Abstract
표면 전위는 기판 표면 위해 미생물의 밀착성 지배적 역할을 간과 물리적 특성이다. 켈빈 프로브 현미경 (KPFM)는 나노 스케일에서 표면 사이의 접촉 전위차를 측정하는 원자 힘 현미경 (AFM)의 모듈이다. AFM KPFM와의 조합은, 표면 전위와 같은 박테리아 세포와 같은 생물학적 샘플의 지형도의 동시 생성을 허용한다. 여기서, 우리는 스테인레스 스틸과 같은 의학적으로 중요한 금 표면에 부착 미생물 표면 전위의 영향을 조사하기 KPFM를 이용한다. 표면 잠재적 인지도는 다른 재료 기판에 미생물 막에 대한 표면 전위의 차이를 한 것으로 밝혀졌습니다. 스텝 높이 그래프는 기판 표면과 미생물 사이의 경계 부분에서의 표면 전위의 차이를 표시하기 위해 생성 하였다. 세포막 표면 전위의 변화는 변화와 연결되어있다세포 대사 및 운동성의. 따라서 KPFM 각종 기재 표면에 접착시 미생물 막 표면 전위의 변화를 조사하기 위해 사용될 수있는 강력한 도구를 나타낸다. 본 연구에서, 우리는를 사용 KPFM 스테인리스 스틸 및 골드 개별 메티 실린 내성 황색 포도상 구균 USA100 세포의 표면 전위를 특성화하는 과정을 보여준다.
Introduction
바이오 필름이 제거에 완강히 저항하고 질병 전송 및 항생제 내성의 증가 속도로 이어질 수있는 장비 표면과 피부 상처에서 생산되는 바이오 필름은 의료 산업에 대한 문제를 제시한다. 첨부 biofilm 형성의 첫 단계와 가역성 1-3로 인해 가장 중요한 단계이다. 기판 표면 특성을 미생물에 부착 중요한 역할을한다. 이러한 표면 경도, 다공도, 조도 및 소수성과 같은 인자가 미생물 부착을 행하도록 도시되었다; 그러나, 미생물의 부착 기판 표면 전위 (SP)의 역할을 조사 연구는 거의 4,5 행해졌 다. 음으로 대전 된 표면은 운모, 실리콘, 및 금 6 바실러스 투 린지 엔시스 포자의 부착을 방지 할 수 있습니다. 세포막 전위의 변화는 세포 부착과 운동성 5,7의 변화를 나타낸다. 그것은 전기 동음 것으로 확인되었습니다ogeneous 표면은 더 쉽게 미생물 부착 5를 촉진한다. 나노 스케일에서 박테리아의 표면 전위를 특성화하는 항 생물 연료 전략의 개발에 도움이 될 수있다하여 각종 세균의 표면에 부착 동역학을 이해하는 신규 한 방법을 제공하고있다. 이러한 전기 영동 광 산란, 제타 전위 및 등전점 결정 박테리아의 전기 역학을 특성화에 사용되는 다른 방법과는 달리, 켈빈 프로브 현미경 (KPFM)는 각각의 세포 대신 전체 문화 8-11의 시험을 허용한다. 셀 - 셀 비교하거나 높은 정확도 및 정밀도와 전기적 특성을 생물막하고자 할 때 유용하다.
KPFM은 원자력 현미경 (AFM)의 모듈이다. AFM은 스캐닝 터널링 현미경 (STM) (12)의 직접적인 결과로서 개발되었다. STM을 사용하여 첫 번째 게시 된 이미지 1982 년 12 게르트 Binnig와 하인리히 Rorhrer에 의해 수행되었다 12 STM을 사용하려고 생물학 여기 고해상도 이미지를 달성 의미. STM은 전문 프로브 팁 (13)를 사용하여 액체에서 수행 할 수 있습니다. 이 린제이 등., 금 전극 (13)에, 10 mM의 HClO 4 물에 이미지 DNA 분자 STM과 AFM을 사용하여 표시 하였다. KPFM 리간드 (26)와 DNA 및 단백질 분석 (25)와 생체 분자 상호 작용의 표면 전위를 결정 증명되었다.
