Abstract
表面電位は、表面を基板への微生物の付着力に支配的な役割を果たしている物理的特性を一般に見落とされる。ケルビンプローブフォース顕微鏡（KPFM）は、ナノスケールでの表面間の接触電位差を測定する原子間力顕微鏡（AFM）のモジュールである。 AFMとKPFMの組み合わせは表面電位と、細菌細胞などの生体試料の地形図の同時生成を可能にする。ここでは、例えば、ステンレス鋼、金などの医学的に関連する表面への微生物付着に対する表面電位の影響を調べるためにKPFMを採用する。表面電位マップは、異なる材料の基板上での微生物膜の表面電位の違いを明らかにした。ステップ高さのグラフは、基板表面と微生物との間の境界領域での表面電位の差を示すために生成された。細胞膜の表面電位の変化は、変化に関連している細胞代謝と運動性で、S。したがって、KPFMは、様々な基材表面への接着の際に微生物の膜表面電位の変化を調べるために利用することができる強力なツールを表す。本研究では、KPFMを使用してステンレス鋼、金個々のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 USA100細胞の表面電位を特徴付けるための手順を示す。
Introduction
バイオフィルム除去に反抗的であり、疾病伝播および抗菌剤耐性の増加率につながる可能性として機器の表面や皮膚創傷で生産バイオフィルムは、医療業界のための問題を提起する。添付ファイルは、バイオフィルム形成の最初のステップであり、その可逆1-3による最も重要なステップです。基板表面特性は微生物付着上で重要な役割を果たしている。このような表面硬度、気孔率、粗さ、および疎水性のような要因には、微生物付着をもたらすことが示されている。しかしながら、微生物付着の基板表面電位（SP）の役割を調べる研究はほとんど4,5行われている。負に帯電した表面は、雲母、シリコン、金6のバチルス·チューリンゲンシスの胞子の付着を防止する。細胞膜電位の変化は、細胞接着および運動性の5,7の変化を示すものである。これは、電気的にホーンが観察されているogeneous表面がより容易に微生物の付着5を促進する。ナノスケールでの細菌の表面電位を特徴付けることは、様々な表面への細菌の付着の動態を理解するための新規な方法を提供することができ、それにより抗生物付着戦略の開発を助けることができる。そのような電気泳動光散乱、ゼータ電位、及び等電点の決定のような細菌の電気動力学を特徴付けるために使用される他の方法とは異なり、ケルビンプローブフォース顕微鏡（KPFM）は全体ではなく培養物8-11の個々の細胞の検査を可能にする。高精度かつ高精度に、細胞 - 細胞または生物膜の電気的特性を比較したい場合に有益である。
KPFMは、原子間力顕微鏡（AFM）のモジュールである。 AFMは、走査トンネル顕微鏡（STM）12の直接の結果として開発された。 STMを使用した最初の公表の画像は1982年12ゲルト·ビーニッヒとハインリッヒRorhrerにより行った12にSTMを使用しようと生物を励起高解像度の画像を達成することの意味。 STMはまた、特殊なプローブチップ13を用いて、液体中で行うことができる。これは、リンジーら 、金電極13上に、10ミリモルのHClO 4中で水に画像DNA分子にSTMおよびAFMを使用することにより示された。 KPFMリガンド26とのDNAおよびタンパク質分析25および生体分子相互作用の表面電位を決定する際に実証されている。
KPFMは、導電性AFMカンチレバーチップと、理想的に導電性のサンプル（ 図1、i）を 14,15との間の接触電位差（CPD）を測定することによって動作する。サンプルは、必ずしも導電性（ すなわち、生物学的なSAMPLである必要はありませんES）。イメージングは、長い非導電性表面が薄いと下地の導電性材料6,7があるのでマイカ、ガラス、シリコン表面（非導通）に行うことができる。 CPDは、表面電位の電圧に相当し、負の電子電荷で割ったチップ（φ 先端 ）と試料（φ サンプル ）の間の仕事関数の差は、として記述することができる（ - E）。導電性AFMチップが試料表面に近づけるとフェルミエネルギーの差（ 図1、二、a）の 15に静電気力（F es を ） が生成され、（距離dだけ分離される）。