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Neuroscience

मनुष्य और माउस में Periventricular ऊतक के पार्श्व ventricles और histological विशेषता के 3 डी मॉडलिंग

Published: May 19, 2015 doi: 10.3791/52328
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Physiology and Neurobiology, University of Connecticut, 2Department of Anatomic Pathology and Laboratory Medicine, University of Connecticut Health Center

Introduction

एक ependymal सेल monolayer लाइनों मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी द्रव (सीएसएफ) और मध्य द्रव (ISF) 1-3 के बीच द्वि-दिशात्मक बाधा और परिवहन कार्यों प्रदान मस्तिष्क के निलय प्रणाली। इन कार्यों मस्तिष्क विषैला मुक्त और शारीरिक संतुलन 2,3 में रखने के लिए मदद करते हैं। चोट या बीमारी के माध्यम से इस अस्तर के कुछ भागों से मनुष्य के नुकसान में अन्य उपकला अस्तर के रूप में पाया पुनर्योजी प्रतिस्थापन में परिणाम के लिए प्रकट नहीं होता है; बल्कि ependymal सेल कवरेज के नुकसान निलय सतह पर ependymal कोशिकाओं के denuded क्षेत्रों को कवर astrocytes की एक meshwork के साथ periventricular astrogliosis में परिणाम के लिए प्रकट होता है। महत्वपूर्ण सीएसएफ / ISF मुद्रा और निकासी तंत्र को गंभीर नतीजों इस उपकला परत 1,2,4-7 के नुकसान से परिणाम की भविष्यवाणी की जाएगी।

मानव उम्र बढ़ने के एक आम सुविधा पार्श्व निलय (ventriculomegaly) और observ के रूप में जुड़े periventricular शोफ बढ़े हुए हैएमआरआई और तरल पदार्थ से तनु उलटा वसूली एमआरआई (एमआरआई / स्वभाव) 8-14 द्वारा एड। Ventriculomegaly और निलय अस्तर के सेलुलर संगठन के बीच संबंधों की जांच करने के लिए, शवपरीक्षा मानव एमआरआई दृश्यों पार्श्व वेंट्रिकल periventricular ऊतक के histological तैयारी के साथ मिलान किया गया। Ventriculomegaly के मामलों में, gliosis की पर्याप्त क्षेत्रों पार्श्व वेंट्रिकल की दीवार के साथ ependymal सेल कवरेज की जगह थी। निलय विस्तार एमआरआई आधारित मात्रा विश्लेषण से पता नहीं किया गया था, ependymal सेल अस्तर बरकरार था और gliosis निलय अस्तर 6 के साथ नहीं पाया गया। इस मिश्रित दृष्टिकोण अंश का wholemount तैयारियाँ या पूरे पार्श्व वेंट्रिकल की दीवार और निलय संस्करणों 6 का 3 डी मॉडलिंग का उपयोग कर पार्श्व वेंट्रिकल अस्तर के सेलुलर अखंडता में पहली व्यापक प्रलेखन का ब्यौरा परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है। कई रोगों (अल्जाइमर रोग, एक प्रकार का पागलपन) और चोटों (घाव मस्तिष्क चोट)एक प्रारंभिक नयूरोपथोलोगिकल सुविधा के रूप में ventriculomegaly दिखा। जिससे ependymal सेल अस्तर के क्षेत्रों के अनाच्छादन सामान्य ependymal सेल समारोह के साथ हस्तक्षेप और सीएसएफ / ISF तरल पदार्थ और घुला हुआ पदार्थ विनिमय के बीच समस्थिति संतुलन समझौता करने के लिए भविष्यवाणी की जाएगी। इस प्रकार, अंतर्निहित या पड़ोसी मस्तिष्क संरचना को वेंट्रिकुलर सिस्टम, अपने सेलुलर संरचना, और परिणाम में परिवर्तन का एक और अधिक संपूर्ण परीक्षा अंततः निलय बढ़ने के साथ जुड़े neuropathology के बारे में अधिक प्रकट करने के लिए शुरू हो जाएगा।

एक साथ ऊतकीय ऊतकों के नमूनों इसी तक सीमित पहुंच के साथ बहुविध इमेजिंग डेटा की कमी है, और विशेष रूप से अनुदैर्ध्य डेटा दृश्यों में, मानव मस्तिष्क विकृतियों का विश्लेषण कठिन बना देता है। मानव बुढ़ापे या बीमारी में पाया मॉडलिंग phenotypes अक्सर माउस मॉडल के साथ प्राप्त किया जा सकता है और पशु मॉडल मानव रोग दीक्षा और प्रगति के बारे में सवालों का पता लगाने के लिए हमारी सबसे अच्छा अर्थ में से एक हो जाते हैं। में कई अध्ययनोंस्वस्थ युवा चूहों पार्श्व वेंट्रिकल की दीवारों की cytoarchitecture और अंतर्निहित स्टेम सेल आला 4,7-15 वर्णन किया है। इन अध्ययनों से 6,15 उम्र बढ़ने के माध्यम से निलय दीवारों की 3 डी मॉडलिंग और सेलुलर विश्लेषण शामिल करने के लिए बढ़ा दिया गया है। चूहों एक अपेक्षाकृत मजबूत subventicular क्षेत्र (SVZ) 6,15 अस्तर एक अक्षुण्ण ependymal सेल करने के लिए सेल आला आधारस्थित स्टेम प्रदर्शित बल्कि periventricular gliosis और न ही ventriculomegaly न तो आयु वर्ग के चूहों में मनाया जाता है। इस प्रकार, हड़ताली प्रजाति विशिष्ट मतभेद 6,15 उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के दौरान सामान्य रखरखाव और पार्श्व वेंट्रिकल अस्तर की अखंडता दोनों में मौजूद हैं। इसलिए, मनुष्यों में पाया स्थितियों से पूछताछ करने के लिए सबसे अच्छा उपयोग चूहों को, दो प्रजातियों के बीच मतभेद की विशेषता और उचित रूप से किसी भी मॉडलिंग प्रतिमान में विचार किया जाना चाहिए। यहाँ, हम दोनों मनुष्यों और मीटर में पार्श्व निलय को अनुदैर्ध्य परिवर्तन और संबद्ध periventricular ऊतक का मूल्यांकन करने के लिए प्रक्रियाओं को पेशouse। हमारे प्रक्रियाओं सेलुलर संगठन और संरचना दोनों चिह्नित करने के लिए 3 डी प्रतिपादन और माउस और मानव निलय दोनों की volumetry, और periventricular ऊतक के पूरे माउंट तैयारियों के immunohistochemical विश्लेषण का उपयोग शामिल है। एक साथ इन प्रक्रियाओं निलय प्रणाली में परिवर्तन और संबद्ध periventricular ऊतक चिह्नित करने के लिए एक साधन प्रदान करते हैं।

