Introduction
Un ependimali linee monostrato cellulare il sistema ventricolare del cervello fornire funzioni bidirezionali di barriera e di trasporto tra il fluido cerebrale spinale (CSF) e liquido interstiziale (ISF) 1-3. Queste funzioni aiutano a mantenere in equilibrio fisiologico 2,3 libero da agenti tossici nel cervello. Negli esseri umani la perdita di porzioni di questo rivestimento per infortunio o malattia non sembra tradursi in sostituzione rigenerativa come si trova in altri rivestimenti epiteliali; piuttosto la perdita di copertura cellulare ependimale sembra comportare astrogliosis periventricolare con un reticolo di astrociti che coprono regioni spoglie di cellule ependimali in superficie ventricolo. Gravi ripercussioni ai meccanismi importanti CSF / cambio ISF e di liquidazione sarebbero previsti come conseguenza la perdita di questo strato epiteliale 1,2,4-7.
Una caratteristica comune di invecchiamento umano è allargata ventricoli laterali (ventricolomegalia) ed edema periventricolare associati come observcato da MRI e fluido attenuato inversion recovery MRI (risonanza magnetica / FLAIR) 8-14. Per indagare il rapporto tra ventricolomegalia e l'organizzazione cellulare del rivestimento ventricolo, post-mortem sequenze MRI umani sono stati abbinati con preparati istologici di ventricolo laterale del tessuto periventricolare. Nei casi di ventricolomegalia, aree consistenti di gliosi avevano sostituito copertura cellulare ependimale lungo la parete del ventricolo laterale. Quando l'espansione ventricolo non è stato rilevato da analisi del volume basato su risonanza magnetica, il rivestimento delle cellule ependimale era intatto e gliosi non è stato rilevato lungo il rivestimento ventricolo 6. Questo approccio combinatorio rappresenta la prima documentazione dettaglio cambiamenti globali in integrità cellulare del rivestimento ventricolo laterale utilizzando preparazioni wholemount di porzioni o l'intera parete del ventricolo laterale e modellazione 3D di volumi ventricolo 6. Molte malattie (malattia di Alzheimer, la schizofrenia) e le lesioni (lesioni cerebrali traumatiche)mostrano ventricolomegalia come funzionalità neuropathological presto. Denudation delle aree del rivestimento delle cellule ependimale quindi sarebbe previsto per interferire con la normale funzione delle cellule ependimali e compromettere l'equilibrio omeostatico tra CSF / fluido ISF e scambio soluto. Così, un esame più approfondito delle modifiche apportate al sistema ventricolare, la sua composizione cellulare, e la conseguenza di strutture cerebrali sottostanti o vicine alla fine inizierà a rivelare di più sulla neuropatologia associata con l'allargamento del ventricolo.
La mancanza di dati di imaging multimodali, in particolare sequenze di dati longitudinali, con accesso limitato ai corrispondenti campioni istologici rende l'analisi di patologie cerebrali umane difficile. Fenotipi modellazione trovano in invecchiamento umano o malattia può spesso essere realizzato con modelli di topo e modelli animali diventano uno dei nostri migliori mezzi per esplorare le domande circa l'inizio e la progressione delle malattie umane. Diversi studi insani giovani topi hanno descritto la citoarchitettura delle pareti ventricolo laterale e la nicchia di cellule staminali sottostante 4,7-15. Questi studi sono stati estesi per includere la modellazione 3D e analisi cellulare delle pareti del ventricolo attraverso invecchiamento 6,15. Né gliosi periventricolare né ventricolomegalia sono osservati in topi anziani, piuttosto topi mostrano una zona subventicular relativamente robusta (SVZ) staminali nicchia di cellule soggiacente ad una cella ependimale intatto fodera 6,15. Così, esistono notevoli differenze specie-specifiche sia nella manutenzione e l'integrità del rivestimento ventricolo laterale generale durante il processo di invecchiamento 6,15. Pertanto, per migliori topi uso di interrogare le condizioni presenti negli esseri umani, le differenze tra le due specie hanno bisogno di essere caratterizzato e adeguatamente considerati in qualsiasi paradigma di modellazione. Qui vi presentiamo le procedure per valutare le variazioni longitudinali ai ventricoli laterali e tessuto periventricolare associati in esseri umani e mouse. Le nostre procedure comprendono Rendering 3D e volumetria del mouse e ventricoli umani, e l'uso di analisi immunoistochimica di interi preparati montaggio di tessuto periventricolare per caratterizzare sia di organizzazione e struttura cellulare. Insieme, questi procedimenti forniscono un mezzo per caratterizzare cambiamenti nel sistema ventricolare e tessuto periventricular associato.
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Protocol
NOTA: le procedure di animali sono stati approvati dalla University of Connecticut IACUC e sono conformi alle linee guida NIH. Il tessuto umano e l'analisi dei dati e le procedure fossero conformi e approvati dalla University of Connecticut IRB e sono conformi alle linee guida NIH.
