Abstract
Ytpotential är ett vanligt förbi fysisk egenskap som spelar en dominerande roll i vidhäftningen av mikroorganismer till substrat ytor. Kelvin probe kraft mikroskopi (KPFM) är en modul för atomkraftsmikroskopi (AFM) som mäter kontaktpotentialskillnaden mellan ytorna på nanoskala. Kombinationen av KPFM med AFM möjliggör samtidig produktion av ytan potential och topografiska kartor över biologiska prover, såsom bakterieceller. Här använder vi KPFM att undersöka effekterna av ytpotential på mikrobiell vidhäftning till medicinskt relevanta ytor som rostfritt stål och guld. Ytpotential kartor avslöjade skillnader i ytpotential för mikrobiella membran på olika materialsubstrat. Ett steg-höjd graf alstrades för att visa skillnaden i ytpotential vid en gräns område mellan substratytan och mikroorganismer. Förändringar i cellmembranytan potential har kopplats med förändringsi cellulär metabolism och motilitet. Därför KPFM utgör ett kraftfullt verktyg som kan användas för att undersöka förändringar av mikrobiell membranyta potential vid vidhäftning till olika substratytor. I denna studie visar vi proceduren att karaktärisera ytpotentialen för individuella MRSA USA100 celler på rostfritt stål och guld med hjälp KPFM.
Introduction
Biofilmer produceras på utrustningsytor och kutana sår presentera ett problem för den medicinska industrin som biofilmer är motsträviga till avlägsnande och kan leda till ökade priser för överföring av sjukdomar och antimikrobiell resistens. Attachment är det första steget i biofilmbildning och är det mest kritiska steget på grund av sin reversibilitet 1-3. Substrat ytegenskaper spelar en avgörande roll på mikrobiell fastsättning. Faktorer som ythårdhet, porositet, råhet, och hydrofobicitet har visat sig påverka mikrobiell fastsättning; har dock lite forskning undersöker vilken roll substratytan potential (SP) på mikrobiell vidhäftning gjorts 4,5. Negativt laddade ytorna för att förhindra vidhäftningen av Bacillus thuringiensis sporer på glimmer, kisel och guld 6. Förändringar i cellmembranpotential indikerar förändringar i cellulär infästning och motilitet 5,7. Det har observerats att elektriskt homogeneous ytor främjar lättare mikrobiell vidhäftning 5. Characterizing ytpotentialen av bakterier i nanoskala kan tillhandahålla ett nytt sätt att förstå vidhäftnings kinetiken av bakterier på olika ytor, och därigenom kan hjälpa till vid utvecklingen av anti-Påväxt strategier. Till skillnad från andra metoder som används för att karakterisera de elektro kinetik bakterier, såsom elektroljusspridning, zeta-potential, och isoelektrisk punkt beslutsamhet, Kelvin probe kraft mikroskopi (KPFM) möjliggör för undersökning av enskilda celler i stället för hela kulturer 8-11. Detta är fördelaktigt när man vill jämföra cell-cell eller biofilm elektriska egenskaper med hög noggrannhet och precision.
KPFM är en modul av atomkraftsmikroskopi (AFM). AFM utvecklades som ett direkt resultat av sveptunnelmikroskop (STM) 12. De första publicerade bilder med STM gjordes av Gerd Binnig och Heinrich Rorhrer 1982 12 12. STM kan också göras i vätskor med hjälp av specialiserade probspetsar 13. Detta visades av Lindsay et al., Som använde STM och AFM till bild DNA-molekyler i 10 mM HCIO4 och i vatten, på guldelektroder 13. KPFM har visats i fastställandet av ytpotentialer av DNA och proteinanalys 25 och biomolekyler interaktion med ligander 26.