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Protocol

नोट: पशु प्रक्रियाओं कनेक्टिकट IACUC विश्वविद्यालय ने मंजूरी दे दी है और एनआईएच दिशा निर्देशों के अनुरूप किया गया। मानव ऊतकों और डेटा विश्लेषण और प्रक्रियाओं के अनुपालन में थे और कनेक्टिकट आईआरबी के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित और एनआईएच दिशा निर्देशों के अनुरूप।

1. माउस: पार्श्व वेंट्रिकल की Periventricular सेलुलर अखंडता और 3 डी मॉडलिंग का विश्लेषण

माउस पार्श्व वेंट्रिकल की दीवार पूरे mounts के 1.1) तैयार करना

  1. Immunohistochemistry (आईएचसी) के लिए माउस पार्श्व वेंट्रिकल पूरे mounts की तैयारी के रूप में पहले 16,17 का वर्णन किया।

पार्श्व वेंट्रिकल विश्लेषण के लिए 1.2) Immunohistochemistry

  1. पहले से 18,19 वर्णित के रूप में फिक्स और खंड माउस मस्तिष्क के ऊतकों।
    1. अंगों (एक पीला रंगाई द्वारा इंगित) को मंजूरी दे दी है जब तक संक्षेप में, transcardially सामान्य से भरा चूहों, कमरे के तापमान खारा, कमरे के तापमान 4% paraformaldehyde के द्वारा पीछाऊतक तक 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा में (पीएफए) (पीबीएस) stiffened गया है।
    2. खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें। बाण के समान सीवन के साथ खोपड़ी के आधार से कटौती करने के लिए आईरिस विच्छेदन कैंची का प्रयोग करें।
    3. खोपड़ी बेनकाब और संदंश के साथ मस्तिष्क को हटा दें। रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए ​​लगानेवाला में मस्तिष्क को विसर्जित कर दिया। तो पीबीएस के साथ 20 मिनट के लिए 3 बार धोएं।
  2. Immunohistochemistry और मात्रा विश्लेषण के लिए धारावाहिक वर्गों तैयार करें।
    1. एक microsurgical स्केलपेल का उपयोग करना, अस्थायी वर्गों immunostained कर रहे हैं जब सही गोलार्द्ध से बाएँ गोलार्द्ध की पहचान की अनुमति के लिए अनुलंबीय बाएँ गोलार्द्ध के कोर्टेक्स के साथ एक छोटा सा चीरा बनाते हैं।
    2. Vibratome सेक्शनिंग के दौरान जोड़ा संरचनात्मक समर्थन के लिए 3% agarose में दिमाग तय डिब्बे में बंद। आसुत जल में गर्म 3% agarose (w / v) पूरी तरह से जब तक एक माइक्रोवेव या गर्म थाली उपयोग कर या तो भंग कर दिया।
    3. एक धार के साथ, एक साथ सेरिबैलम में मस्तिष्क की दुम खंड को दूरएक फ्लैट और यहां तक ​​कि सतह छोड़ने के राज्याभिषेक कटौती,। ऊतक चरण के लिए सुपर गोंद लागू करें और ऊपर की ओर का सामना करना पड़ घ्राण बल्ब के साथ हाल में कटौती की सतह पर मस्तिष्क की स्थिति।
    4. तरल agarose समाधान को छूने के लिए सिर्फ गर्म तापमान को ठंडा है, पूरी तरह से पूरे मस्तिष्क डिब्बे में बंद करने के लिए मस्तिष्क पर समान रूप से लागू होते हैं। Agarose जमना करने की अनुमति दें।
    5. धारा agarose अनुक्रमिक क्रम को बनाए रखने के क्रम में पीबीएस युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली में क्रमानुसार रखा वर्गों के साथ, 50 माइक्रोन वर्गों में एक vibratome पर coronally दिमाग encased।
      नोट: आम तौर पर 12 कुओं, अच्छी तरह से A1 के साथ शुरुआत पार्श्व निलय के उद्भव को देखकर बी -6 के माध्यम से संख्यानुसार चलती है और वापस A1 के लिए साइकिल चालन करने से पहले 5 वर्गों शुरुआत ऊतक के संग्रह के साथ, एक मस्तिष्क के लिए उपयोग किया जाता है। यह वही मस्तिष्क से कई अलग पहचाना वर्गों को एक ही अच्छी तरह से भीतर कार्रवाई की जा सकती है। पार्श्व वेंट्रिकल मात्रा विश्लेषण के लिए, ऊतक संग्रह रह गए जब पार्श्व वेंट्रिकलएस और अच्छी तरह से प्रति लगभग 3 वर्गों या 36 वर्गों में कुल जिसके परिणामस्वरूप तीसरे निलय मर्ज,।
    6. अस्थायी वर्गों गलती से aspirated नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक 20-200 μl micropipette टिप के साथ चिपका एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग पीबीएस aspirate। ब्लॉक और 10% सीरम में तैर वर्गों permeabilize, 0.1% कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में ट्राइटन X-100 (टेक्सास) (पीबीएस टेक्सास)। 24 अच्छी तरह से थाली में मुक्त अस्थायी ऊतक वर्गों को कवर किया और एक कमाल की थाली पर वर्गों के सभी incubations प्रदर्शन करने के प्रति अच्छी तरह से समाधान के 300 μl का प्रयोग करें।
    7. अवरुद्ध समाधान Aspirate, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस टेक्सास रातोंरात (कम से कम 12 घंटा) में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों सेते हैं। राज्याभिषेक वर्गों का उपयोग कर निलय मात्रा निशान के लिए, ependymal कोशिकाओं लेबल विरोधी S100β एंटीबॉडी का उपयोग करें।
    8. महाप्राण प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान, और पीबीएस टेक्सास के साथ वर्गों 10 मिनट के लिए 3 बार प्रत्येक धोने।
    9. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अंधेरे में वर्गों सेते1 की सांद्रता में, फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संरचना: 1,000 10 में% सीरम, पीबीएस टेक्सास। शेष सभी ऊष्मायन चरणों के लिए अंधेरे में वर्गों रखें।
    10. महाप्राण माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान और 5 मिनट सेल नाभिक counterstain करने के लिए पीबीएस में 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 10 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ वर्गों सेते हैं। DAPI के समाधान Aspirate और पीबीएस के साथ वर्गों के 10 मिनट के लिए 3 बार प्रत्येक कुल्ला।
    11. कॉर्टिकल चिह्न का उपयोग स्लाइड्स पर क्रमानुसार माउंट वर्गों दाएँ गोलार्द्ध अभिविन्यास बनाम छोड़ दिया संरक्षित करने के लिए। धीरे स्लाइड करने के लिए बढ़ते मीडिया की एक पतली परत लगाने और से अंधेरे और फिर coverslip में शुष्क हवा वर्गों शीर्ष पर एक गिलास coverslip जगह है। Coverslipped स्लाइड कमरे के तापमान पर रातोंरात सूखे की अनुमति दें।

3 डी पुनर्निर्माण के लिए 1.3) पार्श्व वेंट्रिकल विभाजन

नोट: एक ईमानदार epifluorescence के microsco पर मानचित्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पार्श्व निलय की अनुरेखण सम्पन्नएक स्वचालित मंच और प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए एक डिजिटल कैमरा सीसीडी के साथ पीई।

