Introduction
קווי monolayer תא ependymal חדרי המוח של המוח מספק פונקציות מחסום ותחבורה דו-כיוונית בין הנוזל המוחי השדרה (CSF) ונוזל ביניים (ISF) 1-3. פונקציות אלה מסייעים לשמור toxicant ללא המוח ובאיזון פיסיולוגי 2,3. בהפסד לבני אדם של חלקים של רירית זו בגלל פציעה או מחלה אינו מופיע לגרום להחלפת משובי כפי שנמצא ברפידות אפיתל אחרות; ולא אובדן כיסוי תא ependymal נראה לגרום astrogliosis סביב חדרי המוח עם meshwork של האסטרוציטים מכסים אזורים הערומים של תאי ependymal על פני השטח החדר. השלכות חמורות למנגנוני CSF / החלפת ISF ופינוי חשובים יהיו צפויות לנבוע מאובדן שכבת האפיתל זה 1,2,4-7.
תכונה משותפת של הזדקנות אנושית מוגדלת חדרים לרוחב (ventriculomegaly) ובצקת סביב חדרי המוח הקשורים כobservאד על ידי MRI והתאוששות היפוך נוזל-מוחלש MRI (MRI / פלייר) 8-14. כדי לחקור את הקשר בין ventriculomegaly והארגון הסלולרי של חדר הבטנה, רצפי ה- MRI אדם לאחר המוות זווגו עם הכנות היסטולוגית של רקמה סביב חדרי מוח חדר לרוחב. במקרים של ventriculomegaly, חלקים משמעותיים מדבקים החליפו כיסוי תא ependymal לאורך קיר החדר לרוחב. כאשר הרחבת חדר לא זוהתה על ידי ניתוח נפח מבוסס MRI, בטנת תא ependymal הייתה שלמה ודבקה לא זוהה לאורך חדר הבטנה 6. גישה קומבינטורית זה מייצגת את מקיף תיעוד המפרט השינויים הראשונים בשלמות סלולרית של רירית חדר לרוחב באמצעות הכנות wholemount של מנות או קיר חדר לרוחב כל ומודלים 3D של כרכי חדר 6. כמה מחלות (מחלת אלצהיימר, סכיזופרניה) ופציעות (פגיעה מוחית טראומטית)להראות ventriculomegaly כתכונת נוירו מוקדמת. Denudation של תחומי בטנת תא ependymal כך יהיה צפוי להפריע לתפקוד תא ependymal נורמלי ולהתפשר מצב האיזון בין CSF / נוזל ISF ותמורה מומסת. לפיכך, בחינה מעמיקה יותר של שינויים בחדרים המוח, הרכב הסלולרי שלה, והתוצאה למבני מוח בסיסי או שכנים סופו של דבר מתחילה לחשוף יותר על נוירופתולוגיה הקשורים להגדלת חדר.
המחסור בנתונים הדמיה multimodal, וברצפי נתונים אורכי מסוימים, יחד עם גישה מוגבלת למתאימים דגימות רקמה היסטולוגית עושה ניתוח של פתולוגיות המוח האנושית קשה. פנוטיפים דוגמנות מצאו בהזדקנות או מחלה אנושית יכולים להיות לעתים קרובות הושגו עם מודלים עכבר והמודלים של בעלי החיים הפכו לאחד האמצעים הטובים ביותר שלנו כדי לחקור שאלות על ייזום מחלה אנושי והתקדמות. מספר מחקרים בעכברים צעירים ובריאים שתיארו cytoarchitecture של קירות חדר לרוחב ונישת תאי גזע שבסיס 4,7-15. מחקרים אלה הורחבו לכלול מודלים 3D וניתוח סלולארי של קירות החדר דרך הזדקנות 6,15. לא דבק ולא ventriculomegaly סביב חדרי מוח הם נצפו בעכברים בגיל, ולא עכברים להציג אזור subventicular חזק יחסית (SVZ) נובע subjacent נישה תא לתא ependymal שלם רירית 6,15. כך, הבדלים בולטים מינים ספציפיים קיימים בשתי התחזוקה ויושרה של רירית חדר לרוחב הכלליות בתהליך של הזדקנות 6,15. לכן, לעכברי שימוש הטובים ביותר לחקור את התנאים שנמצאו בבני אדם, הבדלים בין שני המינים צריכים להיות מאופיינים ונחשבים כראוי בכל הפרדיגמה דוגמנות. כאן, אנו מציגים נהלים כדי להעריך את שינויי אורכי לחדרים לרוחב ורקמות סביב חדרי המוח הקשורים בבני האדם ומטרouse. הנהלים שלנו כוללים טיוח 3D וvolumetry של שני עכבר וחדרי לב אדם, ושימוש בניתוח immunohistochemical של הכנות הר שלמות של רקמה סביב חדרי המוח לאפיין שני ארגון ומבנה תאיים. יחד נהלים אלה לספק אמצעי לאפיון שינויים בחדרי המוח ורקמות סביב חדרי המוח קשורים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: נהלי בעלי חיים אושרו על ידי אוניברסיטת קונטיקט IACUC ולהתאים להנחיות NIH. רקמה אנושית וניתוח נתונים ונהלים היו בעמידה ובאושרה על ידי אוניברסיטת קונטיקט IRB ולהתאים להנחיות NIH.
1. עכבר: ניתוח של סביב חדרי המוח סלולרי יושרה ו3D דוגמנות של חדר לרוחב
1.1) הכנת עכבר רוחב חדר הקיר השלם Mounts
- הכן mounts כל חדר לרוחב עכבר אימונוהיסטוכימיה (IHC) כפי שתואר לעיל 16,17.
1.2 אימונוהיסטוכימיה) לניתוח חדר לרוחב
- לתקן ורקמת מוח עכבר סעיף כפי שתואר קודם לכן 18,19.
