Introduction
Een ependymale celmonolaag lijnen het ventriculaire systeem van de hersenen leveren bi-directionele barrière en transport functies tussen de cerebrospinale vloeistof (CSF) en interstitiële vloeistof (ISF) 1-3. Deze functies helpen de hersenen giftige stof-vrij en in fysiologische evenwicht 2,3 bewaren. Bij mensen verlies van delen van deze ommanteling met beschadiging of ziekte lijkt niet te leiden tot regeneratieve vervanging zoals in andere epitheliale bekledingen; eerder verlies van ependymale cel dekking lijkt te resulteren in periventriculaire astrogliose met een vlechtwerk van de astrocyten die regio's ontdaan van ependymale cellen op het ventrikel oppervlak. Ernstige consequenties belangrijke CSF / ISF uitwisseling en klaring mechanismen worden voorspeld met verlies van deze epitheellaag 1,2,4-7.
Een gemeenschappelijk kenmerk van menselijke veroudering wordt vergroot laterale ventrikels (ventriculomegaly) en bijbehorende periventricular oedeem als OBSERVed door middel van MRI en vocht-verzwakte inversie herstel MRI (MRI / FLAIR) 8-14. Om het verband tussen ventriculomegaly en de cellulaire organisatie van het ventrikel bekleding te onderzoeken, werden humane postmortem MRI sequenties gekoppeld met histologische preparaten van laterale ventrikel periventriculaire weefsel. In geval van ventriculomegaly waren belangrijke werkgebieden gliosis ependymale cel dekking vervangen langs de laterale ventrikel wand. Als ventrikel expansie niet werd gedetecteerd door MRI-gebaseerde volume analyse de ependymale cel lining was intact en gliosis niet langs de ventrikel lining 6 gedetecteerd. Deze combinatorische aanpak vormt de eerste uitgebreide documentatie detaillering veranderingen in de cellulaire integriteit van de laterale ventrikel voering met wholemount bereidingen van delen of het gehele laterale ventrikel muur en 3D modelleren van ventrikel volumes 6. Verscheidene ziekten (ziekte van Alzheimer, schizofrenie) en letsels (traumatisch hersenletsel)tonen ventriculomegaly als een vroege neuropathologische functie. Denudation gebieden van de ependymale celbekleding daardoor zou worden voorspeld te interfereren met normale ependymale celfunctie en afbreuk doen aan de homeostatische balans tussen CSF / ISF vloeistof en opgeloste stof uitwisseling. Zo zal een grondiger onderzoek van de wijzigingen in het ventriculaire systeem, de cellulaire samenstelling, en het gevolg onderliggende of aangrenzende hersenstructuren uiteindelijk beginnen om meer over de neuropathologie geassocieerd met ventrikel uitbreiding onthullen.
Het ontbreken van multimodale beeldgegevens, inzonderheid longitudinale gegevensreeksen, samen met de beperkte toegang tot overeenkomstige histologische weefselmonsters maakt analyse van menselijke hersenen pathologieën moeilijk. Modelleren fenotypes gevonden in menselijke veroudering of ziekte kan vaak worden bereikt met muismodellen en diermodellen uitgegroeid tot een van onze beste middel om vragen over de ziekte bij de mens initiatie en progressie te verkennen. Verschillende studies ingezonde jonge muizen hebben de cytoarchitecture van de laterale ventrikel muren en de onderliggende stamcellen niche 4,7-15 beschreven. Deze studies zijn uitgebreid tot 3D-modellering en cellulaire analyse van het ventrikel muren onder door veroudering 6,15. Noch periventriculaire gliosis noch ventriculomegaly worden waargenomen in de leeftijd van muizen, in plaats van muizen vertonen een relatief robuuste subventicular zone (SVZ) stamcel niche onderliggende aan een intacte ependymale cel voering 6,15. Aldus opvallende species-specifieke verschillen bestaan in zowel het algemene onderhoud en de integriteit van het laterale ventrikel bekleding gedurende het verouderingsproces 6,15. Daarom, om optimaal gebruik muizen bij de mens omstandigheden ondervragen verschillen tussen de twee soorten moeten worden gekarakteriseerd en passend beschouwd in elk model paradigma. Hier presenteren we procedures longitudinale veranderingen in de laterale ventrikels en de bijbehorende periventriculaire weefsel in zowel mensen als m evaluerenouse. Onze procedures omvatten 3D-rendering en volumetrie van zowel muis en mens ventrikels, en het gebruik van immunohistochemische analyse van hele berg voorbereidingen van periventricular weefsel om zowel de cellulaire organisatie en structuur karakteriseren. Samen deze werkzaamheden een middel om veranderingen in het ventriculaire stelsel, periventriculaire weefsel te karakteriseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Animal procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van Connecticut IACUC en voldoen aan de NIH richtlijnen. Menselijk weefsel en data-analyse en procedures waren in overeenstemming met en door de Universiteit van Connecticut IRB goedgekeurd en voldoen aan de NIH richtlijnen.
1. Mouse: Analyse van periventriculaire Cellular Integriteit en 3D modellering van de laterale ventrikel
1.1) Voorbereiding van de Mouse laterale ventrikel Muur Whole Mounts
- Bereid muis laterale ventrikel hele mounts voor immunohistochemie (IHC), zoals eerder beschreven 16,17.