この時点で、チップと試料の真空エネルギー（E vは ）平衡および整列している。近いサンプル表面に先端をもたらす際に、チップと試料表面が平行平板コンデンサ（ 図1、二、bと電気的に接触し、行為に入るG>）14,15。時点で、チップと試料表面のフェルミエネルギーは、定常状態平衡に達し、整列ようになる（ 図1、二、b）を先端と試料表面が課金されますと、V CPDが原因E V 'sとの仕事関数の差に形成することになる。原因形成されたVのCPDへの電気的接触面積上のF ESが機能します。この力は、その後に形成されるV CPD（ 図1、二、c）は同じ大きさを有するチップの外部V DCを印加して無効化する。これは、DC電圧を電気接点の領域に表面電荷がなくなり、V CPDのF エスを排除するために必要なV DCの量は、saの間の仕事関数の差に等しく適用mple表面と先端15。これは、チップの仕事関数が既知であり、それは製造業者によって提供されることに留意すべきである。すべてKPFM方法において、AC電圧（V AC、約100から500 mV）はまた、チップと試料14との間の振動電気力を生成するために、先端に印加される。 VのCPDおよび/ またはF ESの変化を測定する際に良好な分解能を提供する。この点において、電気振動の周波数または振幅の変化は、V DCによって補正することができ、表面電位マップを生成することができる。これらのマップの特定の領域からのデータは、特定の地形的特徴についての電気的情報を提供するために分析することができる。
（1）リフトモード、（2）振幅変調（AM）モード、及び（3）周波数変調（FM）モード14,16：KPFMの3つのモードで動作させることができる。リフトモードは初期INCたKPFMのarnation。リフトモードでは、発振チップが地形画像を得るために、表面上でドラッグした二パス方式に依存している。第二のパスのために先端がサンプル上記所定の距離上げて（10から100 nm）をし、同じ領域にわたってスキャンした。これツーパス方法、AM-及びFM-KPFMに比べリフトモードでは、画像取得のために最も長い時間がかかる。表面から離れた先端を上げると、唯一の長距離のF ESが測定されることを保証する。また、地形や表面電位測定間のクロストークが増加し、横方向分解能と感度を犠牲にして分断される。
AM-KPFM同時にサンプル形状と表面電位（ワンパススキャン）14を測定するためのデュアル周波数を使用して、横方向の解像度と感度を改善する。 AMモードでは、カンチレバーが機械的に、一般的に5％（0 f）は、その第1の共振周波数より、発振し、電気的（トン発振するV AC hrough）、その第2の共振周波数（f 1）における。によるFのエス及びVのCPDの変化に対するfの1の大きさの変化は、表面電位測定データを提供しながら、地形データの生成fは0リードの振幅の変化。 f 0はカンチレバーのF 1は、クロストークが14を最小化する重要な信号の周波数およびエネルギーによって分離されている。 AFMの頭部エレクトロニクスボックス（HEB）は、両方の地形を与え、1回のスキャンで同時に潜在的なデータを表面2つの信号を分離する。 FM-KPFMは生体表面14の上にさらにAM-KPFMより解像度が向上します。 FM-KPFMは、静電気力勾配のではなく、静電気力（FのES）15の変化を測定することでAM-KPFMよりも動作が異なります。 AMモードと同様に、FMモードは、デュアル周波数とSINGLを利用地形得ると同時に14を潜在的なデータを表面化電子パス走査機構。 FMモードでは、カンチレバーが機械的にfは0で発振され、電気的に低改変周波数で発振（ モジュレーション fは、典型的には1 - 5 kHzの）。静電相互作用すると、0とf MODミックスF 0±fのmodの F側のバンドを生成する。これらの側波帯は静電気力の変化に非常に敏感であり、AFMのHEBを通じてfは0から分離することができる。 FM-KPFM静電気力勾配の変化を測定するので、先端頂部形状とその保守/完全性は、全体的な表面電位分解能14,15において重要な役割を果たしているAMを使用して潜在的な解像度表面およびFMモードは、横方向に1nmの範囲で14である-16。