Introduction
Um ependimais linhas monocamada de células do sistema ventricular do cérebro fornecendo funções de barreira e de transporte bi-direccionais entre o cerebral fluido espinhal (CSF) e fluido intersticial (ISF) 1-3. Estas funções ajudam a manter o cérebro e no equilíbrio fisiológico 2,3 livre de substâncias tóxicas. Nos seres humanos a perda de porções do revestimento esta, devido a lesão ou doença não parece resultar na substituição regenerativa como encontrado em outros revestimentos epiteliais; em vez de perda de cobertura de célula ependimária parece resultar em astrogliose periventricular com uma malha de astrócitos que abrangem regiões desnudados de células ependimais na superfície do ventrículo. As repercussões graves para mecanismos importantes CSF / troca ISF e de apuramento seria previsível como resultado da perda desta camada epitelial 1,2,4-7.
Uma característica comum de envelhecimento humano é ampliado ventrículos laterais (ventriculomegalia) e edema periventricular associadas como observed por ressonância magnética e-fluido recuperação inversa da atenuação de ressonância magnética (MRI / DOM) 8-14. Para investigar a relação entre ventriculomegalia e a organização celular do revestimento do ventrículo, seqüências de RM humanos post-mortem foram combinados com preparações histológicas de tecido periventricular ventrículo lateral. Nos casos de ventriculomegalia, áreas substanciais de gliosis tinha substituído cobertura celular ependymal ao longo da parede do ventrículo lateral. Quando a expansão ventrículo não foi detectado por análise de volume com base em ressonância magnética, o revestimento celular ependimária estava intacto e gliose não foi detectada ao longo do revestimento do ventrículo 6. Esta abordagem combinatória representa a primeira documentação detalhando mudanças abrangentes na integridade celular do revestimento do ventrículo lateral usando preparações wholemount de partes ou toda a parede ventrículo lateral e modelagem 3D dos volumes do ventrículo 6. Várias doenças (doença de Alzheimer, esquizofrenia) e lesões (traumatismo crânio-encefálico)ventriculomegalia mostrar como um recurso neuropatológico cedo. Desnudação de áreas do revestimento celular ependymal assim seria previsto para interferir com a função das células ependymal normal e comprometer o equilíbrio homeostático entre CSF / fluido ISF eo intercâmbio soluto. Assim, um exame mais profundo de mudanças no sistema ventricular, a sua composição celular, ea consequência para estruturas cerebrais subjacentes ou vizinhos acabará por começar a revelar mais sobre a neuropatologia associada com aumento do ventrículo.
A falta de dados de imagens multimodais, nomeadamente sequências de dados longitudinais, juntamente com acesso limitado a amostras de tecido histológico correspondente torna a análise de patologias cerebrais humanas difícil. Modelando fenótipos encontrados em envelhecimento humano ou doença muitas vezes pode ser conseguido com modelos do rato e modelos animais tornar-se um dos nossos melhores meios para explorar questões sobre iniciação doença humana e progressão. Vários estudos incamundongos jovens saudáveis têm descrito a citoarquitetura das paredes do ventrículo lateral e o nicho de células-tronco subjacente 4,7-15. Esses estudos foram alargados para incluir a modelagem 3D e análise celular das paredes do ventrículo através de envelhecimento 6,15. Nem gliosis periventricular nem ventriculomegalia são observados em ratos envelhecidos, em vez ratos exibir uma zona subventicular relativamente robusta (SVZ) tronco nicho de células subjacente a uma célula ependymal intacto forro 6,15. Assim, as diferenças específicas de espécies de batimento existir tanto na manutenção geral e integridade do revestimento ventrículo lateral durante o processo de envelhecimento 6,15. Portanto, para melhores ratinhos uso para interrogar condições encontradas em seres humanos, as diferenças entre as duas espécies têm de ser caracterizada apropriadamente e considerado em qualquer paradigma de modelagem. Aqui, apresentamos os procedimentos para avaliar as mudanças longitudinais para os ventrículos laterais e do tecido periventricular associadas em seres humanos e mouse. Nossos procedimentos incluem renderização em 3D e volumetria do mouse e ventrículos humanos e uso de análise imuno-histoquímica das preparações inteiras de montagem de tecido periventricular para caracterizar tanto organização e estrutura celular. Em conjunto, estes procedimentos proporcionam um meio para caracterizar as alterações no sistema ventricular e tecido periventricular associado.
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Protocol
NOTA: os procedimentos com animais foram aprovados pela Universidade de Connecticut IACUC e em conformidade com as diretrizes do NIH. Tecidos humanos e análise de dados e procedimentos estavam em conformidade com e aprovado pela Universidade de Connecticut IRB e em conformidade com as diretrizes do NIH.
