Abstract
Potencial de superficie es una característica física comúnmente pasado por alto que desempeña un papel dominante en la adhesión de los microorganismos a las superficies del sustrato. Kelvin fuerza sonda microscopía (KPFM) es un módulo de microscopía de fuerza atómica (AFM) que mide la diferencia de potencial de contacto entre las superficies en la nano escala. La combinación de KPFM con AFM permite la generación simultánea de potencial de superficie y mapas topográficos de muestras biológicas tales como células bacterianas. Aquí, empleamos KPFM para examinar los efectos de potencial de superficie sobre la adhesión microbiana a superficies médicamente relevantes como el acero inoxidable y oro. Superficie potencial mapas revelaron diferencias en el potencial de superficie para las membranas microbianas en diferentes sustratos de material. Un gráfico de paso a la altura fue generado para mostrar la diferencia en el potencial de superficie en una zona límite entre la superficie del sustrato y los microorganismos. Los cambios en el potencial de la superficie de la membrana celular se han relacionado con el cambios en el metabolismo celular y la motilidad. Por lo tanto, KPFM representa una herramienta poderosa que se puede utilizar para examinar los cambios de potencial de superficie de la membrana microbiana sobre la adhesión a diversas superficies de sustrato. En este estudio, se demuestra el procedimiento para caracterizar el potencial de la superficie de las células individuales resistentes a la meticilina Staphylococcus aureus USA100 en acero inoxidable y oro usando KPFM.
Introduction
Los biofilms producidos en las superficies del equipo y en las heridas cutáneas presentan un problema para la industria médica como biofilms son recalcitrantes a la eliminación y puede conducir a un aumento de las tasas de transmisión de enfermedades y la resistencia a los antimicrobianos. El apego es el primer paso en la formación de biopelículas y es el paso más crítico debido a su reversibilidad 1-3. Características de la superficie del sustrato juegan un papel crucial en el apego microbiana. Factores tales como la dureza superficial, porosidad, rugosidad, y la hidrofobicidad se ha demostrado que efectuar la unión microbiana; sin embargo, poca investigación examinar el papel de potencial de superficie de sustrato (SP) en la adhesión microbiana se ha hecho 4,5. Superficies cargadas negativamente impiden la unión de las esporas de Bacillus thuringiensis a la mica, silicio, y oro 6. Los cambios en el potencial de la membrana celular son indicativos de los cambios en la unión celular y la motilidad 5,7. Se ha observado que hom eléctricamentesuperficies ogeneous promueven más fácilmente microbiana adhesión 5. Caracterizar el potencial de superficie de las bacterias en la nanoescala puede proporcionar una forma novedosa para entender la cinética de adhesión de las bacterias a diversas superficies, y por lo tanto puede ayudar en el desarrollo de estrategias anti-incrustación biológica. A diferencia de otros métodos utilizados para caracterizar la cinética de electro de bacterias, tales como la dispersión de luz electroforética, el potencial zeta, y la determinación del punto isoeléctrico, Kelvin fuerza de sonda de microscopía (KPFM) permite el examen de las células individuales en lugar de culturas enteras 8-11. Esto es beneficioso cuando se quiere comparar célula-célula o del biofilm características eléctricas con alta exactitud y precisión.
KPFM es un módulo de microscopía de fuerza atómica (AFM). AFM fue desarrollado como resultado directo del microscopio de efecto túnel (STM) 12. Las primeras imágenes publicadas usando STM fueron hechas por Gerd Binnig y Heinrich Rorhrer en 1982 12 12 emocionado. STM también se puede hacer en líquidos utilizando puntas de las sondas especializadas 13. Esto fue demostrado por Lindsay et al., Que utiliza STM y AFM a moléculas de ADN de imagen en 10 mM HClO 4 y en el agua, sobre electrodos de oro 13. KPFM se ha demostrado en la determinación de los potenciales superficiales de ADN y proteína de análisis 25 y biomoléculas interacción con ligandos 26.