1.2) Immunohistochemie voor laterale ventrikel Analyse
- Fix en sectie muis hersenweefsel zoals eerder beschreven 18,19.
- Kortom, flush muizen transcardiaal met normale kamertemperatuur zoutoplossing, totdat organen gewist (aangegeven door een bleke kleuring), gevolgd door kamertemperatuur 4% paraformaldehyde(PFA) in 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot weefsel is verstijfd.
- Verwijder de hersenen uit de schedel. Gebruik iris dissectie schaar te snijden van de basis van de schedel langs de pijlnaad.
- Expose schedel en de hersenen te verwijderen met een pincet. Dompel de hersenen in 4% PFA fixatief overnacht bij 4 ° C. Was daarna 3 maal gedurende 20 min met PBS.
- Bereid seriële secties voor immunohistochemie en volume analyse.
- Met behulp van een microchirurgische scalpel een kleine insnijding in lengterichting langs de cortex van de linker hersenhelft om de identificatie van de linker hemisfeer toestaan van de rechter hersenhelft als drijvende secties immunostained.
- Encase vaste hersenen in 3% agarose voor extra structurele steun tijdens vibratome snijden. Warm 3% agarose in gedestilleerd water (w / v) tot het volledig opgelost met behulp van een magnetron of een hete plaat.
- Met een scheermesje, verwijder het caudale gedeelte van de hersenen op het cerebellum met eencoronale snede, waardoor een vlak en glad oppervlak. Breng superlijm aan het weefsel podium en de positie van de hersenen op de nieuw te snijden oppervlak met de olfactorische bollen naar boven.
- Wanneer vloeibare agarose oplossing afgekoeld tot een temperatuur juist warm aanvoelen toepassen gelijkmatig over de hersenen naar de gehele hersenen volledig omsluiten. Laat de agarose stollen.
- Sectie agarose ingekapseld hersenen coronaalwaarts op vibratome in 50 urn secties met secties in serie geplaatst in een 24-wells plaat met PBS om de volgorde behouden.
OPMERKING: Over het algemeen 12 putten worden gebruikt voor een hersenen, met een collectie van het weefsel begint 5 secties voorafgaand aan het zien van de opkomst van de laterale ventrikels begint met goed A1, bewegen numeriek tot B6 en fietsen terug naar A1. Zo kunnen meerdere onderscheiden gedeelten van dezelfde hersenen binnen dezelfde goed te verwerken. Voor laterale ventrikel volume analyse, weefsel collectie opgehouden toen de laterale ventrikels en de derde ventrikel samenvoegen, wat resulteert in ongeveer 3 secties per well of 36 secties totaal. - Zuig het PBS met behulp van een overdracht pipet aangebracht met een 20-200 ul micropipet tip om ervoor te zorgen dat de drijvende secties zijn niet per ongeluk opgezogen. Block en doorlaatbaar drijven secties 10% serum, 0,1% Triton X-100 (TX) in PBS (PBS-TX) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Gebruik 300 ul oplossing per put te dekken vrij zwevende weefselcoupes in een 24-wells plaat en voer alle incubaties van secties in een schommelende plaat.
- Zuig de blokkerende oplossing en incubeer secties met primaire antilichamen in PBS-TX overnacht (ten minste 12 uur) bij 4 ° C. Voor ventrikel volume sporen met behulp van coronale secties, gebruik anti-S100β antilichaam aan ependymale cellen te labelen.
- Zuig primaire antilichaam oplossing, en was secties 3 keer voor 10 minuten elk met PBS-TX.
- Incubeer secties donker gedurende 1 uur bij kamertemtuur met fluorescerende secundaire antilichamen bij concentraties van 1: 1000 in 10% serum, PBS-TX. Houd secties in het donker voor alle overige incubatiestappen.
- Zuig secundair antilichaam-oplossing en incubeer secties met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole in PBS (DAPI, 10 ug / ml) gedurende 5 min bij celkernen tegenkleuring. Zuig het DAPI oplossing en spoel secties 3 keer voor 10 minuten elk met PBS.
- Mount secties serieel op dia's met behulp van de corticale merk te behouden links versus rechter hersenhelft oriëntatie. Drogen secties in het donker en vervolgens dekglaasje door een dunne laag van fixeermiddelen aan de dia en plaats voorzichtig een glazen dekglaasje erop. Laat afgedekt dia nacht drogen bij kamertemperatuur.
1.3) laterale ventrikel Segmentatie voor 3D Reconstructies
OPMERKING: Voer het opsporen van de laterale ventrikels met mapping software op een rechtopstaande epifluorescentie Micrpe met een geautomatiseerde fase en een digitale CCD camera voor fluorescentiedetectie.
- Schakel de fluorescentiemicroscoop apparatuur en lanceren mapping software in fluorescentie mode. Open 'Weergaveopties' om de juiste werkbalken en docking instrument panelen die nodig zijn voor het opsporen van laden. Opties> Weergave Opties> Bureau-accessoires en selecteer het 'Hoofd' en werkbalken 'Marker'. In hetzelfde menu, selecteer 'Camera Histogram', 'Multichannel Control', 'Camera-instellingen' en 'Image Acquisition' onder 'Docking Tool Panels.'
- Observeer begin van de ventrikels gebaseerd op sterke S-100β fluorescentie dat ependymale cellen die de laterale ventrikel lijn labels. Bepaal het eerste stuk weefsel dat de laterale ventrikels.
