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Bioengineering

Surface de mesure potentielle de bactéries utilisant Kelvin Probe Force Microscopy

Published: November 28, 2014 doi: 10.3791/52327

Abstract

potentiel de surface est une caractéristique physique souvent négligé qui joue un rôle dominant dans l'adhérence des micro-organismes à des surfaces de substrat. Kelvin microscopie à force de sonde (KPFM) est un module de microscopie à force atomique (AFM) qui permet de mesurer la différence de potentiel de contact entre les surfaces à l'échelle nanométrique. La combinaison de KPFM avec AFM permet la génération simultanée de potentiel de surface et des cartes topographiques d'échantillons biologiques telles que des cellules bactériennes. Ici, nous employons KPFM pour examiner les effets de potentiel de surface sur l'adhésion microbienne des surfaces médicalement pertinents, tels que l'acier inoxydable et or. Surface cartes potentiels ont révélé des différences de potentiel de surface pour les membranes microbiennes sur des substrats différents matériels. Un graphe étape hauteur a été généré pour montrer la différence de potentiel de surface à une zone frontière entre la surface du substrat et des micro-organismes. Les variations de potentiel de surface de la membrane cellulaire ont été liés au changements dans le métabolisme cellulaire et la motilité. Par conséquent, KPFM représente un outil puissant qui peut être utilisé pour examiner les changements de potentiel de surface de la membrane microbienne sur l'adhérence à diverses surfaces de substrat. Dans cette étude, nous démontrons la procédure pour caractériser le potentiel de surface des cellules individuelles de Staphylococcus aureus résistant à la méticilline USA100 sur l'acier inoxydable et l'or en utilisant KPFM.

Introduction

Les biofilms produites sur les surfaces de l'équipement et dans les plaies cutanées présentent un problème pour l'industrie médicale que les biofilms sont récalcitrantes à l'enlèvement et peuvent conduire à une augmentation des taux de transmission de la maladie et de la résistance aux antimicrobiens. L'attachement est la première étape dans la formation de biofilm et est l'étape la plus critique en raison de sa réversibilité 3.1. caractéristiques de la surface du substrat jouent un rôle crucial sur l'attachement microbienne. On a montré que des facteurs tels que la dureté de surface, porosité, rugosité, et pour effectuer la fixation hydrophobicité microbienne; Cependant, peu d'études sur le rôle de potentiel de surface de substrat (SP) sur l'adhérence microbienne a été fait 4,5. Les surfaces chargées négativement empêcher la fixation de spores de Bacillus thuringiensis à mica, du silicium, de l'or et 6. Les changements dans le potentiel de membrane cellulaire indiquent des changements dans l'attachement et la motilité cellulaire 5,7. Il a été observé que hom électriquementsurfaces ogeneous plus facilement promouvoir microbienne adhérence 5. Caractérisation du potentiel de surface des bactéries à l'échelle nanométrique peut fournir une nouvelle façon de comprendre la cinétique d'adhérence des bactéries à diverses surfaces, et peut ainsi aider à l'élaboration de stratégies anti-encrassement biologique. Contrairement à d'autres méthodes utilisées pour caractériser les cinétiques électro de bactéries, telles que la diffusion électrophorétique de lumière, le potentiel zêta, et isoélectrique détermination du point, Kelvin microscopie à force de la sonde (KPFM) permet l'examen de cellules individuelles au lieu de cultures entières 8-11. Cela est bénéfique quand on veut comparer cellule-cellule ou biofilm caractéristiques électriques avec une grande précision et de précision.

KPFM est un module de microscopie à force atomique (AFM). AFM a été développé comme une conséquence directe de la microscope à effet tunnel (STM) 12. Les premières images publiées en utilisant STM ont été faites par Gerd Binnig et Heinrich Rorhrer en 1982 12 12 excité. STM peut aussi être fait dans les liquides à l'aide de pointes de sonde spécialisés 13. Ceci a été démontré par Lindsay et al., Qui a utilisé STM et AFM de molécules d'ADN d'image dans HClO 4 mM et 10 dans l'eau, sur des électrodes en or 13. KPFM a été démontrée pour déterminer les potentiels de surface des ADN et des protéines et analyse des biomolécules 25 interaction avec des ligands 26.