- בקצרה, עכברי סומק transcardially עם נורמלי, מלוחים בטמפרטורת חדר, עד שאיברים ניקו (מסומן בצבע חיוור), ואחריו paraformaldehyde 4% בטמפרטורת חדר(PFA) ב 0.1 נאגרו מלוח M פוספט (PBS) עד רקמות התקשח.
- הסר מוח מהגולגולת. השתמש במספריים לנתיחה איריס לחתוך מבסיס גולגולת לאורך תפר sagittal.
- לחשוף את הגולגולת ולהסיר מוח עם מלקחיים. לטבול את המוח ב-4% מקבע PFA הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף 3 פעמים במשך 20 דקות עם PBS.
- הכן סעיפי סדרתי עבור אימונוהיסטוכימיה וניתוח נפח.
- באמצעות אזמל מייקר, לעשות חתך קטן longitudinally לאורך הקליפה של האונה השמאלית כדי לאפשר זיהוי של האונה השמאלית מהאונה הימנית כאשר חלקים צפים הם immunostained.
- לשים בארגז קבוע מוח ב 3% agarose לתמיכה מבנית הוסיפה במהלך חתך vibratome. agarose 3% חמים במים מזוקקים (w / v) עד לחלוטין מומס או באמצעות מיקרוגל או פלטה.
- עם סכין גילוח, להסיר את סעיף הזנב של המוח במוח הקטן עםלחתוך עטרה, עוזב משטח שטוח ואפילו. החל הדבק סופר לשלב רקמה ולמקם את המוח על פני השטח לחתוך חדש עם נורות חוש הריח פונות כלפי מעלה.
- כאשר פתרון agarose נוזל מתקרר לטמפרטורה חמה רק לגעת, יחול באופן שווה על פני המוח לשים בארגז את כל המוח לחלוטין. אפשר agarose כדי לחזק.
- סעיף agarose עטוף מוח coronally על vibratome לתוך 50 מיקרומטר חלקים, עם קטעים להציב סדרתי לתוך צלחת 24 גם מכילה PBS כדי לשמור על סדר רציף.
הערה: בדרך כלל 12 בארות המשמשות למוח אחד, עם אוסף של רקמה מתחילה 5 סעיפים לפני שראיתי את ההופעה של חדרים לרוחב החל גם A1, נע מבחינה מספרית עד B6 והרכיבה על האופניים חזרה לA1. זה מאפשר להבחין חלקים מרובים מאותו המוח לעיבוד בתוך אותו היטב. לניתוח חדר נפח רוחב, אוסף רקמות חדל כאשר החדר לרוחבים ומיזוג חדר שלישי, וכתוצאה מכך בסעיפים כ 3 לטובים או כלל סעיפי 36. - לשאוב PBS באמצעות פיפטה העברה מודבקת עם קצה micropipette 20-200 μl כדי להבטיח שחלקים צפים אינם להישאף בטעות. בלוק וpermeabilize חלקים צפים בסרום 10%, 0.1% Triton X-100 (TX) בPBS (PBS-טק) עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. השתמש 300 μl של פתרון לכל גם כדי לכסות חלקי רקמות צף-חופשיים בצלחת 24 גם ולבצע את כל incubations סעיפים על צלחת נדנדה.
- לשאוב את פתרון החסימה, ודגירת קטעים עם נוגדנים עיקריים בPBS-TX (שעה לפחות 12) הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. עקבות נפח חדר באמצעות סעיפי עטרה, להשתמש נוגדן אנטי S100β לתייג תאי ependymal.
- פתרון נוגדן ראשוני לשאוב, ולשטוף סעיפים 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם PBS-TX.
- סעיפי דגירה בחושך במשך השעה 1 בטמפרה החדרture עם נוגדנים משני פלורסנט, בריכוזים של 1: 1,000 בסרום 10%, PBS-TX. שמור סעיפים בחושך במשך כל צעדי הדגירה שנותרו.
- פתרון לשאוב נוגדנים משני דגירה קטעים עם 4, 6-diamidino-2-phenylindole 'בPBS (DAPI, 10 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 5 דקות לcounterstain גרעין תא. לשאוב את פתרון DAPI ולשטוף סעיפים 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם PBS.
- חלקי הר סדרתי על גבי שקופיות באמצעות סימן קליפת המוח לשמר שמאל מול נטייה אונה ימנית. סעיפי אוויר יבשים בcoverslip הכהה ולאחר מכן על ידי יישום שכבה דקה של תקשורת הרכבה לשקופית ומניחים בעדינות coverslip זכוכית על גבי. לאפשר שקופיות coverslipped לייבוש למשך הלילה בטמפרטורת חדר.
1.3) פילוח חדר לרוחב ל3D שחזורים
הערה: בצע מעקב של חדרים לרוחב באמצעות תוכנת מיפוי על microsco epifluorescence זקוףPE עם שלב אוטומטי ומצלמת CCD דיגיטלית לגילוי הקרינה.
- הפעל את ציוד מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולהשיק תוכנת מיפוי במצב הקרינה. "אפשרויות תצוגה" פתוחות כדי לטעון את סרגלי הכלים הנכונים ולוחות כלי עגינה דרושים למעקב. אפשרויות> אפשרויות תצוגה> אבזרים, ובחר את 'ראשי' וסרגלי הכלים 'דה מרקר'. באותו התפריט, בחר "מצלמה היסטוגרמה ',' רב-ערוצי בקרה ',' הגדרות מצלמה ', ו'תמונת רכישה' תחת 'פנלי כלי עגינה."