1. Mouse: Analisi di periventricolare Cellular Integrità e modellazione 3D del ventricolo laterale
1.1) Preparazione del mouse ventricolo laterale intera parete Monti
- Preparare il mouse ventricolo laterale interi supporti per immunoistochimica (IHC) come descritto in precedenza 16,17.
1.2) immunoistochimica per ventricolo Analisi laterale
- Fissare e tessuto cerebrale sezione del mouse come descritto in precedenza 18,19.
- In breve, i topi a filo transcardiaca con normale, soluzione fisiologica a temperatura ambiente, fino a quando gli organi hanno eliminato (indicato da una colorazione pallida), seguiti da temperatura ambiente paraformaldeide al 4%(PFA) in 0,1 M tampone fosfato salino (PBS) finché il tessuto è irrigidito.
- Togliere il cervello dal cranio. Usare le forbici dissezione iris per tagliare dalla base del cranio, lungo la sutura sagittale.
- Esporre cranio e rimuovere il cervello con le pinze. Immergere il cervello nel 4% PFA fissativo notte a 4 ° C. Quindi lavare 3 volte per 20 minuti con PBS.
- Preparare sezioni seriali per l'immunoistochimica e l'analisi del volume.
- Usando un bisturi microchirurgico, fare una piccola incisione longitudinalmente lungo la corteccia dell'emisfero sinistro per consentire l'identificazione dell'emisfero sinistro dall'emisfero destro quando sezioni galleggianti sono immunostained.
- Encase cervelli in 3% agarosio per una maggiore sostegno strutturale fisso durante vibratome sezionamento. Warm 3% agarosio in acqua distillata (w / v) fino a completa dissoluzione utilizzando un forno a microonde o piastra calda.
- Con una lametta, rimuovere la sezione caudale del cervello al cervelletto contaglio coronale, lasciando una superficie piana e perfettamente. Applicare la colla super per la fase di tessuti e posizionare il cervello sulla superficie appena tagliato con i bulbi olfattivi rivolti verso l'alto.
- Quando la soluzione di agarosio liquido è raffreddato ad una temperatura appena caldo al tatto, applicare uniformemente sul cervello per racchiudere completamente l'intero cervello. Lasciare che il agarosio solidificare.
- Sezione agarosio racchiuso cervello coronale su un vibratome in 50 sezioni micron, con sezioni disposte in serie in una piastra da 24 pozzetti contenenti PBS per preservare ordine sequenziale.
NOTA: Generalmente 12 pozzi sono utilizzati per un cervello, con la raccolta di tessuto che inizia 5 sezioni prima di vedere l'emergere dei ventricoli laterali che iniziano con ben A1, passando numericamente fino al B6 e in bicicletta torna a A1. Ciò consente a più sezioni distinguibili dallo stesso cervello di essere trattati nello stesso pozzo. Per l'analisi del volume del ventricolo laterale, la raccolta dei tessuti cessò quando il ventricolo laterales e la terza si fondono ventricolo, causando circa 3 sezioni per ben 36 sezioni o totale. - Aspirare il PBS utilizzando una pipetta di trasferimento apposto con una punta micropipetta 20-200 microlitri per garantire che le sezioni galleggianti non sono accidentalmente aspirati. Block e permeabilize sezioni galleggianti in siero 10%, 0,1% Triton X-100 (TX) in PBS (PBS-TX) per 1 ora a temperatura ambiente. Utilizzare 300 ml di soluzione per bene per coprire sezioni di tessuto libero di fluttuare in una piastra da 24 pozzetti e di eseguire tutte le incubazioni delle sezioni su un piatto oscillante.
- Aspirare la soluzione di saturazione, e incubare sezioni con anticorpi primari in PBS-TX notturno (almeno 12 ore) a 4 ° C. Per ventricolo tracce di volume utilizzando sezioni coronali, utilizzare anticorpo anti-S100β per etichettare le cellule ependimali.
- Soluzione anticorpo primario Aspirare e lavare le sezioni 3 volte per 10 minuti ciascuno con PBS-TX.
- Incubare sezioni in buio per 1 ora a temperatura ambienteture con anticorpi secondari fluorescenti, a concentrazioni di 1: 1.000 in 10% di siero, PBS-TX. Mantenere le sezioni al buio per tutte le fasi di incubazione rimanenti.
- Soluzione di anticorpo secondario Aspirare e incubare sezioni con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo in PBS (DAPI, 10 mg / ml) per 5 minuti a Controcolorare nuclei cellulari. Aspirare la soluzione DAPI e risciacquare le sezioni 3 volte per 10 minuti ciascuno con PBS.
- Mount sezioni serialmente sul diapositive utilizzando il marchio corticale di preservare sinistra contro orientamento emisfero destro. Aria Sezioni secco nel vetrino scuro e poi applicando uno strato sottile di mezzi di montaggio al vetrino e delicatamente posto un vetrino coprioggetto sopra. Lasciare i vetrini coprioggetto per asciugare durante la notte a temperatura ambiente.