  1. प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी उपकरणों पर मुड़ें और प्रतिदीप्ति मोड में मानचित्रण सॉफ्टवेयर शुरू। ओपन 'प्रदर्शन विकल्प' पता लगाने के लिए की जरूरत है उचित उपकरण पट्टियों और डॉकिंग उपकरण पैनल लोड करने के लिए। विकल्प> प्रदर्शन विकल्प> सहायक उपकरण, और 'मुख्य' और 'मार्कर' उपकरण पट्टियों का चयन करें। एक ही मेनू में, 'कैमरा हिस्टोग्राम', 'Multichannel कंट्रोल', 'कैमरा सेटिंग' के तहत 'छवि अधिग्रहण' चुनें 'डॉकिंग उपकरण पैनलों।'
  2. पार्श्व वेंट्रिकल कि लाइन ependymal कोशिकाओं लेबल मजबूत है कि एस-100β प्रतिदीप्ति पर आधारित निलय की शुरुआत का निरीक्षण करें। पार्श्व निलय युक्त ऊतक का पहला टुकड़ा पहचानें।
  3. एक नए डेटा फ़ाइल बनाएँ और बाएं पार्श्व वेंट्रिकल ऊपर छवि विंडो में क्लिक करके चरण के आंदोलन के लिए एक संदर्भ बिंदु नामित। छोटे के लिए देखोचीरा सही गोलार्द्ध से छोड़ दिया उन्मुख करने के लिए। धारावाहिक पुनर्निर्माण के लिए आकृति जब आयात करने में मदद करने के लिए फाइल अनुरेखण भर में पार्श्व निलय के लिए एक सुसंगत स्थान सापेक्ष में संदर्भ बिंदु रखें।
  4. , उदाहरण के लिए, ड्रॉप डाउन मेनू समोच्च से उपयुक्त पूर्व निर्धारित समोच्च प्रकार का चयन करें 'वाम पार्श्व वेंट्रिकल।' बाएँ और दाएँ पार्श्व वेंट्रिकल ट्रेसिंग से प्रत्येक के लिए एक अनूठा रंग का प्रयोग करें। समोच्च नाम और रंग में परिवर्तन की आवश्यकता है, 'कंटूर प्रकार जोड़ें' तो समोच्च रंग के नाम को संशोधित करने या चयन, विकल्प> दिखाना पसंद> आकृति को जाना।
  5. 'वाम पार्श्व वेंट्रिकल' समोच्च चयनित साथ, ट्रेस समोच्च शुरू करने के लिए ependymal अस्तर के शिखर सतह के साथ क्लिक करें। शिखर सतह के साथ क्रमिक क्लिक करने के लिए जारी रखने के द्वारा निलय ट्रेस।
    1. अधिक चालाकी की आवश्यकता होती है अनियमित क्षेत्रों के लिए, क्लिक करें और मुक्त हाथ का पता लगाने के क्रम में बाईं माउस बटन दबाए रखें। Ctrl + A से Z, या जाने Tओ विकल्प> पिछले समोच्च बिंदु पूर्ववत करने के लिए पूर्ववत करें। तीर कुंजियों का उपयोग अनुरेखण खिड़की ले जाएँ या एक समोच्च बंद स्क्रीन मुद्दा बना रही है और खिड़की स्वत: ही केंद्र की अनुमति से। ठीक क्लिक करें अनुरेखण निलय खत्म करने और 'बंद कंटूर' का चयन करने के लिए।
  6. ड्रॉप डाउन मेनू का उपयोग कर सही पार्श्व वेंट्रिकल के लिए एक नया समोच्च रंग (समोच्च प्रकार) का चयन करें। बाएं के लिए कदम 1.3.4 के रूप में सही वेंट्रिकल ट्रेस।
  7. समोच्च नाम और रंग में परिवर्तन की आवश्यकता है, सही समोच्च पर क्लिक करें और उचित रंग का चयन करने के बदले कंटूर प्रकार का चयन करें।
  8. 3 डी पुनर्निर्माण के लिए धारावाहिक आकृति aligning में सहायता करने के midline के साथ मार्करों जोड़ें। मार्करों जोड़ने के लिए, बाईं पर मार्कर टूलबार से उपयुक्त मार्कर ('एक्स' का उपयोग करें) का चयन करें और अनुरेखण स्क्रीन पर उन्हें ड्रॉप करने के लिए क्लिक करें। प्रत्येक ऊतक अनुभाग का पता लगाने के लिए आकृति के साथ-साथ आयात मार्करों।
  9. > सहेजें ऊतक निशान, का चयन फाइल को बचाने केके रूप में डेटा फ़ाइल और एक नया फ़ोल्डर और फ़ाइल नाम बनाएँ। नंबर ट्रेसिंग [स्लाइड #] - [ऊतक #] धारावाहिक वर्गों से निशान की आसान पहचान के लिए। उदाहरण के लिए, दूसरा स्लाइड पर तीसरे ऊतक अनुभाग प्रत्येक मस्तिष्क के लिए निर्देशिका के अंदर फाइल नाम '2-3' है।
  10. दोहराएँ निलय दीवार आसंजन के क्षेत्रों को छोड़कर, पूरे मस्तिष्क के माध्यम से निलय ट्रेस करने के लिए मस्तिष्क के ऊतकों में से प्रत्येक धारावाहिक अनुभाग के लिए 1.3.9 करने के लिए 1.3.4 कदम।
  11. निलय आसंजन साइट के लिए उन पृष्ठीय और उदर से आसंजन, उप खंड पूर्वकाल क्षेत्र के एक क्षेत्र की है। प्रत्येक वेंट्रिकल (जैसे, 'पृष्ठीय बाएं वेंट्रिकल' और 'वेंट्रल बाएं वेंट्रिकल') के लिए दो नए समोच्च प्रकार बना। आसंजन के साथ पहली ऊतक टुकड़ा पर एक पूरा निलय पुनर्निर्माण बनाया जा सकता है सुनिश्चित करने के लिए मूल पार्श्व वेंट्रिकल समोच्च और नए पृष्ठीय और उदर आकृति के साथ दोनों पार्श्व वेंट्रिकल का पता लगा।
  12. वर्गों में एक ventricl के पीछेई दीवार आसंजन, प्रत्येक वेंट्रिकल (जैसे, 'पोस्टीरियर बाएं वेंट्रिकल') के पीछे भाग के लिए नए समोच्च रंग का एक सेट बनाने के लिए। वर्तमान आसंजन और नई पीछे समोच्च प्रकार दोनों के साथ यह पहली बार फिर से शामिल हो गए अनुभाग डबल-ट्रेस।