- Maak een nieuw bestand en wijst een referentiepunt voor het podium beweging door te klikken in de afbeelding raam boven de linker laterale ventrikel. Kijk voor de kleineincisie te oriënteren links van rechter hersenhelft. Houd het referentiepunt op een consistente locatie ten opzichte van de laterale ventrikels over het opsporen van bestanden om te helpen bij het importeren contouren voor seriële wederopbouw.
- Kies de juiste vooraf ingestelde contour soort van de contour drop-down menu, bijvoorbeeld, 'Left laterale ventrikel.' Gebruik een unieke kleur voor elk van de linker en rechter laterale ventrikel traces. Als er wijzigingen in de naam en de kleur contour vereist zijn, gaat u naar Opties> Weergave Voorkeuren> Contouren, dan wijzigt de namen van de contour kleuren of selecteer 'Toevoegen Contour Type'.
- Met de 'Left laterale ventrikel' contour geselecteerd, klikt u langs het apicale oppervlak van de ependymale voering om het spoor contour beginnen. Trace het ventrikel door te blijven klikken achtereenvolgens langs de apicale oppervlak.
- Voor onregelmatige gebieden die meer finesse, klik en houd de linker muisknop om de vrije hand te traceren. Druk op Ctrl + Z, of ga to Opties> Ongedaan maken om de vorige contour punt ongedaan te maken. Verplaats het opsporen venster met behulp van de pijltoetsen of door het maken van een contour wijzen buiten het scherm en waardoor het raam om zichzelf automatisch te centreren. Om het ventrikel traceren klik met de rechtermuisknop te voltooien en selecteer 'Sluiten Contour'.
- Selecteer een nieuwe contour kleur (type contour) voor de rechter laterale ventrikel met behulp van het drop down menu. Trace de rechterkamer als in stap 1.3.4 voor de linker.
- Als er wijzigingen in de naam en de kleur contour nodig zijn, klik met de rechtermuisknop op de contour en selecteer Change Contour Type om de juiste kleur te selecteren.
- Markers toe te voegen over de middellijn om te helpen bij de aanpassing van de seriële contouren voor 3D-reconstructie. Om markeringen toe te voegen, selecteert u de juiste markering (gebruik de 'X') van de werkbalk Markers aan de linkerkant en klik op om ze te laten vallen op het scherm te traceren. Markers Import samen met de contouren voor elke sectie weefsel spoor.
- Om het weefsel sporen, selecteert u Bestand opslaan> OpslaanData File As en maak een nieuwe map en de bestandsnaam. Nummer de traces [slide #] - [tissue #] voor gemakkelijke identificatie van sporen uit de seriële secties. Bijvoorbeeld, de derde weefselsectie op de tweede schuif heeft de bestandsnaam "2-3" in de map voor elke hersenen.
- Herhaal de stappen 1.3.4 tot 1.3.9 voor elke seriële sectie van het hersenweefsel om de ventrikels te traceren door het gehele brein, met uitzondering van de regio's van de hartkamer muur hechting.
- Als het ventrikel heeft een gebied van hechting, sub-segment van de voorste regio van de dorsale en ventrale om de hechting website. Maak twee nieuwe contour types voor elk ventrikel (bv 'dorsale Left ventrikel' en 'Ventral Left ventrikel'). Op het eerste weefsel-segment met hechting, sporenelementen het laterale ventrikel met zowel de oorspronkelijke laterale ventrikel contour en de nieuwe dorsale en ventrale contouren te zorgen voor een volledige reconstructie hartkamer worden gemaakt.
- In secties posterior een ventricle muur hechting, een set van de nieuwe contour kleuren voor het achterste gedeelte van elke ventrikel (bv 'Posterior Left ventrikel'). Double-trace deze eerste re-aangesloten deel met zowel de huidige hechting en nieuwe achterste contour types.
1.4) laterale ventrikel 3D Wederopbouw
- Lijn en compileren seriële contour traces van de muis laterale ventrikels naar 3D-reconstructies en volumetrische gegevens te genereren.
- Open 3D-reconstructie programma. Klik op Bestand> Openen en selecteer het bestand contour van de eerste getraceerd seriële sectie. Importeren de contour traces van de linker en rechter ventrikel alsook eventueel toegevoegde markers.
- Om contouren selecteren, klikt u op de knop 'Select Objects' (cursor pictogram) en selecteer de twee hartkamers en markers door het houden van 'Ctrl'. Om de Z-positie van de contouren vast te stellen, klik met de rechtermuisknop en kies 'Wijzig Z-positie'. Stel de eerste tissue slice op 0 um. <li> Voor de reconstructie, selecteert u Bestand> Save Data File Als redden. Sla na elk bestand importeren, dus als er een fout is gemaakt herstel is zo eenvoudig opnieuw laden van het vorige bestand.
- Om de volgende tissue slice toe te voegen aan de wederopbouw, klikt u op Bestand> Append wilt zien. Selecteer de .DAT bestand moet worden toegevoegd, en controleer de 'Merge' doos.
- Volg Stap 1.4.3 naar de Z-positie van de nieuw geïmporteerde trace bestand opnieuw aan te passen. Selecteer alleen de nieuw toegevoegde links en rechts contouren in het hoofdvenster om te voorkomen dat het verplaatsen van de andere sporen. Stel elke opeenvolgende traceerbestand tot 50 urn van de Z-positie van de voorafgaande contour tot 50 urn secties. (Eerste contour: z = 0, tweede contour: z = 50, derde contour: z = 100, etc.)