- שים לב התחלות של החדרים המבוססים על הקרינה S-100β חזקה כי תוויות בתאים המרפדים ependymal החדר לרוחב. זהה את החתיכה הראשונה של רקמה המכילה את החדרים לרוחב.
- ליצור קובץ נתונים חדש ולייעד נקודת התייחסות לתנועת שלב על ידי לחיצה בחלון התמונה למעלה החדר לרוחב עזב. חפש הקטןחתך לאוריינט עזב מאונה ימנית. שמור את נקודת ההתייחסות בקנה אחד מיקום יחסי לחדרים לרוחב לרוחב איתור קבצים כדי לסייע בעת יבוא קווי המתאר לשיקום סידורי.
- בחר את סוג גובה מוגדר מראש מתאים מגובה תפריט נפתחים, לדוגמא, "שמאל רוחב חדר." השתמש בצבע ייחודי עבור כל אחד מהעתקי החדר לרוחב מהשמאל ומימין. אם שינויים בשם הגובה והצבע נדרשים, ללכת לאפשרויות> העדפות תצוגה> קווי מתאר, ואז לשנות את השמות של צבעי מתאר או בחר 'הוסף סוג קונטור ".
- עם קווי המתאר של שמאל רוחב החדר 'נבחרו, לחץ לאורך משטח הפסגה של רירית ependymal להתחיל את קווי המתאר העקבות. עקוב אחר החדר על ידי המשך לחץ ברציפות לאורך משטח הפסגה.
- לאזורים חריגים הדורשים יותר עידון, לחץ והחזק את לחצן העכבר השמאלי כדי להתחקות יד חופשית. לחץ על Ctrl + Z, או ללכת to אפשרויות> בטל כדי לבטל את נקודת הגובה הקודמת. הזז את חלון האיתור באמצעות מקשי חצים או על ידי ביצוע קווי המתאר להצביע מחוץ למסך ומאפשר החלון כדי למרכז את עצמו באופן אוטומטי. כדי לסיים את חדר התחקות קליק ימני ובחר "קונטור סגור '.
- בחר צבע חדש מתאר (קונטור סוג) לחדר לרוחב הנכון באמצעות תפריט הנפתח. עקוב אחר החדר ממני כמו בשלב 1.3.4 לשמאל.
- אם שינויים בשם הגובה והצבע נדרשים, לחץ לחיצה ימנית על קווי המתאר ובחר שינוי קונטור סוג כדי לבחור את הצבע המתאים.
- להוסיף סמנים לאורך קו האמצע כדי לסייע ביישור קווי המתאר סידורי לשיקום 3D. כדי להוסיף סמנים, בחר את הסמן המתאים (להשתמש "X") מסרגל הכלים סמנים בצד השמאל ולחץ לשחרר אותם על מסך המעקב. סמני יבוא יחד עם קווי המתאר לכל עקבות סעיף רקמה.
- כדי לשמור את עקבות רקמה, בחר קובץ> שמורקובץ נתונים וכליצור שם תיקייה וקובץ חדש. מספר העתקים [# שקופית] - [# רקמה] לזיהוי קל של עקבות מסעיפי סדרתי. לדוגמא, סעיף הרקמה השלישי בשקופית השנייה יש את שם הקובץ '2-3 "בתוך הספרייה לכל מוח.
- חזור על שלבי 1.3.4 ל1.3.9 עבור כל מקטע סדרתי של רקמת המוח לאתר את חדרי הלב דרך כל המוח, למעט אזורים של קיר חדר הידבקות.
- אם החדר יש אזור של ההידבקות, תת מגזר באזור הקדמי מאלו גב וגחון לאתר ההידבקות. ליצור שני סוגים חדשים מתאר לכל חדר (למשל, 'שמאל חדר הגבי' ו 'הגחון שמאל חדר "). על פרוסת הרקמה הראשונה עם הידבקות, להתחקות אחר החדר לרוחב עם שני קווי המתאר המקוריים לרוחב חדר והגב החדש וקווי מתאר הגחון כדי להבטיח ניתן ליצור שחזור חדר שלם.
- בסעיפים אחורי לventriclקיר הידבקות דואר, ליצור סט של צבעים חדשים מתאר לחלק האחורי של כל חדר (למשל, 'שמאל חדר אחורי "). פעמיים להתחקות סעיף זה-הצטרף מחדש ראשון עם שתי ההידבקות הנוכחית וסוגים חדשים מתאר אחורי.
1.4) שיקום רוחב החדר 3D
- יישר ולעבד העתקים גובה סידוריים של החדרים לרוחב העכבר כדי ליצור 3D שחזורים ונתונים נפח.
- תכנית שיקום 3D פתוחה. לחץ על קובץ> פתח ובחר את קובץ קווי המתאר של הסעיף הסידורי לייחס הראשון. ייבא את העתקים קווי המתאר של החדר השמאלי וימני וכן כל סמנים הוסיפו.
- כדי לבחור קווי המתאר, לחץ על כפתור 'אובייקטי הבחירה' (סמל סמן) ובחר שני חדרים וסמנים על ידי ההחזקה "Ctrl". כדי לקבוע את מיקום Z של קווי המתאר, לחץ לחיצה ימנית ובחר "שינוי מיקום Z". הגדר את פרוסת הרקמה הראשונה 0 מיקרומטר. <li> כדי לשמור את השחזור, בחר קובץ> שמירת קובץ נתונים כ. חוסכים אחרי כל יבוא קובץ, כך התאוששות אם טעות הוא עשתה היא קלה כמו הקובץ הקודם טעינה מחדש.
- כדי להוסיף פרוסת הרקמה הבאה לשחזור, לחץ על קובץ> צרף לתצוגה. בחר את הקובץ הזאתי מחתה ליצורף, וסמן את התיבה 'המיזוג'.