KPFM fungerar genom mätning av kontaktpotentialskillnaden (CPD) mellan ett AFM ledande fribärande spets och en idealt ledande prov (Figur 1, i) 14,15. Prover behöver inte nödvändigtvis vara ledande (dvs biologiskt samples). Imaging kan utföras på glimmer, glas och kiselytor (icke-ledande) så länge som den icke-ledande ytan är tunn och det finns en underliggande ledande material 6,7. CPD motsvarar ytpotentialen spänning och kan beskrivas som skillnaden i arbetsfunktioner mellan spetsen (φ spets) och prov (φ prov), dividerat med negativ elektronladdningen (- e). När ett ledande AFM spets bringas nära en provyta (separerade med avståndet d), en elektrostatisk kraft (F es) alstras på grund av skillnaden i Fermi energier (figur 1, ii, a) 15. Vid denna punkt, vakuum energier spetsen och provet (E v) är i jämvikt och inriktade. Vid föra spetsen närmare till provytan, spetsen och provytan kommer i elektrisk kontakt och fungerar som parallella plattkondensatorer (Figur 1, II, b 14,15. Vid punkten, de Fermi energier spetsen och provytan blir i linje, nå en steady-state jämvikts (Figur 1, ii, b). Spetsen och provytan kommer att debiteras och en V CPD bildas på grund av en skillnad i E v s och arbetsfunktioner. En F es verkar på den elektriska kontaktytan på grund av den bildade V CPD. Denna kraft därefter upphävs genom tillämpning av en yttre V likström till spetsen som har samma storleksordning som den bildade V-CPD (Figur 1, ii, c). Detta gällde likspänning eliminerar ytladdning inom elektriska kontakten, och mängden V DC nödvändigt att undanröja de F es i V CPD är lika med skillnaden i arbetsfunktioner mellan sample ytan och spetsen 15. Det bör noteras att den arbetsfunktion hos spetsen är känd och det tillhandahålls av tillverkare. I alla KPFM metoder, en växelspänning (V AC, ca 100-500 mV) matas också till spetsen för att alstra oscillerande elektriska krafter mellan spetsen och provet 14. Detta ger bättre upplösning vid mätning förändringar i V CPD och / eller F es. I detta avseende kan förändringar i frekvens eller amplitud av elektrisk svängning korrigeras genom V DC, och ytpotential kartor kan genereras. Data från specifika områden av dessa kartor kan analyseras vidare för att tillhandahålla elektrisk information om specifika topografiska egenskaper.
KPFM kan köras i tre lägen: (1) lyftläge, (2) amplitudmodulering (AM) läget, och (3) frekvensmodulering (FM) mod 14,16. Lyft läget var den initiala incarnation av KPFM. Lyftmod förlitar sig på en två-pass-metod, i vilken en oscillerande spets dras över ytan för att erhålla en topografisk bild. För den andra passagen spetsen höjs ett förinställt avstånd ovanför provet (10-100 nm) och scannas tillbaka över samma område. På grund av denna två-pass metoden, lyftläge, jämfört med AM och FM-KPFM, tar längst tid för bildtagning. Raising spetsen bort från ytan säkerställer att endast långväga F es mäts. Dessutom är överhörning mellan topografi och ytpotential mätningar frikopplade på bekostnad av ökad upplösning och känslighet sidled.
AM-KPFM förbättrar lateral upplösning och känslighet genom att använda dubbla frekvenser att samtidigt mäta provets topografi och ytpotential (one-pass scan) 14. I AM mod är fribärande mekaniskt pendlat, vanligtvis 5% under sin första resonansfrekvens (f 0), och elektriskt pendlade (through en V AC) vid sin andra resonansfrekvensen (f 1). Förändringar i amplitud f 0 leder till generering av topografiska data, medan förändringar i amplitud f 1, på grund av förändringar i F es och V CPD, ge potentiella mätdata yta. f 0 och f 1 av konsolen är åtskilda av betydande frekvenser och energier som signalerar överhörning minimeras 14. Chefen elektronikbox (HEB) av AFM skiljer ut de två signalerna för att ge både topografiska och ytpotentialen uppgifter samtidigt i en skanning. FM-KPFM förbättrar upplösningen ännu längre än AM-KPFM på biologiska ytor 14. FM-KPFM fungerar annorlunda än AM-KPFM genom att den mäter förändringar i elektrostatisk kraft lutningar snarare än elektrostatisk kraft (F es) 15. Liksom AM mod, använder FM-läge dubbla frekvenser och en single-pass skanning mekanism för att få topografiska och ytpotential data samtidigt 14. I FM-läge är fribärande mekaniskt pendlat vid f 0 och elektriskt pendlat på en låg modifierad frekvens (f mod, vanligtvis 1 - 5 kHz). Vid elektrostatiska interaktioner, f 0 och f mod mix att producera sidband f 0 ± f mod. Dessa sidobanden är mycket känsliga för förändringar i elektrostatisk kraft, och kan separeras från f 0 genom AFM: s HEB. Eftersom FM-KPFM mäter förändringar i elektrostatisk kraft gradienter, det tips apex form och dess underhåll / integritet spelar en avgörande roll för den globala ytpotential upplösning 14, 15. Ytpotential upplösning med AM och FM lägen är i intervallet 1 nm sidled 14 -16. Det bör noteras att KPFM avbildning kan ske i icke-polära vätskor, och mer nyligen, har visat sig ske i lågt joniska (<10 mM) polära vätskor (iopen-loop KPFM lägen som inte kräver en bias återkoppling, vilket undanröjer tillämpning av en DC bias) såsom MilliQ vatten; Men KPFM avbildning har ännu göras på levande celler i polära lösningar 17-20. Ytterligare utmaningar förknippade med SP avbildning i vätskan är att lösningar som vanligen används för att upprätthålla celler (dvs, fosfatbuffrad saltlösning) har höga koncentrationer av mobila joner, vilket skulle leda till faradisk reaktioner, sned-inducerad laddningsdynamik och jondiffusion / omfördelning 20. Således för detta experiment gjordes mätningar av torkade och döda MRSA celler på poly-L-lysin funktion stål och guld ytor av rostfritt under omgivningsförhållanden. Imaging kan utföras i luft eller vakuumförhållanden på biologiska prover som tidigare har torkat eller immobiliserade på ytor 20. Fuktiga förhållanden har också visats påverka KPFM avbildning av ytor 6.