1.3) La segmentazione del ventricolo laterale per ricostruzioni 3D
NOTA: Eseguire il tracciamento dei ventricoli laterali utilizzando il software di mappatura su un epifluorescenza microsco rettoPE con una fase automatizzata e una fotocamera CCD digitale per il rilevamento della fluorescenza.
- Accendere l'apparecchio microscopio a fluorescenza e lanciare il software di mappatura in modalità fluorescenza. Aperte "Opzioni di visualizzazione" per caricare le barre degli strumenti adeguati e pannelli attracco degli strumenti necessari per il tracciamento. Opzioni> Opzioni di visualizzazione> Accessori, e selezionare il 'principale' e le barre degli strumenti 'Marker'. Nello stesso menu, selezionate 'Camera Istogramma', 'Multicanale controllo', 'impostazioni della fotocamera', e 'Image Acquisition' sotto 'Pannelli Docking strumenti.'
- Osservare inizi dei ventricoli a base di forte fluorescenza S-100β che etichette cellule ependimali che rivestono il ventricolo laterale. Identificare il primo pezzo di tessuto che contiene i ventricoli laterali.
- Creare un nuovo file di dati e designare un punto di riferimento per il movimento stage facendo clic sulla finestra dell'immagine sopra il ventricolo laterale sinistro. Cercare il piccoloincisione per orientare sinistra dalla dell'emisfero destro. Tenere il punto di riferimento in una posizione coerente rispetto ai ventricoli laterali attraverso il tracciamento dei file per aiutare durante l'importazione di profili per la ricostruzione di serie.
- Selezionate il corretto tipo di contorno predefinito dal contorno menu a discesa, ad esempio, 'Sinistra Ventricolo laterale.' Utilizzare un colore unico per ciascuno dei tracciati ventricolo laterale sinistro e destro. Se sono necessari cambiamenti nel nome del profilo e il colore, andare su Opzioni> Preferenze di visualizzazione> contorni, quindi modificare i nomi dei colori di contorno o selezionare 'Aggiungi Tipo Contour'.
- Con contorno la 'sinistra Ventricolo laterale' selezionata, fare clic lungo la superficie apicale del rivestimento ependimale per iniziare il contorno traccia. Tracciare il ventricolo continuando a fare clic in successione lungo la superficie apicale.
- Per le aree irregolari che richiedono maggiore finezza, cliccare e tenere premuto il tasto sinistro del mouse per tracciare a mano libera. Premere Ctrl + Z, o andare to Opzioni> Annulla per annullare il punto del profilo precedente. Spostare la finestra tracciando con i tasti freccia o facendo lettera a contorno fuori dallo schermo e permettendo la finestra per centrare automaticamente. Per finire il ventricolo tracciamento destro del mouse e selezionare 'Chiudi Contour'.
- Selezionare un nuovo colore di contorno (tipo di contorno) per il ventricolo laterale destro utilizzando il menu a discesa. Tracciare il ventricolo destro come al punto 1.3.4 per la sinistra.
- Se sono necessari cambiamenti nel nome del profilo e il colore, fare clic destro sul contorno e selezionare Cambia Contorno Type per selezionare il colore appropriato.
- Aggiungere marcatori lungo la linea mediana di aiutare ad allineare i contorni di serie per la ricostruzione in 3D. Per aggiungere i marcatori, selezionare il marcatore adeguato (utilizzare la 'X') dalla barra degli strumenti Markers a sinistra e fare clic per farli cadere sullo schermo tracciato. Marcatori Importare insieme con i profili di ciascuna traccia sezione di tessuto.
- Per salvare la tracce di tessuto, selezionare File> SalvaFile Dati e creare un nuovo nome di cartella e di file. Numero tracciati [diapositiva #] - [#] tessuto per una facile identificazione di tracce di sezioni seriali. Ad esempio, la terza sezione di tessuto sulla seconda slitta ha il nome file '2-3' all'interno della directory per ogni cervello.
- Ripetere i punti 1.3.4 a 1.3.9 per ciascuna sezione di serie del tessuto cerebrale a tracciare i ventricoli attraverso l'intero cervello, escludendo le regioni di adesione parete del ventricolo.
- Se il ventricolo ha una regione di adesione, sotto-segmento regione anteriore da quelli dorsale e ventrale al sito adesione. Creare due nuovi tipi di profilo per ciascun ventricolo (per esempio, 'dorsale del ventricolo sinistro' e 'ventrale del ventricolo sinistro'). Sulla fetta primo tessuto con adesione, tracciare il ventricolo laterale sia con il profilo originale ventricolo laterale e la nuova dorsale e ventrale contorni per garantire una completa ricostruzione ventricolo può essere creato.