KPFM는 AFM 도전 캔틸레버 팁과 이상적으로 도전 샘플 사이의 접촉 전위차 (CPD)를 측정하여 14, 15 (, 내가 그림 1)를 운영하고 있습니다. 샘플은 반드시 도전 (즉, 생물학적 SAMPL 될 필요가 없습니다ES). 이미징 운모, 유리, 및 긴 비 - 전도성 표면이 얇고 -6,7- 밑바탕 도전 재료가 실리콘 표면으로 (비 도통)에서 수행 될 수있다. CPD는 표면 전위와 동등한 전압과 음의 전자 전하로 나눈 팁 (팁 φ) 및 샘플 (샘플 φ) 간의 일 함수의 차이로서 설명 될 수있다 (- E). 도전성 AFM 팁이 샘플 표면에 근접하게되면 때문에 페르미 에너지에서의 차이 (도 1, II, a) (15)에 정전 기적 힘 (F의 ES)가 생성된다 (거리 (d)에 의해 분리). 이 시점에서, 팁 및 샘플 (E의 V)의 진공 에너지 평형으로 정렬된다. 가까운 시료 표면에 팁을 가져시, 팁과 시료 표면은 평행 판 커패시터 (도 1, II, B 등의 전기 접점과 행위에 와서 (14, 15). 이때, 팁과 시료 표면의 페르미 에너지는 정상 상태 평형에 도달 정렬 될 (도 1, II, b). 팁과 시료 표면으로 인해 E의 V의 작업 기능의 차이로 청구됩니다 및 V의 CPD가 형성됩니다. 인해 형성된 V의 CPD에 전기 콘택트 영역에서 F ES가 작용한다. 이 힘은 이후에 (도 1, II, c) 형성된 V의 CPD와 동일한 크기를 갖는 선단에 외부의 DC V의인가를 통해 무효화된다. 이는 DC 전압이 전기 접점의 영역에서 표면 전하를 제거 도포하고, V의 CPD의 F의 ES를 제거하는 데 필요한 V DC의 양은 SA 간의 일 함수의 차이와 같다mple 표면과 팁 (15). 이것은 팁의 일 함수가 공지되어 있고, 그것은 제조자에 의해 제공된다는 것을 주목해야한다. KPFM 모든 방법에서, AC 전압 (V AC, 약 100-500 MV)는 또한 팁과 시료 (14) 사이의 진동 전기력을 발생하기 위해 팁에인가된다. V의 CPD 및 / 또는 F 말이지의 변화를 측정 할 때 더 나은 해상도를 제공합니다. 이와 관련하여, 주파수 또는 전기적 진동의 진폭의 변화는 V DC에 의해 보정하고, 전위 맵을 생성 할 수있는 표면 일 수있다. 이지도의 특정 영역의 데이터는 상기 특정 지형은 대한 전기적 정보를 제공하도록 분석 될 수있다.
(1) 리프트 모드, (2), 진폭 변조 (AM) 모드, 및 (3)의 주파수 변조 (FM) 모드 14,16 : KPFM 세 가지 모드에서 동작 할 수있다. 리프트 모드 초기 INC이었다KPFM의 arnation. 리프트 모드 발진 팁 지형 화상을 얻을 표면을 가로 질러 드래그하는 두 단계 방법에 의존한다. 두 번째 패스 팁을위한 샘플 상기 미리 설정된 거리 상승 (10-100 나노 미터) 다시 같은 지역에서 검색합니다. 때문에 AM- 및 FM-KPFM에 비해이 두 단계 방법, 리프트 모드로, 이미지 수집에 대한 가장 긴 시간이 소요됩니다. 멀리 표면으로부터 팁을 올리면 만 장거리 F 말이지 측정되는 것을 보장한다. 또한, 지형과 표면 전위 측정 사이의 크로스 토크가 증가 측면 해상도와 감도의 비용으로 분리된다.
AM-KPFM 동시에 샘플 지형 및 표면 전위 (일회 주사) (14)를 측정하기 위해 듀얼 주파수를 이용하여 가로 해상도와 감도를 향상시킨다. AM 모드에서, 캔틸레버를 기계적 통상 5 %의 제 1 공진 주파수 이하, 발진 (F 0), 전기적 진동 (t두 번째 공진 주파수 (F 1)에서 V AC) hrough. F에 의한 ES 및 V의 변화에 CPD F (1)의 진폭의 변화는, 표면 전위의 측정 데이터를 제공하면서 지형 데이터의 생성 F 0 리드의 진폭의 변화. F 0과 캔틸레버의 F 하나는 크로스 토크가 최소화된다 (14) 신호 및 상당한 주파수 에너지에 의해 분리된다. AFM의 머리 전자 상자 (HEB)는 모두 지형을 제공하고 한 번의 스캔에서 동시에 잠재적 인 데이터를 표면에 두 개의 신호를 분리한다. FM-KPFM 생물학적 표면 (14)에 해상도도 더 이상 AM-KPFM을 향상시킨다. FM-KPFM는 정전기력 구배가 아닌 정전기 힘 (F 말이지) (15)의 변화를 측정하는 것을에서 AM-KPFM 다르게 작동합니다. AM 모드와 마찬가지로, FM 모드는 듀얼 주파수와 자장을 이용하여전자 통과 주사기구는 지형적 구하는 동시에 잠재적 인 데이터 (14)를 표면. FM 모드에서 외팔보 기계적 F 0으로 진동 전기적 낮은 주파수에서 발진하는 수정 (MOD F 전형적 1-5 kHz로). 정전 기적 상호 작용시, 0와 f 모드 믹스 f를 0 ± F 형 모드 F 측 대역을 생성한다. 이러한 측 파대 정전기력의 변화에 매우 민감하고, AFM의 HEB 통해 F 0으로부터 분리 될 수있다. FM-KPFM는 정전기력 구배의 변화를 측정하기 때문에, 팁 선단 형상 및 그 유지 보수 / 무결성. 