1.4) पार्श्व वेंट्रिकल 3D पुनर्निर्माण

  1. संरेखित करें और 3 डी पुनर्निर्माण और बड़ा डेटा उत्पन्न करने के लिए माउस पार्श्व निलय के धारावाहिक समोच्च ट्रेसिंग संकलन।
  2. ओपन 3 डी पुनर्निर्माण कार्यक्रम। ओपन> फ़ाइल क्लिक करें और पहले पता लगाया धारावाहिक अनुभाग के समोच्च फ़ाइल का चयन करें। छोड़ दिया और सही वेंट्रिकल की समोच्च ट्रेसिंग के साथ ही किसी भी जोड़ा मार्करों आयात करें।
  3. आकृति का चयन करने के लिए, 'चुनें वस्तुओं' बटन (कर्सर आइकन) पर क्लिक करें और Ctrl '' धारण करके दो निलय और मार्कर का चयन करें। ठीक क्लिक करें और का चयन करें, आकृति के Z स्थिति स्थापित करने के लिए 'Z स्थिति संशोधित'। 0 माइक्रोन के लिए सबसे पहले ऊतक टुकड़ा सेट करें।
    4. <ली> पुनर्निर्माण के रूप में, फ़ाइल का चयन करें> सहेजें डाटा फाइल को बचाने की। एक गलती की है, तो वसूली फिर से लोड हो रहा है पिछले फ़ाइल के रूप में आसान है तो, हर फ़ाइल आयात करने के बाद सहेजें।
  4. पुनर्निर्माण के बगल में ऊतक टुकड़ा जोड़ने के लिए, प्रदर्शित करने के लिए संलग्न> फ़ाइल क्लिक करें। संलग्न किया जाना है Dat फ़ाइल का चयन करें, और 'मर्ज' बॉक्स की जाँच करें।
  5. फिर से नए आयातित ट्रेस फ़ाइल के Z स्थिति को समायोजित करने के लिए कदम 1.4.3 का पालन करें। अन्य निशान चलती से बचने के लिए मुख्य विंडो में केवल नए जोड़े को छोड़ दिया और सही स्वरूप का चयन करें। 50 माइक्रोन वर्गों के लिए पिछले समोच्च के Z स्थिति से 50 माइक्रोन के लिए एक के बाद एक ट्रेस फ़ाइल सेट करें। (प्रथम समोच्च: Z = 0, दूसरा समोच्च: जेड = 50, तीसरे समोच्च: आदि Z = 100)
  6. , एक्स, चयनित आकृति और मार्कर के y स्थिति को समायोजित करने के लिए क्लिक करें बटन 'माउस के साथ अनुवाद सक्षम करें' और पिछले ऊतक आकृति के साथ संरेखित करने के लिए आकृति खींचें। रखें दोनों वर्तमान का पता लगाने के बाएँ और दाएँ आकृति चयनिततुल्यकालिक आंदोलन की अनुमति है।
  7. निशान midline के मार्कर के अप लाइन के लिए दक्षिणावर्त या काउंटर दक्षिणावर्त बारी बारी से करने के लिए, 'जेड अक्ष रोटेशन' बटन का चयन करें। , ठीक क्लिक करें, आयातित आकृति और मार्कर दोनों का चयन 'सेट रोटेशन कोण' का चयन करें, और 'वाई रोटेशन' में '180' दर्ज (बाएं समोच्च सही पर है तो) वाई अक्ष भर में आकृति फ्लिप करने के लिए।
  8. निलय और midline मार्करों सबसे अच्छा कदम 1.4.4 के रूप में, पुनर्निर्माण फ़ाइल सहेजने से पहले गठबंधन कर रहे हैं सुनिश्चित करें।
  9. चरणों को दोहराएँ प्रत्येक बाद ऊतक टुकड़ा के लिए 1.4.9 करने के लिए 1.4.5 सभी आयातित और ठीक से गठबंधन किया गया है जब तक।
  10. धारावाहिक पुनर्निर्माण की मात्रा डेटा को देखने के लिए, विश्लेषण> 'मार्करों और क्षेत्र विश्लेषण' पर क्लिक करें और '3 डी कंटूर सारांश' का चयन करें। बाएं हाथ के पैनल में सभी आकृति का चयन करें और फिर अंतिम 3D पुनर्निर्माण प्रदर्शित करने के लिए '3 डी दृश्य' बटन पर क्लिक करें।

2. मानव: पार्श्व वेंट्रिकल की Periventricular सेलुलर अखंडता और 3 डी मॉडलिंग का विश्लेषण

2.1) मानव एमआरआई डेटा विश्लेषण

नोट: प्रोटोकॉल 3 डी छवि पुनर्निर्माण और पार्श्व निलय का बड़ा मात्रा का ठहराव बना सकते हैं और अनुदैर्ध्य ओवरले विश्लेषण का उपयोग समय के साथ बड़ा परिवर्तन का आकलन करने के लिए सूचीबद्ध हैं। यह डेटा के शामिल किए जाने के 20 सेट के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण मानदंड हैं एमआर डेटा संग्रह (जैसे, मशीन और चुंबक शक्ति, खंड मोटाई, अभिविन्यास और संकल्प) और बाद के अधिग्रहण के प्रसंस्करण में है कि स्थिरता नोट करना महत्वपूर्ण है।