- Om de X, Y positie van de geselecteerde contouren en markeringen aan te passen, klikt u op de 'Enable Translation met Mouse' ingedrukt en sleep de contouren aan te sluiten bij de vorige weefsel contouren. Houd zowel de links en rechts de contouren van het huidige trace geselecteerdesynchrone beweging mogelijk te maken.
- Om draai de sporen met de klok mee of tegen de klok in om line-up de middellijn markers, selecteert u de 'Z-as Rotation' knop. Om contouren over de Y-as te spiegelen (als de linker contour is aan de rechterkant) te selecteren zowel geïmporteerde contouren en markers, klik met de rechtermuisknop en selecteer 'Set Rotation Angle', en voer '180' in de 'Y-rotatie'.
- Zorg ervoor dat de ventrikels en de middellijn markers beste zijn uitgelijnd voor het opslaan van de reconstructie-bestand, als in stap 1.4.4.
- Herhaal de stappen 1.4.5 tot 1.4.9 voor elke volgende tissue slice totdat alle zijn geïmporteerd en goed uitgelijnd.
- Om het volume gegevens van de seriële reconstructie bekijken, klikt u Analyse> 'Markers en Regio Analysis' en selecteer '3D Contour Samenvatting'. Selecteer alle contouren in het linker paneel en klik op de '3D-visualisatie' knop om de uiteindelijke 3D-reconstructie te geven.
2. Mens: Analyse van periventriculaire Cellular Integriteit en 3D modellering van de laterale ventrikel
2.1) Human MRI Data Analysis
OPMERKING: protocollen worden opgesomd om 3D-beeld reconstructies en volumetrische kwantificering van de laterale ventrikels maken en beoordelen volumetrische veranderingen in de tijd met behulp van longitudinale overlay analyse. Het is belangrijk op te merken dat de consistentie in MR data verzamelen (bv, machine en magneet kracht, coupedikte, oriëntatie en resolutie) en post-acquisitie processing zijn uiterst belangrijke criteria voor opname van data sets 20.
- Ventriculaire Segmentatie
OPMERKING: ITK / Snap wordt gebruikt om het segment van de ventrikels van de hoge-resolutie-T1-gewogen MR beelden. Als alternatief kunnen andere freeware software, zoals Freesurfer worden gebruikt.- Open ITK / Snap, File> Open grijswaardenafbeelding. Selecteer de gewenste bestanden en open een .nii bestand (NITFI bestand).
- Blader door elke anatomical vliegtuig, merkt ventriculaire afwijkingen (vernauwde gebieden, groot of klein tijdelijke hoorns, etc.). In het Main Toolbox klik op 'Snake ROI Tool'. Klik op 'Segment 3D'. Selecteer de optie 'Intensity Region'.
- Klik op 'Preprocessen Image'. Selecteer 'Boven', naar regio's onder een bepaalde intensiteit drempel omvatten om ROI te markeren in het wit. Noteer maximale intensiteit met schuifbalk. Stel de drempel tot 15% van de maximale intensiteit (opnemen deze waarde). Stel gladheid parameter tot 10. Klik op 'OK' en vervolgens op 'Volgende'.
- Voeg 10-12 small (maat 2) "bubbles" aan elke ventrikel: twee in de voorste frontale hoorn, zeven gelijkmatig verdeeld over het bovenste oppervlak van het laterale ventrikel lichaam, een in de occipitale hoorn en een in de tijd Hoorn laterale ventrikel. 'Selecteer Parameters' en stel kromming kracht tot 0,4. Klik op de Play Symbol om actieve contour evolutie beginnen.
- Klik op 'Bijwerken Mesh' aan de oppervlakte te visualiseren; check 'Auto-update'. Stop segmentatie wanneer alle delen van de laterale ventrikel in het gebied van belang (ROI). Vermijd opname van het derde ventrikel. Klik op 'Finish'.
- Handmatig bewerken afbeelding indien nodig om ongewenste gebieden verwijderen door de volgende manieren (meestal moeten derde ventrikel lekkage te wissen). Handmatig gebruik maken van de '3D Scalpel' hulpmiddel om overtollig regio's te verwijderen of handmatig gebruik maken van de 'Penseel' tool 'Clear Label' als de actieve tekening label aan een opname voorbij ROI te wissen.
- Sla segmentatie resultaten als een .nii imago ('Nifti' bestandsformaat).
- Om totale ventrikel volume te verkrijgen, selecteert u 'Segmentatie> Volume' en statistiek; het verkrijgen van de totale volume van de hartkamer met set kleur label.
- Longitudinale Vertegenwoordiging Van laterale ventrikels Van MRIScans
LET OP: Het gebruik vanMango software, zijn longitudinale ROI bedekt op veranderingen in ventrikel volume binnen proefpersonen in de tijd kwalitatief en kwantitatief aan te tonen.- Open Mango. Klik op File> Load ROI van de eerste ROI tijdstip (baseline) als GREEN. File> Load ROI van de tweede ROI tijdstip als RED. Sla longitudinale overlay door Bestand> Opslaan als; toewijzen elk beeld als 'file name_ [eerst punt leeftijd] - [tweede keer punt leeftijd] .nii'.