- Nelle sezioni posterior a un ventricle adesione muro, creare una serie di nuovi colori di contorno per la parte posteriore del ventricolo ogni (ad esempio, 'posteriore del ventricolo sinistro'). Doppio tracciare questa prima sezione della nuova unita sia con l'adesione in corso e nuovi tipi posteriori di contorno.
1.4) Ricostruzione Ventricolo laterale 3D
- Allineare e compilare tracciati di contorno di serie dei ventricoli laterali del mouse per generare ricostruzioni 3D e dati volumetrici.
- Aperto programma di ricostruzione 3D. Fare clic su File> Apri e selezionare il file di contorno della sezione di serie prima tracciato. Importare i tracciati di contorno del ventricolo sinistro e destro nonché eventuali marcatori aggiunti.
- Per selezionare i contorni, fare clic sul pulsante "Seleziona oggetti" (icona del cursore) e selezionare i due ventricoli e gli indicatori tenendo 'Ctrl'. Per stabilire la posizione Z dei contorni, fare clic destro e selezionare 'modifica Z Posizione'. Impostare la prima fetta del tessuto a 0 micron. <li> Per salvare la ricostruzione, selezionare File> Salva File Dati. Salva dopo ogni file di importazione, così recupero se si commette un errore è facile come ricaricare il file precedente.
- Per aggiungere la fetta del tessuto accanto alla ricostruzione, fare clic su File> Append da visualizzare. Selezionare il file .DAT da aggiungere, e selezionare la casella 'Merge'.
- Seguire passo 1.4.3 per regolare nuovamente la posizione Z del file di traccia appena importato. Selezionare solo i contorni appena aggiunti a destra ea sinistra nella finestra principale per evitare di spostare le altre tracce. Impostare ogni file di traccia successivi a 50 micron dalla posizione Z del contorno precedente per 50 sezioni micron. (Prima contorno: z = 0, secondo contorno: z = 50, terzo contorno: z = 100, etc.)
- Per regolare la X, Y posizione dei contorni e indicatori selezionati, fare clic su 'Attiva Translation con il mouse' pulsante e trascinare i contorni per allinearsi con i contorni del tessuto precedenti. Tenere entrambi i contorni destro e sinistro della traccia corrente selezionataper permettere il movimento sincrono.
- Per ruotare le tracce in senso orario o antiorario per allineare i marcatori della linea mediana, selezionare il pulsante 'Z. Rotazione'. Per capovolgere contorni attraverso l'asse Y (se il contorno sinistra è a destra) per selezionare sia i contorni e marcatori importati, fare clic destro, selezionare 'Set angolo di rotazione', e immettere '180' in 'di rotazione Y'.
- Assicurarsi che i marcatori ventricoli e della linea mediana sono meglio allineati prima di salvare il file di ricostruzione, come nel passaggio 1.4.4.
- Ripetere passaggi 1.4.5 a 1.4.9 per ogni sezione di tessuto successivo fino a quando tutti sono stati importati e correttamente allineati.
- Per visualizzare i dati del volume della ricostruzione di serie, fare clic su Analisi> 'Marcatori e Regione Analysis' e selezionare '3D Contour Riepilogo'. Selezionare tutti i contorni nel pannello a sinistra e fare clic sul pulsante 'Visualizzazione 3D' per visualizzare la ricostruzione 3D finale.
2. umana: Analisi di periventricolare Cellular Integrità e modellazione 3D del ventricolo laterale
2.1) Analisi umana MRI dati
NOTA: I protocolli sono elencati per creare ricostruzioni di immagini 3D e quantificazione volumetrica dei ventricoli laterali e valutare variazioni volumetriche nel tempo utilizzando l'analisi di sovrapposizione longitudinale. È importante notare che la coerenza della rilevazione MR dati (ad esempio, la macchina e la forza del magnete, spessore della sezione, l'orientamento e la risoluzione) e l'elaborazione post-acquisizione sono criteri estremamente importanti per l'inclusione di insiemi di dati 20.
- Segmentazione ventricolare
NOTA: ITK / Snap è utilizzato per segmentare i ventricoli da immagini ad alta risoluzione MR T1 pesate. In alternativa, può essere utilizzato altri software freeware come freesurfer.- Aperto ITK / Snap, File> Apri in scala di grigi Immagine. Selezionare il file desiderato e aprire come file .nii (file NITFI).
- Scorrere ogni anataereo omical, rilevando anomalie ventricolare (regioni stenotiche, grandi o piccole corna temporali, ecc). Nel pannello degli strumenti fare clic su 'Snake ROI Tool'. Fare clic su 'Segment 3D'. Selezionare l'opzione 'Intensity Regione'.
- Fare clic su 'preprocessing immagine'. Seleziona 'Above', per includere le regioni al di sotto di una certa soglia di intensità al fine di evidenziare il ROI in bianco. Registra intensità massima usando la barra di scorrimento. Impostare la soglia al 15% della massima intensità (record di tale valore). Impostare il parametro morbidezza a 10. Fare clic su 'OK', quindi 'Avanti'.