전체 표면 전위 해상도 (14), (15)에서 중요한 역할을 AM을 사용하여 잠재적 인 해상도를 표면 및 FM 모드는 횡 방향으로 1 nm 범위의 14 아르 -16. 그것은 KPFM 촬상에가 (비 - 극성 액체에서 수행 될 수 있고, 최근에, 저 이온 (<10 mM)을 극성 액체에서 수행되는 것으로 도시되어 있음을 주목해야한다그러한 한 MilliQ 물로서 DC 바이어스의인가를 미연에 방지, 바이어스 피드백을 필요로하지 않는 개방 루프 KPFM 모드); 그러나, KPFM 영상은 아직 극성 솔루션 17-20에서 살아있는 세포에서 수행되어야한다. 액체에 SP 영상과 관련된 추가 과제 솔루션은 일반적으로 유지하는 세포에 사용되는 (즉, 인산염 완충 생리 식염수) 패러데이 반응, 바이어스 유도 충전 역학, 이온 확산 / 재배포 (20)로 이어질 것 모바일 이온의 높은 농도를 가지고있다. 따라서,이 실험에서, 측정은 주위 조건 하에서 폴리 -L- 라이신 관능 스테인리스 스틸 및 금 표면 상에 건조시키고, MRSA 죽은 세포로부터 취해졌다. 이미지는 이전에 건조 또는 표면 (20)에 고정 된 생체 시료에 공기 또는 진공 상태에서 수행 할 수있다. 습한 환경은 표면 (6)의 촬상 KPFM에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
이 연구에서는 FM-KPFM 고용AFM은 및 폴리 -L- 라이신 관능 스테인리스 금 표면에 메티 실린 내성 황색 포도상 구균 USA100 (MRSA)의 부착에 SP의 역할을 조사한다. MRSA는 최근 인해 다수의 β - 락탐 항생제와 세 팔로 스포린 (21)에 자사의 자연 선택 저항에 다제 내성 (MDR) "슈퍼 벌레"등의 상태를 얻고있다. MRSA 감염은 반코마이신 또는 장기간 치료 (22)로서 사용될 수 없다 따라서 인간에서 높은 독성 수준을 가지며, 옥사 졸리 디논 등의 가혹한 항균제의 사용에 이르는 지금 치료하기 더 어려운 곤란하고 강력하다. 스테인레스 스틸은 자사의 의료 관련성과 골드 비교 금속으로 사용되었다 등 피하 주사 바늘, bedpans, 문 손잡이, 싱크대,의 재료로 많이 사용으로 인해 선택되었다. FM-KPFM 미생물 막 SP가 기판에 부착시 변경되는 경우 검사를 사용 하였다.
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Protocol
유리와 문화 1. 준비
- 이 실험을 진행하기 전에, 5 %의 양의 혈액 한천 (SBA) MRSA 성장에 대 한 번호판을 준비합니다. 37 ° C에서 24 시간 동안 SBA 판을 품어. 이 시간이 지나면, 단일, 잘 절연 식민지 액체 미디어에 이후의 예방 접종에 사용되는 존재해야한다. 2 개월 - 스토어 1 4 ° C에서 단일 콜로니와 SBA 판을 줄무늬.
참고 : 양의 혈액 한천 플레이트 (20) 사이에 들어있는 미리 만들어진 팩에 와서 - 제조 업체에 따라 25 판, 일반적으로 V 양의 피 / w 5 %의 추가와 트립신 간장 한천베이스로 구성되어 있습니다. - 1 % 포도당과 0.1 % NaCl로 보충 트립신 간장 국물 (TSB)의 500 mL로한다. 이 후, 수집이 유리 테스트 튜브를 청소합니다. 오토 클레이브 뚜껑 테스트 튜브를 사용할 수없는 경우, 모자로 알루미늄 호일을 사용합니다. 오토 클레이브 TSB 1 ML의 피펫 팁 상자와 함께 테스트 튜브입니다.
- 바이오 안전성 캐비닛에서 또는 빵 근처버너 욕실, 피펫 이전에 5 ml의 멸균 시험관에 TSB를 멸균. 충분한 시간을 보장하기 위해주의는 TSB을 수 있도록 주어진 및 테스트 튜브는 실온으로 냉각되고있다. 이전에 줄무늬가 5 % SBA 판에서, 6 ml의 TSB 배지에 단일 콜로니를 접종. 하나는 MRSA를 포함하고, 제 2 테스트 튜브 불임을 보장하기 위해 음성 대조군으로 사용한다.
- 접종 TSB 테스트 튜브를 타고 37 ° C에서 24 시간 동안 200 rpm에서 상호 인큐베이터에 배치합니다. 더 성장 제어 시험관에 발생하지해야하는 동안이 시간 후에는 미생물 성장 MRSA 시험관에서 명백하다.
- 신선한 TSB의 6 ml의에 24 시간 문화와 피펫 1 mL를 취하여. 200rpm으로 6 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 피펫 1.5 ml의 미세 원심 튜브에 6 시간 하위 문화 1 ㎖. 850 x g에서 3 분 동안 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 탈 H 2 O의 1 ml의 펠렛을 다시 중단 원심 분리기, 반복, 다시 일시 중지합니다.
- 스테인레스 스틸과 골드 AFM 샘플 디스크 (20mm 각각 10mm 직경)을 가지고 탈 H 2 O 5 ml의 각면을 청소 집게로 지배적 인 손에 샘플 디스크를 잡고 샘플 디스크의 각면에 5 mL를 피펫에 버금 딸림음 손을 사용합니다. 1 분 동안 초음파 처리 한 다음, 탈 H 2 O 20 ㎖를 넣은 비커에 양측 도시 샘플 디스크를 세척 한 후.