I denna studie använde vi FM-KPFMoch AFM att undersöka betydelsen av SP om kvarstad på MRSA USA100 (MRSA) till poly-L-lysin funktion rostfritt stål och guldytor. MRSA har nyligen rönt status som en multiresistent (MDR) "superbug" på grund av sin naturligt utvald resistens mot många β-laktamantibiotika och cefalosporiner 21. MRSA-infektioner är nu mer utmanande, svårt och formidabelt att behandla, vilket leder till användning av hårdare antimikrobiella såsom vankomycin eller oxazolidinoner som har högre gifthalter hos människor, och kan därför inte användas som långtidsbehandling 22. Rostfritt stål valdes på grund av dess medicinska relevans och gemensam användning som material i injektionsnålar, bäcken, dörrhandtag, diskbänkar, etc. Guld användes som ett jämförande metall. FM-KPFM användes för att undersöka om mikrobiell membran SP ändras vid montering på substraten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Glas och kulturer
- Innan detta experiment, förbereder 5% fårmjölk blodagar (SBA) plattor för växande MRSA. Inkubera SBA plattorna under 24 h vid 37 ° C. Efter denna tid bör enkel-, välisolerade kolonier vara närvarande för att användas för efterföljande vaccinationer i flytande medier. Butiks strimmig SBA-plattor med enstaka kolonier vid 4 ° C under 1-2 månader.
OBS: fårblod agarplattor kommer i färdiga förpackningar innehållande mellan 20-25 plattor baserade på tillverkaren, och består typiskt av en tryptisk sojaagar bas med tillsats av 5% vikt / vol fårblod. - Gör 500 ml tryptisk sojabuljong (TSB) kompletterat med 1% glukos och 0,1% NaCl. Efter detta, samla in och rengör 2 provrör. Om autoklaver lock är inte tillgänglig för provrör, använder aluminiumfolie som en huv. Autoklav TSB och provrör tillsammans med en låda med 1 ml pipettspetsar.
- Enligt en biosäkerhetsskåp eller nära en bullarsv brännare, pipett 5 ml tidigare autoklaveras TSB i autoklave provrör. Var noga med att se till att tillräckligt med tid har givits att låta TSB och provrör svalna till rumstemperatur. Från en tidigare strimmig 5% SBA plattan, ympa en enda koloni i 6 ml TSB buljong. En kommer att innehålla MRSA, och det andra provröret kommer att användas som en negativ kontroll för att säkerställa sterilitet.
- Ta inokulerade TSB provrör och placera dem i ett ömsesidigt inkubator för 24 timmar vid 37 ° C och vid 200 rpm. Efter denna tid mikrobiell tillväxt skall vara uppenbara i MRSA provrör medan ingen tillväxt skulle ha skett i kontrollprovröret.
- Ta 1 ml från 24 tim kultur och pipett till 6 ml av färsk TSB. Inkubera vid 37 ° C under 6 h vid 200 varv per minut.
- Pipettera 1 ml av 6 h subkultur i ett 1,5 ml mikrofugrör. Centrifugera under 3 min vid 850 x g. Avlägsna supernatanten och slamma pelleten i 1 ml avjoniserat H2O Centrifug, upprepa, och slamma.
- Ta rostfritt stål och guld AFM provskivor (20 mm och 10 mm diameter respektive) och rengör varje sida med 5 ml avjoniserat H2O Håll provskivorna i den dominanta handen med pincett och använda subdominanten handen att pipettera 5 ml på varje sida av provskivan. Efter tvättning båda sidor, plats provskivorna i en bägare som innehåller 20 ml avjoniserat H2O följt av ultraljudsbehandling under 1 minut.