- Aggiungere 10-12 piccola (misura 2) 'bolle' ad ogni ventricolo: due nel corno frontale anteriore, sette uniformemente distanziati lungo la superficie superiore del corpo ventricolo laterale, uno nel corno occipitale e uno nel corno temporale del ventricolo laterale. 'Selezionare Parametri' e impostare la forza di curvatura a 0,4. Clicca Play Simbolo per iniziare evoluzione contorno attivo.
- Fare clic su 'Aggiorna Mesh' di visualizzare la superficie; controllare 'aggiornamento automatico'. Arrestare segmentazione quando tutte le aree del ventricolo laterale sono inclusi nella regione di interesse (ROI). Evitare l'inserimento del terzo ventricolo. Fare clic su 'Fine'.
- Modificare manualmente l'immagine, se necessario, eliminare aree indesiderate con i seguenti metodi (in genere bisogno di cancellare terzo ventricolo perdite). Utilizzare manualmente lo strumento '3D Bisturi' per rimuovere le regioni in eccesso o manualmente utilizzare lo strumento 'Pennello' con 'Clear Etichetta' come l'etichetta di disegno attiva per cancellare l'eventuale inclusione di là di ROI.
- Salvare i risultati di segmentazione come immagini .nii (formato file 'NIfTI').
- Per ottenere il volume totale ventricolo, selezionare 'Segmentazione> Volume' e Statistica; ottenere il volume totale del ventricolo utilizzando set di etichette colore.
- Rappresentazione longitudinale laterale ventricoli Da MRIScans
NOTA: l'utilizzoSoftware Mango, ROI longitudinali sono sovrapposti a dimostrare qualitativamente e quantitativamente le variazioni di volume del ventricolo entro soggetti nel corso del tempo.- Aprire Mango. Fare clic su File> Carica ROI del punto di tempo prima ROI (baseline) come GREEN. File> Carica ROI del secondo punto di volta ROI a RED. Salva sovrapposizione longitudinale selezionando File> Salva con nome; assegnare ad ogni immagine come 'name_ file [prima età punto temporale] - [età punto seconda volta] .nii'.
- Aprire ITK-SNAP. Riaprire il ROI combinato come 'immagine in scala di grigi', selezionando Segmentazione> Carica da Immagine> file ROI combinato. Per ottenere dati sui volumi longitudinali eseguire il seguente: Segmentazione> Volume e statistiche> Etichetta 1 (rosso) = volume di espansione; Etichetta 2 (verde) = volume di stenosi; Etichetta Volume 3 (blu) = base.
2.2) periventricolare umana del tessuto Preparazione e analisi
- Norme di sicurezza per lavorare con i tessuti umani
- Ottenere appropformazione sulla sicurezza riate (ad es., per via ematica corso patogeni).
- Osservare (universale) misure di sicurezza standard. Indossare guanti. Cambiare i guanti prima di toccare qualsiasi apparecchiatura comune o superfici che non sono usa e getta. Etichettare tutti gli elementi normalmente trattati quando si lavora con i tessuti umani con denominazioni «uso di tessuti umani.
- Seguire le pratiche di decontaminazione per tutti gli articoli a contatto con i tessuti umani. Bleach tutti i liquidi contaminati per un minimo di 24 ore prima dello smaltimento, il trattamento di superfici contaminate con un asciugamano imbevuto di candeggina (per esempio, da banco) o mettendo oggetto direttamente in candeggina (ad esempio una pinza).
- Preparare piano di emergenza per il contatto con i tessuti umani direttamente sulla pelle, che possono includere ammollo un tovagliolo di carta in candeggina e tenendo premuto sulla zona interessata (5-10 minuti).
- Usare un appropriato smaltimento dei rifiuti per tutti gli articoli che entrano in contatto con i tessuti umani.
- Ventricolo laterale Monte Preparazione tutto
- Beginning con un emisfero intatto (fissato in formalina al 10% e sciacquati accuratamente con 0,1 M PBS), tagliare 1,5 centimetri di spessore sezioni coronali attraverso tutto l'emisfero mezzo di grande lama.
NOTA: Tutti i protocolli di fissaggio richiedono la verifica degli anticorpi prima. - Sezioni Label davanti a dietro a cominciare dalla prima sezione contenente il ventricolo laterale. Utilizzare un sistema di etichettatura alfanumerico, etichettatura le fette con le lettere (anteriore a posteriore) e il paragrafo con i numeri (top-down). Evitare di interrompere la superficie ependimale.
- Utilizzando bisturi microchirurgico, sezionare parete del ventricolo 1 centimetro di profondità, mantenendo una sezione continua per tutta la parete laterale. Suddividere parete come necessario per creare sezioni di dimensioni appropriate per la colorazione bene. Sezione Notch sul lato opposto della parete del ventricolo per identificare l'orientamento superiore / inferiore.