KPFM fonctionne en mesurant la différence de potentiel de contact (CPD) entre une pointe d'AFM cantilever conducteur et un échantillon idéalement conductrice (Figure 1, i) 14,15. Les échantillons ne doivent pas nécessairement être conducteur (ce est-sampl biologiques). L'imagerie peut être effectuée sur le mica, le verre, et des surfaces de silicium (non conductrices) aussi longtemps que la surface non-conductrice est mince et il ya une matière conductrice sous-jacente 6,7. Le DPC est équivalente à la tension potentiel de surface et peut être décrit comme la différence dans les fonctions de travail entre la pointe (pointe de φ) et l'échantillon (échantillon de φ), divisé par la charge de l'électron négatif (- e). Quand une pointe AFM conducteur est amené à proximité d'une surface de l'échantillon (séparés par la distance d), une force électrostatique (F ES) est généré en raison de la différence des énergies de Fermi (figure 1, II, a) 15. À ce stade, les énergies à vide de la pointe et l'échantillon (E v) sont en équilibre et alignés. Sur la pointe apportant plus près de la surface de l'échantillon, la surface de la pointe et l'échantillon entrent en contact électrique et d'agir comme des condensateurs de plaques parallèles (Figure 1, ii, b 14,15. Au point, les énergies de Fermi de la surface de la pointe et l'échantillon se alignent, atteignant un équilibre stationnaire (Figure 1, ii, b). La surface de la pointe et l'échantillon sera prélevé et un DPC de V se former à cause d'une différence de E fonctions de v et de travail. Un actes F es sur la zone de contact électrique en raison de la CPD formé de V. Cette force est ensuite annulé par l'application d'un courant continu V externe à l'extrémité qui a la même grandeur que le CPD formé de V (figure 1, ii, c). Cette tension appliquée DC élimine charge de surface dans la zone de contact électrique, et la quantité de V DC nécessaire pour éliminer les es F de V CPD est égal à la différence dans les fonctions de travail entre le SAsurface de mple les pourboires 15. Il convient de noter que la fonction de travail de la pointe est connu et il est fourni par les fabricants. Dans toutes les méthodes de KPFM, une tension alternative (V AC, environ 100 à 500 mV) est également appliqué à la pointe afin de générer des forces électriques oscillants entre la pointe et l'échantillon 14. Cette offre une meilleure résolution lors de la mesure des changements dans V CPD et / ou F es. À cet égard, les changements dans la fréquence ou l'amplitude de l'oscillation électrique peuvent être corrigées par V DC, et la surface cartes de potentiel peuvent être générés. Les données provenant des domaines spécifiques de ces cartes peuvent être analysés plus de fournir des informations sur les caractéristiques topographiques électriques spécifiques.

KPFM peut fonctionner en trois modes: (1) Mode de levage, (2) le mode de modulation d'amplitude (AM), et (3) la modulation de fréquence (FM) en mode 14,16. mode Ascenseur était la première incarnation de KPFM. Ascenseur mode se appuie sur une méthode en deux passes dans lequel une pointe oscille est traîné à travers la surface pour obtenir une image topographique. Pour la deuxième passe de la pointe est soulevé une distance préréglée dessus de l'échantillon (de 10 à 100 nm) et numérisé en arrière à travers la même zone. En raison de ce procédé en deux passes, en mode de levage, et par rapport à AM- FM-KPFM, prend le plus long temps d'acquisition d'images. Augmenter la pointe loin de la surface assure que seul longue portée F es est mesurée. En outre, la diaphonie entre la topographie de surface et des mesures de potentiel est découplée au détriment de la résolution latérale et une sensibilité accrues.