- Efter ultraljudsbehandling använda pincett för att ta bort provskivor från bägaren. Placera skivorna så att de lutar vid en 60 ° vinkel mot kanten av en öppen Petri plattan på en pappershandduk. Använd på locket till Petriskål för att täcka tork diskar. Låt diskar torka helt innan du fortsätter. Torktiden kan variera mellan 4-8 tim.
- När torr, använd pincett för att placera provskivorna i en petriplatta.
- Eventuellt funktionalisera ytorna av provskivor med något material (t.ex. kollagen, hyaluronan, silvernanopartiklar, etc).
- För detta experiment använda poly-L-lysin för att belägga substratytan. För poly-L-lysin funktion, pipett 200-400 pl av 0,1% poly-L-lysin (i H2O) på provskivorna, och låt inkubera under 1 h vid rumstemperatur i en petriskål.
- Efter 1 timme, använd pincett att hålla provskivan, och tvätta med 1 ml avjoniserat H2O Låt torka på hushållspapper som beskrivs i steg 2.2.
- Ta 2x tvättade åter suspenderade celler och plattan 200-400 pl PÅ provskivorna i en biosäkerhet skåp. Om provskivorna är belagda med poly-L-lysin, inkubera i 0,5 h vid rumstemperatur.
- Efter inkubation av celler på provskivorna, tvätta provskivorna försiktigt med 1 ml avjoniserat H2O Låt diskar torka över natten innan avbildning.
3. KPFM Imaging
OBS: För det här experimentet,använda en Agilent 5500 series ILM-AFM.
- För att starta AFM, slå på datorenhet tillsammans med AFM: s HEB och MAC III controller. Öppna AFM bildprogram (t.ex. Agilents PicoView). Var noga med att initialt välja ACAFM eller vilken den korrekta beteckningen är på AFM för avbildning i intermittent kontakt läge.
- Använda AFM pincett i den dominerande handen, och hålla den fjäderbelastade klipp hållaren med subdominant handen, placera en KPFM fribärande in to head-pjäs. Var försiktig när du hanterar och överföring av AFM huvudet-bit till AFM som denna enhet (åtminstone på 5500 ILM-AFM) innehåller bräck piezo kristallenhet som styr X, Y och Z scanning directionalities.
OBS: De KPFM utliggare som används i det här fallet var Mikromasch ledande DPE (lågt brus) utliggare med genomsnittliga resonansfrekvenser på 80 kHz och fjäderkonstanter 2,7 N / m. Utliggare med dessa resonansfrekvenser och fjäderkonstanter valdes på grund av sin användarvänlighet.Utskjutande stöd med större fjäderkonstanter och högre resonansfrekvenserna kan också användas för avbildning. - Lasta huvud-bit till AFM och anslut nödvändiga ledningar (i detta fall två trådar måste inkopplad: laserljus och scenlyftmotor).
- Rikta lasern mot spetsen på fribärande. Vissa enheter innehåller en kamera funktionalitet som gör det enklare anpassning. Om kamerafunktioner inte är närvarande på AFM, rikta in på fribärande spetsen som beskrivs härnäst:
- Rotera front-to-back ratten medurs för att flytta lasern overtop fribärande chip. När lasern når chipet den kommer att blockeras och kommer inte längre att vara synliga. Vrid Endast ratten några gånger.
- Rotera front-to-back ratten moturs tills laserpunkten visas igen. Lasern är nu på chipsets kant.
- Rotera vänster till höger ratten för att positionera lasern på fribärande. Som lasern passerar över fribärande det kommer att försvinna och dyka upp igen in snabb följd. Laserpunkten synas i frostat glas locket där fotodioden enheten senare kommer att sitta.
- Vrid den främre-to-back ratten moturs för att flytta platsen nedåt fribärande mot spetsen tills fläcken på frostat glas försvinner.
- Vrid den främre-to-back ratten medurs bara något för att positionera lasern så att det bara sitter på fribärande spetsen. Laser plats visas igen på frostat glas.
OBS: Detta är laserpositioneringsmetod för dykning-board utliggare. För trekantbommar, skiljer inriktningsprocessen något.
- När lasern är i linje, håll scenen lyftmotorn i "öppet" läge i 10 sekunder för att säkerställa tillräckligt med utrymme mellan konsolen och prov när du sätter provet till AFM.
- Placera provet på KPFM provstadiet. Jorda provet med användning av en koppartråd. Anslut lämpliga ledningar från AFM till provstadiet. Anslut erTage till AFM. I de flesta fall scenen hålls på plats med hjälp av magneter.