- בצע שלב 1.4.3 להתאים את מיקום Z של קובץ זכר המיובא החדש שוב. בחר את קווי המתאר ימין ועל שמאל חדש שנוסף רק בחלון הראשי כדי למנוע העברת העקבות האחרות. להגדיר כל קובץ עקבות רצוף עד 50 מיקרומטר ממיקום Z של קווי המתאר הקודמים עבור 50 מיקרומטר חלקים. (גובה ראשון: Z = 0, גובה שני: Z = 50, שלישי גובה: Z = 100, וכו ')
- כדי להתאים את X, Y מיקום של קווי המתאר וסמנים שנבחרו, לחץ על 'אפשר תרגום עם העכבר' כפתור ולגרור את קווי המתאר להתיישר עם קווי המתאר הרקמה הקודמים. לשמור על שניהם את קווי המתאר ימין ועל השמאל של העקבות הנוכחיות שנבחרוכדי לאפשר תנועת סינכרוני.
- כדי לסובב את העקבות בכיוון השעון או נגד כיוון השעון בשורת סמני קו האמצע, בחר כפתור "Z-ציר הסיבוב '. כדי להעיף קווי המתאר פני ציר Y (אם גובה השמאל הוא מהימין) בחר שני קווי המתאר וסמנים מיובאים, לחץ לחיצה ימנית, בחר 'סיבוב זווית הגדר', והזן '180' ל'סיבוב Y '.
- ודא שסמני החדרים וקו אמצע מיושרים הטובים ביותר לפני שמירת קובץ השחזור, כמו בשלב 1.4.4.
- חזרו על שלבי 1.4.5 ל1.4.9 לכל פרוסה רקמה שלאחר מכן, עד שכל יובאו ומיושר כהלכה.
- כדי להציג נתונים בנפח של השחזור הסידורי, לחץ ניתוח> 'סמנים ואזור ניתוח' ובחר 'סיכום 3D קונטור ". בחר את כל קווי המתאר בלוח יד השמאל ולאחר מכן לחץ על לחצן 'הדמיית 3D' כדי להציג את שחזור 3D הסופי.
2. אדם: ניתוח של סביב חדרי המוח סלולרי יושרה ו3D דוגמנות של חדר לרוחב
2.1) ניתוח אדם MRI נתונים
הערה: פרוטוקולים מפורטים ליצירת שחזורי תמונת 3D וכימות נפח של חדרים לרוחב ולהעריך את שינויי נפח לאורך זמן באמצעות ניתוח כיסוי אורך. חשוב לציין כי בעקביות אוסף MR נתונים (למשל, מכונה וכוח המגנט, עובי סעיף, התמצאות ורזולוציה) ועיבוד שלאחר הרכישה הם קריטריונים חשובים ביותר להכללה של ערכות נתונים 20.
- פילוח חדרית
הערה: ITK / הצמד משמש למגזר חדרי הלב מתמונות MR-T1 משוקלל ברזולוציה גבוהה. לחלופין, ניתן להשתמש בתוכנה חופשית אחרת כגון Freesurfer.- להרחיב ITK / הצמד, קובץ> תמונה בגוונים אפורים להרחיב. בחר את קובץ רצוי ופתוח כקובץ .nii (קובץ NITFI).
- לגלול כל ענתמטוס omical, הפרעות חדרית ציינו (אזורי stenosed, קרנות זמניות גדולות או קטנות, וכו '). בארגז כלי ראשי לחצו על 'נחש ROI כלי'. לחץ על 'מגזר 3D'. בחר באפשרות "אזור העוצמה".
- לחץ על 'תמונת preprocess'. בחירה 'מעל', שיכלול אזורים מתחת לסף מסוים עוצמה על מנת להדגיש את ההחזר על ההשקעה בלבן. להקליט בעוצמה מקסימלית באמצעות סרגל גלילה. הגדר את הסף 15% מעצמה מקסימלית (שיא ערך זה). הגדר פרמטר חלקות עד 10. לחץ על 'אישור', ולאחר מכן "הבא".
- להוסיף 10-12 קטן (גודל 2) "בועות" לכל חדר: שני בקרן הקדמית הקדמית, שבעה באופן שווה ברווח לאורך המשטח מעולה של גוף החדר לרוחב, אחד בקרן העורפית ואחד בקרן הזמנית של חדר לרוחב. 'בחר פרמטרים' וכוח עקמומיות מוגדר 0.4. לחץ על סמל Play כדי להתחיל אבולוציה גובה פעילה.
- לחץ על 'עדכן Mesh "לדמיין פני השטח; לבדוק 'עדכון אוטומטי'. תפסיק פילוח כאשר כל התחומים של החדר לרוחב כלולים באזור של העניין (ROI). הימנע הכללה של החדר השלישי. לחץ על 'סיום'.
- ידני לערוך את התמונה אם יש צורך להסיר אזורים לא רצויים על ידי השיטות הבאות (בדרך כלל צריך למחוק דליפת חדר שלישית). ידני להשתמש בכלי '3D האזמל "כדי להסיר אזורים עודפים או ידני להשתמש בכלי' המברשת 'עם' לייבל נקה 'כתווית ציור הפעילה למחוק כל הכללה מעבר החזר על השקעה.
- שמירת תוצאות פילוח כתמונת .nii (פורמט הקובץ 'ניפטי').
- כדי להשיג כולל חדר נפח, בחר 'פילוח> נפח' וסטטיסטיקה; להשיג את הנפח הכולל של החדר באמצעות תווית צבע סט.