KPFM funciona midiendo la diferencia de potencial de contacto (CPD) entre una punta de AFM en voladizo conductora y una muestra idealmente conductor (Figura 1, i) 14,15. Las muestras no necesariamente tienen que ser conductora (es decir, sampl biológicaes). Imaging puede llevarse a cabo sobre mica, vidrio, y superficies de silicio (no conductores), siempre que la superficie no conductora es fino y no es un material conductor subyacente 6,7. El CPD es equivalente al potencial de tensión de la superficie y puede ser descrito como la diferencia en las funciones de trabajo entre la punta (punta φ) y la muestra (muestra φ), dividido por la carga del electrón negativo (- e). Cuando una punta de AFM conductora se pone cerca de una superficie de la muestra (separados por la distancia d), se genera una fuerza electrostática (F es) debido a la diferencia en las energías de Fermi (Figura 1, ii, a) 15. En este punto, las energías de vacío de la punta y la muestra (E v) están en equilibrio y alineado. Al llevar la punta más cerca de la superficie de la muestra, la superficie de la punta y la muestra entra en contacto eléctrico y actuar como condensadores de placas paralelas (Figura 1, ii, b 14,15. En el punto, las energías de Fermi de la superficie de la punta y la muestra se alinean, alcanzando un equilibrio de estado estacionario (Figura 1, ii, b). La superficie de la punta y la muestra se cargará y se formará una V CPD debido a una diferencia en E funciona 's V y de trabajo. Actos Un F es en el área de contacto eléctrico debido a la CPD V formada. Esta fuerza se anula posteriormente a través de la aplicación de una V DC externa a la punta que tiene la misma magnitud que el CPD V formado (Figura 1, ii, c). Esto aplica voltaje DC elimina la carga superficial en el área de contacto eléctrico, y la cantidad de V DC necesario eliminar las F es de CPD V es igual a la diferencia en las funciones de trabajo entre la sasuperficie mple y propina 15. Cabe señalar que la función de trabajo de la punta es conocido y es proporcionada por los fabricantes. En todos los métodos KPFM, una tensión de CA (V AC, aproximadamente 100 - 500 mV) se aplica también a la punta con el fin de generar fuerzas eléctricas oscilantes entre la punta y la muestra 14. Esto proporciona una mejor resolución en la medición de los cambios en V CPD y / o F es. En este sentido, los cambios en la frecuencia o amplitud de la oscilación eléctrica pueden ser corregidos por V DC, y la superficie de mapas de potencial pueden ser generados. Los datos de las áreas específicas de estos mapas pueden ser analizados para proporcionar información eléctrica sobre las características topográficas específicas.
KPFM puede funcionar en tres modos: (1) el modo de elevación, el modo (2) la modulación de amplitud (AM) y modulación de frecuencia (FM) 14,16 (3). Modo de elevación fue el inc inicialarnation de KPFM. Modo de elevación se basa en un método de dos pasos en el que una punta de oscilar, se arrastra a través de la superficie para obtener una imagen topográfica. Para el segundo pase la punta se eleva una distancia predeterminada por encima de la muestra (10 a 100 nm) y se explora de nuevo a través de la misma zona. Debido a este método de dos pasos, modo de elevación, en comparación con AM- FM-KPFM, toma más tiempo para la adquisición de imágenes. El aumento de la punta lejos de la superficie asegura que sólo se mide de largo alcance F es. Además, la diafonía entre topografía y de la superficie mediciones de potencial se desacopla a expensas de una mayor resolución lateral y sensibilidad.