それはKPFM撮影を中（非極性液体中で行うことができ、そしてより最近では、低イオン性（<10mM）を極性液体で行われることが示されていることに留意すべきであるそのようなMilliQ水としてDCバイアスの印加を不要にバイアスフィードバックを必要としないオープンループKPFMモード）しかしながら、KPFMイメージングは極性溶液17-20の生細胞で行われていない。液体中のSP画像に関 連付けられた追加の課題は、一般的に維持する細胞（ すなわち、リン酸緩衝生理食塩水）のために使用する溶液は、ファラデー反応、バイアス誘起電荷ダイナミクス、イオン拡散/再分配20につながる移動イオンの高濃度を有することである。したがって、この実験のために、測定は、周囲条件下で、ポリ-L-リジン官能化されたステンレス鋼、金表面上で乾燥させ、デッドMRSA細胞から採取した。イメージングは、予め乾燥または表面20上に固定された生物学的サンプルに空気または真空条件下で行うことができる。湿った条件はまた、表面6のKPFMイメージングに影響を及ぼすことが示されている。
本研究では、FM-KPFMを採用そしてAFMは、ポリ-L-リジン官能化ステンレス鋼、金表面へのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 USA100（MRSA）の取り付けにSPの役割を調べた。 MRSAは、最近、多くのβラクタム系抗生物質及びセファロスポリン21にその天然選択された抵抗に多剤耐性（MDR）「スーパーバグ」としての地位を獲得している。 MRSA感染症は、ヒトにおけるより高い毒性レベルを有するバンコマイシンまたはオキサゾリジノンなどの過酷な抗菌剤の使用につながる、今より、厳しい困難、および治療 するのに手強いであるため、長期治療22として使用することができない。ステンレス鋼は、その医療関連性とゴールドは、比較金属として使用されたなどの皮下注射針、便器、ドアハンドル、シンク、材料として一般的な使用のために選ばれました。 FM-KPFMは、微生物膜SPが基板に付着すると変化するかどうかを調べるために利用された。
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Protocol
ガラス製品と文化の作製
- この実験を進める前に、5％の羊の血液寒天（SBA）MRSAを成長させるためのプレートを準備します。 37℃で24時間、SBAプレートをインキュベートする。この時間の後、単一の、十分に単離したコロニーを液体培地中に後続の接種のために使用されるために存在すべきである。 2ヶ月 - ストア1、4℃で、単一のコロニーを有するSBAプレートにストリーク。
注：羊の血液寒天プレートは20の間を含む既製のパックで来る - メーカーに基づいて25のプレート、そして一般的にVの羊の血液/ wの5％を加えたトリプシン大豆寒天ベースで構成されています。 - 確認トリプシン大豆ブロス（TSB）500mlを、1％グルコースおよび0.1％のNaClを補った。この後、2ガラス試験管に収集し、クリーン。オートクレーブ可能蓋が試験管用できない場合、キャップとしてアルミ箔を使用しています。 1ミリリットルピペットチップの箱と一緒にオートクレーブTSBおよび試験管。
- 安全キャビネットの下やバンズ近くバーナーEN、ピペット以前の5ミリリットルをオートクレーブ処理試験管にTSBオートクレーブ。十分な時間がTSBと試験管を室温まで冷却させるために与えられていることを確実にするように注意してください。以前にストリークし、5％のSBAプレートから、6ミリリットルTSBブロス中に単一コロニーを接種する。一つは、MRSAが含まれ、第二の試験管に無菌性を保証するために、陰性対照として使用される。
- 接種されたTSB試験管に取り、37℃、200rpmで24時間の逆数インキュベーターに置き。は増殖を制御試験管に発生していないはずながら、この時間の後、微生物の増殖は、MRSAの試験管には明らかなはずである。
- 新鮮なTSBの6ミリリットルに24時間の文化やピペットから1ミリリットルを取る。 200rpmで6時間、37℃でインキュベートする。