  1. वेंट्रिकुलर विभाजन
    नोट: ITK / स्नैप उच्च संकल्प T1 भारित एमआर छवियों से खंड के लिए निलय प्रयोग किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, इस तरह के Freesurfer के रूप में अन्य फ्रीवेयर सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. ओपन ITK / स्नैप, फ़ाइल> ओपन स्केल छवि। एक .nii फ़ाइल (NITFI फ़ाइल) के रूप में वांछित फ़ाइल और खुले का चयन करें।
    2. प्रत्येक Anat के माध्यम से स्क्रॉल करेंomical विमान, टिप्पण निलय असामान्यताएं (stenosed क्षेत्रों, बड़े या छोटे अस्थायी सींग, आदि)। मुख्य उपकरण बॉक्स में 'नाग आरओआई टूल' पर क्लिक करें। 'खंड 3 डी' पर क्लिक करें। 'तीव्रता क्षेत्र' विकल्प का चयन करें।
    3. 'Preprocess छवि' पर क्लिक करें। सफेद में आरओआई को उजागर करने के क्रम में एक निश्चित तीव्रता सीमा से नीचे के क्षेत्रों को शामिल करने, 'ऊपर' का चयन करें। रपट पट्टी का उपयोग कर अधिकतम तीव्रता रिकॉर्ड। अधिकतम तीव्रता (रिकार्ड इस मूल्य) का 15% करने के लिए सीमा निर्धारित। 'ठीक है' से 10 के लिए क्लिक करें, तो 'अगला' को चिकनाई पैरामीटर सेट करें।
    4. प्रत्येक निलय को 10-12 छोटे आकार (2) 'बुलबुले' जोड़ें: दो पूर्वकाल ललाट सींग में, सात पार्श्व वेंट्रिकल शरीर, पश्चकपाल सींग में एक और के अस्थायी सींग में एक की बेहतर सतह के साथ समान रूप से स्थान दिया गया है पार्श्व वेंट्रिकल। और सेट वक्रता बल 0.4 करने के लिए 'मापदंडों का चयन करें'। सक्रिय समोच्च विकास शुरू करने के लिए प्ले प्रतीक क्लिक करें।
    5. सतह कल्पना करने के लिए 'अपडेट मेष' पर क्लिक करें; 'ऑटो अपडेट' की जाँच करें। पार्श्व वेंट्रिकल के सभी क्षेत्रों को ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र में शामिल कर रहे हैं जब विभाजन बंद करो। तीसरे निलय के शामिल किए जाने से बचें। 'समाप्त' पर क्लिक करें।
    6. निम्न विधियों में से अवांछित क्षेत्रों को दूर करने के लिए यदि आवश्यक हो तो मैन्युअल छवि को संपादित (आम तौर पर तीसरे निलय रिसाव मिटाने के लिए की जरूरत है)। मैन्युअल अतिरिक्त क्षेत्रों को हटाने या मैन्युअल आरओआई से परे किसी भी शामिल किए जाने मिटा करने के लिए सक्रिय ड्राइंग लेबल के रूप में 'साफ़ लेबल' के साथ 'तूलिका' उपकरण का उपयोग करने के लिए '3 डी स्केल्पल' उपकरण का उपयोग करें।
    7. एक .nii छवि के रूप में विभाजन परिणाम ('NIFTI' फ़ाइल स्वरूप) को बचाओ।
    8. कुल निलय मात्रा प्राप्त करने के लिए, 'विभाजन> मात्रा' और सांख्यिकी का चयन करें; सेट रंग लेबल का उपयोग कर वेंट्रिकल की कुल मात्रा प्राप्त करते हैं।
  2. MRIScans से पार्श्व निलय के अनुदैर्ध्य प्रतिनिधित्व
    नोट: का प्रयोगमैंगो सॉफ्टवेयर, अनुदैर्ध्य ROIs के गुणात्मक और मात्रात्मक समय के साथ विषयों के भीतर वेंट्रिकल की मात्रा में परिवर्तन प्रदर्शित करने के लिए मढ़ा जाता है।
    1. ओपन मैंगो। ग्रीन के रूप में पहली आरओआई समय बिंदु (आधारभूत) की फ़ाइल> लोड आरओआई क्लिक करें। फ़ाइल> लाल के रूप में दूसरा आरओआई समय बिंदु से लोड आरओआई। फ़ाइल का चयन करके अनुदैर्ध्य ओवरले सहेज> के रूप में सहेजें; '- [दूसरी बार बिंदु उम्र] .nii फ़ाइल name_ [पहली बार बिंदु उम्र]' के रूप में प्रत्येक छवि आवंटित।
    2. ITK स्नैप-इन खोलें। छवि> संयुक्त आरओआई फ़ाइल से विभाजन> लोड का चयन करके, 'greyscale छवि' के रूप में संयुक्त आरओआई फिर से खोलें। अनुदैर्ध्य मात्रा डाटा निम्नलिखित चलाने को प्राप्त करने के लिए: विभाजन> वॉल्यूम और सांख्यिकी> लेबल 1 (लाल) विस्तार मात्रा =; लेबल 2 (हरा) एक प्रकार का रोग मात्रा =; 3 लेबल (नीला) = बेस मात्रा।

2.2) मानव Periventricular ऊतक तैयारी और विश्लेषण

  1. मानव ऊतक के साथ काम करने के लिए सुरक्षा के निर्देश
    1. Approp प्राप्तriate सुरक्षा प्रशिक्षण (उदा।, रक्त जनित रोगज़नक़ों कोर्स)।
    2. मानक (यूनिवर्सल) सुरक्षा सावधानियों का पालन। दस्ताने पहनें। डिस्पोजेबल नहीं कर रहे हैं कि किसी भी आम उपकरण या सतहों को छूने से पहले दस्ताने बदलें। 'मानव ऊतक का उपयोग करें' पदनाम के साथ मानव ऊतक के साथ कार्य करते समय नियमित रूप से संभाला किसी भी आइटम लेबल।
    3. मानव ऊतक से संपर्क करने के लिए सभी मदों के लिए परिशोधन प्रथाओं का पालन करें। , पूर्व निपटान करने के लिए 24 घंटे की एक न्यूनतम के लिए सभी दूषित तरल पदार्थ ब्लीच एक ब्लीच लथपथ तौलिया (जैसे, बेंच शीर्ष) के साथ या (जैसे संदंश) ब्लीच में सीधे वस्तु रखकर दूषित सतहों का इलाज।
    4. ब्लीच में एक कागज तौलिया भिगोने और प्रभावित क्षेत्र (5-10 मिनट) पर पकड़े शामिल हो सकते हैं जो सीधे त्वचा पर मानव ऊतक, के साथ संपर्क के लिए आपात योजना तैयार करें।
    5. मानव ऊतक के संपर्क में आने वाले सभी मदों के लिए उचित अपशिष्ट निपटान का प्रयोग करें।
  2. पार्श्व वेंट्रिकल पूरा पर्वत तैयारी
    1. बीएक अक्षुण्ण गोलार्द्ध के साथ eginning बड़े चाकू का उपयोग करते हुए पूरे गोलार्द्ध के माध्यम से 1.5 सेमी मोटी राज्याभिषेक वर्गों टुकड़ा, (10% formalin में तय की और 0.1 एम पीबीएस के साथ अच्छी तरह से rinsed)।
      नोट: सभी निर्धारण प्रोटोकॉल पूर्व एंटीबॉडी सत्यापन की आवश्यकता होती है।
    2. लेबल वर्गों सामने पार्श्व वेंट्रिकल युक्त प्रथम खंड की शुरुआत के साथ वापस करने के लिए। नंबर (ऊपर से नीचे) के साथ पत्र (पूर्वकाल पीछे) और उपधारा के साथ स्लाइस लेबलिंग, एक अल्फा-न्यूमेरिक लेबलिंग प्रणाली का प्रयोग करें। Ependymal सतह में खलल न डालें से बचें।
    3. Microsurgical स्केलपेल का उपयोग, पूरे पार्श्व दीवार के लिए एक सतत अनुभाग को बनाए रखने, 1 सेमी गहरी निलय दीवार काटना। अच्छी तरह से धुंधला करने के लिए उचित आकार वर्गों बनाने के लिए आवश्यक के रूप में दीवार प्रतिभाग। निलय दीवार के विपरीत दिशा में पायदान खंड बेहतर / अवर अभिविन्यास की पहचान करने के लिए।
    4. एक डबल boile का उपयोग कर 10-20 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिमी सोडियम साइट्रेट बफर (पीएच 6.0) में ऊतक वर्गों incubating द्वारा प्रतिजन पुनर्प्राप्ति सम्पन्नआर (इष्टतम ऊष्मायन समय अनुभव से निर्धारित किया जाता है)। पीबीएस / 0.1% ट्राइटन X-100 (पीबीएस TX) में 3 बार कुल्ला।
    5. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस / पीबीएस टेक्सास का उपयोग कर 10% घोड़े सीरम में ब्लॉक।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं। निम्नलिखित एंटीबॉडी संयोजन के साथ पूरे mounts immunostain, निलय दीवार अस्तर कल्पना करने के लिए: माउस विरोधी β-catenin (1: 250); बकरी विरोधी GFAP (1: 250); खरगोश विरोधी AQP4 (1: 400)।
    7. अंधेरे में बाद के सभी चरणों को पूरा करें। माध्यमिक एंटीबॉडी (1: 500) के साथ सेते हैं, पीबीएस में ऊतक 3 बार कुल्ला 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा या कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए, और पीबीएस में एक और 3 बार कुल्ला। कमरे के तापमान पर 7 मिनट के लिए DAPI में ऊतक सेते पीबीएस में एक और 3 rinses के साथ पीछा किया।
    8. Parafilm के साथ एक मोम नीचे पकवान कवर द्वारा अंतिम विच्छेदन के लिए ऊतक तैयार करें। , ठीक संदंश का उपयोग पकवान में ऊतक जगह ependymal दीवार के साथ संपर्क बनाने से परहेज है, पीबीएस के साथ पकवान भरें।
    9. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, दृढ़ता से सुरक्षाअपने पक्ष का उपयोग पिनों पर ऊतक पुनः। एक 22.5 डिग्री microsurgical चाकू चाकू के साथ, पार्श्व वेंट्रिकल की दीवार के (लगभग 300 माइक्रोन मोटी) वर्दी पतली वर्गों पैदा करते हैं। बड़े वर्गों या मुश्किल वक्रता के साथ वर्गों के लिए, बढ़ते और नोट स्थान के लिए अंतिम वर्गों में काटने से पहले छोटे cubes में कटौती।
    10. ध्यान से, ठीक संदंश का उपयोग कर स्लाइड पर क्षेत्रीय स्थान और अभिविन्यास के नोट लेने के ऊपर स्लाइड पर विच्छेदित खंड ependyma ओर जगह है। बुलबुले से बचने के लिए, देखभाल करने के aquapolymount की पतली परत के साथ ऊतक कवर। , ऊतक पर coverslip जगह coverslip के तहत किसी भी अंतराल को भरने के लिए आवश्यक के रूप में अतिरिक्त aquapolymount जोड़ें।
    11. कमरे के तापमान पर 2-3 दिनों के लिए अंधेरे और शुष्क में रखा वर्गों रखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर slidebox में स्टोर।
  3. Immunohistochemistry और histological विश्लेषण
    1. उपयोग ओ द्वारा निर्धारित रूप में फ्लोरोसेंट immunohistochemistry के देखने के लिए confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग, निलय सतह पर इमेजिंग फोकल हवाई जहाज़ सेटएफ β-catenin (ependymal कोशिकाओं के शिखर adherens जंक्शन प्रोटीन के लिए मार्कर)। Ependymal सेल कवरेज और सतह astrogliosis (निलय सतह पर GFAP धुंधला) के क्षेत्रों चित्रित करना।
    2. पूरे निलय सतह दस्तावेज़ के लिए और असेंबल, पूरी सतह को कवर करने के लिए अतिव्यापी छवियों का उपयोग करें। धारावाहिक छवियों के असेंबल बनाने के लिए, एडोब फोटोशॉप खुला। ओवरले के लिए छवियों को चुनने के लिए फ़ाइल> स्वचालित> Photomerge> इंटरएक्टिव लेआउट का उपयोग यदि आवश्यक हो तो मैनुअल समायोजन कर रही है।
    3. बरकरार ependyma सेल कवरेज या निलय सतह gliosis का कार्टून प्रतिनिधित्व उत्पन्न करने के लिए असेंबल का पता लगाने की नई परत बनाएँ। प्रत्येक स्लाइड या रॉय के लिए दोहराएँ। एमआरआई पुनर्निर्माण पर क्षेत्र के लिए इसी को वेंट्रिकल की दीवार और लिंक के नक्शे को फिर से संगठित करने के लिए सभी वर्गों को संकलित करें।