AM-KPFM améliore la résolution et la sensibilité latérale en utilisant deux fréquences pour mesurer simultanément la topographie de l'échantillon et le potentiel de surface (de balayage en un seul passage) 14. Dans le mode AM, le cantilever est mécaniquement oscille, généralement 5% en dessous de la première fréquence de résonance (f 0), et oscille électriquement (trâce un AC V) à sa deuxième fréquence de résonance (f 1). Changements dans l'amplitude de f 0 conduisent à la production de données topographiques, tandis que les changements dans l'amplitude de f 1, en ​​raison de changements dans es F et V CPD, donnent données de mesure potentiels de surface. f 0 et f 1 du cantilever sont séparés par des fréquences importantes et les énergies qui signalent diaphonie est réduite au minimum 14. Le boîtier électronique de la tête (HEB) de l'AFM sépare les deux signaux pour donner à la fois topographique et données de surface potentiels simultanément dans une analyse. FM-KPFM améliore la résolution encore plus loin que AM-KPFM sur des surfaces biologiques 14. FM-KPFM fonctionne différemment que AM-KPFM en ce qu'elle mesure les changements dans les gradients de force électrostatiques plutôt que force électrostatique (F ES) 15. Comme mode AM, le mode FM utilise deux fréquences et un singlmécanisme de balayage e-passe d'obtenir des données topographiques et la surface potentiels simultanément 14. En mode FM, le cantilever est mécaniquement oscillait à f 0 et oscillait électriquement à une basse fréquence modifiée (f mod, généralement 1-5 kHz). Sur interactions électrostatiques, f 0 et f mod mix pour produire des bandes latérales f 0 ± f mod. Ces bandes latérales sont très sensibles aux variations de la force électrostatique, et peuvent être séparées de f 0 par l'intermédiaire du HEB de l'AFM. Depuis FM-KPFM mesure les changements dans les gradients de force électrostatiques, la forme sommet de conseils et de son entretien / l'intégrité jouent un rôle critique dans l'ensemble surface de résolution potentielle 14, 15. Surface résolution potentielle en utilisant les modes AM et FM sont de l'ordre de 1 nm latéralement 14 -16. Il convient de noter que l'imagerie KPFM peut être fait dans les liquides non polaires, et plus récemment, a été montré à faire (<10 mm) des liquides polaires faiblement ionique (enKPFM modes en boucle ouverte qui ne nécessitent pas une rétroaction de polarisation, ce qui évite l'application d'une polarisation en courant continu), comme l'eau MilliQ; Toutefois, l'imagerie KPFM n'a pas encore été fait sur ​​des cellules vivantes dans des solutions polaires 17-20. Défis supplémentaires associés à l'imagerie de SP dans un liquide est que les solutions couramment utilisés pour les cellules de maintien (ce est à dire, le tampon phosphate salin) ont des concentrations élevées d'ions mobiles, ce qui conduirait à des réactions de Faraday, la dynamique de la charge induite préjugés, et la diffusion d'ions / redistribution 20. Ainsi, pour cette expérience, des mesures ont été prises à partir de cellules de SARM secs et morts sur acier inoxydable et or surfaces fonctionnalisés poly-L-lysine dans des conditions ambiantes. L'imagerie peut être effectuée dans des conditions atmosphériques ou sous vide sur des échantillons biologiques qui ont été préalablement séchés ou immobilisées sur des surfaces 20. Conditions humides ont également été démontré que l'incidence imagerie KPFM des surfaces 6.

Dans cette étude, nous avons utilisé FM-KPFMAFM et d'examiner le rôle de la SP sur la fixation du Staphylococcus aureus résistant à la méticilline USA100 (SARM) les surfaces en acier inoxydable et or fonctionnalisés poly-L-lysine. SARM a récemment valu le statut de multi-résistante (MDR) "superbactérie" en raison de sa résistance naturelle sélectionnée à de nombreux antibiotiques β-lactamines et les céphalosporines 21. Les infections à SARM sont maintenant plus difficile, difficile, et formidable pour traiter, conduisant à l'utilisation des antimicrobiens plus sévères tels que la vancomycine ou oxazolidinones qui ont des niveaux plus élevés de toxicité chez l'homme, et donc ne peut pas être utilisé comme traitements à long terme 22. L'acier inoxydable a été choisi en raison de sa pertinence médicale et l'utilisation commune comme matière dans les aiguilles hypodermiques, les bassines, les poignées de porte, des éviers, etc. L'or a été utilisé comme un métal comparative. FM-KPFM a été utilisé pour examiner si microbienne SP de la membrane change lors de la fixation des substrats.

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Protocol

1. Préparation de la verrerie et des cultures

  1. Avant de procéder à cette expérience, préparer la gélose au sang de mouton à 5% (SBA) des plaques pour la culture SARM. Incuber les plaques SBA pendant 24 heures à 37 ° C. Après ce temps, simples, des colonies bien isolées doivent être présents à être utilisé pour des inoculations ultérieures dans des milieux liquides. Magasin strié plaques SBA avec des colonies isolées à 4 ° C pendant 1 à 2 mois.
    REMARQUE: Les plaques de gélose au sang de mouton viennent dans les paquets déjà créés contenant entre 20 à 25 plaques sur la base du fabricant, et sont généralement constitués d'une base de gélose trypticase soja avec addition de 5% en poids / sang de v moutons.
  2. Ajouter 500 ml de bouillon de soja tryptique (TSB) supplémenté avec 1% de glucose et 0,1% de NaCl. Après cela, collecter et nettoyer deux tubes à essai en verre. Si couvercles autoclavables sont pas disponibles pour des tubes à essai, utiliser du papier d'aluminium comme un bouchon. Autoclave TSB et des tubes à essai avec une boîte de 1 ml embouts de pipette.
  3. Sous une enceinte de biosécurité ou près d'une Bunsen brûleur, pipette 5 ml de TSB préalablement autoclave dans des éprouvettes autoclave. Soyez attentif à ce que suffisamment de temps a été donné de laisser le BST et des tubes à essai refroidir à température ambiante. De 5% précédemment plaque SBA strié, inoculer une seule colonie dans 6 ml de bouillon TSB. L'une contiendra SARM, et le second tube de test sera utilisé comme contrôle négatif pour assurer la stérilité.
  4. Prenez des tubes à essai du BST inoculés et les placer dans un incubateur réciproque pendant 24 heures à 37 ° C et à 200 tpm. Après cette période, la croissance microbienne doit être apparent dans le tube à essai de SARM alors qu'aucune croissance doit avoir eu lieu dans l'éprouvette de contrôle.
  5. Prélever 1 ml de culture de 24 h à la pipette dans 6 ml de TSB frais. Incuber à 37 ° C pendant 6 heures à 200 tours par minute.
  6. Pipette 1 ml de sous-culture 6 h dans un tube de 1,5 ml. Centrifuger 3 min à 850 x g. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml d'H 2 O. désionisée Centrifugeuse, répéter, et remettre en suspension.