- 1.5mlマイクロチューブにピペットで6時間、サブカルチャーの1ミリリットル。 850×gで3分間遠心。上清を除去し、脱イオンH 2 Oの1ミリリットル中にペレットを再懸濁遠心機は、繰り返し、再懸濁。
- ステンレス鋼、金AFMサンプルディスク（20 mmで、それぞれ10 mmの直径）を取り、脱イオンH 2 O 5mlで各側を清掃鉗子で利き手でサンプルディスクを保持し、サンプルディスクのそれぞれの側に5ミリリットルをピペットサブドミナント手を使用しています。 1分間の超音波処理によって脱イオンH 2 Oを20mlの入ったビーカーに両側場所サンプルディスクを洗浄した後。
- 超音波処理の後ビーカーからサンプルディスクを削除する鉗子を使用しています。彼らはペーパータオルの上に開いたペトリ皿の端に60°の角度で傾くようにディスクを置きます。乾燥ディスクをカバーするためにペトリ皿の蓋を使用してください。ディスクが先に進む前に、完全に乾燥させます。 8時間 - 乾燥時間は4との間を変化させることができる。
- 乾燥したら、ペトリプレートにサンプルディスクを配置するために鉗子を使用しています。
- 必要に応じて、どのような材料でサンプルディスクの表面を機能化（例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、銀ナノ粒子など ）。
- この実験では、被覆するために基板表面をポリ-L-リジンを使用する。サンプルディスク上に（H 2 O中）、0.1％ポリ-L-リジンを400μl、およびペトリ皿中で室温で1時間インキュベートさせ-ポリ-L-リジン機能化、ピペット200のために。
- 1時間後、サンプルディスクを保持し、脱イオンH 2 O 1mlで洗浄するために鉗子を使用してステップ2.2で説明したように紙タオル上で乾燥させます。
- 2X洗浄し、再懸濁した細胞を取り、200プレート - 安全キャビネット内部のサンプルディスク上に400μlのを。サンプルディスクを、ポリ-L-リジンで被覆されている場合は、室温で0.5時間インキュベートする。
- サンプルディスク上の細胞のインキュベーション後に、脱イオンH 2 O 1mlで穏やかにサンプルディスクを洗うディスクがイメージングの前に一晩乾燥させます。
3. KPFMイメージング
注：この実験では、アジレント5500シリーズILM-AFMを使用しています。
- AFMを開始するには、AFMのHEBとMAC IIIコントローラと一緒にコンピュータ·ユニットの電源をオンにします。オープンAFMイメージングソフトウェア（ 例えば、AgilentのPicoView）。最初はACAFMまたはいずれかの正しい指定が断続的接触モードでのイメージングのためのAFMにあるを選択してください。
- 利き手でのAFMピンセットを使用して、サブドミナントの手で開いているばね式クリップホルダーを保持し、ヘッドピースににKPFMカンチレバーを配置。取扱い及び（少なくとも5500 ILM-AFMで）このユニットとしてAFMにAFMヘッドピースを転送するX、Y、Zのスキャン方向性を制御して脆弱なピエゾ水晶ユニットが含まれている場合は注意してください。
注：この場合に使用KPFMのカンチレバーは2.7 N / Mの80 kHzと、スプリング定数の平均共振周波数を持つMikromasch導電DPE（低ノイズ）カンチレバーた。これらの共振周波数とばね定数のカンチレバーによる使用の容易さのために選択した。より大きなバネ定数と高い共振周波数を有するカンチレバーは、イメージングのために使用することができる。 - 慎重にAFMに頭ピースをロードし、（この場合は2本のワイヤで接続される必要がある：レーザー光とステージリフトモータ）適切な配線を接続。
- カンチレバーの先端にレーザーの位置を合わせます。一部のユニットは簡単に位置合わせが可能になり、カメラの機能が含まれています。カメラ機能は、AFMに存在しない場合、次に説明するように、カンチレバーの先端に位置合わせする。
- カンチレバーチップ頭上レーザーを移動するために、前面から背面へのノブを時計回りに回転させます。レーザーは、チップに到達するとそれがブロックされ、表示されなくなります。唯一のノブを数回回す。