- 초음파 사용 집게 후 비커에서 샘플 디스크를 제거합니다. 그들은 종이 타월에 페트리 접시의 가장자리에 60 ° 각도로 기울어 있도록 디스크를 넣습니다. 건조 디스크를 덮도록 페트리 접시 뚜껑을 사용한다. 디스크가 계속 진행하기 전에 완전히 건조 시키십시오. 8 시간 - 건조 시간 (4) 사이를 변화 할 수있다.
- 일단 건조, 페트리 접시에 샘플 디스크를 배치하는 집게를 사용합니다.
- 선택적으로, (임의의 재료 샘플 디스크의 표면을 기능화예를 들면, 콜라겐, 히알루 론산,은 나노 입자 등)를 포함한다.
- 이 실험을 위해, 도포하는 폴리 L 리신 기판 표면을 사용한다. 들면 폴리 -L- 리신 기능화 피펫 200 - 샘플 디스크에 (H 2 O)에서 0.1 % 폴리 -L- 리신의 400 μL, 및 페트리 접시를 실온에서 1 시간 동안 배양하자.
- 1 시간 후, 샘플 디스크를 보유하고 탈 H 2 O의 1 ml로 씻어 집게를 사용 단계 2.2에 설명 된대로 종이 수건 건조 보자.
- 배 세척 다시 중단 세포를 가지고 200 판 - 생물 안전 캐비닛 내부 샘플 디스크에 400 μl를. 샘플 디스크가 폴리 -L- 리신으로 코팅되는 경우, 실온에서 0.5 시간 동안 배양한다.
- 샘플 디스크 세포의 배양 후, 탈 H 2 O의 1 ml로 부드럽게 샘플 디스크를 씻어 디스크 이미징 전에 밤새 건조 시키십시오.
3. KPFM 이미징
참고 :이 실험을 위해,애질런트 5500 시리즈 ILM-AFM을 사용합니다.
- AFM을 시작하려면, AFM의 HEB와 MAC III 컨트롤러와 함께 컴퓨터 기기를 켭니다. 오픈 AFM 이미징 소프트웨어 (예를 들어, 애질런트 PicoView). 처음 ACAFM 또는 중 올바른 지정 간헐적 접촉 모드에서 이미징을위한 AFM에를 선택해야합니다.
- 지배적 인 손에 AFM의 집게를 사용하고, 버금 딸림음 손으로 열고 스프링 클립 홀더를 잡고, 머리 조각에 KPFM 캔틸레버를 배치합니다. 취급 (적어도 5500 ILM-AFM)에이 단위로 AFM에 AFM 헤드 피스를 전송 X, Y 및 Z 스캔 지향성을 제어하는 깨지기 쉬운 피에조 크리스탈 유닛을 포함하는 경우주의해야합니다.
참고 :이 경우에 사용 KPFM의 캔틸레버는 Mikromasch 도전 DPE 2.7 N / m의 80 kHz 및 스프링 상수의 평균 공진 주파수와 (저소음) 캔틸레버했다. 이러한 공진 주파수와 스프링 상수 캔틸레버 인해 사용의 용이성에 선정되었다.큰 스프링 상수 및 높은 공진 주파수를 갖는 캔틸레버 또한 이미징에 사용될 수있다. - 조심스럽게 AFM에 머리 부분을로드하고 (두 개의 와이어가 연결해야하는이 경우 : 레이저 광 무대 리프트 모터) 적절한 선을 연결합니다.
- 캔틸레버의 팁에 레이저를 맞 춥니 다. 일부 장치는 쉽게 정렬 할 수있는 카메라 기능이 포함되어 있습니다. 카메라 기능이 AFM에 존재하지 않는다면, 다음 바와 같이, 캔틸레버 팁 상에 정렬 :
- 캔틸레버 칩 솟다 레이저를 이동 전면에서 후면 손잡이를 시계 방향으로 돌립니다. 레이저 칩 도달하면 차단됩니다 더 이상 볼 수 없습니다. 만 손잡이를 몇 번 돌립니다.
- 레이저 스폿이 다시 나타날 때까지 시계 반대 방향으로 전후 노브를 돌립니다. 레이저는 칩의 가장자리에 지금이다.
- 캔틸레버에 레이저의 위치를 왼쪽에서 오른쪽으로 노브를 돌립니다. 레이저는 캔틸레버를 통과 그것은 사라지고 난을 다시 나타납니다N을 연속으로 빠르게. 레이저 스폿은 포토 다이오드 단위 나중에 앉을 것이다 젖빛 유리 커버에서 볼 수 있어야합니다.
- 젖빛 유리에 자리가 없어 질 때까지 끝을 향해 캔틸레버 아래로 자리를 이동하는 반 시계 방향으로 전후 노브를 돌립니다.
- 그냥 캔틸레버 팁에 앉아 있도록 레이저의 위치를 지정하기 위해 약간 전후 손잡이를 시계 방향으로 돌립니다. 레이저 스폿은 젖빛 유리에 다시 나타납니다.
주 :이 다이빙 보드 캔틸레버 레이저 위치 결정 방법이다. 삼각형 캔틸레버, 배향 처리가 약간 다르다.