1. Mouse: Análise de Periventricular Cellular Integridade e Modelagem 3D do ventrículo lateral
1.1) Preparação do rato lateral do ventrículo parede inteira Mounts
- Prepare rato lateral do ventrículo peças inteiras para imuno-histoquímica (IHQ) como previamente descrito 16,17.
1.2) Imuno-histoquímica para Análise ventrículo lateral
- Fix e tecido seção cérebro do rato como descrito anteriormente 18,19.
- Resumidamente, ratinhos de descarga transcardíaca com o normal, solução salina à temperatura ambiente, até que os órgãos sejam apagadas (indicada por uma coloração pálida), seguido por temperatura ambiente 4% de paraformaldeído(PFA) em 0,1 M de tampão fosfato salino (PBS) até que o tecido tenha endurecido.
- Remover o cérebro do crânio. Use tesouras de dissecação de íris para cortar a partir da base do crânio ao longo da sutura sagital.
- Expor crânio e remover cérebro com uma pinça. Mergulha-se o cérebro em PFA a 4% fixador durante a noite a 4 ° C. Em seguida, lavar 3 vezes durante 20 min com PBS.
- Prepare cortes seriados para imuno-histoquímica e análise de volume.
- Usando um bisturi microcirúrgico, fazer uma pequena incisão longitudinalmente ao longo do córtex do hemisfério esquerdo para permitir a identificação do hemisfério esquerdo do hemisfério direito quando seções flutuantes são imunocorados.
- EnCase cérebros em 3% de agarose para um suporte estrutural adicionado fixa durante vibratome seccionamento. Quente de agarose a 3% em água destilada (w / v) até ficar completamente dissolvido usando um forno de microondas ou placa quente.
- Com uma lâmina de barbear, remover a secção de caudal do cérebro no cerebelo com umcorte coronal, deixando uma superfície plana e uniforme. Aplicar super-cola para a fase de tecido e posicione o cérebro na superfície recém-cortado com os bulbos olfatórios voltadas para cima.
- Quando a solução de agarose líquido arrefecido a uma temperatura pouco quente ao toque, aplicam-se uniformemente ao longo do cérebro para envolver completamente todo o cérebro. Permitir que a agarose solidificar.
- Secção de agarose envolto cérebros coronalmente em um vibratome em secções de 50 um, com secções colocadas em série numa placa de 24 poços contendo PBS, a fim de preservar a ordem sequencial.
Nota: Geralmente 12 poços são usados para um cérebro, com coleta de tecido começando cinco seções antes de ver o surgimento dos ventrículos laterais começando com bem A1, movendo-se numericamente através de B6 e de bicicleta de volta à A1. Isso permite que várias seções distintas do mesmo cérebro para ser processada dentro do mesmo bem. Para a análise de volume do ventrículo lateral, coleta de tecido cessou quando o ventrículo laterals e terceiro ventrículo mesclagem, resultando em cerca de 3 secções por bem ou 36 seções total. - Aspirar o PBS com uma pipeta de transferência afixada com uma micropipeta ponta 20-200 ul para garantir que as seções flutuantes não são acidentalmente aspirados. Bloquear e permeabilizar secções flutuantes em 10% de soro, 0,1% de Triton X-100 (TX) em PBS (PBS-TX), durante 1 h à temperatura ambiente. Use 300 ul de solução por cavidade para cobrir as secções de tecido de flutuação livre em uma placa de 24 poços e as incubações de executar todas as secções sobre uma placa de balanço.
- Aspirar a solução de bloqueio, e incuba-se secções com anticorpos primários em PBS-TX durante a noite (pelo menos 12 horas) a 4 ° C. Para vestígios volume do ventrículo utilizando cortes coronais, utilize o anticorpo anti-S100β para rotular células ependimárias.
- Aspirar solução de anticorpo primário, e secções de lavar 3 vezes durante 10 minutos cada com PBS-TX.
- Incubar seções no escuro durante 1 hora a tempera quartotura com anticorpos secundários fluorescentes, em concentrações de 1: 1000 em 10% de soro, PBS-TX. Mantenha seções no escuro para todas as etapas de incubação restantes.
- Aspirar solução de anticorpo secundário e incubar secções com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol em PBS (DAPI, 10 ug / ml) durante 5 min para contracoloração núcleos celulares. Aspirar a solução DAPI e enxaguar seções 3 vezes durante 10 minutos cada com PBS.
- Seções de montagem em série em lâminas usando a marca cortical para preservar esquerda versus orientação hemisfério direito. Ar secções secos sob a lamela escuro e depois por aplicação de uma fina camada de meio de montagem para a corrediça e suavemente colocar uma lamela de vidro na parte superior. Permitir lâminas lamínulas para secar durante a noite à temperatura ambiente.