- Open ITK-SNAP. Open het gecombineerde ROI als 'grijswaarden', door het selecteren van Segmentatie> Load Uit afbeelding> gecombineerd ROI-bestand. Voor het verkrijgen van longitudinale datavolume voert u de volgende: Segmentatie> Volume en Statistiek> Label 1 (rood) = expansievolume; Label 2 (groen) = stenose volume; Label 3 (blauw) = basis volume.
2.2) Human periventriculaire Tissue Voorbereiding en Analyse
- Veiligheidsvoorschriften voor het werken met menselijk weefsel
- Verkrijgen appropriate veiligheid opleiding (bijv., bloedpathogenen natuurlijk).
- Observeer standaard (universele) veiligheidsmaatregelen. Draag handschoenen. Wijzig handschoenen voordat het aanraken gemeenschappelijke apparatuur of oppervlakken die niet eenmalig zijn. Label alle items routinematig behandeld bij het werken met menselijk weefsel met 'menselijk gebruik weefsel' aanduidingen.
- Volg ontsmetting practices voor alle items contact menselijk weefsel. Bleach alle vervuilde vloeistoffen voor een minimum van 24 uur voorafgaand aan verwijdering, behandeling van besmette oppervlakken met een bleekwater gedrenkte doek (bijvoorbeeld, bank boven) of door het plaatsen van objecten direct in bleekwater (bijv tang).
- Bereid rampenplan voor contact met menselijk weefsel direct op de huid, die kunnen bestaan uit het weken een papieren handdoek in bleekwater en houden op het getroffen gebied (5-10 min).
- Gebruik de juiste afvalverwijdering voor alle items in contact komen met menselijk weefsel.
- Laterale ventrikel Hele Mount Voorbereiding
- Beginning met een intacte halfrond (gefixeerd in 10% formaline en grondig gespoeld met 0,1 M PBS), snijd 1,5 cm dik coronale secties door middel van hele halfrond met groot mes.
OPMERKING: Alle fixatie protocollen vereisen voordat antilichaam verificatie. - Label secties voor naar achter te beginnen met eerste deel bevat de laterale ventrikel. Gebruik een alfanumeriek etiketteersysteem labelen van de plakjes met letters (anterior naar posterior) en punt met nummers (top down). Vermijd verstoren ependymale oppervlak.
- Met behulp van microchirurgische scalpel, ontleden ventrikel wand 1 cm diep, het onderhouden van een continue gedeelte voor hele laterale wand. Splits de muur als nodig is om de juiste maat secties te creëren voor zowel kleuring. Notch deel aan de andere kant van de hartkamer muur om superieure / inferieure oriëntatie te identificeren.
- Voer antigeenterugtrekking door incubatie weefselsecties in 10 mM natriumcitraat buffer (pH 6,0) bij 100 ° C gedurende 10-20 min onder toepassing van een dubbele BOILEr (optimale incubatietijd is empirisch bepaald). Spoel 3 maal in PBS / 0,1% Triton X-100 (PBS-TX).
- Block in 10% paardenserum middels PBS / PBS-TX gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Incubeer met primaire antilichamen gedurende 48 uur bij 4 ° C. Om ventrikel wandbekleding visualiseren, immunostain hele mounts met de volgende antilichaam combinaties: de muis anti-β-catenine (1: 250); geit anti-GFAP (1: 250); konijnen anti-AQP4 (1: 400).
- Voer alle volgende stappen in het donker. Spoel tissue 3 maal in PBS, geïncubeerd met secundaire antilichamen (1: 500) gedurende 24 uur bij 4 ° C of 2 uur bij kamertemperatuur geroerd, en spoel nog 3 maal in PBS. Incubeer weefsel in DAPI gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur geroerd gevolgd door nog 3 spoelingen in PBS.
- Bereid weefsel voor de uiteindelijke dissectie door het bedekken van een wax bodem gerecht met parafilm. Vul schotel met PBS, plaats weefsel in de schotel met behulp van fijne tang, het vermijden van contact maken met ependymale muur.
- Onder de microscoop ontleden, stevig Secure weefsel op zijn kant met pinnen. Met een 22.5 ° microchirurgische stab mes, maken uniforme dunne secties (ongeveer 300 micrometer dik) van de laterale ventrikel wand. Voor grote delen of secties met moeilijke kromming, snijd ze in kleine blokjes vóór het snijden in de definitieve secties voor montage en note locatie.
- Plaats zorgvuldig ontleed sectie ependyma kant naar boven op dia met behulp van fijne tang, het kennis nemen van de regionale locatie en oriëntatie op de dia. Bedek weefsel met dun laagje aquapolymount, zorg om luchtbellen te vermijden. Plaats dekglaasje dan weefsel, voeg extra aquapolymount als nodig is om eventuele lacunes vullen onder dekglaasje.
- Plaats gemonteerde secties donker en droog gedurende 2-3 dagen bij kamertemperatuur geroerd. Bewaren in slidebox bij 4 ° C.
- Beginning met een intacte halfrond (gefixeerd in 10% formaline en grondig gespoeld met 0,1 M PBS), snijd 1,5 cm dik coronale secties door middel van hele halfrond met groot mes.