  1. Prendre en acier inoxydable et les disques de l'échantillon de l'AFM d'or (20 mm et 10 mm de diamètre, respectivement) et de nettoyer chaque côté avec 5 ml d'eau désionisée 2 O. Tenez disques échantillons dans la main dominante avec une pince et utiliser la main sous-dominante à la pipette 5 ml de chaque côté de l'échantillon disque. Après avoir lavé deux côtés, disques lieu de l'échantillon dans un bêcher contenant 20 ml de H 2 O déminéralisée suivie par sonication pendant 1 min.
  2. Après l'utilisation des ultrasons pince pour retirer les disques de l'échantillon du bécher. Placez les disques afin qu'ils se penchent à un angle de 60 ° contre le bord d'une boîte de Petri ouverte sur une serviette en papier. Utiliser le couvercle de la boîte de Petri pour couvrir les disques de séchage. Laissez sécher complètement avant disques procédure. Le temps de séchage peut varier entre 4-8 heures.
  3. Une fois sec, utilisez une pince pour placer disques d'échantillons dans une boîte de Petri.
    1. Eventuellement, fonctionnaliser les surfaces de disques de l'échantillon de toutes matières (par exemple, le collagène, l'acide hyaluronique, des nano-particules d'argent, etc.).
    2. Pour cette expérience, on utilise la poly-L-lysine pour revêtir la surface du substrat. Pour la poly-L-lysine fonctionnalisation, une pipette de 200 à 400 ul de 0,1% de poly-L-lysine (en H 2 O) sur des disques de l'échantillon, et laisser incuber pendant 1 heure à température ambiante dans une boîte de Pétri.
    3. Après 1 heure, utiliser une pince pour maintenir l'échantillon disque, et laver avec 1 ml de H 2 O. déminéralisée Laisser sécher sur du papier absorbant comme décrit dans l'étape 2.2.
  4. Prenez 2x cellules remises en suspension lavés et plaque de 200 à 400 pi sur des disques d'échantillons dans une enceinte de sécurité biologique. Si les disques d'échantillons sont revêtus de poly-L-lysine, incuber pendant 0,5 heures à température ambiante.
  5. Après incubation de cellules sur les disques de l'échantillon, laver disques échantillons doucement avec 1 ml de H 2 O. déminéralisée Laissez sécher une nuit avant de disques imagerie.

3. KPFM Imaging

NOTE: Pour cette expérience,utiliser une série Agilent 5500 ILM-AFM.