1.3) Segmentação ventrículo lateral para reconstruções em 3D
NOTA: Execute o rastreio de ventrículos laterais usando software de mapeamento em um microsco epifluorescência verticalpe com um palco automatizado e uma câmera CCD digital para detecção de fluorescência.
- Ligue o equipamento microscópio de fluorescência e lançar o software de mapeamento no modo de fluorescência. Abertas 'Opções de exibição' para carregar as barras de ferramentas adequadas e painéis de ferramentas de encaixe necessários para o rastreamento. Opções> Opções de visualização> Acessórios e selecione o 'Main' e barras de ferramentas 'marcador'. No mesmo menu, selecione 'Camera Histograma', 'Controle Multicanal "," Definições da Câmara "e" Aquisição de Imagem "em" Painéis de ferramentas Docking.'
- Observe começos dos ventrículos com base em fluorescência forte S-100β que rotula células ependimárias que a linha do ventrículo lateral. Identificar a primeira peça de tecido contendo os ventrículos laterais.
- Criar um novo arquivo de dados e designar um ponto de referência para o movimento palco clicando na janela da imagem acima do ventrículo lateral esquerdo. Olhe para o pequenoincisão para orientar esquerda do hemisfério direito. Mantenha o ponto de referência em um local relativamente consistente aos ventrículos laterais através de arquivos de rastreamento para ajudar ao importar contornos para a reconstrução de série.
- Selecione o tipo de contorno predefinido apropriado a partir do contorno menu drop-down, por exemplo, 'Left lateral do ventrículo. Usar uma única cor para cada um dos traçados ventrículo lateral esquerdo e direito. Se forem necessárias alterações no nome do contorno e cor, vá para Opções> Preferências> Exibição Contours, em seguida, modificar os nomes das cores contorno ou selecione "Adicionar tipo de Contour '.
- Com o contorno 'Left lateral do ventrículo' selecionada, clique em ao longo da superfície apical do revestimento ependymal para começar o contorno de rastreamento. Trace o ventrículo, continuando a clique sucessivamente ao longo da superfície apical.
- Para as áreas irregulares que exigem mais finesse, clique e segure o botão esquerdo do mouse, a fim de traçar mão livre. Pressione Ctrl + Z, ou ir to Opções> Desfazer para desfazer o ponto de contorno anterior. Mova a janela de rastreamento usando as setas do teclado ou fazendo um contorno apontar fora da tela e permitindo que a janela para centrar-se automaticamente. Para finalizar o rastreamento clique ventrículo direito e selecione "Fechar contorno".
- Selecione uma nova cor de contorno (tipo de contorno) para o ventrículo lateral direita usando o menu drop-down. Trace o ventrículo direito como no Passo 1.3.4 para a esquerda.
- Se forem necessárias alterações de nome e cor do contorno, clique direito sobre o contorno e selecione Alterar Contour Tipo de escolher a cor apropriada.
- Adicionar marcadores ao longo da linha média para auxiliar no alinhamento contornos de série para a reconstrução 3D. Para adicionar marcadores, selecione o marcador apropriado (use o 'X') a partir da barra de ferramentas Marcadores à esquerda e clique para soltá-los na tela do traçado. Marcadores de importação, juntamente com os contornos para cada traço secção de tecido.
- Para salvar a vestígios de tecido, selecione Arquivo> SalvarArquivo de Dados Como e criar um nome de pasta e arquivo novo. Número traçados [Slide #] - [#] tecido para facilitar a identificação de traços de cortes seriados. Por exemplo, a seção de tecido terceiro no segundo slide tem o nome do arquivo '2-3' dentro do diretório para cada cérebro.
- Repita os passos 1.3.4 a 1.3.9 para cada seção de série do tecido cerebral para rastrear os ventrículos através de todo o cérebro, com excepção das regiões de adesão da parede do ventrículo.
- Se o ventrículo tem uma região de adesão, sub-segmento da região anterior daqueles dorsal e ventral para o sítio de adesão. Criar dois novos tipos de contorno para cada ventrículo (por exemplo, 'Dorsal Ventrículo Esquerdo' e 'Ventral Ventrículo Esquerdo'). Na primeira fatia de tecido com a adesão, rastrear o ventrículo lateral, com tanto o contorno original lateral do ventrículo e da nova dorsal e ventral contornos para assegurar uma reconstituição completa do ventrículo pode ser criado.
- Em secções posteriores a uma ventricle adesão parede, criar um conjunto de novas cores de contorno para a parte posterior de cada ventrículo (por exemplo, 'Posterior Ventrículo Esquerdo'). Double-traçar esta seção primeiro re-entrou para tanto com a adesão atual e novos tipos de contorno posterior.