AM-KPFM mejora la resolución lateral y la sensibilidad mediante el uso de personas con doble frecuencias para medir simultáneamente la topografía de la muestra y potencial de superficie (exploración de una pasada) 14. En el modo AM, el voladizo se hace oscilar mecánicamente, generalmente 5% por debajo de su primera frecuencia de resonancia (f 0), y eléctricamente oscilado (tediante una V AC) en su segunda frecuencia de resonancia (f 1). Los cambios en la amplitud de f 0 conducen a la generación de los datos topográficos, mientras que los cambios en la amplitud de f 1, debido a los cambios en es F y V CPD, dan superficiales posibles datos de medición. f 0 y f 1 del voladizo están separados por frecuencias y energías importantes que señalan la diafonía se minimiza 14. La caja electrónica de cabeza (HEB) de la AFM separa las dos señales para indicar tanto topográfica y datos de superficie potenciales simultáneamente en una exploración. FM-KPFM mejora la resolución incluso más allá de AM-KPFM sobre superficies biológicas 14. FM-KPFM funciona de manera distinta AM-KPFM en que mide los cambios en los gradientes de fuerza electrostática en lugar de fuerza electrostática (F es) 15. Al igual que el modo AM, el modo de FM utiliza dual-frecuencias y una singlmecanismo de análisis de correo-pass para obtener topográfico y superficie de datos posibles de forma simultánea 14. En el modo FM, el voladizo se hace oscilar mecánicamente a f 0 y eléctricamente oscila a una frecuencia baja modificada (f mod, típicamente 1 - 5 kHz). Al interacciones electrostáticas, f 0 y f mezcla mod para producir bandas laterales f 0 ± f mod. Estas bandas laterales son muy sensibles a cambios en la fuerza electrostática, y pueden separarse de f 0 HEB a través de la AFM. Desde FM-KPFM mide los cambios en los gradientes de fuerza electrostática, las puntas forma del ápice y su mantenimiento / integridad juegan un papel crítico en la superficie global potencial de resolución 14, 15. Superficie resolución potencial utilizando AM y FM están en el rango de 1 nm lateralmente 14 -16. Cabe señalar que la imagen KPFM se puede hacer en líquidos no polares, y más recientemente, se ha demostrado que ser hecho en (<10 mm) líquidos polares iónica baja (enKPFM modos de bucle abierto que no requieren una realimentación de polarización, obviando la aplicación de una polarización DC) como el agua MilliQ; Sin embargo, las imágenes KPFM aún no se ha hecho en las células vivas en soluciones polares 17-20. Retos adicionales asociados con la formación de imágenes SP en el líquido es que las soluciones comúnmente utilizados para las células que mantienen (es decir, tampón fosfato salino) tienen altas concentraciones de iones móviles, lo que llevaría a reacciones de Faraday, la dinámica de carga de polarización inducida, y difusión de los iones / redistribución 20. Por lo tanto, para este experimento, las mediciones se tomaron a partir de células de MRSA secos y muertos en superficies de acero inoxidable funcionalizados con poli-L-lisina acero y oro en condiciones ambientales. Imaging puede llevarse a cabo en condiciones de aire o de vacío en muestras biológicas que han sido previamente secado o inmovilizadas sobre superficies 20. Las condiciones de humedad también se han demostrado afectar de imágenes KPFM de las superficies 6.
En este estudio, hemos empleado FM-KPFMy AFM para examinar el papel de la SP en la unión de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina USA100 (MRSA) a las superficies de acero inoxidable y oro funcionalizadas poli-L-lisina. MRSA ganó recientemente condición de resistente a múltiples fármacos (MDR) "superbacteria" debido a su resistencia seleccionado naturalmente a muchos antibióticos β-lactámicos y cefalosporinas 21. Infecciones de MRSA son ahora más difícil, difícil, y formidable para tratar, lo que lleva a la utilización de los antimicrobianos más severas tales como vancomicina o oxazolidinonas que tienen altos niveles de toxicidad en los seres humanos, y por lo tanto no se puede utilizar como tratamientos a largo plazo 22. El acero inoxidable fue elegido debido a su relevancia médica y el uso común como material en agujas hipodérmicas, orinales, manijas de puertas, lavabos, etc. El oro fue utilizado como un metal comparativa. FM-KPFM se utilizó para examinar si la membrana microbiana SP cambia tras la unión de los sustratos.
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Protocol
1. Preparación de Cristalería y Culturas
- Antes de continuar con este experimento, preparar agar sangre al 5% de oveja (SBA) placas para el cultivo de MRSA. Incubar las placas SBA durante 24 horas a 37 ° C. Después de este tiempo, las colonias individuales, bien aisladas deben estar presentes para ser utilizado para inoculaciones subsiguientes en medios líquidos. Tienda rayado placas SBA con colonias individuales a 4 ° C durante 1-2 meses.
NOTA: placas de agar sangre de oveja vienen en paquetes pre-hechos que contienen entre 20 a 25 platos basados en el fabricante, y típicamente consisten en una base de agar de soja tríptico con la adición de 5% w / v de sangre de oveja. - Hacer 500 ml de caldo de soja tríptico (TSB) suplementado con 1% de glucosa y 0,1% de NaCl. Después de esto, recoger y limpiar 2 tubos de ensayo de vidrio. Si tapas autoclavables no están disponibles para tubos de ensayo, utilice papel de aluminio como una tapa. Autoclave TSB y tubos de ensayo, junto con una caja de puntas de pipeta 1 ml.