  1. Pour commencer AFM, tourner sur l'unité de l'ordinateur avec le contrôleur HEB et MAC III de l'AFM. Logiciel d'imagerie Open AFM (par exemple, d'Agilent PicoView). Veillez à sélectionner d'abord ACAFM ou selon la désignation correcte est sur l'AFM pour l'imagerie en mode intermittent-contact.
  2. En utilisant des pinces de l'AFM dans la main dominante, et en maintenant le support du clip à ressort ouverte avec la main sous-dominante, placez un cantilever KPFM dans la pièce de tête. Soyez prudent lors de la manipulation et le transfert de la pièce de tête AFM à l'AFM que cet appareil (au moins sur le 5500 ILM-AFM) contient l'unité de cristal piézo fragile qui contrôle X, Y et directionnalités de numérisation Z.
    REMARQUE: Les cantilevers KPFM utilisés dans ce cas étaient Mikromasch conducteur DPE (à faible bruit) avec cantilevers fréquences de résonance moyenne de 80 kHz et de printemps constantes de 2,7 N / m. Cantilevers avec ces fréquences de résonance et les constantes de printemps ont été choisis en raison de leur facilité d'utilisation.Cantilevers ayant des constantes de ressort et de plus grandes fréquences de résonance plus élevées peuvent également être utilisés pour l'imagerie.
  3. Charger soigneusement pièce de tête dans le AFM et brancher les fils appropriés (dans ce cas deux fils doivent être branché: la lumière laser et moteur de levage de la scène).
  4. Aligner le laser sur la pointe du cantilever. Certaines unités contiennent une fonctionnalité de la caméra qui permet un alignement plus facile. Si la fonctionnalité de la caméra ne est pas présent sur l'AFM, alignez sur la pointe cantilever comme décrit suivante:
    1. Tourner le bouton dans le sens horaire avant-arrière pour déplacer le laser overtop la puce en porte à faux. Lorsque le laser atteint la puce il sera bloqué et ne sera plus visible. Seulement tournez le bouton à quelques reprises.
    2. Tournez le bouton avant-sens inverse des aiguilles jusqu'à ce que le spot laser réapparaît. Le laser est maintenant au bord de la puce.
    3. Tournez le bouton de gauche à droite pour positionner le laser sur le cantilever. Comme le laser passe au-dessus du cantilever il va disparaître et réapparaître in succession rapide. Le spot laser doit être visible dans le couvercle en verre dépoli, où l'unité de photodiode tard asseoir.
    4. Tournez le bouton avant vers l'arrière vers la gauche pour déplacer le point en bas de la console vers la pointe jusqu'à ce que la tache sur le verre dépoli disparaît.
    5. Tourner l'avant-à-dos dans le sens horaire que légèrement afin de positionner le laser de sorte qu'il se trouve juste sur la pointe cantilever. Le spot laser réapparaîtra sur le verre dépoli.
      NOTE: Ce est la méthode de positionnement laser pour la plongée-pension cantilevers. Pour contreforts triangulaires, le processus d'alignement diffère légèrement.
  5. Une fois que le laser est aligné, maintenez le moteur de levage d'étape dans la position "ouverte" pendant 10 secondes afin d'assurer suffisamment d'espace entre le cantilever et de l'échantillon lors de la fixation de l'échantillon à l'AFM.
  6. Placez l'échantillon sur la scène de l'échantillon de KPFM. Rez de l'échantillon en utilisant un fil de cuivre. Connecter les fils appropriés de l'AFM à l'étape de l'échantillon. Connectez les sTage à l'AFM. Dans la plupart des cas, la scène est maintenu en place grâce à des aimants.
  7. Dans le logiciel de l'AFM, syntonisez commencer le cantilever puis approche de la pointe cantilever à l'échantillon. Assurez-vous que le temps de stabilisation est fixé à plus de 10 ms, et que les vitesses d'approche ne dépasse pas 2,0 um / sec afin d'éviter des dommages de pointe.
  8. Une fois que l'extrémité en porte à faux se trouve sur la surface de l'échantillon, sélectionner une taille de la fenêtre de formation d'image et la zone de formation d'image idéale. Optimiser les gains I et P ainsi que le point de sorte que l'imagerie topographique est optimisée de jeu en porte à faux.
    1. Une fois l'imagerie topographique est optimisée, tourner sur le module KPFM (FM ou AM, ici, utiliser le mode FM). Il convient de noter que l'imagerie KPFM est très difficile à l'extérieur de 5 um fenêtre d'imagerie x 5 pm. Aussi, pour l'imagerie de KPFM optimale, utilisez une résolution 512 x 512 avec des vitesses de balayage lent (de 0,02 à 0,05 de lignes / sec).
  9. Pour les réglages FM-KPFM (non ACAFM paramètres), réglez le pour cent d'entraînement entre 5 à 10%. Réglez le cantilever frequency comprise entre 1 - 5 kHz avec une largeur de bande de 2 kHz. Réglez I et P gains pour les réglages FM-KPFM à 0,3%.
    1. Variez la bande passante du signal et I et P gains entre les surfaces de l'échantillon. Pour optimiser l'imagerie de SP, ajuster encore la bande passante du signal et I et P gains pour obtenir des images optimales. La plage recommandée des gains I et P sont de 0,22 à 0,35%.
  10. Traiter et analyser les images recueillies KPFM aide d'un logiciel de traitement post-image pour recueillir des données de SP.