1.4) Reconstrução lateral do ventrículo 3D
- Alinhe e compilar traçados de contorno de série dos ventrículos laterais do mouse para gerar reconstruções 3D e dados volumétricos.
- Abrir programa de reconstrução 3D. Clique em Arquivo> Abrir e selecione o arquivo de contorno da secção de série primeiro rastreado. Importe os traçados de contorno do ventrículo esquerdo e direito, bem como quaisquer marcadores adicionados.
- Para selecionar contornos, clique no botão "Selecionar objetos" (ícone de cursor) e selecionar os dois ventrículos e marcadores, segurando 'Ctrl'. Para estabelecer a posição Z dos contornos, clique direito e selecione "Modificar Posição Z '. Defina a primeira fatia de tecido para 0 mm. <li> Para salvar a reconstrução, selecione Arquivo> Salvar arquivo de dados como. Salvar depois de cada importação do arquivo, por isso, se um erro é cometido a recuperação é tão fácil quanto re-carregar o arquivo anterior.
- Para adicionar a fatia de tecido junto à reconstrução, clique em Arquivo> Anexar para exibir. Selecione o arquivo .dat seja anexado, e marque a caixa "Mesclar".
- Siga o passo 1.4.3 para mais uma vez ajustar a posição Z do arquivo de rastreamento recém-importado. Selecione apenas os contornos esquerdo e direito recém-adicionados na janela principal para evitar mover os outros vestígios. Defina cada arquivo de rastreamento sucessivas a 50 um a partir da posição Z do contorno anterior para 50 mm seções. (Primeira contorno: z = 0, o segundo contorno: z = 50, terceiro contorno: z = 100, etc.)
- Para ajustar o X, Y posição de contornos e marcadores selecionados, clique no botão "Ativar tradução com Mouse 'botão e arrastar os contornos para alinhar com os contornos dos tecidos anteriores. Mantenha ambos os contornos esquerdo e direito do traço atual selecionadopara permitir o movimento síncrono.
- Para rodar os traços no sentido horário ou anti-horário para alinhar os marcadores da linha média, selecione o botão 'Z-eixo de rotação ". Para virar contornos ao longo do eixo Y (se o contorno esquerdo está à direita) selecione ambos os contornos e os marcadores importados, clique com botão direito, selecione 'Set Ângulo de rotação', e digite '180' para o 'rotação Y'.
- Certifique-se de que os marcadores ventrículos ea linha média são melhor alinhadas antes de salvar o arquivo de reconstrução, como no Passo 1.4.4.
- Repita os passos 1.4.5 a 1.4.9 para cada fatia do tecido subsequente até que todos tenham sido importados e devidamente alinhados.
- Para visualizar dados de volume da reconstrução de série, clique em Análise> 'Marcadores e Análise Região "e selecione" Contour 3D Resumo'. Selecione todos os contornos do painel do lado esquerdo e, em seguida, clique no botão "Visualização 3D 'para exibir a reconstrução 3D final.
2. Humana: Análise de Periventricular Cellular Integridade e Modelagem 3D do ventrículo lateral
2.1) Análise dos dados de MRI Humana
Nota: Os protocolos são listados para criar reconstruções de imagens em 3D e quantificação volumétrica dos ventrículos laterais e avaliar as mudanças volumétricas ao longo do tempo por meio de análise de sobreposição longitudinal. É importante notar que a coerência na recolha MR dados (por exemplo, máquina e força ímã, espessura de corte, orientação e resolução) e processamento pós-aquisição são critérios extremamente importantes para a inclusão de conjuntos de dados 20.
- Segmentação ventricular
NOTA: ITK / de pressão é usado para segmentar os ventrículos de alta resolução imagens de RM ponderadas em T1. Alternativamente, outro software gratuito como o FreeSurfer pode ser usado.- Abrir ITK / Snap, File> Open imagem em tons de cinza. Selecione o arquivo desejado e aberto como um (arquivo NITFI) arquivo .nii.
- Percorra cada anatplano efec- tuada, observando anormalidades ventriculares (regiões estenosadas, chifres temporais grandes ou pequenas, etc.). Na caixa de ferramentas principal, clique em 'Ferramenta de ROI Snake'. Clique em "Segmento 3D '. Selecione a opção "Intensidade Região".
- Clique em 'Preprocess Imagem'. Selecione 'Above', para incluir regiões abaixo de um determinado limiar de intensidade, a fim de destacar ROI em branco. Grave intensidade máxima usando a barra deslizante. Definir o limite de 15% da intensidade máxima (recorde este valor). Ajuste o parâmetro suavidade ao 10. Clique em 'OK', depois em 'Next'.