- En virtud de un gabinete de bioseguridad o cerca de un Bollosen la hornilla, una pipeta 5 ml de TSB previamente en autoclave en tubos de ensayo en autoclave. Tenga cuidado para asegurarse de que el tiempo suficiente se le ha dado para que la TSB y tubos de ensayo enfriar a temperatura ambiente. Desde un 5% placa SBA previamente rayada, inocular una sola colonia en 6 ml de caldo TSB. Una contendrá el SARM, y el segundo tubo de ensayo se utilizó como control negativo para asegurar la esterilidad.
- Tome tubos de ensayo TSB inoculadas y colocarlos en una incubadora recíproca durante 24 horas a 37 ° C ya 200 rpm. Después de este tiempo el crecimiento microbiano debería ser evidente en el tubo de ensayo MRSA mientras que ningún crecimiento debería haber ocurrido en el tubo de ensayo control.
- Tomar 1 ml de cultivo de 24 horas y la pipeta en 6 ml de TSB fresco. Incubar a 37 ° C durante 6 horas a 200 rpm.
- Pipeta 1 ml de 6 hr subcultura en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar durante 3 min a 850 x g. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de H2O desionizada Centrífuga, repetir y volver a suspender.
- Tome acero inoxidable y discos de la muestra de AFM de oro (20 mm y 10 mm de diámetro, respectivamente) y limpiar cada lado con 5 ml de H2O desionizada Mantenga discos de la muestra en la mano dominante con unas pinzas y usar la mano subdominante de pipeta de 5 ml en cada lado del disco de la muestra. Después de lavar ambos lados, discos lugar de la muestra en un vaso que contiene 20 ml de H2O desionizada seguido por ultrasonidos durante 1 minuto.
- Después de su uso sonicación fórceps para extraer discos de la muestra del vaso de precipitados. Coloque los discos de forma que se inclinan en un ángulo de 60 ° contra el borde de una placa de Petri abierta sobre una toalla de papel. Utilice la tapa de la placa Petri para cubrir los discos de secado. Deje que los discos se secan totalmente antes de continuar. El tiempo de secado puede variar entre 4 - 8 hr.
- Una vez seco, el uso de fórceps para colocar discos de la muestra en una placa de Petri.
- Opcionalmente, funcionalizar la superficie de discos de la muestra con cualquier material (por ejemplo, colágeno, ácido hialurónico, las nanopartículas de plata, etc.).
- Para este experimento, el uso de poli-L-lisina para recubrir la superficie del sustrato. Para poli-L-lisina funcionalización, pipeta de 200 a 400 l de 0,1% de poli-L-lisina (en H 2 O) en discos de muestra, y dejar incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en una placa de Petri.
- Después de 1 hora, use pinzas para sujetar el disco de muestra, y se lava con 1 ml de H2O desionizada Deje que se seque con toallas de papel como se describe en el paso 2.2.
- Tome 2x células resuspendidas lavadas y placa 200-400 l en discos de la muestra dentro de un gabinete de bioseguridad. Si los discos de muestra están recubiertas con poli-L-lisina, se incuba durante 0,5 horas a temperatura ambiente.
- Después de la incubación de las células en discos de muestra, lavar suavemente con discos de la muestra 1 ml de H2O desionizada Deje secar durante la noche antes de discos de formación de imágenes.
3. KPFM Imaging
NOTA: Para este experimento,utilizar una serie Agilent 5500 ILM-AFM.
- Para iniciar AFM, encienda la unidad de cómputo junto con el controlador HEB y MAC III de la AFM. Software de imágenes Abrir AFM (por ejemplo, PicoView de Agilent). Asegúrese de seleccionar inicialmente ACAFM o el que sea la denominación correcta es en el AFM para la imagen en modo intermitente contacto.
- Con unas pinzas de AFM en la mano dominante, y la celebración de la titular de clip de resorte abierto con la mano subdominante, coloque un voladizo KPFM en la cabeza pieza. Tenga cuidado al manipular y transferir la pieza de cabeza a la AFM AFM como esta unidad (al menos en el 5500 ILM-AFM) contiene la unidad de cristal piezo frágil que controla X, Y, Z y direccionalidades de escaneo.
NOTA: Los voladizos KPFM utilizados en este caso eran Mikromasch DPE conductor (bajo ruido) voladizos con frecuencias de resonancia promedio de 80 kHz y constantes de resorte de 2,7 N / m. Voladizos con estas frecuencias de resonancia y constantes de resorte se eligieron debido a su facilidad de uso.Voladizos con constantes de resorte más grandes y frecuencias de resonancia más altas también se pueden usar para formación de imágenes. - Coloque con cuidado la cabeza pieza en el AFM y conectar los cables adecuados (en este caso dos cables tienen que ser enchufado: la luz láser y motor de elevación de fase).