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Representative Results

Immunostained 50 माइक्रोन राज्याभिषेक वर्गों और 3 डी पुनर्निर्माण (चित्रा 3) के आधार पर माउस पार्श्व निलय का कंटूर ट्रेसिंग मात्रा डेटा की बीमारी या चोट के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में माउस का उपयोग कर विभिन्न प्रयोगात्मक मानदंड में एकत्र होने के लिए अनुमति देता है। इस प्रक्रिया के लिए गंभीर पार्श्व वेंट्रिकल की दीवारों एक दूसरे का पालन जहां क्षेत्रों के बहिष्कार है। निलय के क्षेत्रों subsegmenting और प्रत्येक क्षेत्र (चित्रा -3 सी) के लिए एक अलग रंग निर्दिष्ट करके, सन्निहित वर्गों पालन किया जा सकता है और क्षेत्रीय और कुल मात्रा संकलित subsegments से गणना की जा सकती है।

इसी प्रकार के अध्ययन के लिए 3 डी renderings के लिए पार्श्व निलय की अर्द्ध स्वचालित विभाजन (ITK-स्नैप) के साथ मिलकर मस्तिष्क का एमआरआई स्कैन का उपयोग किया जा सकता है। निलय संस्करणों का सीधा बाँधना और periventricular ऊतक विश्लेषण, पूर्व या पोस्टमार्टम के लिए एमआरआई स्कैन खंडों और (3 डी पुनर्निर्माण बनाने के लिए गठबंधन कर रहे हैं (चित्रा 5) के लिए मढ़ा जा सकता है। अनुदैर्ध्य विश्लेषण भविष्य immunohistochemical विश्लेषण के लिए विशेष रुचि के क्षेत्रों के बारे में जानकारी प्रदान करता है। इसी ऊतक निलय सतह (चित्रा 6A) पर बरकरार ependymal सेल monolayer बनाम astrogliosis के क्षेत्रों प्रकट करने के लिए immunohistochemically विश्लेषण किया है। ऊतक छवियों पर कब्जा कर लिया और फिर निलय सतह (चित्रा 6B) के बड़े क्षेत्रों को कवर करने के montaged कर रहे हैं। संकलित montages के कार्टून अभ्यावेदन में बदला और फिर periventricular सेलुलर अखंडता (चित्रा 6C) में क्षेत्रीय परिवर्तन को दिखाने के लिए एक एमआरआई आधारित 2 डी मॉडल पर मैप किए जाते हैं। वेंट्रिकल की दीवार के पूरे माउंट तैयारी निलय सतह के बड़े विस्तार के मनोरम दृश्य के लिए अनुमति देता है, या हम पूरे पार्श्व वेंट्रिकल सतह 6 का प्रदर्शन किया है के रूप में। बढ़ी हुई एलशोफ के सुझाव सतह gliosis के क्षेत्रों में Aquaporin-4 अभिव्यक्ति की evels निलय अस्तर अखंडता 6 का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