- Adicionar 10-12 pequeno (tamanho 2) 'bolhas' para cada ventrículo: dois no corno frontal anterior, sete uniformemente espaçados ao longo da superfície superior do corpo do ventrículo lateral, um no corno occipital e um no corno temporal do ventrículo lateral. 'Selecione Parâmetros' e definir vigor curvatura para 0,4. Clique no símbolo Play para começar a evolução contorno ativo.
- Clique em 'Atualizar Malha' para visualizar a superfície; verifique 'Auto-Update'. Pare segmentação quando todas as áreas do ventrículo lateral estão incluídas na região de interesse (ROI). Evitar a inclusão do terceiro ventrículo. Clique em "Concluir".
- Editar imagem manualmente, se necessário, para remover as regiões indesejadas pelos seguintes métodos (tipicamente precisa apagar terceiro vazamento ventrículo). Usar a ferramenta manualmente "Scalpel 3D 'para remover o excesso de regiões ou manualmente usar a ferramenta' Pincel 'com' Limpar Etiqueta 'como o rótulo de desenho ativa para apagar qualquer inclusão além de ROI.
- Exceto resultados de segmentação como uma imagem .nii (formato de arquivo 'NIfTI').
- Para obter volume total ventrículo, selecione 'Segmentação> Volume "e Estatística; obter o volume total do ventrículo usando conjunto de etiquetas de cores.
- Representação longitudinal lateral Ventrículos De MRIScans
NOTA: UsandoSoftware Mango, ROIs longitudinais são sobrepostas a qualitativa e quantitativamente demonstrar mudanças no volume ventricular dentro de temas ao longo do tempo.- Abrir Mango. Clique em Arquivo> Load ROI do ponto de tempo primeira ROI (baseline) como VERDE. Arquivo> Carga ROI do segundo ponto de tempo ROI como RED. Salve sobreposição longitudinal, selecionando Arquivo> Salvar como; atribuir a cada imagem como 'arquivo name_ [primeira idade ponto de tempo] - [idade ponto segunda vez] .nii'.
- Abra ITK-SNAP. Reabrir o ROI combinados como "imagem em tons de cinza ', selecionando Segmentação> Load From Imagem> ROI arquivo combinado. Para obter os dados de volume longitudinais executar o seguinte: Segmentação> Volume e Estatística> Etiqueta 1 (vermelho) = volume de expansão; Etiqueta 2 (verde) = volume de estenose; Rótulo de volume 3 (azul) = base.
2.2) Periventricular Human Tissue Elaboração e Análise
- Instruções de segurança para trabalhar com tecido humano
- Obter approptreinamento de segurança riate (por exemplo., transmitidas por sangue Pathogens claro).
- Observe padrão (universais) as precauções de segurança. Use luvas. Mudar de luvas antes de tocar em qualquer equipamento comum ou superfícies que não são descartáveis. Rotular todos os itens rotineiramente manipulados quando se trabalha com o tecido humano com denominações «uso tecido humano '.
- Siga as práticas de descontaminação para todos os itens contacto com o tecido humano. Bleach todos os líquidos contaminados para um mínimo de 24 horas antes da eliminação, tratar superfícies contaminadas com uma toalha embebida água sanitária (por exemplo, bancada) ou colocando objeto diretamente na água sanitária (por exemplo, fórceps).
- Prepare plano de contingência para o contato com o tecido humano diretamente na pele, que podem incluir a imersão uma toalha de papel em água sanitária e segurando sobre a área afetada (5-10 min).
- Use recipiente adequado de lixo para todos os itens que entrem em contacto com o tecido humano.
- Lateral Ventrículo Preparação Monte todo
- Beginning com um hemisfério intacto (fixo em formol 10% e lavadas cuidadosamente com 0,1 M PBS), 1,5 centímetros de espessura fatia cortes coronais através hemisfério inteiro usando o grande faca.
NOTA: Todos os protocolos de fixação exigir a verificação prévia de anticorpos. - Secções do rótulo da frente para trás começa com a primeira secção que contém ventrículo lateral. Use um sistema de rotulagem alfa-numérico, rotulando as fatias com letras (anterior para posterior) e subseção com números (de cima para baixo). Evite interromper superfície ependymal.
- Usando bisturi microcirúrgico, dissecar ventrículo parede 1 cm de profundidade, mantendo uma secção contínua por toda a parede lateral. Subdivide parede conforme necessário para criar seções de tamanho apropriado para a coloração bem. Secção do entalhe no lado oposto da parede do ventrículo para identificar a orientação superior / inferior.