- ייצוג אורך של רוחב חדרי הלב מMRIScans
הערה: שימוש בתוכנת מנגו, ROIs אורך הם כיסו איכותיים וכמותית להפגין שינויים בחדר נפח בתוך נושאים לאורך זמן.- מנגו פתוח. לחץ ROI טען קובץ> של נקודת החזר על השקעה בפעם הראשונה (בסיס) כירוק. קובץ> החזר על השקעה של עומס נקודת זמן החזר על השקעה השנייה אדום. להציל את הכיסוי אורך על ידי בחירת קובץ> שמירה בשם; להקצות לכל תמונה כ'name_ קובץ [גיל נקודת זמן ראשון] - [גיל נקודת זמן השני] .nii '.
- פתח ITK-SNAP. פתח מחדש את ההחזר על ההשקעה בשילוב כ'תמונה בגווני אפור ', על ידי בחירה> טען פילוח מקובץ ROI תמונה> שילוב. כדי לקבל נתונים בנפח אורך לרוץ הבא: פילוח> הנפח וסטטיסטיקה> לייבל 1 (אדום) = הרחבת נפח; תווית 2 (ירוק) = היצרות נפח; תווית 3 (כחול) = בסיס נפח.
2.2) רקמות סביב חדרי המוח אנושיים הכנה וניתוח
- הוראות בטיחות לעבודה עם רקמה אנושית
- להשיג appropהדרכת בטיחות riate (, כמובן למשל. שמקורן בדם פתוגנים).
- הקפד על אמצעי זהירות בטיחות סטנדרטית (אוניברסלית). ללבוש כפפות. לשנות כפפות לפני שתיגע בכל ציוד או משטחים נפוצים שאינם חד פעמיות. תווית כל פריטים באופן שיגרתי טיפלו בעבודה עם רקמה אנושית עם כינויים "שימוש רקמה אנושי".
- עקוב שיטות טיהור לכל פריטי הפנייה רקמה אנושית. להלבין את כל הנוזלים המזוהמים למינימום של 24 שעות לפני הסילוק, טיפול במשטחים מזוהמים במגבת ספוגה אקונומיקה (למעלה ספסל למשל,) או על ידי הצבת אובייקט ישירות באקונומיקה (למשל מלקחיים).
- הכן תכנית מגירה למגע עם רקמה אנושית ישירות על עור, אשר עשוי לכלול שריה מגבת נייר באקונומיקה ומחזיק על האזור הפגוע (5-10 דקות).
- השתמש סילוק פסולת מתאים לכל הפריטים הבאים במגע עם רקמה אנושית.
- לרוחב חדר שלם הר הכנה
- Beginning עם אונה שלמה (קבוע בפורמלין 10% ושטף ביסודיות עם 0.1 M PBS), לחתוך קטעי 1.5 סנטימטרים עובי עטרה לאורך כל חצי הכדור באמצעות סכין גדול.
הערה: כל פרוטוקולי הקיבעון דורשים אימות נוגדן לפני. - סעיפי תווית מלפנים לאחור מתחילים עם החלק ראשון מכיל את החדר לרוחב. השתמש מערכת תיוג אלפא נומרי, תיוג פרוסות עם אותיות (קדמי לאחוריים) וסעיף קטן עם מספרים (מלמעלה למטה). למנוע שיבוש משטח ependymal.
- באמצעות אזמל מייקר, לנתח קיר חדר 1 סנטימטר עמוק, שמירה רציפה סעיף אחד לקיר לרוחב כולו. לחלק קיר כנדרש כדי ליצור חלקים בגודל המתאים למכתים גם. סעיף חריץ בצד שני של קיר חדר לזהות נטייה מעולה / נחותה.
- לבצע אחזור אנטיגן על ידי דוגרים סעיפי רקמות ב 10 חיץ נתרן ציטרט מ"מ (pH 6.0) בשעה 100 מעלות צלזיוס במשך 10-20 דקות באמצעות חם כפולr (זמן דגירה אופטימלי נקבע באופן אמפירי). לשטוף 3 פעמים PBS / 0.1% Triton X-100 (PBS-טק).
- בלוק בסרום 10% סוס באמצעות PBS / PBS-TX עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
- דגירה עם נוגדנים עיקריים עבור 48 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. כדי להמחיש את קיר חדר בטנה, immunostain mounts השלם עם שילובי הנוגדן הבאים: אנטי-β-קטנין עכבר (1: 250); עז אנטי GFAP (1: 250); אנטי-AQP4 ארנב (1: 400).
- לבצע את כל השלבים הבאים בחושך. יש לשטוף את הרקמה 3 פעמים ב PBS, דגירה עם נוגדנים משני (1: 500) עבור 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס או 2 שעות בטמפרטורת חדר, ולשטוף עוד 3 פעמים PBS. דגירה רקמה בDAPI במשך 7 דקות בטמפרטורת חדר אחריו עם עוד 3 שטיפות בPBS.
- הכן רקמות לנתיחה סופית על ידי כיסוי צלחת תחתית שעווה עם parafilm. מלא צלחת עם PBS, מקום רקמה בצלחת באמצעות מלקחיים עדינים, הימנעות ליצור קשר עם קיר ependymal.
- תחת מיקרוסקופ לנתח, בתקיפות secuמחדש רקמות בפינים הצד באמצעותה. עם 22.5 מעלות סכין דקירת מייקר, ליצור מקטעים דקים אחידים (כ -300 מיקרומטר עבים) של קיר חדר לרוחב. לחלקים או חלקים עם עקמומיות קשה גדולים, חתוך לקוביות קטנות לפני החיתוך למקטעים סופיים להרכבה ומיקום פתק.
- בזהירות להניח בצד ependyma סעיף גזור לעלות על שקופית באמצעות מלקחיים עדינים, בשים לב למיקום וכיוון אזוריים בשקופית. לכסות רקמה עם שכבה דקה של aquapolymount, לטפל כדי למנוע בועות. מניחים coverslip על רקמה, להוסיף aquapolymount נוסף לפי צורך כדי למלא את כל פערים בcoverslip.