- レーザスポットが再表示されるまで、反時計回りに、前面から背面へのノブを回します。レーザーは、チップの端になりました。
- カンチレバー上にレーザを配置する左から右へのノブを回します。レーザーはカンチレバー上を通過するとして、それは私が消え、再び表示されますnは矢継ぎ早。レーザスポットは、フォトダイオード部は、後で座って曇りガラスカバーの中に表示されるはずです。
- 曇りガラス上のスポットが消えるまで、先端に向かってカンチレバーをスポットを下に移動し、反時計回りに、前面から背面へのノブを回します。
- それだけでカンチレバー先端に座るように、レーザを位置決めするために、わずかに前面から背面へのノブを時計回りに回します。レーザスポットは、すりガラスに再表示されます。
注：これは、ダイビングボードカンチレバー用レーザ測位方法である。三角形のカンチレバーの場合は、配向処理がわずかに異なります。
- レーザーが整列されると、AFMにサンプルを装着する際に、カンチレバーと試料との間の十分なスペースを確保するために、10秒間「開」位置でのステージリフトモータを保持する。
- KPFMの試料ステージ上の試料を置きます。銅線を使用してサンプルを接地してください。試料ステージにAFMから適切な配線を接続します。 Sを接続しますAFMに田下。ほとんどの場合、ステージは、磁石を用いて所定位置に保持される。
- AFMソフトウェアでは、曲がカンチレバーと、試料にカンチレバー先端のアプローチを開始。セトリング時間は10ミリ秒以下に設定され、そのアプローチ速度がチップの損傷を回避するために、2.0ミクロン/秒を超えないことを保証する。
- カンチレバーの先端が試料表面上にあると、撮像窓のサイズと理想的な画像領域を選択。地形画像化が最適化されるようカンチレバー設定点と共にI及びPゲインを最適化する。
- 地形イメージングが最適化されると、（;ここでは、FMモードを使用したFMまたはAMモードのいずれか）KPFMモジュールをオンにします。それはKPFMイメージングが5μm×5μmの撮像窓の外側に非常に困難であることに留意すべきである。 （ - 0.05ライン/秒0.02）。また、最適KPFMイメージングのために、低速走査速度の512×512の解像度を使用します。
- 10％ - FM-KPFM設定（しないACAFM設定）の場合は、5間の駆動パーセントを設定します。カンチレバーfrとを設定する2 kHzの帯域幅5 kHzの - 1の間のequency。 0.3％IとFM-KPFM設定のPゲインを設定します。
- 信号帯域幅を変化させ、Iと試料表面との間のPゲイン。 SP画像化を最適化するために、さらに最適な画像を得るために信号帯域幅とIとPゲインを調整する。 0.35％ - 私とPゲインの推奨範囲は0.22からです。
- プロセス及びSPデータを収集する後の画像処理ソフトウェアを使用して収集されたKPFM画像を分析する。
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Representative Results
KPFMを使用してSPを測定する能力は、試料表面とカンチレバーチップの両方がある程度導電性であるという原理に依存している。ステンレススチールとゴールドは、MRSAが取り付けられていたように導電性表面を務めた。 KPFM画像は512×512の解像度を持つ、と5×5ミクロンから10×10μmの範囲のスキャン領域と両面に15 MRSA細胞から採取された。走査は、0.02ライン/秒から0.05ライン/秒の範囲のライン速度で実施した。そのため、行ごとに収集512データポイントとスキャンする512線で、スキャン時間は2.84時間から7.11時間の範囲であった。収集された画像の種類は、 図2に見ることができる。KPFMデュアル周波数を使用して動作し、そのようなものとして、地形の画像が同時に表面の電気的特性に関するデータと一緒に収集される。熱フィルタは、より容易に表面電位の小さな変化（ 図2）を識別するために、SPマップに適用した。 SPマップデータワット分析した後、画像処理ソフトウェアとして平均表面電位および標準偏差を決定する。統計分析は、Rオープンソースの統計的プログラミングを使用して行った。スチューデントt検定は、P <0.05を有意と考えた状態でグループを比較するために行った。