- Executar a recuperação de antigénio por incubação de secções de tecido em 10 mM de tampão de citrato de sódio (pH 6,0) a 100 ° C durante 10-20 minutos usando um boile duploR (tempo de incubação óptimo é determinado empiricamente). Lavar 3 vezes em PBS / 0,1% de Triton X-100 (TX-PBS).
- Bloco em 10% de soro de cavalo utilizando PBS / PBS-TX, durante 1 h à temperatura ambiente.
- Incubar com anticorpos primários durante 48 horas a 4 ° C. Para visualizar ventrículo revestimento de parede, as peças inteiras imunocoloração com as seguintes combinações de anticorpos: de ratinho anti-β-catenina (1: 250); de cabra anti-GFAP (1: 250); de coelho anti-AQP4 (1: 400).
- Execute todas as etapas subsequentes no escuro. Lavar o tecido 3 vezes em PBS, incubar com anticorpos secundários (1: 500) durante 24 h a 4 ° C ou 2 horas a temperatura ambiente, e lavar mais 3 vezes em PBS. Incubar tecido em DAPI durante 7 minutos à temperatura ambiente seguido com mais 3 lavagens em PBS.
- Prepare tecido para dissecção definitiva, cobrindo um prato fundo de cera com parafilme. Preencha prato com PBS, coloque no prato tecido usando uma pinça fina, evitando fazer contato com a parede ependymal.
- Sob o microscópio de dissecação, firmemente secure tecido em seu lado usando pinos. Com um 22,5 ° microcirúrgica faca facada, criar secções finas uniformes (cerca de 300 mm de espessura) da parede do ventrículo lateral. Para grandes seções ou seções com curvatura difícil, corte em cubos pequenos antes de cortar em seções finais para a montagem e localização nota.
- Coloque cuidadosamente ependyma seção dissecados para cima de slides usando uma pinça fina, tomando nota da localização regional e orientação sobre o slide. Cobrir o tecido, com fina camada de aquapolymount, tomando cuidado para evitar bolhas. Coloque lamela sobre o tecido, adicione aquapolymount adicional conforme necessário para preencher eventuais lacunas sob lamela.
- Coloque secções montadas em seco e escuro durante 2-3 dias à temperatura ambiente. Loja em slidebox a 4 ° C.
- Beginning com um hemisfério intacto (fixo em formol 10% e lavadas cuidadosamente com 0,1 M PBS), 1,5 centímetros de espessura fatia cortes coronais através hemisfério inteiro usando o grande faca.
- A imuno-histoquímica e análise histológica
- Usando a microscopia confocal para visualizar imuno fluorescente, definir o plano focal de imagem na superfície do ventrículo, tal como determinado pelo uso óf β-catenina (marcador para proteínas de junções aderentes apicais de células ependimais). Delinear as regiões de cobertura celular ependymal e astrogliosis superfície (coloração GFAP na superfície do ventrículo).
- Para documento e da montagem de toda a superfície do ventrículo, usar imagens sobrepostas para cobrir toda a superfície. Para criar montagem de imagens seriadas, abrir o Adobe Photoshop. Use Arquivo> Automatizar> Layout do Photomerge> Interativo de selecionar imagens para sobrepor, fazendo ajustes manuais, se necessário.
- Crie uma nova camada de rastrear montagem para gerar representação dos desenhos animados da cobertura celular ependyma intacta ou gliosis superfície ventrículo. Repita o procedimento para cada slide ou ROI. Compilar todas as seções para reconstruir o mapa de parede do ventrículo e link para a região correspondente na reconstrução de ressonância magnética.
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Representative Results
Traçado do contorno dos ventrículos laterais do rato com base em imunomarcadas 50 mm cortes coronais e reconstruções em 3D (Figura 3) permite que os dados de volume a ser coletado em diferentes paradigmas experimentais utilizando o mouse como um sistema modelo para a doença ou lesão. Crítico para este procedimento é a exclusão de regiões onde as paredes ventriculares laterais aderir uns aos outros. Por subsegmenting regiões dos ventrículos e designa uma cor diferente para cada região (Figura 3C), seções contíguas possam ser cumpridos e do volume regional e total pode ser calculada a partir subsegmentos compilados.
Estudos semelhantes podem ser realizados utilizando exames de ressonância magnética do cérebro junto com a segmentação semi-automática (ITK-SNAP) dos ventrículos laterais para desenhos em 3D. Para o emparelhamento direta de volumes ventriculares ea análise do tecido periventricular, pré ou pós-mortem exames de ressonância magnética são segmentadas e alinhadas para criar reconstruções em 3D (
Figura 1: Execução de segmentação ventrículo lateral utilizando a ferramenta de ROI Serpente ITK / de pressão (A) 'Bubbles' são adicionados ao ventrículos laterais. (B) 'Bubbles' expandir durante a evolução contorno ativo. (C) A segmentação é completa quando toda ventrículo lateral é preenchido. (Cuidado é tomado para evitar o 3º ventrículo.)