- Immunohistochemische en histologische analyse
- Met behulp van confocale microscopie fluorescerende immunohistochemie geven, de beeldvormende brandvlak aan het ventrikel oppervlak, zoals bepaald met behulp of β-catenine (marker voor apicale adherens junction eiwitten van ependymale cellen). Bakenen gebieden van ependymale cel dekking en oppervlakte astrogliose (GFAP kleuring op ventrikel oppervlak).
- Te documenteren en Montage het gehele ventrikel oppervlak, gebruik overlappende afbeeldingen om gehele oppervlak te dekken. Om montage van de seriële beelden te creëren, openen Adobe Photoshop. Gebruik Bestand> Automatisch> Photomerge> Interactieve lay-out om beelden te selecteren om overlay, waardoor handmatige aanpassingen indien nodig.
- Maak een nieuwe laag aan montage aan cartoon vertegenwoordiging van intacte ependyma mobiele dekking of ventrikel oppervlak gliosis genereren traceren. Herhaal dit voor elke dia of ROI. Compileer alle secties om de kaart van de hartkamer muur en koppeling te reconstrueren aan de overeenkomstige gebied op MRI wederopbouw.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Contour traceren van de muis laterale ventrikels gebaseerd op immuno 50 urn coronale secties en 3D-reconstructies (figuur 3) laat datavolume te halen in verschillende experimentele paradigma muis gebruiken als modelsysteem voor de ziekte of letsel. Essentieel voor deze werkwijze is het uitsluiten van gebieden waar de laterale ventrikel wanden aan elkaar hechten. Bij subsegmenting gebieden van de ventrikels en aanwijzing van een verschillende kleur voor elk gebied (figuur 3C), kunnen opeenvolgende secties worden voldaan en regionale en totale volume worden berekend opgesteld deelsegmenten.
Vergelijkbare studies kunnen worden uitgevoerd met behulp van MRI scan van de hersenen met semi-automatische segmentatie (ITK-SNAP) van de laterale ventrikels 3D renderings. Voor de directe koppeling van ventrikel volumes en periventricular weefsel analyse, pre- of post-mortem MRI scans worden gesegmenteerd en afgestemd op 3D-reconstructies te maken (
Figuur 1: Het uitvoeren van de laterale ventrikel segmentatie met behulp van de ITK / Snap Snake ROI Tool (A) 'Bubbles' worden toegevoegd aan de laterale ventrikels. (B) 'Bubbles' uit te breiden tijdens actieve contour evolutie. (C) Segmentatie is voltooid wanneer hele laterale ventrikel wordt gevuld. (Care is genomen om de 3 e ventrikel te voorkomen.)
Figuur 2: Human laterale ventrikel wand dissectie (
Figuur 3: Het opsporen en 3D-reconstructie van de muis laterale ventrikels (A Coronale deel muizenhersenen waaronder laterale ventrikels, door S100β-immunoreactieve ependymale cellen geschetst (*, laterale ventrikels; beugel regio adhe. Sion; schaal bar, 500 pm). (B) Muis laterale ventrikels worden getraceerd als 'contouren' en ingericht als sub-gesegmenteerd secties, met uitzondering van de regio's van intraventriculair hechting uit te bemoeien met volumetrische analyse. (C) 3D-reconstructie van de laterale ventrikel contouren. Gele, contour volle hersenvolume verspreid het interessegebied dat de laterale ventrikels.
Figuur 4: MRI-gebaseerde laterale ventrikel segmentatie (A) MR-beelden worden geassembleerd. (B) laterale ventrikel wordt gedefinieerd als ROI (rood). (C) 3D beeldreconstructie maakt volumetrische kwantificatie en kwalitatieve weergave van de laterale ventrikel.
ad / 52328 / 52328fig5highres.jpg "/>
Figuur 5: Beoordeling van longitudinale ventrikel uitbreiding Longitudinal MRI's vanaf meerdere punten kunnen worden uitgelijnd en bedekt te visualiseren en te kwantificeren ventrikel volume-expansie binnen onderwerpen in de tijd.
Figuur 6: Immunohistochemische evaluatie en regionale registratie van menselijke laterale ventrikel oppervlak (A) gebieden van intacte ependyma cellen door β-catenine kleuring geschetst, vertonen een geplaveide uiterlijk (asterisk) en worden afgebakend door een stippellijn uit gebieden van astrogliosis op ventrikel oppervlak (GFAP + vlekken). (B) Serial confocale beelden worden bedekt met een regionaal montage te genereren en opgespoord met behulp van Adobe Photoshop voor een cartoon vertegenwoordiging van cellulaire organisatie op het ventrikel oppervlak. (C) van het beeldverhaal vanimage montage is toegewezen aan ventrikel oppervlak corresponderende MRI gebaseerde 3D ventrikel reconstructie. (Schaalmaat (A), 40 micrometer, schaalmaat (B), 1 mm)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren instrumenten en protocollen die kunnen worden gebruikt om de integriteit van de hersenen ventrikelsysteem bij muizen en bij de mens te evalueren. Deze hulpmiddelen kunnen echter ook worden toegepast op andere hersenstructuren of orgaansystemen die verandert als gevolg van letsel, ziekte ondergaan, of tijdens het verouderingsproces 14,21,22. De strategieën gepresenteerd take voordeel van software die het mogelijk maakt de uitlijning van cross-sectionele en longitudinale MRI sequenties voor 3D volume voorstellingen van specifieke regio's of structuren van belang te genereren. Longitudinale MRI sequenties mogelijk compilatie van 3D-volume veranderingen die zich voordoen in de tijd en kan worden uitgebreid tot de totale hersenvolume, voor laterale ventrikel aan totale hersenvolume ratio's, en / of andere hersenstructuren (bijv nucleus subthalamicus 23 of corpus callosum witte stof traktaten omvatten met behulp van diffusie-gewogen tensor imaging). Samen kunnen een uitgebreide analyse van de hersenen structurele veranderingen worden uitgevoerd. Uiteindelijkaan leeftijd gerelateerde en ziektegerelateerde veranderingen hersenstructuren evalueren van een verzameling van multimodale beeldvormingstechnieken nodig zijn meest getrouwe beeld van de hersenen gezondheidsstatus 24 verschaffen. Documentatie en compilatie van kritische structurele gegevens, samen met de subject-subject variabiliteit en het bereik van de variabiliteit over onderwerpen, zou idealiter worden gebruikt voor ultra-high veld MRI atlassen tot beste gids klinische diagnose van weefsel in gezondheid of ziekte te genereren.