- I AFM mjukvara, tune börja fribärande och sedan tillvägagångssätt för fribärande tips till provet. Se till att inställningstid är satt till högst 10 ms, och att ingångshastigheter inte överstiger 2,0 pm / sek för att undvika spetsskador.
- När fribärande spets är på provytan, väljer en bildfönsterstorlek och perfekt bildområde. Optimera I och P vinster tillsammans med fribärande börvärde så att topografisk avbildning optimeras.
- När topografisk avbildning är optimerad, slå på KPFM modul (antingen FM eller AM-läge, här använder FM-läge). Det bör noteras att KPFM avbildning är mycket utmanande utanför 5 um x 5 um avbildningsfönster. Även för optimal KPFM avbildning, använd en 512 x 512 upplösning med långsamma skanningshastigheter (0,02-0,05 rader / sek).
- För FM-KPFM inställningar (inte ACAFM inställningar), ställ in driv procent mellan 5-10%. Ställ fribärande frequency mellan 1 - 5 kHz med en bandbredd på 2 kHz. Ställ Jag och P vinster för FM-KPFM inställningar till 0,3%.
- Variera signalbandbredd och jag och P vinster mellan provytor. För att optimera SP avbildning, ytterligare anpassa signalbandbredd och jag och P vinster för att erhålla optimala bilder. Det rekommenderade intervallet I och P vinster är från 0,22 till 0,35%.
- Bearbeta och analysera insamlade KPFM bilder med hjälp av post-bildbehandlingsprogram för att samla SP uppgifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förmågan att mäta SP använder KPFM bygger på principen att både provytan och fribärande spets är ledande i viss utsträckning. Rostfritt stål och guld agerade som ledande ytor på vilka MRSA fästes. KPFM bilder togs av 15 MRSA celler på båda ytorna med 512 x 512 upplösning och med skannings områden från 5 x 5 pm till 10 x 10 um. Scanning genomfördes med linjehastigheter som sträcker sig från 0,02 linjer / sek till 0,05 linjer / sek. Därför, med 512 datapunkter samlas per linje och 512 rader för att skanna, skanna tider varierade från 2,84 h till 7,11 tim. De typer av bilder som samlats kan ses i figur 2. KPFM fungerar med dubbla frekvenser, och som sådan, är topografiska bilder samtidigt samlas tillsammans med uppgifter om de elektriska egenskaperna hos ytan. Termiska filter applicerades på SP kartor för att lättare urskilja små förändringar i ytpotential (Figur 2). Data från kartor SP wsom analyserats efter bildbehandlingsprogram för att fastställa de genomsnittliga ytpotentialer och standardavvikelser. Statistisk analys utfördes med hjälp av statistiska R Open Source Programmering. Student t-tester utfördes för att jämföra grupper med P <0,05 vägs signifikant.
SP bilder analyserades för att bestämma mikrobiell membranyta potential. Dessa var jämfördes sedan med tillväxten på olika substratytor. Detta gjordes för att avgöra om typ ytan påverkade mikrobiell membranyta potential. Inledningsvis vi försökte inkubera MRSA celler statiskt under 3 timmar på substratytor. Men inga bifogade mikrober var synliga under AFM. SP data för ren och poly-L-lysin funktion ytor bestämdes från 5 x 5 pm skannade områden. SP skannar av de kala rostfritt stål och nakna guld substrat visade övergripande negativa ytpotentialer (-0,045 ± 0,057 V och -0,126 ± 0,052 V, respektive, P = 0,047, Figur 3). Poly-L-lysin användes för att funktionalisera ytorna för att göra dem mer gynnsamma för cellbindning. Funktion ytor visade en förskjutning till positiva ytpotentialer för stål- och guldytor rostfritt (0,133 ± 0,063 V och 0,126 ± 0,030 V respektive Figur 3). Vi undersökte därefter membranpotentialer av MRSA på poly-L-lysin funktion rostfritt stål och guldytor. Man fann att MRSA cellmembranpotentialer varierade mellan rostfritt stål och guldytor. Ytor i rostfritt stål ledde till betydligt större positiva membran SPs för celler jämfört med deras guld motsvarighet. Till exempel, SP MRSA celler bytte från positiva till negativa SPs. MRSA visade positivt SP på ytor av rostfritt stål med SP på 0,160 ± 0,022 V och SP på -0,025 ± 0,016 V på guldytor (P <0,001).
För att visa den fulla kapaciteten hos KPFM, ett exempelav en steg-höjd graf av MRSA på rostfritt stål är anordnad (figur 4). Detta visar skillnaden i ytpotential mellan substratytan och den mikrobiella membranet.