Figura 2: dissecção da parede do ventrículo lateral humana (
Figura 3: Rastreamento e reconstrução 3D do rato ventrículos laterais (A seção cérebro do rato Coronal incluindo ventrículos laterais, delineados por células ependimárias S100β-imunorreactivas (*, lateral ventrículos; suporte, região de Adhe. Sion; barra de escala, 500 mm). (B) mouse ventrículos laterais são rastreados como 'contornos' e dispostas como secções sub-segmentado, com excepção das regiões de adesão intraventricular de interferir com a análise volumétrica. (C) a reconstrução 3D de contornos ventrículo lateral. Amarelo, contorno do volume cerebral total que abrange a região de interesse contendo os ventrículos laterais.
Figura 4: a segmentação do ventrículo lateral baseada em MRI (A) MR As imagens são montadas. (B) ventrículo lateral é definido como ROI (vermelho). Imagem reconstrução (C) 3D permite a quantificação volumétrica e visualização qualitativa do ventrículo lateral.
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Figura 5: Avaliação da expansão ventrículo longitudinal Longitudinal ressonância magnética a partir de vários pontos podem ser alinhadas e sobrepostas para visualizar e quantificar ventrículo expansão de volume dentro de indivíduos ao longo do tempo.
Figura 6: Avaliação imunohistoquímica e mapeamento regional da superfície lateral do ventrículo humana (A) Áreas de células ependyma intactas, delineado pela coloração de β-catenina, mostrar uma aparência de paralelepípedos (asterisco) e são demarcados por uma linha pontilhada de regiões de astrogliosis na superfície do ventrículo (GFAP + coloração). (B) imagens confocal de série são sobrepostos para gerar uma montagem regional e rastreados usando o Adobe Photoshop para uma representação dos desenhos animados da organização celular na superfície do ventrículo. (C) dos desenhos animados demontage imagem é mapeado para a superfície do ventrículo na ressonância magnética baseado ventrículo 3D reconstrução correspondente. (Barra de escala (A), 40 uM; Barra de escala (B), 1 mM)
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Discussion
Nós apresentamos ferramentas e protocolos que podem ser utilizados para avaliar a integridade de sistema ventricular do cérebro em ratos e em seres humanos. Estas ferramentas, no entanto, pode também ser aplicada a outras estruturas cerebrais ou sistemas de órgãos que sofrem alterações devido a lesões, doença, ou durante o processo de envelhecimento 14,21,22. As estratégias apresentadas tirar proveito do software que permite o alinhamento de seqüências de RM transversais e longitudinais para gerar representações em 3D de volume de regiões ou estruturas de interesse específicos. Longitudinal sequências de ressonância magnética permitem a compilação de mudanças de volume 3D que ocorrem ao longo do tempo e pode ser estendido para incluir volume total do cérebro, para ventrículo lateral para rácios volume total do cérebro, e / ou outras estruturas do cérebro (por exemplo, núcleo subtalâmico 23 ou corpo caloso tratos de substância branca usando ponderadas pelo tensor de difusão). Juntos, uma análise abrangente das mudanças estruturais do cérebro pode ser realizada. Em última análise,para avaliar as alterações relacionadas com a idade e doenças relacionadas com a estruturas do cérebro uma coleção de técnicas de imagem multimodais são necessários para fornecer a imagem mais precisa do estado de saúde do cérebro 24. Documentação e compilação de dados estruturais críticos, juntamente com a variabilidade sujeito-sujeito e da gama de variabilidade entre os indivíduos, poderia idealmente ser usado para gerar ultra-alta de campo atlas ressonância magnética para melhor guia diagnóstico clínico de tecido na saúde ou doença.
Vários passos críticos são importante notar, a fim de diminuir a aquisição e processamento de variabilidade entre e dentro dos conjuntos de dados sujeitos. Idealmente para se obter sequências de dados correspondentes, o mesmo MRI scanner e sequência de tipo deve ser usado durante todo o estudo. Tecido cerebral post-mortem é muitas vezes de qualidade variável; factores críticos, tais como a causa da morte, o intervalo post-mortem, a qualidade da perfusão, e período de tempo em fixador todos podem afectar a eficácia e manchando a necessidade de umprotocolo de recuperação antigênica. Além disso, o tamanho do cérebro humano requer várias secções da fatia com cada fatia exigir manipulação adicional para obtenção de um tecido que contém as regiões de interesse. Portanto, é essencial que a localização e a orientação de cada secção é claramente marcados e registados. Em última análise, o problema principal com a análise de tecido post-mortem é precisamente que - é postmortem - e, por conseguinte, fornece apenas uma visão de imagem de tecido no final da vida. Melhoria das técnicas de imagem multimodais é necessário para análise em tempo real de mudanças nas estruturas cerebrais e informação morfo-funcional com resolução celular.