- 레이저가 정렬되면, AFM에 샘플을 부착 할 때 캔틸레버와 샘플 사이에 충분한 공간을 확보하기 위해 10 초 동안 "열기"위치에있는 스테이지 리프트 모터를 개최합니다.
- KPFM 샘플 무대에 샘플을 놓습니다. 구리 와이어를 사용하여 샘플의 정전기를 제거하십시오. 샘플 단계에 AFM에서 해당 와이어를 연결합니다. 의 연결AFM에 다케. 대부분의 경우에 단계는 자석을 이용하여 제 위치에 유지된다.
- AFM 소프트웨어에서, 조정은 캔틸레버 다음 샘플에 캔틸레버 끝의 접근을 시작한다. 안정화 시간 이하를 10msec로 설정되어 있는지 확인하고, 그 접근 속도는 선단의 손상을 방지하기 위하여는 2.0㎛ / 초를 초과하지 않는다.
- 캔틸레버의 팁이 샘플 표면에 일단 촬상 윈도우 크기 및 최적 이미징 영역을 선택한다. 지형적 촬상 최적화되도록 캔틸레버 세트 포인트와 함께 I 및 P 이득을 최적화.
- 지형적 촬상 최적화되면 KPFM 모듈 켜 (FM 있거나, AM 모드 여기서, FM 모드를 사용한다). 그것은 KPFM 촬상 5 ㎛의 X는 5㎛ 촬상 창 바깥 매우 어려운 것을 주목해야한다. (- 0.05 라인 / 초 0.02) 또한, 최적의 KPFM 이미징, 느린 검색 속도와 512 X 512 해상도를 사용합니다.
- 10 % - FM-KPFM 설정에 대해 (설정을 ACAFM되지 않음), (5) 사이의 드라이브 %로 설정합니다. 캔틸레버 FR 설정2 kHz의 대역폭이 5 kHz로 - 1 사이 equency. 0.3 %로 FM-KPFM 설정에 I와 P 게인을 설정합니다.
- 신호 대역폭 및 I 및 샘플 표면 사이의 P 이득을 다릅니다. SP 영상을 최적화하기 위해, 상기 신호의 대역폭을 조정하고 P 및 I 이득은 최적의 이미지를 얻었다. 0.35 % - I와 P 이익의 권장 범위는 0.22에서 있습니다.
- 프로세스 및 SP는 데이터를 수집 후 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 KPFM 수집 분석한다.
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Representative Results
KPFM를 이용하여 SP를 측정하는 능력은 시료 표면과 캔틸레버 팁 모두 어느 정도 도전성 있다는 원리에 의존한다. 스테인레스 스틸과 골드는 MRSA가 부착 된에 전도성 표면을 행동했다. KPFM 이미지는 512 X 512 해상도 양면에 15 MRSA 세포의 촬영, 5 × 5 μm의 10 × 10 μm의 범위 스캔 영역으로 하였다. 스캔 라인은 0.02 / 초 내지 0.05 줄 / 초의 범위의 선 속도로 행했다. 512 데이터 포인트는 스캔 라인과 512 라인 당 수집에 따라서, 스캔 시간은 2.84 시간에서 7.11 시간였다. 수집 된 영상의 형식은도 2에서 볼 수있다. KPFM 듀얼 주파수를 이용하여 동작하고, 같은 지형 이미지 동시에 표면의 전기적 특성에 관한 데이터와 함께 수집된다. 열 필터는보다 쉽게 표면 전위 (그림 2)의 작은 변화를 식별하기 위해지도를 (SP)에 적용되었다. SP지도의 데이터 w분석 후 이미지 처리 소프트웨어로 평균 표면 전위 및 표준 편차를 결정한다. 통계 분석은 R 오픈 소스 통계 프로그램을 사용하여 수행 하였다. 학생 t-시험은 중요한 고려중인 P <0.05로 그룹을 비교 하였다.
SP 이미지는 미생물 막 표면 전위를 결정하기 위해 분석 하였다. 이들은 다른 기판 표면에 성장에 비해 다음이었다. 이것은 표면 유형 미생물 막 표면 전위에 영향을 미치지 여부를 결정하기 위해 수행되었다. 우리는 초기 기판 표면에 3 시간 동안 정적으로 MRSA 세포 배양 시도. 그러나, 부착 된 미생물은 AFM에서 볼 수 없었다. 깨끗하고 폴리 -L- 라이신 표면 기능화 된 SP 데이터에 대한 5 × 5 ㎛의 스캔 영역에서 측정 하였다. 베어 스테인리스 스틸 및 베어 금 기판의 SP 스캔은 각각 전체 음의 표면 전위 (-0.045 ± 0.057 V와 -0.126 ± 0.052 V를 보여 주었다, P = 0.047, 그림 3). 폴리 -L- 라이신 세포 부착하기에 더 유리한 있도록 표면 기능화를 위해 사용되었다. 기능화 표면은 스테인리스 스틸과 골드 표면 (각각 0.133 ± 0.063 V와 0.126 ± 0.030 V, 그림 3)에 대한 긍정적 인 표면 전위에 변화를 보여 주었다. 우리는이어서 폴리 -L- 라이신 관능 스테인리스 강 표면에 금 MRSA의 막 전위를 조사 하였다. 그것은 MRSA 세포막 전위는 스테인레스 스틸과 골드 표면 사이에서 변화 한 것으로 나타났습니다. 자신의 골드 대응에 비해 스테인레스 스틸 표면은 세포 상당히 큰 긍정적 인 멤브레인의 SP에했다. 예를 들면, MRSA 셀 SP 부정적인 SPS에서 긍정적로 전환. MRSA는 0.160 ± 0.022 V의 SP에 금 표면에 -0.025 ± 0.016 V의 SP (P <0.001)와 스테인레스 스틸 표면에 긍정적 인 SP를 보였다.