- Alinear el láser sobre la punta del cantilever. Algunas unidades contienen una funcionalidad de la cámara que permite una alineación más fácil. Si funcionalidad de la cámara no está presente en AFM, alinear en la punta en voladizo como se describe a continuación:
- Gire el mando a la derecha de adelante hacia atrás para mover el láser overtop el chip en voladizo. Cuando el láser alcanza el chip será bloqueado y ya no será visible. Sólo gire la perilla de un par de veces.
- Gire el mando de adelante hacia atrás en sentido antihorario hasta el punto láser vuelve a aparecer. El láser es ahora en el borde del chip.
- Gire el botón de izquierda a derecha para colocar el láser en el voladizo. A medida que el láser pasa sobre el voladizo desaparecerá y reaparecerá in rápida sucesión. El punto de láser debe ser visible en la cubierta de vidrio esmerilado en la unidad fotodiodo tarde sentarse.
- Gire el mando de adelante hacia atrás hacia la izquierda para mover el punto por el voladizo hacia la punta hasta el punto en el vidrio esmerilado desaparece.
- Gire el mando de adelante hacia atrás las agujas del reloj sólo ligeramente con el fin de posicionar el láser de modo que sólo se sienta en el extremo en voladizo. El punto láser volverá a aparecer en el cristal esmerilado.
NOTA: Este es el método de posicionamiento láser para voladizos trampolín. Para ménsulas triangulares, el proceso de alineación difiere ligeramente.
- Una vez que el láser está alineado, mantenga el motor de elevación de fase en la posición "abierto" durante 10 segundos para asegurar suficiente espacio entre la palanca y la muestra al colocar la muestra a la AFM.
- Coloque la muestra en la etapa de la muestra KPFM. Planta la muestra usando un alambre de cobre. Conecte los cables apropiados desde el AFM para la etapa de la muestra. Conecte los sTage a la AFM. En la mayoría de los casos, la etapa se mantiene en su lugar mediante imanes.
- En el software de AFM, sintonice el voladizo y luego comenzar enfoque de la punta en voladizo a la muestra. Asegúrese de que el tiempo de estabilización se fija en no más de 10 mseg, y que las velocidades de aproximación no exceda de 2,0 m / seg, a fin de evitar daños en la punta.
- Una vez que la punta en voladizo está en la superficie de la muestra, seleccione un tamaño de la ventana de imágenes y zona ideal de formación de imágenes. Optimizar ganancias I y P, junto con el punto de modo que la imagen topográfica se optimiza conjunto voladizo.
- Una vez que la imagen topográfica se optimiza, encienda módulo KPFM (modo AM FM o; aquí, use el modo FM). Cabe señalar que la imagen KPFM es muy difícil fuera de 5 micras ventana de imagen x 5 m. También, para la proyección de imagen óptima KPFM, utilice una resolución de 512 x 512 con una velocidad lenta exploración (desde 0,02 hasta 0,05 líneas / seg).
- Para la configuración de FM-KPFM (no ACAFM ajustes), establezca el porcentaje de transmisión entre 5-10%. Ajuste el fr voladizoecuencia entre 1 - 5 kHz con un ancho de banda de 2 kHz. Set I y P ganancias para los ajustes de FM-KPFM a 0,3%.
- Varíe el ancho de banda de la señal y yo y ganancias P entre las superficies de la muestra. Para optimizar las imágenes SP, ajustar aún más el ancho de banda de la señal y I y P ganancias para obtener imágenes óptimas. El rango recomendado de ganancias I y P son 0,22 a 0,35%.
- Procesar y analizar recoge imágenes KPFM utilizando software de procesamiento posterior de las imágenes para recopilar datos SP.