Estudos em camundongos permitem interrogatório da variável condição humana por variável e não apresentam muitas das dificuldades encontradas quando se trabalha com o tecido humano. Estudos com ratos usados para modelar doenças humanas ou ferimentos através de análise de dinâmica estrutural causais podem oferecer melhorias para a doença-modelo validation. No entanto, diferenças específicas de cada espécie deve ser observado. Na nossa análise dos ventrículos laterais, é importante notar que os ratinhos reter um nicho de células estaminais activa ao longo da parede lateral dos ventrículos laterais e mediada por células-tronco reparação regenerativa do ventrículo revestimento ocorre em casos de perda de células ependimária modesto, como encontrado em camundongos com idade ou quando limitado desnudação célula ependymal ocorre através da exposição do ependyma a neuraminidase 19. Em contraste, os humanos não manter um nicho de células-tronco robusto ao longo das paredes ventriculares laterais 25-27 e pouco, se algum, a regeneração é provável. Em contraste com os ratos com idade, seres humanos com idades mostram grande astrogliose na superfície do ventrículo associada à expansão ventrículo 6. Este nível de desnudamento e 'cicatrizes' do revestimento do ventrículo pode ser modelado em mouse usando neuraminidase para desnudar o forro ventrículo de células ependimárias 6,28. Além disso, é importante reconhecer them camundongos mantidos-viveiro não experimentam infecções, doença ou trauma, apresentando uma história médica muito diferente da maioria dos seres humanos. Além disso, os ratos normalmente não mostram doença neurodegenerativa associada à idade, ventriculomegalia ou gliosis periventricular. Portanto, para observar esses fenótipos que têm de ser modelado. No final, nenhum modelo animal pode recapitular totalmente a ontogenia, fisiopatologia e da complexidade sintomática da doença humana e que estas limitações devem ser reconhecidas e devidamente comunicada.
Em resumo, apresentamos técnicas e protocolos para avaliar volumes ventriculares laterais de rato e humana. Ventrículos podem ser renderizados em 3D e análise longitudinal permite a compilação das mudanças do volume espaço-temporais. Além disso, utilizando-se tecido cerebral emparelhado demonstramos como características celular pode ser ligada a alterações no volume do ventrículo. Resultados recentes que demonstram níveis de Aquaporin-4 expressão aumentada nas zonas de periventricular gliosis sugerem edema ao longo da superfície do ventrículo. Portanto investigações futuras emparelhamento FLAIR-RM com a histologia do tecido irá melhorar a nossa compreensão da CSF e intercâmbio fluido intersticial, e fornecer informações críticas sobre a saúde do sistema ventricular e como sua deterioração afeta várias funções cerebrais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 21600-069 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 19210 | Use at 4% in PBS, 4 °C |
| Normal Horse Serum | Life Technologies | 16050 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210 | 10% in PBS-TX (v/v) |
| Triton X-100 (TX) | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.1% in PBS (v/v) |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Imager.M2 | |
| Camera | Hamamatsu | ORCA R2 | |
| Microscope Stage Controller | Ludl Electronic Products | MAC 6000 | |
| Stereology software | MBF Bioscience | Stereo Investigator 11 | |
| Stereology software | ImageJ/NIH | NIH freeware | |
| 3D Reconstruction software | MBF Bioscience | Neurolucida Explorer | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | |
| MRI Software | |||
| Freesurfer | https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall | Segmentation and Volume | |
| ITK-Snap | http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php | Segmentation and Volume | |
| Multi-image Analysis GUI (Mango) | http://ric.uthscsa.edu/mango/ | Longitudinal overlay | |
| Whole Mount Equipment | |||
| 22.5° microsurgical straight stab knife | Fisher Scientific | NC9854830 | |
| parafilm | |||
| wax bottom dissecting dish | |||
| pins | |||
| fine forceps | |||
| aquapolymount | |||
| Dissecting Microscope | Leica | MZ95 | |
| Whole Mount Antibodies | |||
| mouse anti-b-catenin | BD Bioschiences, San Jose, CA, USA | 1:250 | |
| goat anti-GFAP | Santa Cruz Biotechnology | 1:250 | |
| rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4) | Sigma-Aldrich | 1:400 | |
| Coronal Antibodies | |||
| Anti-S100β antibody | Sigma-Aldrich | 1:500 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D-1306 | 10 µg/ml in PBS |
References
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