- הנח סעיפים רכובים כהה ויבש במשך 2-3 ימים בטמפרטורת חדר. חנות בslidebox על 4 מעלות צלזיוס.
- Beginning עם אונה שלמה (קבוע בפורמלין 10% ושטף ביסודיות עם 0.1 M PBS), לחתוך קטעי 1.5 סנטימטרים עובי עטרה לאורך כל חצי הכדור באמצעות סכין גדול.
- אימונוהיסטוכימיה וניתוח היסטולוגית
- באמצעות מיקרוסקופ confocal כדי להציג אימונוהיסטוכימיה ניאון, להגדיר את מישור מוקד ההדמיה על פני השטח החדר, כפי שנקבע על ידי o השימושו β-קטנין (סמן לחלבונים צומת adherens הפסגה של תאי ependymal). להתוות אזורי כיסוי תא ependymal וastrogliosis משטח (מכתים GFAP בשטח חדר).
- למסמך ומונטאז 'כל שטח החדר, להשתמש בתמונות חופפות לכיסוי כל פני השטח. כדי ליצור מונטאז 'של תמונות סדרתי, לפתוח Adobe Photoshop. השתמש קובץ פריסת מיזוג תמונות> אינטראקטיבית אוטומציה>> כדי לבחור תמונות כדי כיסוי, ביצוע התאמות ידניות במידת צורך.
- צור שכבה חדשה כדי לעקוב אחר מונטאז 'כדי ליצור ייצוג קריקטורה של כיסוי תא ependyma שלם או דבק משטח חדר. חזור לכל שקופית או החזר על השקעה. לאסוף את כל החלקים לשחזר מפה של קיר חדר וקישור למתאים אזור בשחזור MRI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מעקב קווי המתאר של החדרים לרוחב העכבר מבוססים על 50 מיקרומטר סעיפי עטרה immunostained ושחזורי 3D (איור 3) מאפשר נפח הנתונים שנאספו בפרדיגמות ניסוי שונות באמצעות עכבר כמערכת מודל למחלה או פציעה. קריטי להליך זה הוא ההדרה של אזורים שבם קירות חדר לרוחב לדבוק זה בזה. על ידי subsegmenting אזורים של החדרים ומייעדים צבע שונה לכל אזור (איור 3 ג), יכולים להיות נענו סעיפים רציפים ונפח אזורי וכולל ניתן לחשב מsubsegments הידור.
ניתן לבצע מחקרים דומים באמצעות סריקות MRI של המוח יחד עם הפילוח חצי אוטומטי (ITK-SNAP) של החדרים לרוחב להדמיות 3D. לזיווג ישיר של כרכי חדר וניתוח רקמות סביב חדרי מוח, מראש או לאחר המוות סריקות MRI מפולחות ומיושרים ליצירת שחזורי 3D (
איור 1: ביצוע פילוח חדר לרוחב באמצעות ITK / הצמד נחש ROI הכלי () 'בועות' מתווספים לחדרים לרוחב. (ב) "בועות" להרחיב במהלך האבולוציה גובה פעילה. פילוח (C) יושלם כאשר החדר לרוחב כל מלא. (הטיפול נלקח כדי למנוע את חדר 3 rd.)
איור 2: קיר חדר לרוחב לנתיחה אדם (
איור 3: איתור ושחזור 3D של חדרי הלב עכבר לרוחב (סעיף מוח עכבר העטרה כוללים חדרים לרוחב, שתוארו על ידי תאי ependymal S100β-immunoreactive (*, רוחב חדרי הלב; הסוגר, אזור של adhe. שיאון; סרגל קנה מידה, 500 מיקרומטר). חדרים לרוחב (B) עכבר הם איתרו כ'קווי המתאר 'ומסודר כמו סעיפים-משנה מפולח, למעט אזורים של הידבקות תוך חדרי להתערב בניתוח נפח. שחזור (C) 3D של קווי המתאר חדר לרוחב. צהוב, קווי המתאר של המוח כולו משתרע על פני האזור של עניין המכיל את החדרים לרוחב נפח.
איור 4: פילוח חדר לרוחב מבוסס MRI תמונות () MR הם התאספו. חדר לרוחב (B) מוגדר כהחזר על השקעה (אדום). שחזור תמונה (C) 3D מאפשר לכימות נפח והדמיה איכותית של חדר לרוחב.
מודעה / 52,328 / 52328fig5highres.jpg "/>
איור 5: הערכה של הרחבת חדר אורך אורך בדיקות MRI ממספר רבה של נקודות יכול להיות מיושרת ומעולף לדמיין ולכמת הרחבת נפח חדר בנושאים לאורך זמן.