चित्र 1
चित्रा 1: ITK / स्नैप नाग आरओआई उपकरण (ए) का उपयोग कर पार्श्व वेंट्रिकल विभाजन प्रदर्शन 'बुलबुले' पार्श्व निलय में जुड़ जाते हैं। (ख) 'बुलबुले' सक्रिय समोच्च विकास के दौरान का विस्तार करें। पूरे पार्श्व वेंट्रिकल भर जाता है जब (सी) विभाजन पूरा हो गया है। (केयर 3 आरडी निलय से बचने के लिए लिया जाता है।)

चित्र 2
चित्रा 2: मानव पार्श्व वेंट्रिकल दीवार विच्छेदन ( (डी) में दिखाया गया है। (ई) वेंट्रिकल की दीवार का एक खंड बाहर विच्छेदित और आईएचसी के लिए कार्रवाई की है। ऊतक के उपखंड आकार और वक्रता के आधार पर आवश्यक हो सकता है। अभिविन्यास बनाए रखने के लिए, ऊतक निलय सतह के विपरीत पक्ष (हरा) पर शीर्ष पर नोकदार है। पिंस (काले डॉट्स) के ऊतकों को सुरक्षित और अंतिम विच्छेदन मार्गदर्शन करने के लिए उपयोग किया जाता है (लाल रेखा धराशायी)। अंतिम पूरे माउंट तैयारी निलय सतह (हरा) का सामना करना पड़ के साथ स्लाइड पर मुहिम शुरू की है।

चित्र तीन
चित्रा 3: ट्रेसिंग और S100β-immunoreactive ependymal कोशिकाओं द्वारा उल्लिखित माउस पार्श्व निलय (लेटरल निलय सहित एक राज्याभिषेक माउस मस्तिष्क अनुभाग, की 3 डी पुनर्निर्माण (*, पार्श्व निलय, वर्ग, adhe के क्षेत्र। सायन; पैमाने पर पट्टी, 500 माइक्रोन)। (बी) माउस पार्श्व निलय बड़ा विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप से intraventricular आसंजन के क्षेत्रों को छोड़कर, 'आकृति' के रूप में पता लगाया और उप खंडों वर्गों के रूप में व्यवस्थित कर रहे हैं। पार्श्व वेंट्रिकल आकृति (सी) 3 डी पुनर्निर्माण। पार्श्व निलय युक्त हित के क्षेत्र में फैले पूरे मस्तिष्क की मात्रा का पीला, समोच्च।

चित्रा 4
चित्रा 4: एमआरआई आधारित पार्श्व वेंट्रिकल विभाजन (ए) एमआर छवियों इकट्ठा कर रहे हैं। (बी) के पार्श्व वेंट्रिकल रॉय (लाल) के रूप में परिभाषित किया गया है। (सी) 3 डी छवि पुनर्निर्माण बड़ा मात्रा का ठहराव और पार्श्व वेंट्रिकल की गुणात्मक दृश्य के लिए अनुमति देता है।

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चित्रा 5: अनुदैर्ध्य निलय विस्तार अनुदैर्ध्य MRIs का आकलन कई बिंदुओं से गठबंधन और कल्पना और समय के साथ विषयों के भीतर निलय मात्रा विस्तार यों के लिए मढ़ा जा सकता है।

चित्रा 6
चित्रा 6: Immunohistochemical मूल्यांकन और β-catenin धुंधला द्वारा उल्लिखित मानव पार्श्व वेंट्रिकल सतह (ए) बरकरार ependyma कोशिकाओं के क्षेत्रों के क्षेत्रीय मानचित्रण, एक cobblestone उपस्थिति (तारांकन) दिखाने के लिए और निलय सतह पर astrogliosis के क्षेत्रों से एक बिंदीदार रेखा ने सीमांकन कर रहे हैं (GFAP + धुंधला)। (बी) के सीरियल confocal छवियों एक क्षेत्रीय असेंबल उत्पन्न करने के लिए मढ़ा और निलय सतह पर सेलुलर संगठन का एक कार्टून प्रतिनिधित्व के लिए एडोब फोटोशॉप का उपयोग कर पता लगाया जाता है। (सी) कार्टूनछवि असेंबल एमआरआई आधारित 3 डी निलय पुनर्निर्माण के लिए इसी पर निलय सतह के लिए मैप किया गया है। (स्केल बार (ए), 40 माइक्रोन; स्केल बार (बी), 1 मिमी)

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Discussion

हम उपकरण और चूहों में और मानव में मस्तिष्क के निलय प्रणाली की अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। ये उपकरण, तथापि, यह भी, या 14,21,22 उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के दौरान चोट, बीमारी की वजह से परिवर्तन से गुजरना है कि अन्य मस्तिष्क संरचना या अंग प्रणालियों को लागू किया जा सकता है। रणनीतियों पार के अनुभागीय और अनुदैर्ध्य एमआरआई दृश्यों के संरेखण विशिष्ट क्षेत्रों या ब्याज की संरचनाओं के 3 डी की मात्रा अभ्यावेदन उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है कि सॉफ्टवेयर का लाभ लेने प्रस्तुत किया। अनुदैर्ध्य एमआरआई दृश्यों की अनुमति देने के समय के साथ होते हैं और कुल मस्तिष्क की मात्रा के अनुपात को पार्श्व वेंट्रिकल के लिए कुल मस्तिष्क की मात्रा, और / या अन्य मस्तिष्क संरचना (जैसे, सबथैलेमिक नाभिक 23 या महासंयोजिका सफेद बात इलाकों को शामिल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है कि 3 डी की मात्रा में परिवर्तन के संकलन ) प्रसार भारित आतानक इमेजिंग का उपयोग। साथ में, मस्तिष्क संरचनात्मक परिवर्तन के लिए एक व्यापक विश्लेषण किया जा सकता है। अंत में,बहुविध इमेजिंग तकनीक का संग्रह मस्तिष्क संरचना करने के लिए उम्र से संबंधित है और रोग से संबंधित परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए मस्तिष्क स्वास्थ्य की स्थिति 24 की सबसे सटीक चित्र प्रदान करने के लिए आवश्यक हैं। एक साथ विषय-विषय परिवर्तनशीलता और विषयों भर में परिवर्तनशीलता की सीमा के साथ प्रलेखन और महत्वपूर्ण संरचनात्मक डेटा का संकलन, आदर्श स्वास्थ्य या बीमारी में ऊतक का सबसे अच्छा मार्गदर्शन नैदानिक ​​निदान के लिए अति उच्च क्षेत्र एमआरआई एटलस उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