SP画像は、微生物膜の表面電位を測定するために分析した。これらは、異なる基材表面上での成長と比較さであった。これは、表面型微生物の膜表面電位に影響を与えたかどうかを決定するために行った。当初我々は、基板表面上の3時間静的にMRSA細胞をインキュベートすることを試みた。しかし、添付の微生物は、AFMの下に見られなかった。清潔で、ポリ-L-リジン機能化表面のためのSPデータは、5×5μmの走査領域から決定した。裸のステンレス鋼と裸の金基板のSPスキャンは、それぞれ全体的に負の表面電位（-0.045±0.057 Vと-0.126±0.052 Vを示した、P = 0.047、 図3）。ポリ-L-リジンは、細胞接着のためにそれらをより良好なものとするために表面を官能化するために使用された。官能化された表面は、ステンレス鋼、金表面（それぞれ、0.133±0.063 Vと0.126±0.030 V、 図3）のための正の表面電位へのシフトを示した。我々は、その後、ポリ-L-リジン官能化ステンレス鋼、金表面上のMRSAの膜電位を調べた。これは、MRSA、細胞の膜電位は、ステンレス鋼、金表面の間で変化していることがわかった。ステンレス鋼表面は、金の対応物と比較した細胞で有意に大きな正の膜のSPに導いた。例えば、MRSA細胞のSPは、負のSP正から切り替える。 MRSAは、0.160±0.022 VのSPは、金表面上-0.025±0.016 VのSP（P <0.001）とステンレス鋼表面上の正のSPを示した。
KPFM、例のすべての機能を表示するにはステンレス鋼上のMRSAのステップ高さのグラフ（ 図4）が設けられている。これは、基板表面と微生物の膜との間の表面電位の差を示している。
原子間力顕微鏡（i）およびケルビンプローブフォース顕微鏡（ii）の （15）からの許可を得て転載1.作業原理図 。 AFMの基本構成は、（i）に示されている。 AFMでは、鋭利な先端は、電気化学蒸着によりカンチレバーに取り付けられている。 Mikromasch白金被覆された導電性DPE（低ノイズ）カンチレバーがこの実験に使用した210×30ミクロンの寸法は、80 kHzの共振周波数、および2.7 N / mのばね定数を有していた。カンチレバーは、容易な取り扱いを可能にするために、大きなチップに結合させた。 AFMで組み立てた後、レーザは、カンチレバー先端に位置合わせされる。 cantilでたわみ今までに先端がフォトダイオードを介して検出されている。偏向は地形画像を生成するために使用される。 （二であり、a、b、c）はKPFMの動作原理を示している。カンチレバーは、電気的接触が発生することを可能にするために、表面に十分に近接させる。先端と表面との間の表面電位の差は、先端部が偏向する原因。 DC電圧は、このたわみを補正するために適用される。このDC印加電圧は、基板表面の表面電位に等しい。 （リフト、AM、FM）に使用される撮像モードの種類に応じて、この動作原理は、わずかに異なっている。図1（ii）は15から変更されている。
図2の代表的な地形やポリ-L-リジン官能化されたステンレス鋼、金基板上のMRSAのポテンシャルマップの表面 。イメージ（iおよびiii）の代表的なトポグラフィー画像を示すそれぞれステンレススチールとゴールドの表面にMRSA細胞の、。画像のサイズは、対応する有色高さプロファイルと一緒にこれらの画像のX及びY軸に見ることができる。 （IIおよびIV）には、それぞれの表面上にMRSAの対応のSPマップを示します。標準の「金」のカラーフィルタは、熱フィルタをより容易にSPの小さな変化を識別するSP画像に適用しながら画像を地形に適用した。これは、基板表面のSPが均一ではなかったことに留意すべきである。 SPは、不均一の両方の基板表面上の見かけの正および負の領域に分布していることが見出された。