KPFM, 예제의 전체 기능을 표시하려면스테인리스 강에 MRSA의 단계 높이의 그래프 (도 4)가 제공된다. 이것은 기판 표면과 미생물 사이의 막 표면 전위의 차이를 나타낸다.
원자 힘 현미경 (I)와 켈빈 프로브 현미경 (II) (15)로부터 허가 재판 1. 작동 원리 그림. AFM의 기본 구성은 (ⅰ)에 도시되어있다. AFM에서 예리한 팁은 전기 화학적 침착에 의해 칸틸 레버에 부착된다. Mikromasch 백금 피복 도전성 DPE (저잡음) 캔틸레버는이 실험에 사용 하였다 210 X 30 ㎛, 치수 80 kHz의 공진 주파수, 2.7 N / m의 스프링 상수를 가졌다. 칸틸 레버 취급 용이성을 허용하기 위해 더 큰 칩에 부착 하였다. AFM에 조립되면, 레이저 캔틸레버 팁 상에 정렬된다. cantil의 처짐이제까지 팁은 포토 다이오드를 통해 감지됩니다. 편향은 지형 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. (II는, a, b, c)는 KPFM의 작동 원리를 보여줍니다. 캔틸레버가 발생하는 전기적 접촉을 허용하기 위해 표면에 충분히 가까이하게된다. 팁과 표면 사이의 표면 전위의 차이는 팁 편향시킬. DC 전압이 편향을 보정하기 위해 적용된다. 이 DC 전압인가는 기판 표면의 표면 전위와 동일하다. 이용 촬상 모드의 종류에 따라 (리프트, AM, FM)의 경우이 작동 원리는 약간 다르다. 그림 1 (II) (15)에서 수정되었습니다.
그림 2. 대표 지형과 폴리 -L- 라이신 작용 스테인레스 스틸과 골드 기판에 MRSA의 잠재적 인지도를 표면. 이미지 (I과 III)의 대표 지형 이미지를 보여 각각 스테인레스 스틸과 골드 표면에 MRSA 세포의. 이미지 크기는 높이에 대응하는 컬러 프로파일과 함께 이러한 이미지의 X와 Y 축에서 볼 수있다. (II와 IV) 각각의 표면에 MRSA의 해당 SP지도를 보여줍니다. 표준 '골드'컬러 필터는 열 필터가 더 쉽게 SP의 작은 변화를 분별하는 이미지를 (SP)에 적용하는 동안 이미지 지형도를 적용했다. 또한, 기판 표면의 SP가 균일하지 않았다 주목해야한다. SP는 균질 양 기판 표면 상 명백 플러스, 마이너스 영역으로 분포되는 것으로 밝혀졌다. 이것은 이종 SP의 스테인레스 스틸과 골드 기판에 관찰되는 MRSA 세포 주위에 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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기판 표면과 MRSA 세포막의 그림 3. 표면 전위. 그림 3은 15 세포에서 해당 KPFM의 스테인리스 (SS 여기에 표시) 스틸과 골드 표면의 데이터뿐만 아니라, 같은 데이터를 보여줍니다. 별표는 비교 샘플에 해당하는 별표의 수와 샘플 간의 유의 한 차이를 나타냅니다. MRSA 데이터는, 30 분 더 항온 배양 한 후에 기능화 된 표면에 부착 된 세포로부터 수집 하였다. 이 때문에 어떤 세포가 3 시간 후 노출 된 기판 표면에 부착 찾을 수 없습니다 사실에 이루어졌다.