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Representative Results

La capacité de mesurer SP utilisant KPFM repose sur le principe que tant la surface de l'échantillon et la pointe de cantilever sont conducteurs dans une certaine mesure. Acier inoxydable et or ont agi comme des surfaces conductrices à laquelle SARM étaient attachés. KPFM images ont été prises de 15 cellules de SARM sur les deux faces avec 512 x 512 résolutions, et des zones de numérisation allant de 5 x 5 um à 10 um x 10. Balayage a été réalisé avec des vitesses de ligne allant de 0,02 lignes / s à 0,05 lignes / sec. Par conséquent, avec 512 points de données recueillies par les lignes de ligne et de 512 à numériser, temps de balayage allaient de 2,84 à 7,11 h h. Les types d'images collectées peut être vu dans la figure 2. KPFM fonctionne en utilisant deux fréquences, et en tant que tel, les images topographiques sont simultanément recueillies ainsi que des données sur les caractéristiques électriques de la surface. Les filtres thermiques ont été appliqués à SP cartes afin de discerner plus facilement les petites variations de potentiel de surface (Figure 2). Les données de cartes SP wen tant que logiciel de traitement post-image analysée pour déterminer les potentiels de surface moyennes et les écarts types. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide de programmation Open Source R statistique. T-tests de Student ont été effectuées pour comparer les groupes avec P <0,05 étant considéré comme significatif.

images de SP ont été analysés pour déterminer le potentiel de surface de la membrane microbienne. Ceux-ci ont ensuite été comparés avec la croissance sur les différentes surfaces de substrat. Ceci a été réalisé afin de déterminer si le type de surface a eu un effet sur le potentiel de surface de la membrane microbienne. Initialement, nous avons tenté de faire incuber les cellules de SARM statique pendant 3 heures sur les surfaces du substrat. Cependant, aucun microbes attachés étaient visibles sous l'AFM. SP données pour des surfaces fonctionnalisées propre et poly-L-lysine a été déterminée à partir de 5 x 5 um zones balayées. scans de SP de l'acier inoxydable et or nue substrats nus ont montré des potentiels de surface globale négatifs (-0,045 ± 0,057 V et -0,126 ± 0,052 V, respectivement, P = 0,047, figure 3). Poly-L-lysine a été utilisée pour fonctionnaliser les surfaces à rendre plus favorable pour la fixation des cellules. Surfaces fonctionnalisés ont montré un changement à des potentiels de surface positifs pour l'acier et or surfaces en acier inoxydable (0,133 ± 0,063 V et 0,126 ± 0,030 V, respectivement, figure 3). Nous avons ensuite examiné les potentiels de membrane de SARM sur les surfaces en acier inoxydable et or fonctionnalisés poly-L-lysine. Il a été constaté que les potentiels de membrane cellulaire SARM ont varié entre l'acier inoxydable et les surfaces d'or. Surfaces en acier inoxydable ont conduit à beaucoup plus importants PS membrane positifs pour les cellules par rapport à leurs homologues de l'or. Par exemple, le SP de cellules SARM commuté du positif au négatif SP. SARM montré SP positif sur les surfaces en acier inoxydable avec SPS de 0,160 ± 0,022 V et de -0,025 ± SP 0,016 V sur des surfaces d'or (P <0,001).

Pour montrer les capacités de KPFM, un exempled'un graphe étape hauteur de SARM sur l'acier inoxydable est fourni (Figure 4). Cela montre la différence de potentiel de surface entre la surface du substrat et la membrane microbienne.

Figure 1
Figure 1. Principes de travail du microscope à force atomique (i) et la force de la sonde Kelvin microscope (ii) Reproduit avec la permission de (15). La configuration de base de l'AFM est représenté en (i). En AFM, une pointe aiguisée est attaché à un porte à faux par dépôt électrochimique. Mikromasch platiné (DPE) à faible bruit consoles conductrices ont été utilisés dans cette expérience avait des dimensions de 210 x 30 um, la fréquence de résonance de 80 kHz, et les constantes de rappel de 2,7 N / m. Cantilevers ont été attachés à une puce plus grande afin de permettre une manipulation aisée. Une fois assemblé dans l'AFM, un laser est aligné sur la pointe cantilever. Déflection cantilpointe jamais sont détectés par une photodiode. Les flèches sont utilisées pour générer des images topographiques. (Ii, a, b, c) montre le principe de fonctionnement de KPFM. Le cantilever est amené suffisamment près de la surface pour permettre un contact électrique de se produire. Les différences dans les potentiels de surface entre la pointe et la surface provoquent la pointe de dévier. Une tension continue est appliquée pour corriger cette déviation. Cette tension appliquée DC est égal au potentiel de surface de la surface du substrat. Selon le type de mode d'imagerie utilisé (ascenseur, AM, FM), ce principe de fonctionnement diffère légèrement. Figure 1 (ii) a été modifié depuis 15.