- Eseguire recupero dell'antigene incubando sezioni di tessuto in 10 mM tampone citrato di sodio (pH 6.0) a 100 ° C per 10-20 minuti usando una doppia boiler (tempo ottimale di incubazione è determinato empiricamente). Lavare 3 volte in PBS / 0,1% Triton X-100 (PBS-TX).
- Block in siero di cavallo 10% utilizzando PBS / PBS-TX per 1 ora a temperatura ambiente.
- Incubare con anticorpi primari per 48 ore a 4 ° C. Per visualizzare rivestimento della parete del ventricolo, immunostain monta intere con le seguenti combinazioni di anticorpi: topo anti-β-catenina (1: 250); capra anti-GFAP (1: 250); coniglio anti-AQP4 (1: 400).
- Eseguire tutti i passaggi successivi al buio. Risciacquare tessuto 3 volte in PBS, incubate con anticorpi secondari (1: 500) per 24 ore a 4 ° C o 2 ore a temperatura ambiente, e risciacquare altre 3 volte in PBS. Incubare il tessuto con DAPI per 7 minuti a temperatura ambiente seguita con altri 3 lavaggi in PBS.
- Preparare il tessuto per la dissezione finale coprendo un piatto fondo di cera con parafilm. Riempire piatto con PBS, posizionare il tessuto in un piatto con una pinza sottile, evitando di entrare in contatto con la parete ependimale.
- Sotto il microscopio da dissezione, fermamente secure tessuto sui suoi perni laterali utilizzando. Con un microchirurgico coltello pugnalata 22,5 °, creare sezioni sottili omogenei (spessore circa 300 micron) di parete del ventricolo laterale. Per le grandi sezioni o sezioni con curvatura difficile, tagliata a cubetti piccoli prima di tagliare in sezioni finali per il montaggio e la posizione nota.
- Posizionare con cura la sezione sezionato lato ependima su sopra presentazione utilizzando una pinza sottile, prendendo atto della posizione e l'orientamento regionale sulla diapositiva. Ricoprire il tessuto con uno strato sottile di aquapolymount, avendo cura di evitare bolle. Posizionare vetrino su tessuto, aggiungere aquapolymount supplementare se necessario per colmare le eventuali lacune sotto coprioggetto.
- Inserire sezioni montate in buio e asciutto per 2-3 giorni a temperatura ambiente. Conservare in slidebox a 4 ° C.
- Beginning con un emisfero intatto (fissato in formalina al 10% e sciacquati accuratamente con 0,1 M PBS), tagliare 1,5 centimetri di spessore sezioni coronali attraverso tutto l'emisfero mezzo di grande lama.
- Immunoistochimica e analisi istologica
- Utilizzando la microscopia confocale per visualizzare immunoistochimica fluorescente, impostare il piano focale di imaging in superficie ventricolo, come determinato mediante l'uso of β-catenina (marcatore per adherens apicali giunzione proteine delle cellule ependimali). Delineare le regioni di copertura cellulare ependimale e astrogliosis superficie (GFAP macchie sulla superficie del ventricolo).
- Per documentare e montage l'intera superficie ventricolo, utilizzare le immagini sovrapposte per coprire tutta la superficie. Per creare montaggio di immagini seriali, aprire Adobe Photoshop. Utilizzare File> Automatizza> Photomerge disposizione> Interattivo per selezionare le immagini da sovrapporre, le regolazioni manuali, se necessario.
- Crea un nuovo livello di tracciare montaggio per generare la rappresentazione a fumetti di copertura cellulare ependima intatto o gliosi superficie ventricolo. Ripetere l'operazione per ogni diapositiva o ROI. Compilare tutte le sezioni di ricostruire la mappa di parete del ventricolo e link alla corrispondente regione alla MRI ricostruzione.
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Representative Results
Contour tracciamento dei ventricoli laterali del mouse sulla base immunostained 50 micron sezioni coronali e ricostruzioni 3D (Figura 3) consente ai dati del volume per essere raccolti in diversi paradigmi sperimentali utilizzando il mouse come sistema modello per la malattia o infortunio. Fondamentale per questa procedura è l'esclusione delle regioni in cui le pareti laterali ventricolo aderiscono l'uno all'altro. Con subsegmenting regioni dei ventricoli e la designazione di un colore diverso per ogni regione (Figura 3C), sezioni contigue possano essere rispettati e il volume totale regionale e possono essere calcolati da sottosegmenti compilati.