これは、異種SPはステンレススチールとゴールドの基板上に観測されるMRSA細胞の周りに見ることができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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基板表面およびMRSA細胞膜の、図3の表面電位 。 図3は、ステンレス（SSとしてここに表示）鋼及び金表面から対応KPFMデータを示し、同様に、15セルからのデータ。アスタリスクは、比較したサンプルに対応するアスタリスクの数のサンプル間の有意差を表す。 MRSAデータはインキュベーションの30分後に官能化された表面に付着した細胞から収集した。これにより、細胞は全く3時間後にベア基板の表面に付着することが見出されなかったという事実のために行われた。
ポリ-L-リジンで官能ステンレス鋼上のMRSAの図4.ステップの高さの表面電位像 。後の画像処理ソフトを用いて、ステップの高さのグラフはcapabiliを示すために生成されたソフトウェアの関係、並びに、基板表面と細胞膜の間のSPにおける顕著な違い。選択された断面積は、灰色の線と対応するSPマップ上に表される。基板表面上の0.21 Vに細胞表面に0.15 Vからのシフトは明らかに明らかである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 会社 | プローブタイプ | バネ定数（N / M） | 共振周波数（kHz） | カンチレバー外形寸法 | ヒントアペックス直径 |
| アサイラムリサーチ | AC240TM-R3 | 2 | 70 | 長さ= 240ミクロン WIDTH =40μmの</ TD> | 28 nmの |
| ブルカーAFMプローブ | SCM-PIT | 2.8 | 75 | 長さ= 225ミクロン WIDTH = 28ミクロン | 20ナノメートル |
| Mikromasch | 導電性DPE（低ノイズ）カンチレバー | 2.7 | 80 | 長さ= 210ミクロン WIDTH = 30ミクロン | 40 nmの |
| ナノ及びその他のUSA | PtSiの-NCH | 42 | 330 | 長さ= 125ミクロン WIDTH = 30ミクロン | > 25 nmの |
| ナノサイエンス·インスツルメンツ | AppNano導電性タッピングモードAFMプローブ。 | 40 | 300 | 長さ= 125ミクロン WIDTH = 35ミクロン | 30ナノメートル |
| ナノサイエンス·インスツルメンツ | AppNano導電性タッピングモードAFMプローブ。 | 40 | 300 | 長さ= 125ミクロン WIDTH = 35ミクロン |
KPFMプローブの広い範囲を提供。企業のさまざまな表1.企業は今、様々な先端頂点の直径、バネ定数、共振周波数のKPFMチップを提供しています。ヒントのカスタマイズは、企業が一般的に意図された実験用のカスタム仕様のカンチレバーを構築するために提供して、無限に近い。ほとんどのKPFMプローブはプラチナコーティングされたシリコン窒化物である。プラチナはカンチレバーに導電性の機能を提供します。他の一般的なコーティング材料は、イリジウム、プラチナ+イリジウム、金等が使用可能である。最もKPFMチップはまた代わりに、電気力顕微鏡（EFM）のために使用することができる。ヒント頂点はKPFMカンチレバーのために重要である。大きな直径のヒントは、より少ない電気的ノイズのために、より高解像度の地形イメージングを生け贄に捧げる。逆に、より小さな直径の先端（<25 nm）を提供トポグラフィ画像の解像度を改善したが、電気的ノイズの影響を受けやすい。この研究では、研究者はMikromasch行為を使用IVE DPE（低ノイズ）カンチレバー。
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Discussion