Verschillende kritische stappen zijn belangrijk om op te merken met het oog op het verzamelen en verwerken variabiliteit afnemen tussen en binnen onderwerp datasets. Ideaal om aangepaste gegevens sequenties te verkrijgen, moeten dezelfde MRI-scanner en de volgorde het type worden gebruikt in de studie. Postmortem hersenweefsel is vaak van wisselende kwaliteit; kritische factoren zoals de doodsoorzaak, de postmortem interval, de kwaliteit van de perfusie en tijdsduur in fixeermiddel allen kleuring werkzaamheid en de noodzaak van affectantigen retrieval protocol. Bovendien is de grootte van de menselijke hersenen vereist meerdere slice secties met elk segment ter verdere bewerking aan weefsel dat de gebieden van belang te verkrijgen. Daarom is het essentieel dat de locatie en oriëntatie van elke sectie duidelijk aangegeven en geregistreerd. Uiteindelijk is het primaire probleem bij postmortem weefsel analyse juist dat - het postmortem - en dus geeft slechts een momentopname van het weefsel aan het einde van het leven. Verbeterde multimodale beeldvormingstechnieken vereist voor real-time analyse van veranderingen hersenstructuren en morfo-functionele informatie met cellulaire resolutie.
Mouse studies laten ondervraging van de menselijke conditie variabele door variabele en niet veel van de problemen gevonden bij het werken met menselijk weefsel te presenteren. Mouse studies gebruikt om het model menselijke ziekte of letsel door analyse van causale structurele dynamica kunnen verbeteringen voor de ziekte-model val biedenidation. Er moet echter species-specifieke verschillen worden opgemerkt. In onze analyse van de laterale ventrikels is het belangrijk op te merken dat muizen steeds een actieve stamcelniche langs de laterale wand van de laterale ventrikels en de steel celgemedieerde regeneratief herstel van het ventrikel voering komt in geval van geringe ependymale celverlies, zoals gevonden in de leeftijd van muizen of wanneer beperkt ependymale cel denudatie gebeurt door blootstelling van de ependyma om neuraminidase 19. Daarentegen hebben mensen niet stellen robuust stamcelniche langs de laterale ventrikel wanden 25-27 en weinig of geen regeneratie waarschijnlijk. In tegenstelling tot oudere muizen, leeftijd mensen vertonen uitgebreide astrogliosis aan het ventrikel oppervlak geassocieerd met hartkamer expansie 6. Dit niveau van erosie en 'littekens' van het ventrikel bekleding kan worden gemodelleerd in de muis met behulp van neuraminidase naar het ventrikel bekleding van ependymale cellen 6,28 beroven. Bovendien is het belangrijk te erkennen that-Vivarium onderhouden muizen niet ervaren infecties, ziekte of trauma, de presentatie van een veel verschillende medische geschiedenis van de meeste menselijke proefpersonen. Bovendien, muizen meestal niet zien leeftijdgebonden neurodegeneratieve ziekte, ventriculomegaly of periventriculaire gliosis. Daarom, om deze fenotypen ze moeten worden gemodelleerd observeren. Op het einde, kan er geen diermodel volledig recapituleren de ontogenie, pathofysiologie, en symptomatische complexiteit van de ziekte bij de mens en deze beperkingen moeten worden erkend en goed gecommuniceerd.