Studi simili possono essere eseguite utilizzando scansioni MRI del cervello insieme con la segmentazione semi-automatico (ITK-SNAP) dei ventricoli laterali per rendering 3D. Per l'abbinamento diretto di volumi ventricolo e analisi dei tessuti periventricolare, pre- o post-mortem scansioni MRI sono segmentati e allineati per creare ricostruzioni 3D (
Figura 1: Esecuzione di segmentazione ventricolo laterale utilizzando la ITK scatto / Snake ROI Tool (A) 'Bubbles' sono aggiunte le ventricoli laterali. (B) 'Bubbles' espandersi durante l'evoluzione del profilo attivo. (C) La segmentazione è completa quando tutta la ventricolo laterale è piena. (Cura è presa per evitare il 3 ° ventricolo.)
Figura 2: parete del ventricolo laterale umana dissezione (
Figura 3: Tracing e ricostruzione 3D dei ventricoli laterali del mouse (Una sezione cervello di topo coronale compresi ventricoli laterali, delineati da cellule ependimali S100β-immunoreattive (*, laterali ventricoli, staffa, nella regione di ade. sione; barra della scala, a 500 micron). Ventricoli laterali (B) del mouse sono tracciate come "contorni" e disposti come sezioni sub-segmentato, escludendo le regioni di adesione intraventricolare di interferire con l'analisi volumetrica. (C) ricostruzione 3D dei contorni ventricolo laterale. Giallo, contorno di volume del cervello intero attraversa la regione di interesse che contiene i ventricoli laterali.
Figura 4: a base di MRI segmentazione ventricolo laterale (A) MR immagini vengono assemblate. (B) ventricolo laterale è definita come ROI (rosso). (C) 3D ricostruzione di immagini consente per la quantificazione volumetrica e la visualizzazione qualitativa del ventricolo laterale.
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Figura 5: Valutazione di dilatazione ventricolare longitudinale Longitudinal risonanza magnetica da più punti può essere allineato e sovrapposti per visualizzare e quantificare l'espansione del volume del ventricolo entro soggetti nel corso del tempo.
Figura 6: valutazione immunoistochimica e mappatura regionale di superficie umana ventricolo laterale (A) Aree di cellule ependima intatte, delineato da β-catenina colorazione, mostrano un aspetto ciottolato (asterisco) e sono delimitate da una linea tratteggiata dalle regioni di astrogliosis sulla superficie ventricolo (GFAP + colorazione). (B) le immagini confocale seriali vengono sovrapposti per creare un montaggio regionale e tracciati utilizzando Adobe Photoshop per la rappresentazione del fumetto di organizzazione cellulare in superficie ventricolo. (C) del fumetto diimmagine montaggio viene mappato superficie ventricolo sul corrispondente MRI basato ventricolo 3D ricostruzione. (Scala bar (A), 40 micron, bar Scale (B), 1 mm)
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Discussion
Presentiamo strumenti e protocolli che possono essere utilizzati per valutare l'integrità del sistema ventricolare del cervello in topi e negli esseri umani. Questi strumenti, tuttavia, possono essere applicati anche ad altre strutture cerebrali o sistemi di organi che subiscono variazioni dovute a lesioni, malattie, o durante il processo di invecchiamento 14,21,22. Le strategie presentate approfittare di software che permette l'allineamento di sequenze MRI trasversali e longitudinali per generare rappresentazioni di volume 3D di regioni o strutture di interesse specifici. Sequenze longitudinale MRI permettono la compilazione di cambiamento del volume in 3D che si verificano nel tempo e possono essere estesi per includere volume totale del cervello, per ventricolo laterale in rapporto al volume totale del cervello, e / o di altre strutture cerebrali (ad esempio, nucleo subtalamico 23 o corpo calloso tratti di materia bianca utilizzando pesata in diffusione imaging del tensore). Insieme, un'analisi completa di cambiamenti strutturali del cervello può essere eseguita. In Definitiva,per valutare le variazioni legate all'età e malattie correlate a strutture cerebrali un insieme di tecniche di imaging multimodale sono necessari per fornire il quadro più preciso di cervello lo stato di salute 24. Documentazione e raccolta di dati strutturali critici, insieme con la variabilità soggetto-oggetto e il range di variabilità tra i soggetti, potrebbe idealmente essere utilizzati per generare ultra-alto campo MRI atlanti di guida migliore diagnosi clinica di tessuti in salute o di malattia.
Diversi passaggi critici sono importante notare al fine di diminuire acquisizione e l'elaborazione di variabilità tra e all'interno dei set di dati soggetti. Idealmente per ottenere sequenze di dati abbinati, la stessa MRI scanner e la sequenza tipo deve essere utilizzato nel corso dello studio. Tessuto cerebrale post-mortem è spesso di qualità variabile; fattori critici come la causa della morte, l'intervallo post-mortem, qualità della perfusione, e la lunghezza di tempo in fissativo tutti possono influenzare la colorazione efficacia e la necessità di unprotocollo di recupero dell'antigene. Inoltre, la dimensione del cervello umano richiede più sezioni fetta con ogni fetta richiede ulteriori manipolazioni di ottenere tessuto contenente le regioni di interesse. Pertanto, è fondamentale che la posizione e l'orientamento di ciascuna sezione è chiaramente contrassegnati e registrati. In definitiva, il problema principale con analisi dei tessuti post-mortem è proprio quello - è postmortem - e quindi fornisce soltanto una visione istantanea del tessuto al termine della vita. Miglioramento delle tecniche di imaging multimodale è richiesta per l'analisi in tempo reale delle modifiche alle strutture cerebrali e informazioni morfo-funzionale con risoluzione di cellulare.