Figur 1. Arbets principer om atomkraftsmikroskop (i) och Kelvin probe kraft mikroskop (ii) Återges med tillstånd från (15). Grundkonfigurationen av AFM visas i (i). I AFM, är en vass spets fäst vid en fribärande genom elektrokemisk nedfall. Mikromasch platinabelagda ledande DPE (lågt brus) utliggare användes i detta experiment hade dimensionerna 210 x 30 um, 80 kHz resonansfrekvens, och fjäderkonstanter 2,7 N / m. Cantilevers fästes till en större chip i syfte att möjliggöra enkel hantering. När monteras i AFM, är en laser inriktad på fribärande spetsen. Nedböjningar i cantilnågonsin tips upptäcks genom en fotodiod. Nedböjningar används för att generera topografiska bilder. (II, a, b, c) visar funktionsprincipen för KPFM. Den cantilever bringas tillräckligt nära ytan för att möjliggöra elektrisk kontakt att uppstå. Skillnader i de ytpotentialer mellan spetsen och ytan orsaka spetsen att böjas. En DC-spänning appliceras för att korrigera denna böjning. Denna DC pålagda spänningen är lika med ytpotentialen av substratytan. Beroende på vilken typ av bildläge som används (hiss, AM, FM), skiljer detta arbetssätt något. Figur 1 (ii) har ändrats från 15.
Figur 2. Representant topografi och ytpotential kartor över MRSA på poly-L-lysin funktion rostfritt stål och guld substrat. Bilder (I och III) visar representativa topografibilder av MRSA celler på rostfritt stål och guldytor, respektive. Bildmått kan ses i X- och Y-axeln av dessa bilder tillsammans med en motsvarande färgad höjdprofil. (II och IV) visar motsvarande SP kartor över MRSA på deras respektive ytor. Standard "guld" färgfilter applicerades på topografi bilder medan termiska filter applicerades på SP bilder att lättare urskilja små förändringar i SP. Det bör noteras att SP av substratytor var inte homogen. SP befanns vara ojämnt fördelade med uppenbara positiva och negativa områden på båda substratytor. Detta kan ses runt MRSA celler där heterogena SPs observeras på stål- och guldsubstrat rostfritt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
52.327 / 52327fig3highres.jpg "/>
Figur 3. ytpotentialen för substratytor och MRSA cellulära membran. Figur 3 visar de motsvarande KPFM data från rostfritt stål (märkt här som SS) och guldytor, såväl som data från 15 celler. Asterisker utgör betydande skillnader mellan prover med det antal asterisker som motsvarar de jämförda proverna. MRSA data samlades in från celler kopplade till funktion ytor efter 30 min av inkubation. Detta gjordes på grund av det faktum att inga celler befanns fästa till de kala substratytor efter 3 tim.
Figur 4. Steg-höjd ytpotential bild av MRSA på poly-L-lysin funktion rostfritt stål. Använda efter bildbehandlingsprogram, var ett steg höjd diagram genereras för att visa capabiliband av programvaran, liksom, det märkbar skillnad i SP mellan substratytan och cellmembran. Den tvärsnittsarea valt representeras på motsvarande kartan SP med den grå linjen. En övergång från 0,15 V på cellytan till 0,21 V på substratytan är tydligt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Företag | Probe Type | Fjäderkonstant (N / m) | Resonant frekvens (kHz) | Cantilever Dimensioner | Tips Spetsdiametem |
| Asyl Research | AC240TM-R3 | 2 | 70 | Längd = 240 nm Bredd = 40 pm </ Td> | 28 nm |
| Bruker AFM Probes | SCM-PIT | 2,8 | 75 | Längd = 225 nm Bredd = 28 nm | 20 nm |
| Mikromasch | Ledande DPE (Low-Noise) utliggare | 2,7 | 80 | Längd = 210 nm Bredd = 30 nm | 40 nm |
| Nano och mer USA | PTSI-NCH | 42 | 330 | Längd = 125 ^ m Bredd = 30 nm | > 25 nm |
| Nanoscience Instruments | AppNano Konduktiva Tapping Mod AFM sonder. | 40 | 300 | Längd = 125 ^ m Bredd = 35 nm | 30 nm |
| Nanoscience Instruments | AppNano Konduktiva Tapping Mod AFM sonder. | 40 | 300 | Längd = 125 ^ m Bredd = 35 nm |
Tabell 1. Företag som erbjuder ett brett utbud av KPFM sonder. En mängd olika företag erbjuder nu KPFM spets med varierande spets spets diametrar, fjäderkonstanter och resonansfrekvenser. Tips anpassning är nära gränslös, med företag ofta med att bygga utliggare med anpassade specifikationer för en avsedd experiment. De flesta KPFM prober är platinabelagd kiselnitrid. Platinum ger ledande funktionalitet till fribärande. Andra vanliga beläggningsmaterial innefattar iridium, platina + iridium och guld. De flesta KPFM tips kan också alternativt användas för elektrisk kraft mikroskopi (EFM). Tip spets är viktigt för KPFM utliggare. Tips större diameter offra högre upplösning topografi avbildning för mindre elektriskt brus. Omvänt, tips med mindre diameter (<25 nm) erbjudande förbättrad topografi bildupplösning men är mer benägna att elektriskt brus. För denna studie har forskarna Mikromasch uppträdandeive DPE (lågt brus) utliggare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
