر مما لا شك فيه أن يؤدي إلى توليد بيانات SP غشاء الخلية أكثر دقة وواقعية. لهذه الدراسة أردنا تطبيق هذه التكنولوجيا في طريقة جديدة لقياس إمكانات غشاء الخلية الميكروبية، وكذلك دراسة خصائص التصاق MRSA على سطح ذات الصلة طبيا. وقد لوحظت تغييرات في المنتجات الخاصة غشاء الميكروبية على حضانة على السطوح الركيزة مختلفة. وهذا قد يعني أن نوع الركيزة قد تؤثر على الأيض الخلوي. أملنا هو أن هذه البيانات الأولية قد يؤدي إلى توليد نانو الطلاء مع الشحنات الكهربائية الكامنة التي يمكن تطبيقها على الأسطح أو المعدات الطبية (بما في ذلك مواد أخرى مثل الضمادات والشاش) من أجل منع التعلق الميكروبي. ويهدف البروتوكول موضح في غضون هذه المقالة لمساعدة الباحثين على فهم مبادئ KPFM وعرض الطرق التي يمكن تطبيقها لقياس وخلق SP الخرائط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
| DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
| PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
| Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
| Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |
References
- Seth, A. K., et al. In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review. J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).
- Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. Biofilms and chronic infections. JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).
- Hoiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. Micro. Infect. 3 (2), 55-65 (2011).
- Zhang, W., Hughes, J., Chen, Y. Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of E. coli cells. Appl. Environ. Microbiol. 78 (11), 3905-3915 (2012).
- Lorite, G. S., et al. Surface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm development. PLoS One. 8 (9), (2013).
- Lee, I., Chung, E., Kweon, H., Yiacoumi, S., Tsouris, C. Scanning surface potential microscopy of spore adhesion on surfaces. Coll. Surf. Biointer. 92, 271-276 (2012).
- Tsai, C., Hung, H., Liu, C., Chen, Y., Pan, C. Changes in plasma membrane surface potential of PC12 cells as measured by Kelvin probe force microscopy. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Jucker, B. A., Harms, H., Zehnder, A. J. Adhesion of the positively charged bacterium Strenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon. J. Bacteriology. 178 (18), 5472-5479 (1996).
- Soon, R. L., et al. Different surface charge of colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii cells measured with zeta potential as a function of growth phase and colistin treatment. J. Anti. Chemo. 66, 126-133 (2011).
- Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. Link between culture zeta potential homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 78 (7), 2282-2288 (2012).
- Ayala-Torres, C., Hernandez, N., Galeano, A., Novoa-Aponte, L., Soto, C. Zeta potential as a measure of the surface charge of mycobacterial cells. Ann Microbiol. , (2013).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Nanomed. Nanobiotech. 2 (6), 613-634 (2010).
- Lindsay, S. M., et al. Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy studies of biomaterials at a liquid-solid interface. J. Vac. Sci. Technol. 11 (4), 808-815 (1993).
- Moores, B., Hane, F., Eng, L., Leonenko, Z. Kelvin probe force microscopy in application to biomolecular films: frequency modulation, amplitude modulation, and lift mode. Ultramicroscopy. 110 (6), 708-711 (2010).
- Melitz, W., Shen, J., Kummel, A. C., Kelvin Lee, S. probe force microscopy and its application. Surf. Sci. Reports. 66 (1), 1-27 (2011).
- Loppacher, C., et al. FM demodulated Kelvin probe force microscopy for surface photovoltage tracking. Nanotechnology. 16 (3), (2005).
- Domanski, A. L., et al. Kelvin probe force microscopy in nonpolar liquids. Langmuir. 28 (39), 13892-13899 (2012).
- Collins, L., et al. Dual harmonic Kelvin probe force microscopy at the graphene-liquid interface. Appl. Phys. Letters. 104 (13), 133103 (2014).
- Kobayashi, N., Asakawa, H., Fukuma, T. Nanoscale potential measurements in liquid by frequency modulation atomic force microscopy. Rev. Sci. Instru. 81, (2010).
- Collins, L., et al. Probing charge screening dynamics and electrochemical processes at the solid-liquid interface with electrochemical force microscopy. Nature Comm. 5, 2871 (2014).
- Pastar, I., et al. Interactions of methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300 and Pseudomonas aeruginosa in polymicrobial wound infection. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Brien, D. J., Gould, I. M. Does vancomycin have a future in the treatment of skin infections. Cur. Opin. Infec. Diseas. 27 (2), 146-154 (2014).
- Wang, P., Kinraide, T. B., Zhou, D., Kopittke, P. M., Peijnenburg, W. J. G. M. Plasma membrane surface potential: dual effects upon ion uptake and. 155 (2), 808-820 (2011).
- Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infect. Immun. 69 (5), 3423-3426 (2001).
- Sinensky, A. M., Belcher, A. M. Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy. Nat. Nanotechnol. 2, 653-659 (2007).
- Park, J., et al. Single-molecule recognition of biomolecular interaction via kelvin probe force microscopy. ACS Nano. 5 (9), 6981-6990 (2011).