Studi mouse permettono interrogatori della condizione variabile umana variabile e non presentano molte delle difficoltà incontrate quando si lavora con i tessuti umani. Studi mouse utilizzati per modellare malattie umane o lesioni attraverso l'analisi delle dinamiche strutturali causali possono offrire miglioramenti per la malattia modello validation. Tuttavia, le differenze specie-specifici da notare. Nella nostra analisi dei ventricoli laterali, è importante notare che i topi mantengono una nicchia di cellule staminali attiva lungo la parete laterale dei ventricoli laterali e staminali cellulo-mediata riparazione rigenerativa del ventricolo rivestimento si verifica nei casi di modesta perdita di cellule ependimali, come si trovano in topi anziani o quando si verifica limitata denudamento cella ependimale attraverso l'esposizione del ependima di neuroaminidasi 19. Al contrario, gli esseri umani non mantengono una robusta nicchia cellule staminali lungo le pareti laterali 25-27 ventricolo e piccoli, eventualmente, la rigenerazione è probabile. In contrasto topi anziani, esseri umani di età mostrano vasta astrogliosis alla superficie ventricolare associato espansione ventricolo 6. Questo livello di denudamento e 'sfregio' del rivestimento ventricolare può essere modellato in mouse usando neuraminidasi per spogliare il rivestimento ventricolo cellule ependimali 6,28. Inoltre, è importante riconoscere thin topi da terrario mantenuto non esperienza infezioni, malattie o traumi, presentando una storia medica molto diverso dalla maggior parte dei soggetti umani. Inoltre, i topi in genere non mostrano malattie neurodegenerative associate all'età, ventricolomegalia o gliosi periventricolare. Pertanto, per osservare questi fenotipi che devono essere modellati. Alla fine, nessun modello animale può riassumere pienamente l'ontogenesi, fisiopatologia, e la complessità sintomatico della malattia umana e questi limiti devono essere riconosciute e adeguatamente comunicata.
In sintesi, vi presentiamo le tecniche e protocolli per valutare i volumi ventricolo laterale in topo e umano. Ventricoli possono essere resi in 3D e l'analisi longitudinale permette la compilazione di cambiamento del volume spazio-temporali. Inoltre, utilizzando il tessuto cerebrale in coppia si dimostra come funzionalità cellulare può essere collegato alle variazioni dei volumi ventricolari. Recenti risultati dimostrando aumento dei livelli di Aquaporin-4 espressione in aree di periventricular gliosi suggerisce edema lungo la superficie ventricolo. Pertanto le indagini future accoppiano FLAIR-RM con istologia tessuto miglioreranno la nostra comprensione di CSF e di scambio liquido interstiziale, e fornire informazioni critiche sulla salute del sistema ventricolare e di come il suo deterioramento colpisce diverse funzioni cerebrali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 21600-069 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Use at 4% in PBS, 4 °C |
| Normal Horse Serum | Life Technologies | 16050 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Triton X-100 (TX) | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.1% in PBS (v/v) |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Imager.M2 | |
| Camera | Hamamatsu | ORCA R2 | |
| Microscope Stage Controller | Ludl Electronic Products | MAC 6000 | |
| Stereology software | MBF Bioscience | Stereo Investigator 11 | |
| Stereology software | ImageJ/NIH | NIH freeware | |
| 3D Reconstruction software | MBF Bioscience | Neurolucida Explorer | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | |
| MRI Software | |||
| Freesurfer | https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall | Segmentation and Volume | |
| ITK-Snap | http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php | Segmentation and Volume | |
| Multi-image Analysis GUI (Mango) | http://ric.uthscsa.edu/mango/ | Longitudinal overlay | |
| Whole Mount Equipment | |||
| 22.5° microsurgical straight stab knife | Fisher Scientific | NC9854830 | |
| parafilm | |||
| wax bottom dissecting dish | |||
| pins | |||
| fine forceps | |||
| aquapolymount | |||
| Dissecting Microscope | Leica | MZ95 | |
| Whole Mount Antibodies | |||
| mouse anti-b-catenin | BD Bioschiences, San Jose, CA, USA | 1:250 | |
| goat anti-GFAP | Santa Cruz Biotechnology | 1:250 | |
| rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4) | Sigma-Aldrich | 1:400 | |
| Coronal Antibodies | |||
| Anti-S100β antibody | Sigma-Aldrich | 1:500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D-1306 | 10 µg/ml in PBS |
References
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