KPFM var anställd som en ny teknik för att få ytan elektriska data. Det har ofta använts som en metod för att undersöka laddningsfördelning i kemi och har först nyligen börjat tillämpas för att studera biologiska system på mikro- och nano skalor. Utifrån de uppgifter som samlats in fann vi att mikrober inte verkade lätt fästa till rent stål och guld ytor av rostfritt, även efter 3 h av statisk inkubation. Poly-L-lysin funktion ytor uppvisade snabb mikrobiell fastsättning efter 30 min. Längre inkubationstider av mikrober på funktion ytor lett till cell överbeläggning på provytor och dålig topografi bilder. Ytfunktionalisering ledde till en övergång från negativ SP till positiv SP för stål- och guldytor rostfritt. Tidigare studier har visat att mikroorganismer har typiskt negativa SPs på grund av inneslutning av negativt laddade joner runt celler att upprätthålla osmotiska och joniska balans 23. Det är också käntatt närvaron av fosfatgrupper i gramnegativa mikroorganismer och teichoic syror i grampositiva mikroorganismer leder vidare till bildningen av negativa SPs 24. Kunskap om grundläggande kemi gram positiva och negativa cellmembranen ledde oss att tro att positiva substrat SPs skulle leda till snabb mikrobiell fastsättning. Men som kan ses i figurerna 2 - 4, att det fanns en stor övergång från positiv till negativ MRSA cell SPs på stål- och guldsubstrat rostfritt, respektive. Mikrobiell kvarstad kunde ha initialt skett från kvarstad av negativa joner runt membranet. Vid tvättning av cellerna och låta dem torka på substratytor, skulle vi ha tvätta bort denna joniska medier. Dessutom bör det noteras att KPFM data är endast inkluderar de yttre cellväggområden i Grampositiva (MRSA) celler. Det har visat sig i vissa fall att en mikroorganismcellmembranpotential kan förändras på närvaron av CaTiOsnic antimikrobiella peptider eller andra stress 8.
Den ena största nackdelen med KPFM jämfört med vanliga zeta potentiella mätningar på mikrobiella cellkulturer är att i KPFM insamlade data görs på döda och torkade celler. KPFM användes för att undersöka generella trender i cellytan potentiella skift med avseende på olika fästsubstratytor. Tillämpningen av DC-spänningar till fribärande spets (för att motverka F es), tillsammans med kravet på en ledande provyta, begränsa standard KPFM att öppna-air avbildning. Imaging i polära vätska är för närvarande inte möjlig med standard KPFM och sålunda avbildning av levande celler med användning KPFM inte som av ännu möjlig. Utvecklingen av nya öppna-slinga och dubbla frekvens KPFM lägen har visat lovande resultat i deras förmåga att bildytor i svagt jonlösningar 18-20. Det är vår förhoppning att i framtiden här tekniken utvecklas ytterligare så att avbildning kan göras på live cellkulturer. Den avbildning av celler i en mer naturlig miljö skulle utan tvekan leda till uppkomsten av mer exakta och realistiska cellmembran SP uppgifter. För denna studie ville vi att tillämpa denna teknik på ett nytt sätt att mäta mikrobiella cellmembranpotentialer, samt studera vidhäftningsegenskaper MRSA på en medicinskt relevant underlag. Förändringar i mikrobiella membran SPs observerades vid inkubation på olika substratytor. Detta kan innebära att substrattypen kan påverka cellulär metabolism. Vår förhoppning är att denna preliminära uppgifter kan leda till uppkomsten av nano beläggningar med inneboende elektriska laddningar som skulle kunna tillämpas på medicinska ytor eller utrustning (inklusive andra material såsom bandage och gasväv) för att förhindra mikrobiell fastsättning. Protokollet som beskrivs i denna artikel är avsedd att hjälpa forskare förstå principerna för KPFM och visar hur den kan tillämpas för att mäta och skapa SP kartor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
| DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
| PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
| Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
| Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |
References
- Seth, A. K., et al. In vivo modeling of biofilm-infected wounds: a review. J. Surg. Research. 178 (1), 330-338 (2012).