Figure 2
Figure 2. Représentant et la topographie de surface des cartes du potentiel de SARM sur fonctionnalisés acier inoxydable et or substrats poly-L-lysine. Images (i et iii) Voir les photos de la topographie représentatives des cellules de SARM sur l'acier inoxydable et des surfaces d'or, respectivement. Dimensions de l'image peut être vue dans l'axe X et Y de ces images le long d'un profil de hauteur de couleur correspondante. (Ii et iv) afficher les cartes SP correspondantes du SARM sur leurs surfaces respectives. «Or» filtres standard de couleur ont été appliquées à la topographie des images pendant filtres thermiques ont été appliqués à SP images de discerner plus facilement de petits changements dans SP. Il convient de noter que le SP de surfaces de substrat ne était pas homogène. SP se est révélé être distribué de manière hétérogène avec des zones positives et négatives apparentes sur les deux surfaces du substrat. Ceci peut être vu autour des cellules de SARM où SP hétérogènes sont observés sur l'acier inoxydable et or substrats. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. potentiel de surface des surfaces de substrat et les membranes cellulaires SARM. La figure 3 montre les données correspondantes de KPFM à partir d'acier inoxydable (SS marqué comme ici) et des surfaces d'or, ainsi que, les données de 15 cellules. Les astérisques représentent des différences significatives entre les échantillons avec le nombre d'astérisques correspondant aux échantillons comparés. données de SARM ont été recueillies à partir de cellules attachées aux surfaces fonctionnalisés après 30 min d'incubation. Cela a été fait en raison du fait qu'aucune cellule n'a été trouvé à fixer sur les surfaces des substrats nus après 3 heures.

Figure 4
Figure 4. surface Step-hauteur de l'image potentielle de SARM sur l'acier inoxydable fonctionnalisé poly-L-lysine. Grâce à un logiciel de traitement post-image, un graphe étape hauteur a été généré afin de montrer la fonc ondes attaches du logiciel, ainsi que, le SP différence notable entre dans la surface du substrat et la membrane cellulaire. La superficie de la section choisie est représentée sur la carte de SP correspondant à la ligne grise. Un changement de 0,15 V sur la surface de la cellule à 0,21 V sur la surface du substrat est clairement. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Société Type de sonde Constant Spring (N / m) Fréquence de résonance (kHz) Cantilever Dimensions Astuce Apex Diamètre
Asylum Research AC240TM-R3 2 70 Longueur = 240 um
Largeur = 40 um </ Td>
28 nm
Bruker AFM Sondes SCM-PIT 2,8 75 Longueur = 225 um
Largeur = 28 um
20 nm
Mikromasch DPE (à faible bruit) Cantilevers conducteurs 2,7 80 Longueur = 210 um
Largeur = 30 um
40 nm
Plus Nano et USA PtSi-NCH 42 330 Longueur = 125 um
Largeur = 30 um
> 25 nm
Instruments nanosciences AppNano conducteurs mode tapping AFM sondes. 40 300 Longueur = 125 um
Largeur = 35 um
30 nm
Instruments nanosciences AppNano conducteurs mode tapping AFM sondes. 40 300 Longueur = 125 um
Largeur = 35 um

Tableau 1. Les entreprises offrant un large éventail de sondes KPFM. Une variété d'entreprises offrent maintenant pointe de KPFM avec différents diamètres extrémité de la pointe, les constantes de printemps, et les fréquences de résonance. Astuce personnalisation est près sans limites, avec des entreprises proposant en général de construire des consoles avec des spécifications personnalisées pour une expérience prévue. La plupart des sondes de platine KPFM sont revêtues de nitrure de silicium. Platinum offre des fonctionnalités conducteur pour le cantilever. D'autres matériaux de revêtement comprennent commun iridium, le platine + iridium et l'or. La plupart des conseils de KPFM peuvent également être alternativement utilisés pour la microscopie à force électrique (EFM). Astuce sommet est important pour consoles de KPFM. Des conseils de plus grand diamètre supérieur sacrifient imagerie résolution de la topographie pour moins de bruit électrique. Inversement, des conseils de plus petit diamètre (<25 nm) offre une meilleure résolution d'image de la topographie, mais sont plus sujettes au bruit électrique. Pour cette étude, les chercheurs ont utilisé la conduite Mikromaschive DPE (à faible bruit) cantilevers.