폴리 -L- 라이신 작용 스테인레스 스틸에 MRSA의 그림 4 단계 높이 표면 잠재적 인 이미지. 이후의 화상 처리 소프트웨어를 사용하여, 스텝 높이 capabili 그래프를 표시하기 위하여 생성 된소프트웨어의 관계이며, 또한, 기판 표면과 세포막 SP 사이에서 눈에 띄는 차이. 선택된 단면적 회색 라인 SP 대응 맵 상에 표현된다. 기판 표면에 0.21 V로 세포 표면에 0.15 V에서 변화가 명확하게 알 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 회사 | 프로브 유형 | 스프링 상수 (N / m) | 공진 주파수 (kHz) | 캔틸레버 치수 | 에이펙스 직경 팁 |
| 정신 병원 연구 | AC240TM-R3 | 이 | (70) | 길이 = 240 μm의 폭 = 40 μm의 </ TD> | 28 nm의 |
| 브루 커 AFM 프로브 | SCM-PIT | 2.8 | (75) | 길이 = 225 μm의 폭 = 28 μm의 | 20 nm의 |
| Mikromasch | 전도성 DPE (저잡음) 캔틸레버 | 2.7 | (80) | 길이 = 210 μm의 폭 = 30 μm의 | 40 nm의 |
| 나노 및 기타 미국 | PtSi-NCH | (42) | (330) | 길이 = 125 μm의 폭 = 30 μm의 | > 25 nm의 |
| 나노 인스트루먼트 | AppNano 전도성 태핑 모드 AFM 프로브. | (40) | (300) | 길이 = 125 μm의 폭 = 35 μm의 | 30 nm의 |
| 나노 인스트루먼트 | AppNano 전도성 태핑 모드 AFM 프로브. | (40) | (300) | 길이 = 125 μm의 폭 = 35 μm의 |
KPFM 프로브의 넓은 범위를 제공합니다 표 1. 기업. 회사의 다양한 이제 다양한 팁 정점 직경, 스프링 상수, 공진 주파수와 KPFM 팁을 제공합니다. 팁 사용자 정의는 기업이 일반적으로 의도 된 실험에 대한 사용자 정의 사양 캔틸레버를 구축 제공과 함께, 가까운 무한. 대부분 KPFM 프로브 백금 코팅 된 실리콘 질화물이다. 백금은 캔틸레버에 도전 기능을 제공합니다. 다른 일반적인 코팅 물질은 이리듐, 백금 + 이리듐, 금 등을 사용할 수있다. 대부분 KPFM 팁은 대안 전기력 현미경 (EFM)에 사용될 수있다. 팁 정점 KPFM의 캔틸레버 중요하다. 큰 직경의 끝은 적은 전기 노이즈에 대한 높은 해상도의 지형 영상을 희생. 역으로, 작은 직경의 팁 (<25 ㎚) 제안 지형 이미지 해상도를 개선하지만, 전기적 노이즈에 더 쉽다. 이 연구를 위해 연구자들은 Mikromasch의 행위를 사용필자 DPE (저소음) 캔틸레버.
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Discussion
KPFM 표면 전기적인 데이터를 획득하기위한 신규 한 기술로서 채택되었다. 그것은 일반적으로 화학 전하 분포를 조사하기위한 방법으로 사용되었으며, 최근 마이크로 및 나노 비늘 생물학적 시스템의 연구에 적용되기 시작했다. 수집 된 데이터에서 우리는 미생물이 쉽게 심지어 정적 배양 3 시간 후, 스테인레스 스틸과 금 표면을 청소하는 연결을하지 않은 것으로 보입니다 것으로 나타났습니다. 폴리 -L- 라이신 기능화 된 표면을 30 분 후에 급격한 미생물 부착을 보였다. 기능화 표면에 미생물의 긴 배양 시간은 샘플 표면, 가난한 지형 이미지에 과밀 세포되었다. 표면 기능화는 스테인레스 스틸과 골드 표면에 대한 긍정적 인 SP에 부정적인 SP에서 변화되었다. 이전의 연구는 일반적으로 미생물 삼투 이온 밸런스 (23)를 유지하기 때문에 셀 주위 음으로 하전 된 이온의 봉쇄에 음의 SP있는 것으로 나타났다. 또한 알려져그램 그램 양성 미생물에서 미생물과 음극에서 테이 코 산 포스페이트 기의 존재는 또한 부정적인의 SP (24)의 형성을 유도한다는. 그람 양성 및 음성 세포막의 기본적인 화학 지식은 긍정적 인 기판 SP의 신속한 미생물 부착으로 이어질 것이라고 가정하는 우리를 이끌었다. 스테인레스 스틸과 금 기판 상에 네거티브 MRSA 셀 SP에 긍정적에서 큰 변화는 각각이 있었다고, 4 - 그러나,이도 2에서 볼 수있다. 미생물 부착은 초기에 멤브레인의 주위에 음이온 발생으로부터 격리 할 수있다. 세포를 세척하고, 기판 표면에이를 건조시키는되면,이 이온 성 매체를 씻어 수 있었다. 또한, KPFM 데이터 그램 양성 (MRSA) 세포의 세포벽 외측 영역에만 포함되는 것은 아니다. 이 미생물의 세포막 전위 카티 우의 존재에 따라 변경 될 수 있다는 경우에 도시 한 내용NIC 항균 펩타이드 또는 다른 스트레스 8.