- Wolcott, R. D., Ehrlich, G. D. Biofilms and chronic infections. JAMA. 299 (22), 2682-2684 (2008).
- Hoiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. Micro. Infect. 3 (2), 55-65 (2011).
- Zhang, W., Hughes, J., Chen, Y. Impacts of hematite nanoparticle exposure on biomechanical, adhesive, and surface electrical properties of E. coli cells. Appl. Environ. Microbiol. 78 (11), 3905-3915 (2012).
- Lorite, G. S., et al. Surface physicochemical properties at the micro and nano length scales: role on bacterial adhesion and Xylella fastidiosa biofilm development. PLoS One. 8 (9), (2013).
- Lee, I., Chung, E., Kweon, H., Yiacoumi, S., Tsouris, C. Scanning surface potential microscopy of spore adhesion on surfaces. Coll. Surf. Biointer. 92, 271-276 (2012).
- Tsai, C., Hung, H., Liu, C., Chen, Y., Pan, C. Changes in plasma membrane surface potential of PC12 cells as measured by Kelvin probe force microscopy. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Jucker, B. A., Harms, H., Zehnder, A. J. Adhesion of the positively charged bacterium Strenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon. J. Bacteriology. 178 (18), 5472-5479 (1996).
- Soon, R. L., et al. Different surface charge of colistin-susceptible and -resistant Acinetobacter baumannii cells measured with zeta potential as a function of growth phase and colistin treatment. J. Anti. Chemo. 66, 126-133 (2011).
- Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. Link between culture zeta potential homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 78 (7), 2282-2288 (2012).
- Ayala-Torres, C., Hernandez, N., Galeano, A., Novoa-Aponte, L., Soto, C. Zeta potential as a measure of the surface charge of mycobacterial cells. Ann Microbiol. , (2013).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Nanomed. Nanobiotech. 2 (6), 613-634 (2010).
- Lindsay, S. M., et al. Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy studies of biomaterials at a liquid-solid interface. J. Vac. Sci. Technol. 11 (4), 808-815 (1993).
- Moores, B., Hane, F., Eng, L., Leonenko, Z. Kelvin probe force microscopy in application to biomolecular films: frequency modulation, amplitude modulation, and lift mode. Ultramicroscopy. 110 (6), 708-711 (2010).
- Melitz, W., Shen, J., Kummel, A. C., Kelvin Lee, S. probe force microscopy and its application. Surf. Sci. Reports. 66 (1), 1-27 (2011).
- Loppacher, C., et al. FM demodulated Kelvin probe force microscopy for surface photovoltage tracking. Nanotechnology. 16 (3), (2005).
- Domanski, A. L., et al. Kelvin probe force microscopy in nonpolar liquids. Langmuir. 28 (39), 13892-13899 (2012).
- Collins, L., et al. Dual harmonic Kelvin probe force microscopy at the graphene-liquid interface. Appl. Phys. Letters. 104 (13), 133103 (2014).
- Kobayashi, N., Asakawa, H., Fukuma, T. Nanoscale potential measurements in liquid by frequency modulation atomic force microscopy. Rev. Sci. Instru. 81, (2010).
- Collins, L., et al. Probing charge screening dynamics and electrochemical processes at the solid-liquid interface with electrochemical force microscopy. Nature Comm. 5, 2871 (2014).
- Pastar, I., et al. Interactions of methicillin resistant Staphylococcus aureus USA300 and Pseudomonas aeruginosa in polymicrobial wound infection. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Brien, D. J., Gould, I. M. Does vancomycin have a future in the treatment of skin infections. Cur. Opin. Infec. Diseas. 27 (2), 146-154 (2014).
- Wang, P., Kinraide, T. B., Zhou, D., Kopittke, P. M., Peijnenburg, W. J. G. M. Plasma membrane surface potential: dual effects upon ion uptake and. 155 (2), 808-820 (2011).
- Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infect. Immun. 69 (5), 3423-3426 (2001).
- Sinensky, A. M., Belcher, A. M. Label-free and high-resolution protein/DNA nanoarray analysis using Kelvin probe force microscopy. Nat. Nanotechnol. 2, 653-659 (2007).
- Park, J., et al. Single-molecule recognition of biomolecular interaction via kelvin probe force microscopy. ACS Nano. 5 (9), 6981-6990 (2011).