कई महत्वपूर्ण कदम के बीच और विषय डेटा सेट के भीतर अधिग्रहण और प्रसंस्करण परिवर्तनशीलता को कम करने के क्रम में नोट करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। आदर्श रूप में मिलान किया डेटा दृश्यों प्राप्त करने के लिए, एक ही एमआरआई स्कैनर और अनुक्रम प्रकार अध्ययन के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए। शवपरीक्षा मस्तिष्क के ऊतकों अक्सर गुणवत्ता बदलती के है; ऐसे लगानेवाला में मौत का कारण, पोस्टमार्टम अंतराल, छिड़काव की गुणवत्ता और समय की लंबाई के रूप में महत्वपूर्ण कारकों सब धुंधला प्रभावकारिता और एक के लिए की जरूरत को प्रभावित कर सकताप्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रोटोकॉल। इसके अलावा, मानव मस्तिष्क के आकार के हित के क्षेत्रों से युक्त ऊतक प्राप्त करने के लिए आगे हेरफेर की आवश्यकता होती है प्रत्येक टुकड़ा के साथ कई टुकड़ा वर्गों की आवश्यकता है। इसलिए, यह प्रत्येक अनुभाग के स्थान और अभिविन्यास स्पष्ट रूप से चिह्नित और दर्ज की गई है कि महत्वपूर्ण है। अंत में, पोस्टमार्टम ऊतक विश्लेषण के साथ प्राथमिक समस्या ठीक है कि है - यह पोस्टमार्टम है - और इसलिए जीवन के अंत में ऊतक का केवल एक स्नैपशॉट दृश्य प्रदान करता है। बेहतर बहुविध इमेजिंग तकनीक मस्तिष्क संरचना और सेलुलर संकल्प के साथ Morpho कार्यात्मक जानकारी में परिवर्तन के वास्तविक समय विश्लेषण के लिए आवश्यक है।

माउस अध्ययन चर द्वारा मानव हालत चर से पूछताछ की अनुमति है और मानव ऊतक के साथ कार्य करते समय पाया कठिनाइयों के कई मौजूद नहीं है। कारण संरचनात्मक गतिशीलता के विश्लेषण के माध्यम से मानव रोग या चोट मॉडल के लिए इस्तेमाल माउस अध्ययन रोग-मॉडल मूल्य सृजन के लिए सुधार की पेशकश कर सकतेidation। हालांकि, प्रजाति विशिष्ट मतभेद ध्यान दिया जाना चाहिए। पार्श्व निलय के हमारे विश्लेषण में, यह चूहों के रूप में, पार्श्व निलय के पार्श्व दीवार के साथ एक सक्रिय स्टेम सेल आला बनाए रखने और अस्तर मामूली ependymal सेल हानि के मामलों में होता है वेंट्रिकल की सेल की मध्यस्थता पुनर्योजी मरम्मत कि स्टेम नोट करना महत्वपूर्ण है आयु वर्ग के चूहों में पाए या सीमित ependymal सेल अनाच्छादन ependyma के प्रदर्शन के माध्यम से होती है जब 19 neuraminidase करने के लिए। किसी भी, उत्थान की संभावना है इसके विपरीत, यदि मनुष्य, पार्श्व वेंट्रिकल की दीवारों 25-27 और थोड़ा के साथ एक मजबूत स्टेम सेल आला बनाए रखने के लिए नहीं है। आयु वर्ग के चूहों के विपरीत, आयु वर्ग के मनुष्य निलय विस्तार 6 के साथ जुड़े निलय सतह पर व्यापक astrogliosis दिखा। अनाच्छादन और निलय अस्तर के 'scarring के' के इस स्तर ependymal कोशिकाओं 6,28 के निलय अस्तर उघाड़ना को neuraminidase का उपयोग करने के लिए माउस में मॉडलिंग की जा सकती है। इसके अलावा, यह वें पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हैमछली पालने का बाड़ा बनाए रखा चूहों पर सबसे मानव विषयों से एक बहुत अलग चिकित्सा के इतिहास पेश, संक्रमण, बीमारी या मानसिक आघात का अनुभव नहीं है। इसके अलावा, चूहे आम तौर पर उम्र जुड़े neurodegenerative रोग, ventriculomegaly या periventricular gliosis नहीं दिखाते। इसलिए, वे मॉडलिंग की जा करने के लिए इन phenotypes निरीक्षण करने के लिए। अंत में, कोई पशु मॉडल पूरी तरह से व्यक्तिवृत्त, pathophysiology, और मानव रोग के लक्षण जटिलता पुनरावृत्ति कर सकते हैं और इन सीमाओं को स्वीकार किया है और ठीक से संप्रेषित करने की आवश्यकता है।

सारांश में, हम तकनीक और प्रोटोकॉल माउस और मानव में पार्श्व वेंट्रिकल संस्करणों का आकलन करने के लिए उपस्थित थे। निलय 3 डी में गाया जा सकता है और अनुदैर्ध्य विश्लेषण spatiotemporal मात्रा में परिवर्तन के संकलन की अनुमति देता है। इसके अलावा, बनती मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग कर हम वेंट्रिकल की मात्रा में परिवर्तन करने के लिए जोड़ा जा सकता है कि कैसे सेलुलर सुविधाओं प्रदर्शित करता है। हाल के परिणामों periventricu के क्षेत्रों में Aquaporin-4 अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि हुई का प्रदर्शनLAR gliosis निलय सतह के साथ शोफ सुझाव देते हैं। ऊतक ऊतक विज्ञान के साथ स्वभाव एमआरआई बाँधना इसलिए भविष्य जांच सीएसएफ और मध्य द्रव विनिमय के बारे में हमारी समझ को बेहतर बनाने, और निलय प्रणाली स्वास्थ्य और कैसे इसकी गिरावट के मस्तिष्क के विभिन्न कार्यों को प्रभावित करता है के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करेगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline (PBS) Life Technologies 21600-069
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 19210 Use at 4% in PBS, 4 °C
Normal Horse Serum Life Technologies 16050 10% in PBS-TX (v/v)
Normal Goat Serum Life Technologies 16210 10% in PBS-TX (v/v)
Triton X-100 (TX) Sigma-Aldrich T8787 0.1% in PBS (v/v)
Vibratome Leica VT1000S
Fluorescence Microscope Zeiss Imager.M2
Camera Hamamatsu ORCA R2
Microscope Stage Controller Ludl Electronic Products MAC 6000
Stereology software MBF Bioscience Stereo Investigator 11
Stereology software ImageJ/NIH NIH freeware
3D Reconstruction software MBF Bioscience Neurolucida Explorer
Confocal Microscope Leica TCS SP2
MRI Software
Freesurfer https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall Segmentation and Volume
ITK-Snap http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php Segmentation and Volume
Multi-image Analysis GUI (Mango) http://ric.uthscsa.edu/mango/ Longitudinal overlay
Whole Mount Equipment
22.5° microsurgical straight stab knife Fisher Scientific NC9854830
parafilm
wax bottom dissecting dish 
pins
fine forceps
aquapolymount
Dissecting Microscope Leica MZ95
Whole Mount Antibodies
mouse anti-b-catenin BD Bioschiences, San Jose, CA, USA 1:250
goat anti-GFAP Santa Cruz Biotechnology 1:250
rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4)  Sigma-Aldrich 1:400
Coronal Antibodies
Anti-S100β antibody Sigma-Aldrich 1:500
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Life Technologies D-1306 10 µg/ml in PBS

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References

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Acabchuk, R. L., Sun, Y., Wolferz, Jr., R., Eastman, M. B., Lennington, J. B., Shook, B. A., Wu, Q., Conover, J. C. 3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse. J. Vis. Exp. (99), e52328, doi:10.3791/52328 (2015).

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