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Representative Results
La capacidad de medir SP usando KPFM se basa en el principio de que tanto la superficie de la muestra y la punta en voladizo son conductoras hasta cierto punto. Acero inoxidable y oro actuaron como superficies conductoras a las que se adjuntaban MRSA. KPFM imágenes fueron tomadas de 15 células de MRSA en ambas superficies con 512 x 512 resoluciones, y con áreas de escaneado que van desde 5 x 5 m a 10 x 10 m. Scanning se llevó a cabo con velocidades de línea que van desde 0,02 líneas / seg a 0,05 líneas / seg. Por lo tanto, con 512 puntos de datos recogidos por línea y 512 líneas para escanear, los tiempos de exploración variaron de 2.84 a 7.11 hr hr. Los tipos de imágenes recogidas se pueden ver en la Figura 2. KPFM funciona con frecuencias dobles, y como tal, las imágenes topográficos se recogen de forma simultánea junto con los datos acerca de las características eléctricas de la superficie. Filtros térmicos se aplicaron a SP mapas para discernir más fácilmente pequeños cambios en el potencial de superficie (Figura 2). Los datos de mapas SP wcomo software de procesamiento de post-imagen analizada para determinar los potenciales superficiales promedio y las desviaciones estándar. Se realizó un análisis estadístico mediante programación R Open Source de Estadística. Se realizaron pruebas t de Student para comparar grupos con P <0,05 se consideró significativo.
Imágenes SP se analizaron para determinar el potencial de superficie de la membrana microbiana. Estos se compararon con el crecimiento en las diferentes superficies de sustrato. Esto se hizo con el fin de determinar si el tipo de superficie tuvo un efecto en el potencial de superficie de la membrana microbiana. Inicialmente se intentó incubar células MRSA estáticamente durante 3 horas en las superficies de los sustratos. Sin embargo, no hay microbios unidos eran visibles bajo la AFM. Datos de SP para superficies funcionalizadas limpio y poli-L-lisina se determinó a partir de 5 x 5 m áreas escaneadas. Exploraciones SP de los sustratos de acero inoxidable y oro desnudo descalzos mostraron potenciales superficiales en general negativos (-0.045 ± 0.057 V y -0,126 ± 0,052 V, respectivamente, P = 0,047, Figura 3). Poli-L-lisina se utilizó con el fin de funcionalizar las superficies para hacerlas más favorable para la fijación celular. Superficies funcionalizadas mostraron un cambio de potenciales superficiales positivas para superficies de acero inoxidable y oro (0.133 ± 0.063 V y 0.126 ± 0.030 V, respectivamente, Figura 3). Posteriormente se examinaron los potenciales de membrana de MRSA en superficies de acero inoxidable y oro funcionalizadas de poli-L-lisina. Se encontró que los potenciales de membrana de células MRSA variaron entre el acero inoxidable y superficies de oro. Superficies de acero inoxidable llevó a significativamente mayores SP membrana positivos para las células en comparación con su contraparte de oro. Por ejemplo, el SP de las células de MRSA cambia de positivo a SPs negativos. MRSA mostró SP positivo sobre superficies de acero inoxidable con los PE de 0,160 ± 0,022 V y SP de -0.025 ± 0.016 V en superficies de oro (P <0,001).
Para mostrar todas las capacidades de KPFM, un ejemplode un gráfico de paso a la altura de MRSA en el acero inoxidable se proporciona (Figura 4). Esto muestra la diferencia de potencial de superficie entre la superficie del sustrato y la membrana microbiana.
Figura 1. Principios de Trabajo del microscopio de fuerza atómica (i) y la fuerza de sonda Kelvin microscopio (ii) Reproducido con permiso del (15). La configuración básica del AFM se muestra en (i). En AFM, una punta afilada está unido a un voladizo través de la deposición electroquímica. Se utilizaron Mikromasch recubierto de platino DPE (bajo ruido) voladizos conductores en este experimento tenían dimensiones de 210 x 30 m, la frecuencia de resonancia de 80 kHz, y las constantes elásticas de 2,7 N / m. Voladizos se adjunta a un chip más grande con el fin de permitir un fácil manejo. Una vez montado en el AFM, un láser se alinea en la punta en voladizo. Las deflexiones en el cantilpunta cada vez se detectan a través de un fotodiodo. Las deflexiones se utilizan para generar imágenes topográficas. (Ii, a, b, c) muestra el principio de funcionamiento de KPFM. El voladizo se lleva lo suficientemente cerca de la superficie para permitir el contacto eléctrico que se produzca. Las diferencias en los potenciales de superficie entre la punta y la superficie causan la punta para desviar. Se aplica un voltaje DC para corregir esta desviación. Esta tensión aplicada DC es igual al potencial de superficie de la superficie del sustrato. Dependiendo del tipo de modo de imagen utilizado (ascensor, AM, FM), este principio de funcionamiento es ligeramente diferente. Figura 1 (ii) se ha modificado desde el 15.