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Discussion

KPFM a été utilisé comme une nouvelle technique pour obtenir des données électriques de surface. Il a souvent été utilisé comme une méthode pour examiner la répartition de charge en chimie et n'a que récemment commencé à appliquer pour l'étude des systèmes biologiques sur le micro et nano-échelles. D'après les données recueillies nous avons constaté que les microbes ne semblent pas attacher facilement pour nettoyer les surfaces en acier inoxydable et or, même après 3 heures d'incubation statique. Surfaces fonctionnalisées poly-L-lysine ont montré fixation microbienne rapide après 30 min. Prolongement de la durée d'incubation de microbes sur les surfaces fonctionnalisés ont conduit à la cellule surpopulation sur l'échantillon surfaces, et des images de la topographie pauvres. La fonctionnalisation de surface conduit à un changement de SP négative à SP positif pour les surfaces en acier inoxydable et or. Des études antérieures ont montré que les micro-organismes ont typiquement SPs négatifs dus à la séquestration des ions chargés négativement dans les cellules afin de maintenir l'équilibre osmotique et ionique 23. Il est également connuque la présence de groupes phosphates dans les micro-organismes Gram négatifs et Les acides téchoïques dans des micro-organismes à Gram positif conduit en outre à la formation de PS 24 négatif. La connaissance de la chimie de base des membranes cellulaires Gram positifs et négatifs nous a conduit à supposer que les PS de substrat positifs conduirait à la fixation microbienne rapide. Cependant, comme on peut le voir dans les figures 2-4, qu'il y avait un grand changement de positif à négatif SP cellulaires de SARM sur acier inoxydable et or substrats, respectivement. Fixation microbienne aurait eu lieu d'abord de la séquestration des ions négatifs autour de la membrane. Après lavage des cellules et les laisser sécher sur les surfaces de substrat, nous aurions pu emportant ce média ionique. En outre, il convient de noter que les données ne KPFM compris les zones de paroi extérieures de la cellule à Gram positif (SARM) cellules. Il a été démontré que dans certains cas, un potentiel de membrane cellulaire de micro-organismes, peut être modifié de la présence d'catiopeptides antimicrobiens nic ou d'autres facteurs de stress 8.

Le seul inconvénient principal de KPFM par rapport aux mesures de potentiel zêta standard sur des cultures de cellules microbiennes est que dans KPFM les données recueillies se fait sur les cellules mortes et séchées. KPFM a été utilisé pour examiner les tendances générales dans la surface cellulaire des changements potentiels en ce qui concerne à différentes surfaces de substrat de fixation. L'application de tensions continues à la pointe de la console (pour contrer F es), avec l'exigence d'une surface de l'échantillon conducteur, limiter KPFM standard pour ouvrir air imagerie. Imagerie en liquide polaire ne est pas actuellement possible avec KPFM standard, et ainsi l'imagerie de cellules vivantes en utilisant KPFM ne est pas possible pour le moment. Développements de la nouvelle boucle ouverte et les modes de KPFM double fréquence ont montré des résultats prometteurs dans leur capacité à surfaces d'image dans les solutions à faible ioniques 18-20. Ce est notre espoir que dans l'avenir cette technologie est développée de telle sorte que l'imagerie peut être fait sur livdes cultures de cellules e. L'imagerie de cellules dans un environnement plus naturel serait sans doute conduire à la génération de données plus précises et réalistes SP membrane cellulaire. Pour cette étude, nous voulions appliquer cette technologie dans une nouvelle façon de mesurer microbiens potentiels de membrane de la cellule, ainsi que d'étudier les caractéristiques d'adhérence de SARM sur une surface cliniquement pertinente. Changements dans SPS membrane microbiennes ont été observés lors de l'incubation sur les différentes surfaces de substrat. Cela peut signifier que le type de substrat peut affecter le métabolisme cellulaire. Notre espoir est que ces données préliminaires peuvent conduire à la génération de nano-revêtements avec des charges électriques inhérents qui pourraient être appliquées à des surfaces ou équipements médicaux (y compris d'autres matériaux tels que des bandages et gazes) afin d'empêcher la fixation microbienne. Le protocole décrit dans cet article est destiné à aider les chercheurs à comprendre les principes de KPFM et montrer des façons dont elle peut être appliquée à mesurer et à créer des cartes de SP.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
5500ILM Atomic Force Microscope Agilent Technologies #N9435S
AFM/STM Metal Specimen Discs TED PELLA, INC. #16219 Stainless steel sample discs
DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes Mikromasch #HQ:DPE-XSC11 There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments.
PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs TED PELLA, INC. #16218-G Gold sample discs
PicoView Software Agilent Technologies #N9797B 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software
Pico Image Software (Pico Image Basic) Agilent Technologies #N9797AU-1FP 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge Thomas Scientific #91201513 Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood BD #221261 Pre-made plates
Tryptic Soy Broth BD #257107 Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container.

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References

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Bioengineering Numéro 93 la microscopie à force de la sonde Kelvin microscopie à force atomique potentiel de surface l'acier inoxydable l'attachement microbienne biofilms bactériens résistant à la méthicilline
Surface de mesure potentielle de bactéries utilisant Kelvin Probe Force Microscopy
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Birkenhauer, E., Neethirajan, S.More

Birkenhauer, E., Neethirajan, S. Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy. J. Vis. Exp. (93), e52327, doi:10.3791/52327 (2014).

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