Samenvattend stellen wij technieken en protocollen laterale ventrikel volumes bij muis en mens te evalueren. Ventrikels kan worden gemaakt in 3D en longitudinale analyse maakt compilatie van tijdruimtelijk volume verandert. Bovendien, gebruikmakend van gepaarde hersenweefsel we zien hoe cellulaire functies kunnen worden gekoppeld aan veranderingen in ventrikel volumes. Recente resultaten aantonen van verhoogde niveaus van Aquaporin-4 expressie in gebieden van periventricuLAR gliosis suggereren oedeem langs het ventrikel oppervlak. Daarom toekomstige onderzoeken koppelen FLAIR-MRI met weefsel histologie zal ons begrip van CSF en interstitiële vloeistof uitwisseling te verbeteren, en bieden belangrijke informatie over gezondheid ventrikel systeem en hoe de achteruitgang treft verschillende hersenfuncties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 21600-069 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Use at 4% in PBS, 4 °C |
| Normal Horse Serum | Life Technologies | 16050 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Triton X-100 (TX) | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.1% in PBS (v/v) |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Imager.M2 | |
| Camera | Hamamatsu | ORCA R2 | |
| Microscope Stage Controller | Ludl Electronic Products | MAC 6000 | |
| Stereology software | MBF Bioscience | Stereo Investigator 11 | |
| Stereology software | ImageJ/NIH | NIH freeware | |
| 3D Reconstruction software | MBF Bioscience | Neurolucida Explorer | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | |
| MRI Software | |||
| Freesurfer | https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall | Segmentation and Volume | |
| ITK-Snap | http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php | Segmentation and Volume | |
| Multi-image Analysis GUI (Mango) | http://ric.uthscsa.edu/mango/ | Longitudinal overlay | |
| Whole Mount Equipment | |||
| 22.5° microsurgical straight stab knife | Fisher Scientific | NC9854830 | |
| parafilm | |||
| wax bottom dissecting dish | |||
| pins | |||
| fine forceps | |||
| aquapolymount | |||
| Dissecting Microscope | Leica | MZ95 | |
| Whole Mount Antibodies | |||
| mouse anti-b-catenin | BD Bioschiences, San Jose, CA, USA | 1:250 | |
| goat anti-GFAP | Santa Cruz Biotechnology | 1:250 | |
| rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4) | Sigma-Aldrich | 1:400 | |
| Coronal Antibodies | |||
| Anti-S100β antibody | Sigma-Aldrich | 1:500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D-1306 | 10 µg/ml in PBS |
References
- Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 55-73 (2010).
- Johanson, C., et al. The distributional nexus of choroid plexus to cerebrospinal fluid, ependyma and brain: toxicologic/pathologic phenomena, periventricular destabilization, and lesion spread. Toxicol Pathol. 39, 186-212 (2011).
- Roales-Bujan, R., et al. Astrocytes acquire morphological and functional characteristics of ependymal cells following disruption of ependyma in hydrocephalus. Acta Neuropathologica. 124, 531-546 (2012).
- Cserr, H. F. Physiology of the choroid plexus. Physiol Rev. 51, 273-311 (1971).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4, 147ra111 (2012).
- Shook, B. A., et al. Ventriculomegaly associated with ependymal gliosis and declines in barrier integrity in the aging human and mouse brain. Aging Cell. , (2013).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342, 373-377 (2013).
- Fazekas, F., et al. Pathologic correlates of incidental MRI white matter signal hyperintensities. Neurology. 43, 1683-1689 (1993).
- Meier-Ruge, W., Ulrich, J., Bruhlmann, M., Meier, E. Age-related white matter atrophy in the human brain. Ann N Y Acad Sci. 673, 260-269 (1992).
- Resnick, S. M., Pham, D. L., Kraut, M. A., Zonderman, A. B., Davatzikos, C. Longitudinal magnetic resonance imaging studies of older adults: a shrinking brain. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 23, 3295-3301 (2003).
- Sener, R. N. Callosal changes in obstructive hydrocephalus: observations with FLAIR imaging, and diffusion MRI. Comput Med Imaging Graph. 26, 333-337 (2002).
- Sze, G., et al. Foci of MRI signal (pseudo lesions) anterior to the frontal horns: histologic correlations of a normal finding. AJR Am J Roentgenol. 147, 331-337 (1986).
- Tisell, M., et al. Shunt surgery in patients with hydrocephalus and white matter changes. Journal of Neurosurgery. 114, 1432-1438 (2011).
- Valdes Hernandez Mdel, C., et al. Automatic segmentation of brain white matter and white matter lesions in normal aging: comparison of five multispectral techniques. Magn Reson Imaging. 30, 222-229 (2012).
- Shook, B. A., Manz, D. H., Peters, J. J., Kang, S., Conover, J. C. Spatiotemporal changes to the subventricular zone stem cell pool through aging. The Journal of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 32, 6947-6956 (2012).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
- Luo, J., Daniels, S. B., Lennington, J. B., Notti, R. Q., Conover, J. C. The aging neurogenic subventricular zone. Aging Cell. 5, 139-152 (2006).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. J Neurosci. 28, 3804-3813 (2008).
- Marcus, D. S., Fotenos, A. F., Csernansky, J. G., Morris, J. C., Buckner, R. L. Open access series of imaging studies: longitudinal MRI data in nondemented and demented older adults. J Cogn Neurosci. 22, 2677-2684 (2010).
- Giorgio, A., De Stefano, N. Clinical use of brain volumetry. J Magn Reson Imaging. 37, 1-14 (2013).
- Caspers, S., et al. Studying variability in human brain aging in a population-based German cohort-rationale and design of 1000BRAINS. Front Aging Neurosci. 6, 149 (2014).
- Keuken, M. C., et al. Ultra-high 7T MRI of structural age-related changes of the subthalamic nucleus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 4896-4900 (2013).
- Marti-Bonmati, L., Sopena, R., Bartumeus, P., Sopena, P. Multimodality imaging techniques. Contrast Media Mol Imaging. 5, 180-189 (2010).
- Bergmann, O., et al. The age of olfactory bulb neurons in humans. Neuron. 74, 634-639 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Wang, C., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21, 1534-1550 (2011).
- Carmen Gomez-Roldan, D. el, M,, et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507, 1571-1587 (2008).