Figura 2. Representante y la topografía de superficie potenciales mapas de MRSA en sustratos de acero inoxidable y oro funcionalizadas de poli-L-lisina. Imágenes (I y III) muestran imágenes representativas de topografía de las células de MRSA en acero inoxidable y superficies de oro, respectivamente. Dimensiones de la imagen se pueden ver en el eje X e Y de estas imágenes junto con un perfil de altura de color correspondiente. (Ii y iv) muestran los mapas SP correspondientes del MRSA en sus superficies respectivas. Filtros de color estándar 'de oro' se aplicaron a la topografía imágenes mientras se aplicaron filtros térmicos a SP imágenes para discernir más fácilmente pequeños cambios en SP. Cabe señalar que la SP de superficies de sustrato no era homogénea. SP fue encontrado para ser distribuidos heterogéneamente con áreas positivas y negativas aparentes en ambas superficies del sustrato. Esto se puede ver alrededor de las células de MRSA en que se observen los SP heterogéneos sobre sustratos de acero inoxidable y oro. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. potencial superficial de superficies de sustrato y MRSA membranas celulares. La Figura 3 muestra los datos correspondientes KPFM de acero inoxidable (etiquetada aquí como SS) y superficies de oro, así como, los datos de 15 células. Los asteriscos representan diferencias significativas entre las muestras con el número de asteriscos corresponden a las muestras comparadas. Datos de MRSA se recogió de células unidas a las superficies funcionalizadas después de 30 minutos de incubación. Esto se hizo debido al hecho de que no se encontraron células se unan a las superficies de los sustratos desnudos después de 3 h.
Figura 4. superficie Paso-altura de la imagen potencial de MRSA en acero inoxidable funcionalizado con poli-L-lisina. El uso de software de procesamiento post-imagen, un gráfico paso a la altura se generó con el fin de mostrar la capabililazos de software, así como, la notable diferencia en SP entre la superficie del sustrato y la membrana celular. El área de sección transversal elegida está representado en el mapa SP correspondiente con la línea gris. Un cambio de 0,15 V en la superficie celular de 0,21 V en la superficie del sustrato es claramente evidente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Empresa | Tipo de sonda | Constant Spring (N / m) | Frecuencia Resonante (kHz) | Cantilever Dimensiones | Sugerencia Apex Diámetro |
| Asilo de Investigación | AC240TM-R3 | 2 | 70 | Longitud = 240 micras Ancho = 40 micras </ Td> | 28 nm |
| Bruker AFM Sondas | SMC-PIT | 2.8 | 75 | Longitud = 225 micras Ancho = 28 micras | 20 nm |
| Mikromasch | DPE (silenciosa) Cantilevers conductores | 2.7 | 80 | Longitud = 210 micras Ancho = 30 micras | 40 nm |
| Nano y Más EE.UU. | PtSi-NCH | 42 | 330 | Longitud = 125 micras Ancho = 30 micras | > 25 nm |
| Nanociencia Instrumentos | AppNano conductores tapping mode AFM Sondas. | 40 | 300 | Longitud = 125 micras Ancho = 35 micras | 30 nm |
| Nanociencia Instrumentos | AppNano conductores tapping mode AFM Sondas. | 40 | 300 | Longitud = 125 micras Ancho = 35 micras |
Tabla 1. Las empresas que ofrecen una amplia gama de sondas KPFM. Una variedad de compañías ahora ofrecen punta KPFM con diferentes diámetros de punta de vértice, constantes primavera, y las frecuencias resonantes. Personalización punta es casi ilimitado, con las empresas suelen ofrecer para construir voladizos con las especificaciones de encargo para un experimento destinado. La mayoría de las sondas KPFM son de platino recubierto de nitruro de silicio. Platinum proporciona una funcionalidad conductora a la voladizo. Otros materiales de recubrimiento común incluye el iridio, platino + iridio, y oro. La mayoría de los consejos KPFM también se pueden utilizar alternativamente para microscopía de fuerza eléctrica (EFM). Ápice Consejo es importante para voladizos KPFM. Consejos de mayor diámetro sacrifican más alta resolución de imagen topografía por menos ruido eléctrico. Por el contrario, consejos de diámetros pequeños (<25 nm) oferta mejorada resolución de imagen topografía pero son más propensas al ruido eléctrico. Para este estudio, los investigadores utilizaron conducta Mikromaschive DPE (bajo ruido) voladizos.