KPFM表面電気的データを得るための新規な技術を用いた。これは、一般化学における電荷分布を調べるための方法として使用されており、ごく最近、マイクロおよびナノスケールでの生物学的システムの研究に適用され始めている。収集したデータから、我々は微生物が容易にさえ静的インキュベーションの3時間後に、ステンレス鋼、金表面を洗浄するために添付するようには見えなかったことがわかった。ポリ-L-リジン機能化表面は、30分後に急速な微生物付着を示した。官能化された表面上の微生物のより長いインキュベーション時間は、試料表面上の細胞過密、悪いトポグラフィ画像につながった。表面機能化は、ステンレス鋼、金表面のためのポジティブSPへの負のSPからのシフトにつながった。以前の研究では、微生物は、典型的には、浸透圧及びイオンバランス23を維持するために起因する細胞の周りに負に帯電したイオンの封鎖に負のSPを有することが示されている。また、知られているグラム陽性微生物におけるグラム陰性微生物及びタイコ酸中のリン酸基の存在は、さらに負のSP 24の形成をもたらすこと。グラム陽性と陰性の細胞膜の基本的な化学の知識は、正の基板SPが急速な微生物付着につながると仮定することは私たちを導いた。ステンレス鋼、金基板上の負のMRSA細胞のSPが正から大きなシフトがそれぞれあったこと、4 -しかしとしては、 図2に見ることができる。微生物付着は当初、膜の周りのマイナスイオンの隔離から発生している可能性があります。細胞を洗浄し、基板表面にドライそれらをさせる際に、我々は、このイオン性のメディアを洗い流しれた可能性があります。また、KPFMデータグラム陽性（MRSA）は、細胞の外側の細胞壁の領域のみを含めたことに留意すべきである。それは、微生物の細胞膜電位がたCaTiOの存在に変化することがある場合に示されているNICの抗菌ペプチドまたは他のストレッサー8。
微生物細胞培養物に対する標準ゼータ電位測定に比べKPFMの一方の主な欠点は、KPFMで収集したデータは、死んだ、乾燥させた細胞で行われていることである。 KPFM異なる取付基板表面に関して細胞表面電位のシフトの一般的な傾向を調べた。 DCのアプリケーションは、カンチレバー先端に電圧を導電性の試料表面の要件に沿って、（F ESを打ち消すために）、オープンエアのためのイメージングを標準KPFMを制限する。極性液体中のイメージングは、標準KPFMで現在は不可能であるため、KPFMを使用した生細胞のイメージングはまだのようにはできません。新しい開ループ及び二重周波数KPFMモードの開発は、低イオン溶液18〜20の画像表面へのそれらの能力において有望であることを示している。イメージングは、LIV上で行うことができるように、将来的にはこの技術がさらに発展していることを願ってい電子細胞培養物。より自然環境における細胞のイメージングは、間違いなく、より正確かつ現実的な細胞膜のSPデータの生成につながる。この研究のために我々は、微生物細胞膜電位を測定するだけでなく、医学的に関連する表面にMRSAの接着特性を研究するための新規な方法でこの技術を適用したいと考えていました。微生物膜のSPの変化が異なる基板表面上のインキュベーションの際に観察された。これは、基板の種類は、細胞の代謝に影響を与えることが意味し得る。我々の希望は、この予備的なデータは、微生物の付着を防止するために（例えば、包帯およびガーゼなどの他の材料を含む）、医療表面または機器に適用することができる固有の電荷を有するナノコーティングの生成をもたらす可能性があることである。この記事内に記述プロトコルは、研究者がKPFMの原則と、それが測定したSPマップを作成するために適用することができるショーの方法を理解するのに役立つことを意図している。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
| DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
| PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
| Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
| Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |
References
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