미생물 세포 배양에 표준 제타 전위 측정에 비해 KPFM의 하나의 큰 단점은 KPFM에서 수집 한 데이터가 죽은 및 건조 세포에서 수행된다는 점이다. KPFM 다른 부착 기판 표면과 관련하여 세포 표면 전위 변화의 일반적인 경향을 조사하기 위해 사용 하였다. DC의 응용 프로그램이 캔틸레버 끝에 전압 도전 시료 표면의 요구 사항과 함께, (F 말이지 대응하기 위해), 오픈 에어에 대한 이미지를 표준 KPFM을 제한 할 수 있습니다. 극성 액체에 이미징 표준 KPFM와 함께하실 수 없습니다, 따라서 KPFM을 사용하여 살아있는 세포의 영상은 아직 수의로하지 않습니다. 새로운 개방 루프 및 듀얼 주파수 KPFM 모드의 개발은 낮은 이온 솔루션 18-20에서 이미지 표면에 자신의 능력에 약속을 보여 주었다. 그것은 그 이미지가 거실에서 수행 할 수 있도록 앞으로이 기술이 더욱 발전되어 우리의 희망입니다E 세포 배양. 더욱 자연 환경에서 세포의 촬상은 의심 할 여지없이 더 정확하고 현실적인 세포막 SP 데이터의 생성을 초래할 것이다. 본 연구에서 우리는 미생물 세포막 전위의 측정뿐만 아니라 의학적으로 중요한 MRSA의 표면에 접착 특성을 연구하기 위해 새로운 방법이 기술을 적용하고 싶었. 미생물 막 SP의 변화는 다른 기판 표면에 배양에 관찰되었다. 이것은 그 기판 유형은 세포 대사에 영향을 미칠 수있는 의미 할 수 있습니다. 우리의 소망이 예비 데이터가 미생물 부착을 방지하기 위해 (예 거즈 붕대 및 다른 물질을 포함) 표면 또는 의료 기기에 적용 할 수있는 고유의 전기적 전하에 나노 코팅의 생성을 초래할 수 있다는 것이다. 이 문서에서 설명 프로토콜은 연구자가 KPFM의 원칙과는 측정 및 SP 맵을 만들 적용 할 수있는 표시 방법을 이해하는 데 도움을주기위한 것입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
| DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
| PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
| Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
| Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |
References
- Seth, A. K., et al. In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review. J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).
- Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. Biofilms and chronic infections. JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).
- Hoiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. Micro. Infect. 3 (2), 55-65 (2011).
- Zhang, W., Hughes, J., Chen, Y. Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of E. coli cells. Appl. Environ. Microbiol. 78 (11), 3905-3915 (2012).
- Lorite, G. S., et al. Surface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm development. PLoS One. 8 (9), (2013).
- Lee, I., Chung, E., Kweon, H., Yiacoumi, S., Tsouris, C. Scanning surface potential microscopy of spore adhesion on surfaces. Coll. Surf. Biointer. 92, 271-276 (2012).
- Tsai, C., Hung, H., Liu, C., Chen, Y., Pan, C. Changes in plasma membrane surface potential of PC12 cells as measured by Kelvin probe force microscopy. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Jucker, B. A., Harms, H., Zehnder, A. J. Adhesion of the positively charged bacterium Strenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon. J. Bacteriology. 178 (18), 5472-5479 (1996).
- Soon, R. L., et al. Different surface charge of colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii cells measured with zeta potential as a function of growth phase and colistin treatment. J. Anti. Chemo. 66, 126-133 (2011).
- Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. Link between culture zeta potential homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 78 (7), 2282-2288 (2012).
- Ayala-Torres, C., Hernandez, N., Galeano, A., Novoa-Aponte, L., Soto, C. Zeta potential as a measure of the surface charge of mycobacterial cells. Ann Microbiol. , (2013).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Nanomed. Nanobiotech. 2 (6), 613-634 (2010).
- Lindsay, S. M., et al. Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy studies of biomaterials at a liquid-solid interface. J. Vac. Sci. Technol. 11 (4), 808-815 (1993).
- Moores, B., Hane, F., Eng, L., Leonenko, Z. Kelvin probe force microscopy in application to biomolecular films: frequency modulation, amplitude modulation, and lift mode. Ultramicroscopy. 110 (6), 708-711 (2010).
- Melitz, W., Shen, J., Kummel, A. C., Kelvin Lee, S. probe force microscopy and its application. Surf. Sci. Reports. 66 (1), 1-27 (2011).
- Loppacher, C., et al. FM demodulated Kelvin probe force microscopy for surface photovoltage tracking. Nanotechnology. 16 (3), (2005).
- Domanski, A. L., et al. Kelvin probe force microscopy in nonpolar liquids. Langmuir. 28 (39), 13892-13899 (2012).
- Collins, L., et al. Dual harmonic Kelvin probe force microscopy at the graphene-liquid interface. Appl. Phys. Letters. 104 (13), 133103 (2014).
- Kobayashi, N., Asakawa, H., Fukuma, T. Nanoscale potential measurements in liquid by frequency modulation atomic force microscopy. Rev. Sci. Instru. 81, (2010).
- Collins, L., et al. Probing charge screening dynamics and electrochemical processes at the solid-liquid interface with electrochemical force microscopy. Nature Comm. 5, 2871 (2014).
- Pastar, I., et al. Interactions of methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300 and Pseudomonas aeruginosa in polymicrobial wound infection. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Brien, D. J., Gould, I. M. Does vancomycin have a future in the treatment of skin infections. Cur. Opin. Infec. Diseas. 27 (2), 146-154 (2014).
- Wang, P., Kinraide, T. B., Zhou, D., Kopittke, P. M., Peijnenburg, W. J. G. M. Plasma membrane surface potential: dual effects upon ion uptake and. 155 (2), 808-820 (2011).
- Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infect. Immun. 69 (5), 3423-3426 (2001).
- Sinensky, A. M., Belcher, A. M. Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy. Nat. Nanotechnol. 2, 653-659 (2007).
- Park, J., et al. Single-molecule recognition of biomolecular interaction via kelvin probe force microscopy. ACS Nano. 5 (9), 6981-6990 (2011).