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Discussion
KPFM fue empleado como una novedosa técnica para la obtención de los datos eléctricos de superficie. Comúnmente se ha utilizado como un método para examinar la distribución de carga en química y sólo recientemente ha comenzado a aplicar para el estudio de sistemas biológicos en la micro y nano-escala. A partir de los datos recogidos, se encontró que los microbios no parecían adjuntar fácilmente para limpiar las superficies de acero inoxidable y oro, incluso después de 3 horas de incubación estática. Superficies funcionalizadas poli-L-lisina mostraron una rápida fijación microbiana después de 30 minutos. Tiempos de incubación más largos de microbios en superficies funcionalizadas llevaron a la celda el hacinamiento en las superficies de las muestras, y las imágenes de la topografía pobres. Funcionalización de superficies llevó a un cambio de SP negativa a SP positivo para superficies de acero inoxidable y oro. Estudios anteriores han demostrado que los microorganismos tienen típicamente SPs negativo debido a la secuestrante de iones cargados negativamente alrededor de las células para mantener osmótica y el equilibrio iónico 23. También se conoceque la presencia de grupos fosfato en microorganismos Gram negativos y ácidos teicoicos en microorganismos Gram positivos conduce además a la formación de negativo SPs 24. El conocimiento de la química básica de las membranas celulares positivos y Gram negativos nos llevó a suponer que los SP sustrato positivas conducirían a una rápida fijación microbiana. Sin embargo, como puede verse en las figuras 2 - 4, que hubo un gran cambio de positivo a SPs celulares MRSA negativos sobre sustratos de acero inoxidable y oro, respectivamente. Fijación microbiana podría haber ocurrido inicialmente desde el secuestro de iones negativos alrededor de la membrana. Tras lavar las células y dejar que se sequen en la superficie del sustrato, podríamos haber estado lavando este medio iónico. Además, cabe señalar que los datos KPFM sólo es inclusiva de las áreas de la pared celular externa de la Gram positiva (MRSA) células. Se ha demostrado en algunos casos que un potencial de membrana celular microorganismos puede cambiar de la presencia de Catiopéptidos antimicrobianos nic u otros factores estresantes 8.
La única desventaja principal de KPFM en comparación con las mediciones de potencial zeta estándar en cultivos de células microbianas es que en KPFM los datos recogidos se hace en las células muertas y secas. KPFM se utilizó para examinar las tendencias generales en la superficie celular posibles cambios con respecto a las diferentes superficies de sustrato archivo adjunto. La aplicación de voltajes de DC a la punta en voladizo (para contrarrestar F es), junto con el requisito de una superficie de la muestra conductora, limitar KPFM estándar para abrir al aire de formación de imágenes. Imaging en líquido polar no es actualmente posible con KPFM estándar, y por lo tanto la formación de imágenes de células vivas utilizando KPFM no es hasta el momento posible. Desarrollos de nuevos modos KPFM doble frecuencia en lazo abierto y han demostrado ser prometedores en su capacidad para superficies imagen en soluciones de bajo iónicos 18-20. Es nuestra esperanza que en el futuro se desarrolla aún más esta tecnología para que las imágenes se puede hacer en livcultivos celulares e. La obtención de imágenes de células en un entorno más natural, sin duda conducir a la generación de los datos más exactos y realistas SP de la membrana celular. Para este estudio hemos querido aplicar esta tecnología en una forma novedosa para medir los potenciales de membrana de células microbianas, así como estudiar las características de adhesión de MRSA en una superficie médicamente relevante. Se observaron cambios en los PE de membrana microbiana tras la incubación en las diferentes superficies de los sustratos. Esto puede implicar que el tipo de sustrato puede afectar el metabolismo celular. Nuestra esperanza es que estos datos preliminares pueden dar lugar a la generación de nano-recubrimientos con cargas eléctricas inherentes que podrían aplicarse a superficies o equipos médicos (incluyendo otros materiales como vendas y gasas) a fin de impedir la adhesión microbiana. El protocolo descrito en este artículo está destinado a ayudar a los investigadores a entender los principios de KPFM y mostrar las formas en que se puede aplicar para medir y crear mapas SP.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
| DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
| PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
| Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
| Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |
References
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