איור 6: הערכה אימונוהיסטוכימיים ומיפוי האזורי של פני השטח אנושיים לרוחב חדר () תחומי תאי ependyma שלמים, שתוארו על ידי צביעת β-קטנין, להראות מראה מרוצף (כוכבית) ומתוחם על ידי קו מקווקו מאזורים של astrogliosis על פני השטח חדר (GFAP + צביעה). תמונות confocal סידוריים (ב ') הם כיסו ליצור מונטאז אזורי ולייחס באמצעות Adobe Photoshop לייצוג קריקטורה של ארגון סלולארי על פני השטח החדר. (ג) קריקטורה שלמונטאז תמונה ממופה למשטח חדר במקביל שחזור חדר 3D MRI מבוסס. (בר סולם (), 40 מיקרומטר; בר סולם (ב '), 1 מ"מ)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מציגים כלים ופרוטוקולים שניתן להשתמש כדי להעריך את היושרה של חדרי המוח של המוח בעכברים ובבני אדם. כלים אלה, לעומת זאת, יכולים להיות מיושמים גם למבנים אחרים במוח או מערכות איברים שעוברים שינויים עקב פציעה, מחלה, או בתהליך של הזדקנות 14,21,22. האסטרטגיות שהוצגו נצלו תוכנה המאפשרת היישור של רצפי MRI חתך אורך ורוחב כדי ליצור ייצוגי נפח 3D של אזורים או מבנים של עניין ספציפיים. רצפי האורך MRI מאפשרים אוסף של שינויי נפח 3D המתרחשים לאורך זמן וניתן להאריך לכלול מוח כולל מבנים אחרים במוח (למשל, שטחי חומר לבנים גרעין subthalamic 23 או כפיס מוח נפח, לחדר לרוחב לכלל יחסי נפח המוח, ו / או באמצעות הדמיה מותח משוקלל דיפוזיה). יחד, ניתוח מקיף של שינויים מבניים במוח יכול להתבצע. סופו של דבר,כדי להעריך הקשורות לגיל והקשורים למחלות שינויים מבנים במוח אוסף של טכניקות הדמיה multimodal דרושים כדי לספק את התמונה מדויקת ביותר של מצב בריאות מוח 24. תיעוד ואיסוף של נתונים מבניים קריטיים, יחד עם השתנות נושא-נושא, והמגוון של השתנות פני נושאים, יכולים באופן אידיאלי לשמש כדי ליצור אטלסי MRI גבוה במיוחד תחום האבחון הטוב ביותר המדריך הקליני של רקמה בבריאות או מחלה.
כמה שלבים קריטיים חשובים לציין כדי להקטין השתנות רכישה ועיבוד בין ובתוך ערכות נתונים נושא. באופן אידיאלי להשיג רצפי נתונים מתאימים, יש להשתמש באותו סוג הסורק ורצף MRI לאורך כל תקופת המחקר. רקמת מוח שלאחר המוות היא לעתים קרובות באיכות משתנה; גורמים קריטיים כגון סיבת מוות, מרווח שלאחר המוות, באיכות של זלוף, ומשך זמן בכל מקבע עשויים להשפיע יעילות מכתימה ואת הצורך בפרוטוקול אחזור אנטיגן. בנוסף, הגודל של המוח האנושי דורש סעיפי הפרוסה מרובים עם כל פרוסה דורשת מניפולציה נוספת כדי להשיג רקמה המכילה את האזורים של עניין. לכן, זה קריטי, כי המיקום והכיוון של כל קטע מסומן בבירור ונרשמו. סופו של דבר, הבעיה העיקרית עם ניתוח שלאחר המוות של רקמות היא בדיוק זה - זה שלאחר המוות - ולכן מספק רק תצוגת תמונת מצב של הרקמה בסוף החיים. טכניקות הדמיה multimodal משופרות נדרשת לניתוח של שינויים במבנה המוח ומידע Morpho-פונקציונלי עם רזולוציה סלולרית בזמן אמת.
מחקרי עכבר יאפשר חקירה של משתנה מצב האנושי על ידי משתנה ולא מציגים הרבה מהקשיים מצאו בעבודה עם רקמה אנושית. מחקרי עכבר משמשים מודל מחלה או פציעת אדם באמצעות ניתוח של דינמיקה מבנית סיבתי עשויים להציע שיפורים ולאל-מחלה המודלidation. עם זאת, יש לציין הבדלי מינים ספציפיים. בניתוח של חדרים לרוחב שלנו, חשוב לשים לב כי עכברים לשמור נישה תאי גזע פעילה לאורך הקיר לרוחב של חדרים לרוחב ונובעים תיקון משובי תא בתיווך של חדר בטנה מתרחשת במקרים של אובדן תא ependymal הצנוע, כ מצא בעכברים בגיל או כאשר denudation תא ependymal מוגבל מתרחש באמצעות חשיפה של ependyma לneuraminidase 19. לעומת זאת, בני אדם לא לשמור על נישה תאי גזע חזקה לאורך קירות חדר לרוחב 25-27 וקטן, אם בכלל, התחדשות היא סבירה. בניגוד לעכברים בגיל, בני אדם בגילים להראות astrogliosis נרחב על פני השטח החדר הקשורים הרחבת חדר 6. רמה זו של denudation ו'צלקות 'של חדר הרירית יכולה להיות מודל בעכבר באמצעות neuraminidase ללערטל חדר הרירית של תאי ependymal 6,28. בנוסף, חשוב להכיר הבעכברים-שמר ביבר לא חווה זיהומים, מחלה או טראומה, מציג הרבה היסטוריה רפואית שונה מרוב בני אדם. יתר על כן, עכברים בדרך כלל לא מראים מחלה ניוונית של מערכת עצבים הקשורים בגיל, ventriculomegaly או דבקה סביב חדרי מוח. לכן, כדי לבחון פנוטיפים אלה שיש להם להיות מודל. בסופו של הדבר לא מודל חיה יכול לשחזר באופן מלא את ontogeny, הפתופיזיולוגיה, ומורכבות סימפטומטי של מחלות אנושיות ומגבלות אלה צריכים להיות מוכרות ותקשרו כראוי.
לסיכום, אנו מציגים טכניקות ופרוטוקולים להעריך כרכי חדר לרוחב בעכבר ואדם. יכול להיות שניתנו חדרי הלב ב3D וניתוח אורך מאפשר אוסף של שינויי נפח חלל ובזמן. בנוסף, שימוש ברקמת המוח לזווג אנו מדגימים כיצד סלולארי תכונות יכולה להיות קשורים לשינויים בהיקפי חדר. התוצאות האחרונות הוא הראה רמות גבוהות של aquaporin-4 ביטוי בתחומי periventricuדבק Lar מציע בצקת על פני השטח החדר. החקירות לכן עתיד זיווג FLAIR-MRI עם היסטולוגיה רקמה תשפר את ההבנה של CSF והחלפת נוזל ביניים שלנו, ולספק מידע קריטי על בריאות מערכת חדר ואיך ההידרדרות שלה משפיעה על תפקודי מוח שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 21600-069 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Use at 4% in PBS, 4 °C |
| Normal Horse Serum | Life Technologies | 16050 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Triton X-100 (TX) | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.1% in PBS (v/v) |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Imager.M2 | |
| Camera | Hamamatsu | ORCA R2 | |
| Microscope Stage Controller | Ludl Electronic Products | MAC 6000 | |
| Stereology software | MBF Bioscience | Stereo Investigator 11 | |
| Stereology software | ImageJ/NIH | NIH freeware | |
| 3D Reconstruction software | MBF Bioscience | Neurolucida Explorer | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | |
| MRI Software | |||
| Freesurfer | https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall | Segmentation and Volume | |
| ITK-Snap | http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php | Segmentation and Volume | |
| Multi-image Analysis GUI (Mango) | http://ric.uthscsa.edu/mango/ | Longitudinal overlay | |
| Whole Mount Equipment | |||
| 22.5° microsurgical straight stab knife | Fisher Scientific | NC9854830 | |
| parafilm | |||
| wax bottom dissecting dish | |||
| pins | |||
| fine forceps | |||
| aquapolymount | |||
| Dissecting Microscope | Leica | MZ95 | |
| Whole Mount Antibodies | |||
| mouse anti-b-catenin | BD Bioschiences, San Jose, CA, USA | 1:250 | |
| goat anti-GFAP | Santa Cruz Biotechnology | 1:250 | |
| rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4) | Sigma-Aldrich | 1:400 | |
| Coronal Antibodies | |||
| Anti-S100β antibody | Sigma-Aldrich | 1:500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D-1306 | 10 µg/ml in PBS |
References
- Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 55-73 (2010).
- Johanson, C., et al. The distributional nexus of choroid plexus to cerebrospinal fluid, ependyma and brain: toxicologic/pathologic phenomena, periventricular destabilization, and lesion spread. Toxicol Pathol. 39, 186-212 (2011).
- Roales-Bujan, R., et al. Astrocytes acquire morphological and functional characteristics of ependymal cells following disruption of ependyma in hydrocephalus. Acta Neuropathologica. 124, 531-546 (2012).
- Cserr, H. F. Physiology of the choroid plexus. Physiol Rev. 51, 273-311 (1971).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4, 147ra111 (2012).
- Shook, B. A., et al. Ventriculomegaly associated with ependymal gliosis and declines in barrier integrity in the aging human and mouse brain. Aging Cell. , (2013).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342, 373-377 (2013).
- Fazekas, F., et al. Pathologic correlates of incidental MRI white matter signal hyperintensities. Neurology. 43, 1683-1689 (1993).
- Meier-Ruge, W., Ulrich, J., Bruhlmann, M., Meier, E. Age-related white matter atrophy in the human brain. Ann N Y Acad Sci. 673, 260-269 (1992).
- Resnick, S. M., Pham, D. L., Kraut, M. A., Zonderman, A. B., Davatzikos, C. Longitudinal magnetic resonance imaging studies of older adults: a shrinking brain. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 23, 3295-3301 (2003).
- Sener, R. N. Callosal changes in obstructive hydrocephalus: observations with FLAIR imaging, and diffusion MRI. Comput Med Imaging Graph. 26, 333-337 (2002).
- Sze, G., et al. Foci of MRI signal (pseudo lesions) anterior to the frontal horns: histologic correlations of a normal finding. AJR Am J Roentgenol. 147, 331-337 (1986).
- Tisell, M., et al. Shunt surgery in patients with hydrocephalus and white matter changes. Journal of Neurosurgery. 114, 1432-1438 (2011).
- Valdes Hernandez Mdel, C., et al. Automatic segmentation of brain white matter and white matter lesions in normal aging: comparison of five multispectral techniques. Magn Reson Imaging. 30, 222-229 (2012).
- Shook, B. A., Manz, D. H., Peters, J. J., Kang, S., Conover, J. C. Spatiotemporal changes to the subventricular zone stem cell pool through aging. The Journal of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 32, 6947-6956 (2012).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
- Luo, J., Daniels, S. B., Lennington, J. B., Notti, R. Q., Conover, J. C. The aging neurogenic subventricular zone. Aging Cell. 5, 139-152 (2006).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. J Neurosci. 28, 3804-3813 (2008).
- Marcus, D. S., Fotenos, A. F., Csernansky, J. G., Morris, J. C., Buckner, R. L. Open access series of imaging studies: longitudinal MRI data in nondemented and demented older adults. J Cogn Neurosci. 22, 2677-2684 (2010).
- Giorgio, A., De Stefano, N. Clinical use of brain volumetry. J Magn Reson Imaging. 37, 1-14 (2013).
- Caspers, S., et al. Studying variability in human brain aging in a population-based German cohort-rationale and design of 1000BRAINS. Front Aging Neurosci. 6, 149 (2014).
- Keuken, M. C., et al. Ultra-high 7T MRI of structural age-related changes of the subthalamic nucleus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 4896-4900 (2013).
- Marti-Bonmati, L., Sopena, R., Bartumeus, P., Sopena, P. Multimodality imaging techniques. Contrast Media Mol Imaging. 5, 180-189 (2010).
- Bergmann, O., et al. The age of olfactory bulb neurons in humans. Neuron. 74, 634-639 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Wang, C., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21, 1534-1550 (2011).
- Carmen Gomez-Roldan, D. el, M,, et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507, 1571-1587 (2008).
